Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Um rastreio de baseada em célula de murino ilhotas pancreáticas para produtos químicos ambientais Diabetogenic

Published: June 25, 2018 doi: 10.3791/57327
* These authors contributed equally

Summary

Aqui nós apresentamos um protocolo para isolar células de ilhotas pancreáticas do mouse para as induções ROS de triagem pelos xenobióticos para identificar os potenciais químicos xenobióticos de diabetogenic.

Abstract

Exposição a certas substâncias químicas ambientais em humanos e animais foi encontrada para causar dano celular das células β do pâncreas que conduzirá ao desenvolvimento de diabetes mellitus tipo 2 (T2DM). Embora os mecanismos para o danos nas células β induzida em química foram clara e susceptível de ser complexo, uma constatação recorrente é que estes produtos químicos induzem o estresse oxidativo levando a geração de espécies de excessiva reativas de oxigênio (ROS) que induzem danos a célula β. Para identificar potenciais produtos químicos ambientais diabetogenic, isolamos as células de ilhotas pancreáticas de camundongos C57BL/6 e de células da ilhota cultivadas em placas de cultura de células 96 poços; em seguida, as células das ilhotas foram tratadas com produtos químicos e a geração de ROS foi detectada por 2', tintura fluorescente 7'-diclorofluoresceína (Diniz Melo-DA). Usando esse método, nós encontrou que o bisfenol A (BPA), Benzo [a] pireno (BaP) e os bifenilos policlorados (PCBs), poderia induzir altos níveis de ROS, sugerindo que eles podem potencialmente induzir danos nas células das ilhotas. Este método deve ser útil para a seleção diabetogenic xenobióticos. Além disso, as células das ilhotas culta também podem ser adaptadas para análise em vitro de toxicidade induzida por substância química nas células do pâncreas.

Introduction

Aumento na prevalência de T2DM tornaram-se uma crise de saúde global nos últimos anos posando uma séria ameaça à saúde pública1. Muitos fatores foram encontrados para ser causalmente ligada ao desenvolvimento do T2DM, entre os quais, recorrentes achados sugerem que um ponto convergente comuns a esses fatores é a indução de estresse oxidativo, que leva à geração de excessiva ROS2 , 3.

Um amplo espectro de produtos químicos ambientais incluindo PCBs, dioxinas e BaP foi encontrado para induzir o estresse oxidativo, que pode prejudicar a função das células β do pâncreas e levar à resistência à insulina e T2DM4. Embora o nível fisiológico de ROS desempenha um papel importante nas funções celulares, exposição a ROS que excede a capacidade do sistema antioxidante resulta em danos de tecidos/células e leva a doenças5. Células β do pâncreas expressam um baixo nível de enzima antioxidante e assim são um alvo sensível para o dano mediada por estresse oxidativo6,7. A exposição crônica a níveis elevados de ROS foi mostrada para causar disfunção de células pancreáticas induzida por estresse5 bem como resistência à insulina no fígado e tecido adiposo8.

O objetivo geral deste projeto é desenvolver um ensaio baseada em célula de substâncias químicas de tela para seus potenciais de diabetogenic com base na sua indução de ROS em células pancreáticas. O pâncreas carece de desintoxicação metabólica e é um alvo sensível para dano induzido por xenobiótico6,7. Portanto, medindo diretamente o ROS gerado nas células do pâncreas, este ensaio deve fornecer uma aproximação direta da lesão induzida por produto químico no pâncreas. Para desenvolver este método, nós isolado de ilhotas pancreáticas do mouse, culta o ilhéu isolado sob condição de cultura celular com produtos químicos e utilizou a geração de ROS induzida por substância química como a leitura. Este procedimento é simples e eficaz na identificação de produtos químicos ROS-induzindo o ilhéu isolado; Isso pode ser desenvolvido para a investigação dos mecanismos de toxicidade que são específicos para o pâncreas em vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos os experimentos com animais foram executados em conformidade com todas as orientações pertinentes, regulamentos e agências reguladoras. O protocolo que está sendo demonstrado foi realizado sob a orientação e aprovação do cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) do Texas A & M Instituto de Medicina Genômica.

1. preparação da solução

  1. Diluir a solução de sal equilibrada do Hank x 10 x 1 com água destilada dobro H2O e armazenar a 4 ° C.
  2. Prepare a solução de isolamento adicionando HEPES (10 mM), MgCl2 (1 mM) e glicose (5 mM). Ajustar o pH para 7,4 e manter no gelo.
  3. Prepare a solução de colagenase da colagenase tipo 4.
    Nota: Especificamente, colagenase tipo 4 contém 160 U por mg de peso seco. 1 g de colagenase tipo 4 é diluído em 5 mL duplo destilada H2O com uma concentração de 200 mg/mL. 2 mL da colagenase diluído é adicionado para 30 mL de solução de isolamento frio gelo e 6 mL de solução de colagenase é transferido para um tubo de 50 mL para cada rato.
  4. Prepare a solução de lavagem, adicionando 1 mM CaCl2 para a solução de isolamento.
  5. Prepare a solução de purificação com solução de diatrizoate de sódio polysucrose frio (1,1119 g/mL, 5 mL).
  6. Prepare 500 mL de meio de cultura de ilhota pela adição de L-glutamina (20 mM), penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 µ g/mL) e soro fetal bovino (FBS) (10%) em meio RPMI.
  7. Preparar a solução Diniz Melo-DA-mãe, dissolvendo o pó em água destilada a 200 µM e loja a-20 ° C.
    Nota: O ROS coloração solução recém feito diluindo a solução para a concentração final de 5 µM em RPMI Diniz Melo-DA. Este reagente deve ser protegido da luz.

2. cirúrgica preparação

  1. Intraperitonealmente injete (I.P.) um rato com avertin (2,5% avertin, 0,4 mL/20 g). Depois que o mouse é completamente anestesiado e não responde mais os pés hind pitadas, eutanásia o mouse e mover para o capô biológico.
  2. Coloque o mouse euthanized com a abdominal virados para cima e pulverizar a pele com álcool 70% para a esterilização.
  3. Abrir a cavidade abdominal com um U-incisão de 1 cm em cima do abdômen superior e retrair a pele no sentido rostral sobre o peito para expor na cavidade abdominal.

3. remoção e perfusão pâncreas

  1. Conforme ilustrado na Figura 1, encontre a localização na ampola. Use um par de pinças curvas para fixar o duodeno perto a posição do esfíncter de Oddi. Use outro par de pinças curvas para fixar a parede do duodeno para bloquear o caminho de bile no duodeno.
    Nota: A ampola não foi inserida nesta etapa. Esta etapa destina-se a bloquear o caminho de bile no duodeno.
  2. Reposicione o mouse com a cabeça proximal e distal em relação ao pesquisador os pés.
  3. Encontrar o ducto biliar comum e lentamente injete 3 mL de solução de colagenase com uma seringa de 5 mL e agulha de 30g. Certifique-se que o ducto biliar e o pâncreas estão inflacionados após a injeção.
  4. Remova o pâncreas distendido, usando a pinça curvada e tesouras bem para separá-lo do descendente do cólon, intestinos, estômago e baço. Coloque o pâncreas em um tubo de 50 mL contendo 3 mL de solução de colagenase e mantê-lo no gelo.

4. pâncreas digestão

  1. Coloque cada tubo de 50 mL em um banho-37 ° C. Incubar durante 15-20 minutos (tempo varia com a tensão e a idade dos ratos).
  2. Vibre o tubo usando um vórtice.
  3. 4-5 pâncreas digerido em um coador grande coletor estéril da piscina e use uma colher para fazer com que o pâncreas desmoronar completamente. Use uma seringa de 10 mL e agulha 23G contendo solução de lavagem para pipetar com força as células digeridas fora da tela. Recolha a solução de lavagem em um tubo de 50 mL.
  4. Centrifugar os tubos a 97 x g a 4 ° C por 1 min e decante o sobrenadante.
  5. Adicionar 25 mL de solução de lavagem para tubos e ressuspender o tecido vortexing suave. Spin para baixo os tecidos a 97 x g a 4 ° C por 1 min e decante o sobrenadante. Repita por 3 vezes. Tenha cuidado para não deslocar o tecido granulado.

5. purificação de Ilhéus

  1. Adicionar 10 mL de solução de purificação para a pelota de tecido lavado e ressuspender delicadamente o conteúdo.
  2. Delicadamente sobreposição de 5 mL de solução de isolamento sobre a solução de purificação. Tenha cuidado para manter uma interface líquida acentuada entre as duas soluções.
  3. Centrifugar o tubo a 560 x g a 4 ° C por 15 min com aceleração lenta e sem freio. Introduza a pipeta a interface e recolher a camada de ilhotas para novos tubos de 50 mL.
  4. Lave os ilhéus, conforme descrito na etapa 3.5.

6. chapeamento e tratamento de células das ilhotas

  1. Resuspenda as ilhotas em 10 mL de solução de cultura de Ilhéus, delicadamente misture bem e coloque 100 µ l/poço com uma pipeta multicanal para uma placa de 96 poços. Coloque aproximadamente 5 ilhotas por 96 bem.
  2. Coloque a placa na incubadora de cultura de tecido para 12h.
  3. Centrifugar (112 x g) a placa de 96 poços e remover o meio de cultura.
  4. Dilua os químicos ambientais em meio de cultura de Ilhéus. Adicione 100 µ l de cada um dos diluentes a química em cavidades separadas da placa. Resuspenda as ilhotas em cada poço e incubar durante 12 horas a 37 ° C (a concentração varia para os diferentes produtos químicos ambientais).

7. ROS manchando e medição

  1. Após o tratamento de Ilhéus, lave com 1X PBS (200 µ l de cada poço-96).
    Nota: A concentração das substâncias químicas é como segue: AFB1: 3 µM, atrazina: 100 µM, BaP: 10 µM, BPA: 100 µM, β-estrogênio, PCB126: 10 µM, nonilfenol e BPA: 100 µM.
  2. Use o N-acetil cisteína (NAC) como um antioxidante para saciar ROS. Adicionar 5 mM do NAC para o diluente químico induzida por ROS e incubar durante 12 horas a 37 ° C.
  3. Centrifugue a placa de 96 a 112 x g e com solução de 5 µM de sonda fluorescente (H2-Diniz Melo-DA dissolvido na mídia RPMI), incubar a 37 ° C por 60 min.
  4. Lavar as células da ilhota tratada 3 vezes com PBS e medir a fluorescência com um leitor de microplacas em 488 nm.
    Nota: O acúmulo de DCF nas células pode ser medido por um aumento na fluorescência 530 nm quando a amostra está animada em 488 nm.
  5. Executar a secreção (GSIS) de insulina glicose-estimulada ensaio9 na indução ROS xenobiótico tratados ilhotas e Ilhéus não tratadas para medir os efeitos de xenobióticos sobre a função fisiológica das ilhotas pancreáticas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Uma micrografia de ilhéu isolado do saudável é mostrada na Figura 2, em que ilhéus tem uma forma redonda ou oval com relativamente uniforme tamanho (apesar de uniformidade de tamanho pode variar de cepa para cepa). Em seguida, investigamos as funções de ilhotas pancreáticas em um ensaio em vitro isolando o ilhéu e estimulando a secreção de insulina em ilhotas a cultura. A Figura 3 mostra a nossa análise típica do ensaio de ilhotas de rato isolado C57BL/6 induzida por 3,3 mM e 16,7 mM de glicose9GSIS.

Usando o método de tela de formato de placa, nós identificamos vários xenobióticos que causou significativa indução de ROS em células da ilhota (Figura 4). Nós tratados as ilhotas isoladas com produtos químicos diferentes para 12h e encontrou a atrazina, BPA, BaP e PCB126, e β-estrogênio pode causar indução significativa de ROS na ilhotas isoladas10,11,12 , 13.

Embora ROS não é igual para a indução de diabetogenic, há ampla evidência indicando o importante papel de ROS em causar danos às funções fisiológicas das células β do pâncreas, que leva a T2DM8. Portanto, o valor do trabalho é identificar esses ROS indução química como a tela inicial. Além disso, os compostos identificados podem ser mais analisados em vitro no sistema de cultura de célula isolada ilhota pancreatic descrito no manuscrito. Mostramos os efeitos de indução ROS xenobióticos na glicose-estimulando a secreção de insulina das ilhotas isoladas, que brevemente fornecer dados diabetogenic para estes compostos testados. Ilhotas pancreáticas pré-tratadas com PCB126 e BPA mostraram uma significativa diminuição na secreção de insulina do que o grupo controle (Figura 5).

Figure 1
Figura 1 : Procedimento de perfusão de pâncreas de rato. O procedimento consiste as seguintes etapas: (1) encontrar a ampola e usar dois pares de pinças curvas para fixar na ampola. (2) inserir a agulha através do bile comum. (3) lentamente injete 3 mL de caldo de colagenase solução na seringa de 5 mL. (4) recolha o pâncreas distendido, a partir do duodeno.
 

Figure 2
Figura 2 : Isolado ilhotas rato. Ilhotas pancreáticas de rato isolado em meio de cultura são mostradas. Barra de escala de 500 µm.

Figure 3
Figura 3 : Secreção de insulina glicose-estimulada de ilhotas pancreáticas isoladas. A secreção de insulina glicose-estimulada de dose-dependente (1, 3,3 e 16,7 mM, tratados por 15 min) foi medido em ilhotas isoladas (média de 5 ilhotas por alvéolo), usando uma insulina de rato ELISA kit. Barras de erro mostram desvios-padrão. p < 0,05.

Figure 4
Figura 4 : Indução de ROS por xenobióticos em ilhotas isoladas de camundongos C57BL/6. Ilhotas isoladas (A) foram tratadas por 12h e coradas com corante de fluorescência 2', 7'-diclorofluoresceína (Diniz Melo-DA) por 1h. A fluorescência foi determinada por um leitor de placa de fluorescência. (B) o produto químico induzida ROS foram extinguidos por NAC (5 mM). (AFB1: 3 µM, atrazina: 100 µM, BaP: 10 µM, BPA: 100 µM, PCB126: 10 µM, nonilfenol, BPA: 100 µM e NAC: 5 mM). Barras de erro mostram desvios-padrão. p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Efeitos de xenobióticos sobre a secreção de insulina glicose-estimulada de ilhotas isoladas. Ilhotas isoladas foram pré-tratadas com PCB126, β-estrogênio e BPA (4h) e mantidas em meio de cultura ilhéu por 1h. O sobrenadante dos ilhéus foi coletado para medição de insulina por uma insulina de rato comercialmente disponível ELISA ensaio. Barras de erro mostram desvios-padrão. p < 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Acumular evidências sugere que a exposição a substâncias químicas ambientais desempenha um papel importante no desenvolvimento do T2DM. Induzida por xenobióticos ROS tem sido reconhecida como um fator etiológico potencial, contribuindo para o desenvolvimento do T2DM. Os seres humanos são expostos a uma ampla gama de produtos químicos xenobióticos e há uma grande necessidade de técnicas de pesquisa de romance para efetivamente identificar os tóxicos do pâncreas e para investigar o mecanismo de toxicidade específico para as células do pâncreas.

Neste estudo, com base em procedimentos publicados14, desenvolvemos um protocolo ilhotas pancreáticas de mouse e tela de isolar as células com xenobióticos químicos para dano induzida por estresse oxidativo às células do pâncreas. Também utilizamos este procedimento para investigar as respostas tóxicas específicas pancreáticas induzidas pelos compostos xenobióticos. Para obter o pâncreas de rato, nós preferimos usar avertin sobre outra anestesia porque não altera os níveis de glicose do sangue e não afeta a vascularização do pâncreas15,16,17. Nós achamos que a etapa de centrifugação gradiente de densidade é crítica para isolamento de ilhotas com elevado grau de pureza. Deve ter cuidado para obter a camada distinta entre a fase de reserva de polysucrose de sódio e isolamento para obter uma amostra pura de Ilhéus, desprovido de detritos e tecidos/células exócrinas. O método pode ser usado para análise em vitro de efeitos químicos ambientais sobre fisiologia de ilhotas pancreáticas, tais como o ensaio GSIS (como mostrado na Figura 3). Os ilhéus devem ser cuidadosamente dispersos com pipetagem repetidas em celas separadas para garantir o número do celular uniformizados na placa de cultura de células 96. O método descrito aqui combinado o isolamento de ilhotas e um ensaio rápido para geração de ROS e, portanto, é uma simples e eficaz a tela inicial para potenciais substâncias químicas nocivas para o pâncreas.

Usamos a secreção de insulina em resposta ao desafio de glicose para confirmar a identidade dos ilhéus do pâncreas isolados. O procedimento é altamente adaptável para análise de alterações nos parâmetros, incluindo a secreção de insulina (Figura 3) e geração de acampamento, em resposta aos tratamentos xenobióticos18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por uma concessão do projeto piloto do centro CREH patrocinado pela NIEHS e pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (n. º 31572626).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10×Hank’s balanced salt solution  GIBCO 14185-052
Collagenase Type 4 Worthington Biochemical Corporation CLS-4
polysucrose/sodium diatrizoate solution  Sigma 10771
2’,7’-dichlorofluorescein (DCFH-DA) Sigma D6883-50MG
fluorescence microplate reader  Biotek
L-glutamine Sigma G8540-25G
streptomycin GIBCO 15140148
FBS GIBCO 26140079
RPMI 1640 GIBCO 11875-085
avertin Sigma T48402-25G
Rat/Mouse Insulin ELISA Kit Millipore EZRMI-13K
Centrifuge Sorval Sorval RT7 for 96-well plate centrifuge
Microplate reader Biotek Epoch 2 for fluorescence reading

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maruthur, N. M. The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival? Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).
  2. Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).
  3. Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus. Exp Diabetes Res. , 703538 (2012).
  4. Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants. Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).
  5. Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. Glucose toxicity in β-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection. Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).
  6. Kaneto, H., et al. Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction. Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).
  7. Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).
  8. Gao, D., et al. The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).
  9. Efendić, S., et al. Pancreastatin and islet hormone release. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).
  10. Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. Ah receptor and NF-κB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity. Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).
  11. Cui, H., et al. Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[α]-pyrene-induced DNA damage. Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).
  12. Li, L. A., Wang, P. W. PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells. Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).
  13. Asahi, J., et al. Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes. Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).
  14. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255 (2007).
  15. Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).
  16. Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).
  17. Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).
  18. Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).

Tags

Imunologia e infecção edição 136 espécies reativas de oxigênio ilhotas pancreáticas T2DM xenobióticos de produtos químicos ROS diabetogenic
Um rastreio de baseada em célula de murino ilhotas pancreáticas para produtos químicos ambientais Diabetogenic
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, J., Zhong, L., Wu, J., Ke, S., More

Chen, J., Zhong, L., Wu, J., Ke, S., Morpurgo, B., Golovko, A., Ouyang, N., Sun, Y., Guo, S., Tian, Y. A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals. J. Vis. Exp. (136), e57327, doi:10.3791/57327 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter