Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 以隔离小鼠胰岛细胞筛选的 ROS 归纳的外来化合物, 以确定潜在的致糖尿病 xenobiotic 化学品。
Abstract
暴露在人类和动物中的某些环境化学物质已经被发现会导致胰腺β细胞的细胞损伤, 这将导致2型糖尿病 (T2DM) 的发展。虽然化学诱导β细胞损伤的机制不清楚, 而且很可能是复杂的, 但一个反复发现是这些化学物质诱导氧化应激导致产生过量的活性氧 (ROS), 从而导致损害β细胞。为了识别潜在的致糖尿病环境化学物质, 我们从 C57BL/6 小鼠和培养的胰岛细胞中分离出了96井细胞培养皿中的胰腺细胞;然后, 用化学试剂对胰岛细胞进行了剂量测定, 用 2 ', 7 '-dichlorofluorescein (DCFH) 荧光染料检测了 ROS 的产生。使用这种方法, 我们发现双酚 a (BPA), 苯并 [a] 芘 (BaP) 和多氯联苯, 可能会诱发高水平的 ROS, 表明它们可能会导致胰岛细胞的损害。该方法应用于筛选致糖尿病外来化合物。此外, 培养的胰岛细胞也可用于胰腺细胞化学诱导毒性的体外分析。
Introduction
T2DM 患病率的上升已成为近年来全球卫生危机, 对公共卫生构成严重威胁1。许多因素被发现与 T2DM 的发展有因果关系, 其中, 反复发现表明, 这些因素的一个共同的收敛点是诱导氧化应激导致过量 ROS 的产生2,3。
广泛的环境化学物质, 包括多氯联苯, 二恶英和 BaP 被发现诱导氧化应激, 这可能会损害胰β细胞的功能, 导致胰岛素抵抗和 T2DM4。虽然 ros 的生理水平在细胞功能中起着重要作用, 但暴露于活性氧超过抗氧化剂系统的能力会导致细胞/组织的损伤, 导致疾病5。胰β细胞表达的抗氧化酶水平较低, 因此是一个敏感的目标为氧化应激介导的损害6,7。慢性暴露于高水平的 ROS 已经表明, 导致应力诱发胰腺细胞功能障碍5以及胰岛素抵抗的肝脏和脂肪组织8。
这个项目的总目标是建立一个细胞为基础的检测, 以筛选化学物质的致糖尿病潜能的基础上, 他们诱导的活性氧在胰腺细胞。胰腺缺乏代谢解毒, 是 xenobiotic 致损伤6、7的敏感靶。因此, 通过直接测定胰腺细胞中产生的 ROS, 可以直接对胰腺内化学诱发的损伤进行近似分析。为了开发这种方法, 我们分离了小鼠胰岛, 用化学物质在细胞培养条件下培养出孤立的胰岛, 并利用化学诱导的 ROS 生成作为读数。该方法简便、有效地鉴别孤立胰岛中的活性氧诱导化学物质;它可以进一步发展, 以调查的毒性机制, 具体的胰腺的体外。
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Protocol
所有动物实验都是按照所有相关的指导方针、规章和管理机构执行的。正在示范的《议定书》是在德克萨斯一个 & M 基因组医学研究所的机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的指导和批准下进行的。
1. 解决方案准备
- 将10x 汉克的平衡盐溶液稀释为 1x, 双蒸馏 H2O, 并贮存在4摄氏度。
- 通过添加 HEPES (10 毫米)、氯化镁2 (1 毫米) 和葡萄糖 (5 毫米) 来制备隔离溶液。将 pH 值调整为 7.4, 并保持冰。
- 从4型胶原酶中制备胶原酶溶液。
注:具体地说, 胶原酶4型含有 160 U 每毫克的干重。1克胶原酶4型稀释5毫升双蒸馏 H2O 与浓度200毫克/毫升。2毫升的稀释胶原酶添加到30毫升冰冷隔离解决方案, 6 毫升的胶原酶溶液被转移到50毫升管为每只老鼠。 - 通过将1毫米 CaCl2添加到隔离溶液中, 准备洗涤液。
- 用冷聚蔗糖/钠葡溶液 (1.1119 克/毫升, 5 毫升) 制备纯化溶液。
- 将 l-谷氨酰胺 (20 毫米), 青霉素 (100 毫升), 链霉素 (100 µg/毫升) 和胎牛血清 (10%) 加入 RPMI 培养基中, 制备500毫升胰岛培养基。
- 在200µM 的蒸馏水中溶解粉末, 并贮存在-20 摄氏度时, 准备 DCFH 的溶液。
注:ROS 染色溶液是通过稀释 DCFH 溶液, 以5µM 的最终浓度在 RPMI 中新鲜地制成的。这种试剂应该保护免受光线的侵害。
2. 外科准备
- 腹腔注射 (ip) 一只老鼠与 avertin (2.5% avertin, 0.4 mL/20 g)。当鼠标完全麻醉后, 不再响应后足捏, 弄死鼠标, 移动到生物罩。
- 将安乐死鼠标放在腹部面朝上, 用70% 乙醇喷雾皮肤进行杀菌。
- 用1厘米的 U 型切口在上腹部打开腹腔, 并将延髓方向的皮肤收回, 露出腹腔。
3. 胰腺灌注和清除
- 如图 1所示, 找到壶腹的位置。用一对弯曲钳夹住靠近 Oddi 括约肌位置的十二指肠。用另一对弯曲钳夹住十二指肠壁, 阻断十二指肠的胆汁通路。
注:此步骤中未插入壶腹。这一步骤旨在阻断十二指肠的胆汁通路。 - 将鼠标与头部近端和脚远端对研究员进行定位。
- 找到胆总管, 用30克针和5毫升注射器慢慢注射3毫升胶原酶溶液。在注射后要确保胆总管和胰腺被充气。
- 用弯钳和细剪刀去除膨胀的胰腺, 将其与降结肠、肠、胃和脾分开。将胰腺放置在含有3毫升胶原酶溶液的50毫升管内, 并将其放在冰上。
4. 胰腺消化
- 将每50毫升管放入37°c 水浴。孵育 15-20 分钟 (时间随小鼠的应变和年龄而变化)。
- 用旋涡震动管子。
- 池 4-5 消化胰腺在一个大的无菌水槽过滤器和使用勺子, 使胰腺彻底崩溃。使用23克针和10毫升注射器含有洗涤液, 有力地将消化的细胞从屏幕上移开。在50毫升的管子里收集洗涤液。
- 离心管在 97 x g 在4°c 为1分钟和醒酒上清。
- 在试管中加入25毫升的洗涤液, 用温和的涡流重新悬浮组织。将组织在 97 x g 处旋转4摄氏度为1分钟, 醒酒上清。重复3次。小心不要把颗粒组织去除。
5. 胰岛的纯化
- 将10毫升的纯化液加入洗涤组织颗粒中, 轻轻并用重悬。
- 在净化溶液上轻轻覆盖5毫升的隔离液。注意在两个解决方案之间保持一个尖锐的液体接口。
- 离心管在 560 x g 在4°c 为15分钟以缓慢的加速度和没有刹车。将吸管插入到界面中, 将胰岛层收集到新的50毫升管中。
- 如步骤3.5 所述, 清洗胰岛。
6. 胰岛细胞的电镀和治疗
- 并用重悬在10毫升的胰岛培养溶液中的胰岛, 轻轻地混合好, 并放置100µL/井与多通道的吸管到96井板。安置大约5个小岛每96井。
- 把盘子放在组织培养孵化器里12小时。
- 离心机 (112 x g) 96 井板, 去除培养基。
- 在胰岛培养基中稀释环境化学物质。将每种化学稀释剂中的100µL 加入板的分离井中。并用重悬小岛在每个井和孵化12小时在37°c (浓度变化为不同的环境化学物质)。
7. ROS 染色和测量
- 胰岛治疗后, 用 1x PBS 冲洗 (每96µL 200 个)。
注:化学物质的浓度如下: AFB1: 3 µM, 阿特拉津: 100 µM, BaP:10 µM, BPA: 100 µM, β雌激素, PCB126:10 µM, 壬基酚和 BPA: 100 µM。 - 用 n-乙酰半胱氨酸 (NAC) 作为抗氧化剂来猝灭 ROS。加入5毫米的 NAC 在 ROS 诱导的化学稀释剂和孵育12小时在37摄氏度。
- 离心96井板在 112 x g 和孵化与5µM 解答荧光探针 (H2-DCFH-DA 溶解在 RPMI 媒介) 在37°c 为60分钟。
- 用 PBS 冲洗处理过的胰岛细胞3次, 用微板块读取器在488纳米上测量荧光。
注:当样品在 488 nm 激发时, 在细胞中的 DCF 的积累可以用荧光量增加 530 nm 来测量。 - 执行葡萄糖刺激胰岛素分泌 (GSIS)9的活性氧诱导 xenobiotic 治疗胰岛和未经治疗的胰岛, 以测量 xenobiotic 对胰岛的生理功能的影响。
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Representative Results
图 2显示了健康的孤立胰岛的显微图像, 其中胰岛具有圆形或椭圆形, 尺寸相对均匀 (虽然大小均匀性可以不同于应变)。我们接下来研究胰岛在试管中的作用, 通过分离胰岛和刺激胰岛素分泌的培养胰岛。图 3显示了我们对由3.3 毫米和16.7 毫米葡萄糖9诱导的 C57BL/6 小鼠孤立胰岛 GSIS 检测的典型分析。
使用板格式屏幕方法, 我们已经发现了几个外来化合物, 导致显着诱导活性氧在胰岛细胞 (图 4)。我们处理了不同化学物质的孤立胰岛12小时, 发现阿特拉津, BPA, BaP 和 PCB126, β雌激素可能导致显着诱导 ROS 在孤立的胰岛10,11,12,13。
虽然 ros 不等于致糖尿病诱导, 有充分的证据表明活性氧对胰腺β细胞的生理功能造成损害的重要作用, 从而导致 T2DM8。因此, 工作的价值是确定这些 ROS 诱导化学作为初始屏幕。此外, 在手稿中描述的孤立胰岛细胞培养系统中, 可以进一步分析所鉴定的化合物。我们已经表明, ROS 诱导外来化合物对葡萄糖刺激胰岛素分泌的孤立胰岛, 简要提供致糖尿病数据, 这些测试化合物。胰岛经 PCB126 和 BPA 预处理后, 胰岛素分泌明显减少 (图 5)。
图 1: 小鼠胰腺灌注过程.该过程由以下步骤组成: (1) 找到壶腹, 并用两对弯曲钳夹住壶腹。(2) 通过普通胆汁插入针。(3) 在5毫升注射器中慢慢注射3毫升胶原酶溶液。(4) 从十二指肠开始收集扩张的胰腺。
图 2: 孤立的老鼠胰岛.在培养基中显示孤立的小鼠胰岛。刻度条为500µm。
图 3: 葡萄糖刺激胰岛素分泌的孤立胰岛.剂量依赖性葡萄糖刺激胰岛素分泌 (1, 3.3, 16.7 毫米, 治疗15分钟) 是测量在孤立的胰岛 (每井平均5个胰岛), 使用鼠标胰岛素 ELISA 试剂盒。误差线显示标准偏差。*p < 0.05。
图 4: 从 C57BL/6 小鼠的孤立胰岛中外来化合物诱导 ROS.(A) 对12小时的孤立胰岛进行治疗, 并染色 2 ', 7 '-dichlorofluorescein (DCFH) 1 h 的荧光染料。荧光是由荧光板读取器确定的。(B) 化学诱导的 ROS 由 NAC (5 毫米) 淬火。(AFB1: 3 µM, 阿特拉津: 100 µM, BaP:10 µM, BPA: 100 µM, PCB126:10 µM, 壬基酚, BPA: 100 µM, 和 NAC: 5 毫米)。误差线显示标准偏差。*p < 0.05。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: Xenobiotic 对孤立胰岛葡萄糖刺激胰岛素分泌的影响.用 PCB126、β雌激素和 BPA (4 h) 预处理分离胰岛, 并将其保存在胰岛培养基中1小时。用一种商用的小鼠胰岛素 ELISA 法对胰岛上清液进行胰岛素测定。误差线显示标准偏差。*p < 0.05。
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Discussion
积累的证据表明, 接触环境化学物质对 T2DM 的发展起着重要的作用。外来化合物诱导的 ROS 已被认为是一个潜在的致病因素, 有助于 T2DM 的发展。人类接触到广泛的 xenobiotic 化学物质, 有很大的需要, 新的研究技术, 以有效地识别胰腺毒物和研究的毒性机制, 特异的胰腺细胞。
在这项研究中, 根据已发布的程序14, 我们已经制定了一个协议, 以隔离鼠胰岛和屏幕的细胞与 xenobiotic 化学物质氧化应激损伤的胰腺细胞。我们还使用这个程序来研究 xenobiotic 化合物引起的胰腺特异性毒性反应。为了从老鼠那里获得胰腺, 我们更喜欢使用 avertin 在其他麻醉, 因为它不会改变血糖水平, 不影响胰腺的血管15,16,17。研究发现, 密度梯度离心法对高纯度胰岛的分离至关重要。应注意获得聚蔗糖/钠和隔离缓冲期之间的不同层, 以获得一个纯胰岛样本, 没有碎片和外分泌细胞/组织。该方法可用于对胰岛生理环境化学效应的体外分析, 如 GSIS 法 (如图 3所示)。胰岛应小心地分散与重复吹打到单独的细胞, 以确保在96细胞培养板上的制服细胞数。这里描述的方法结合了胰岛的分离和快速的活性氧生成法, 因此, 是一个简单有效的初始屏幕, 为潜在的胰腺损伤化学品。
我们使用胰岛素分泌反应葡萄糖挑战, 以确认孤立的胰岛的身份。该程序非常适合分析参数的变化, 包括胰岛素分泌 (图 3) 和阵营生成, 以应对 xenobiotic 治疗18。
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Disclosures
作者声明他们没有竞争的财政利益。
Acknowledgments
这项工作得到了由 NIEHS 和中国国家自然科学基金 (31572626 号) 赞助的 CREH 中心的试点项目赠款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×Hank’s balanced salt solution | GIBCO | 14185-052 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corporation | CLS-4 | |
| polysucrose/sodium diatrizoate solution | Sigma | 10771 | |
| 2’,7’-dichlorofluorescein (DCFH-DA) | Sigma | D6883-50MG | |
| fluorescence microplate reader | Biotek | ||
| L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| streptomycin | GIBCO | 15140148 | |
| FBS | GIBCO | 26140079 | |
| RPMI 1640 | GIBCO | 11875-085 | |
| avertin | Sigma | T48402-25G | |
| Rat/Mouse Insulin ELISA Kit | Millipore | EZRMI-13K | |
| Centrifuge | Sorval | Sorval RT7 | for 96-well plate centrifuge |
| Microplate reader | Biotek | Epoch 2 | for fluorescence reading |
References
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