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Immunology and Infection

Un îlots pancréatiques Murine Cell-based Screening for diabétogène Environmental Chemicals

Published: June 25, 2018 doi: 10.3791/57327
* These authors contributed equally

Summary

Nous présentons ici un protocole visant à isoler les cellules des îlots pancréatiques souris pour contrôler les inductions de ROS par les xénobiotiques afin d’identifier les potentiels chimiques xénobiotiques diabétogène.

Abstract

L’exposition à certains produits chimiques environnementaux chez l’homme et les animaux s’est avérée de causer des dommages cellulaires des cellules β pancréatiques qui conduira au développement du diabète de type 2 (T2DM). Bien que les mécanismes pour les dommages de cellules β induite par le produit chimique étaient peu claires et susceptibles d’être complexe, une constatation récurrente est que ces produits chimiques provoquent un stress oxydatif conduisant à la génération de trop reactive oxygen species (ROS) qui provoquent des dommages aux la cellule β. Pour identifier les produits chimiques environnementaux de potentiel diabétogène, les auteurs ont isolé des cellules des îlots pancréatiques de souris C57BL/6 et des cellules des îlots cultivés dans des plaques de 96 puits cellulaires de la culture ; Ensuite, les cellules des îlots pancréatiques ont été dosés avec des produits chimiques et la production de ROS a été détectée par 2', 7'-dichlorofluorescéine (DHFC-DA) colorant fluorescent. En utilisant cette méthode, nous a constaté que le bisphénol A (BPA), Benzo [a] pyrène (BaP) et les polychlorobiphényles (PCB), risque d’entraîner des niveaux élevés de ROS, suggérant qu’ils peuvent induire potentiellement des dommages dans les cellules des îlots pancréatiques. Cette méthode devrait être utile pour le dépistage des xénobiotiques diabétogène. En outre, les cellules des îlots pancréatiques cultivées peuvent également être adaptés pour in vitro d’analyse de la toxicité induite par le produit chimique dans les cellules du pancréas.

Introduction

Augmentation de la prévalence de T2DM est devenus une crise de santé mondiale ces dernières années, posant une menace sérieuse pour la santé publique1. Plusieurs facteurs ont été trouvés à être causalement liée au développement de T2DM, parmi lesquels, récurrents résultats suggèrent que l’un points convergents communs pour ces facteurs sont l’induction de stress oxydatif, ce qui conduit à la génération d’excessive ROS2 , 3.

Un large éventail de produits chimiques environnementaux, y compris les BPC, les dioxines et BaP s’est avéré d’induire un stress oxydatif, qui peuvent nuire au fonctionnement des cellules β pancréatiques et conduire à l’insulino-résistance et T2DM4. Bien que le niveau physiologique de ROS joue un rôle important dans les fonctions cellulaires, exposition aux offices récepteurs qui dépasse la capacité du système antioxydant se traduit par des dommages aux cellules/tissus et conduit à des maladies5. Les cellules β du pancréas expriment un faible taux d’enzyme antioxydante et sont donc une cible sensible pour l’induite par le stress oxydatif6,7. Une exposition chronique à des concentrations élevées de ROS a été démontrée que la cause de dysfonctionnement des cellules pancréatiques induite par le stress5 ainsi que de la résistance à l’insuline dans le foie et le tissu adipeux8.

L’objectif global de ce projet est de développer un test d’amplification cellulaire aux produits chimiques pour leurs potentiels diabétogène basés sur leur induction de ROS dans les cellules du pancréas. Le pancréas n’a pas de détoxification métabolique et est une cible sensible pour les dommages causés par les xénobiotiques6,7. Par conséquent, de mesurer directement la ROS générées dans les cellules du pancréas, ce test devrait fournir une approximation directe de la lésion induite par le produit chimique dans le pancréas. Pour développer cette méthode, nous isolé des îlots pancréatiques de souris cultivées l’îlot isolé sous condition de culture cellulaire avec des produits chimiques et utilise la génération de ROS induite par le produit chimique comme la lecture. Cette procédure est simple et efficace pour identifier les ROS-induisant des produits chimiques dans l’îlot isolé ; Il peut être développé pour l’étude des mécanismes de toxicité qui sont spécifiques à la pancréas in vitro.

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Protocol

Toutes les expériences animales ont été exécutés dans le respect de toutes les directives pertinentes, des règlements et des organismes de réglementation. Le protocole fait la démonstration a été réalisé sous la direction et l’approbation des institutionnels animalier et utilisation Comité (IACUC) de la Texas A & M Institut pour la médecine génomique.

1. préparation de la solution

  1. Diluer la solution saline équilibrée de Hank de x 10 à 1 x avec double distillée H2O et conserver à 4 ° C.
  2. Préparer la solution d’isolation en ajoutant HEPES (10 mM), MgCl2 (1 mM) et du glucose (5 mM). Ajuster le pH à 7,4 et rester sur la glace.
  3. Préparer la solution de collagénase de collagénase de Type 4.
    Remarque : Plus précisément, la collagénase de Type 4 contient 160 U par milligramme de poids sec. 1 g de collagénase de Type 4 est dilué dans 5 mL double distillée H2O avec une concentration de 200 mg/mL. 2 mL de la collagénase dilué on ajoute 30 mL de solution d’isolation froid glace et 6 mL de solution de collagènase est transférée dans un tube de 50 mL pour chaque souris.
  4. Préparer la solution de lavage en ajoutant 1 mM CaCl2 à la solution d’isolation.
  5. Préparer la solution de purification avec la solution de diatrizoate froid polysucrose/sodium (1,1119 g/mL, 5 mL).
  6. Préparer 500 mL de milieu de culture des îlots en ajoutant de la L-glutamine (20 mM), la pénicilline (100 U/mL), streptomycine (100 µg/mL) et sérum fœtal (SVF) (10 %) dans un milieu RPMI.
  7. Préparer la solution mère de DHFC-DA en dissolvant la poudre dans l’eau distillée à 200 µM et conserver à-20 ° C.
    Remarque : Le ROS solution de coloration est fraîchement préparés en diluant la solution-mère à la concentration finale de 5 µM de RPMI DHFC-DA. Ce réactif doit être protégé de la lumière.

2. préparation chirurgicale

  1. Injecter par voie intrapéritonéale de (I.P.) une souris avec avertin (2,5 % avertin, 0,4 mL/20 g). Après que la souris est complètement anesthésiée et ne répond plus à hind pied pincées, euthanasier la souris et déplacez la hotte biologique.
  2. Placez la souris euthanasiée face abdominale vers le haut et pulvériser la peau avec l’éthanol à 70 % pour la stérilisation.
  3. Ouvrir la cavité abdominale avec un U-incision de 1 cm sur le haut de l’abdomen et se rétracter de la peau dans la direction rostrale sur la poitrine pour exposer la cavité abdominale.

3. enlèvement et la Perfusion de pancréas

  1. Tel qu’illustré à la Figure 1, recherchez l’emplacement de l’ampoule. Utiliser une paire de pinces courbée afin de serrer le duodénum à proximité de la position du sphincter d’Oddi. Utiliser une autre paire de pinces courbée afin de serrer la paroi du duodénum pour bloquer la voie de la bile dans le duodénum.
    Remarque : L’ampoule n’a pas été inséré dans cette étape. Cette étape vise à bloquer la voie de la bile dans le duodénum.
  2. Repositionner la souris avec la tête proximale et distale en ce qui concerne le chercheur pieds.
  3. Trouver le canal cholédoque et injecter lentement 3 mL de solution de collagènase avec une seringue de 5 mL et de l’aiguille 30 G. Assurez-vous que la voie biliaire principale et le pancréas sont gonflés après l’injection.
  4. Enlever le pancréas distendu à l’aide de la pince courbée et des ciseaux pour le séparer du côlon descendant, intestins, estomac et rate. Placer le pancréas dans un tube de 50 mL contenant 3 mL de solution de collagénase et le maintenir sur la glace.

4. la Digestion du pancréas

  1. Placez chaque tube de 50 mL dans un bain d’eau 37 ° C. Incuber pendant 15-20 min (temps varie selon la souche et l’âge des souris).
  2. Vibrer le tube à l’aide d’un vortex.
  3. Poule 4-5 pancréas digérées dans une passoire grand évier stérile et un scoop pour rendre le pancréas se désagrège complètement. Utiliser une seringue aiguille et 10 mL de 23 G contenant la solution de lavage pour pipeter avec force les cellules digérées hors de l’écran. Recueillir la solution de lavage dans un tube de 50 mL.
  4. Centrifuger les tubes à 97 x g à 4 ° C pendant 1 min et éliminer le surnageant.
  5. Ajouter 25 mL de solution de lavage dans les tubes et remettre en suspension le tissu doux vortexer. Tournez en bas les tissus à 97 x g à 4 ° C pendant 1 min et éliminer le surnageant. Répéter 3 fois. Veillez à ne pas déloger le même tissu.

5. purification des îlots

  1. Ajouter 10 mL de solution de purification à la pastille de tissu lavé et resuspendre doucement le contenu.
  2. 5 mL de solution d’isolation sur la solution de purification de superposition doucement. Veillez à conserver une interface liquide forte entre les deux solutions.
  3. Centrifuger le tube à 560 x g à 4 ° C pendant 15 min avec une accélération lente et sans frein. Insérer la pipette dans l’interface et recueillir la couche des îlots dans des nouveaux tubes de 50 mL.
  4. Laver les îlots comme indiqué au point 3.5.

6. électrodéposition et le traitement des cellules des îlots pancréatiques

  1. Remettre en suspension les îlots dans 10 mL de la solution nutritive îlots, doucement bien mélanger et placer 100 µL/puits avec une pipette multicanaux pour une plaque à 96 puits. Placer environ 5 îlots par 96 bien.
  2. Placer la plaque dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 12 h.
  3. Centrifuger (112 x g) la plaque 96 puits et enlever le milieu de culture.
  4. Diluer les produits chimiques environnementaux dans le milieu de culture des îlots. Ajouter 100 µL de chacune des diluants chimiques dans des puits séparés de la plaque. Remettre en suspension les îlots dans chaque puits et incuber pendant 12 h à 37 ° C (la concentration varie selon les différents produits chimiques environnementaux).

7. ROS souillure et la mesure

  1. Après le traitement d’îlots, laver avec du PBS 1 x (200 µL à chaque puits-96).
    Remarque : La concentration des substances chimiques est comme suit : AFB1 : 3 µM, Atrazine : 100µm, BaP : 10 µM, BPA : 100 µM, β-oestrogène, PCB126 : 10 µM, nonylphénol et BPA : 100 µM.
  2. Utiliser le N-acétyl cystéine (NAC) en tant qu’antioxydant pour étancher ROS. Ajouter 5 mM de la NAC dans les diluants chimiques induite par le ROS et incuber pendant 12 h à 37 ° C.
  3. Centrifuger la plaque 96 puits à x 112 g et incuber 5 solution µM de sonde fluorescente (H2-DHFC-DA dissous en milieu RPMI) à 37 ° C pendant 60 min.
  4. Laver les cellules des îlots pancréatiques traitée 3 fois avec du PBS et mesurer la fluorescence avec un lecteur de microplaques à 488 nm.
    Remarque : L’accumulation de DCF dans des cellules peut être mesurée par une augmentation de fluorescence à 530 nm quand l’échantillon est excitée à 488 nm.
  5. Effectuer l’insuline stimulée par le glucose sécrétion (GSIS) dosage9 sur ROS induisant des xénobiotiques traités îlots et îlots non traitées pour mesurer les xénobiotiques effets sur la fonction physiologique des îlots pancréatiques.

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Representative Results

Un balayage de l’îlot isolé sain est montré dans la Figure 2, dans lequel les îlots ont une forme ronde ou ovale avec grandeur relativement uniforme (bien que l’uniformité de la taille peut varier d’une souche à). Nous avons ensuite étudié les fonctions d’îlots pancréatiques lors d’un test in vitro en isolant l’îlot et en stimulant la sécrétion de l’insuline dans les îlots de culture. La figure 3 montre notre analyse typique du dosage GSIS des îlots d’isolé de souris C57BL/6 induite par le glucose à 3,3 et 16,7 mM9.

À l’aide de la méthode d’écran format plaque, nous avons identifié plusieurs xénobiotiques qui a provoqué une induction significative des ROS dans les cellules des îlots pancréatiques (Figure 4). Nous avons traités des îlots isolés avec différents produits chimiques pendant 12 h et trouvé que l’Atrazine, BPA, BaP et PCB126, et β-oestrogène provoquerait une induction significative des ROS dans les îlots isolés10,11,12 , 13.

Bien que le ROS ne correspond pas à l’induction diabétogène, il y a suffisamment de preuves indiquant l’importance du rôle des offices récepteurs en causant des dommages aux fonctions physiologiques des cellules β du pancréas, ce qui conduit à T2DM8. Par conséquent, la valeur du travail est d’identifier ces ROS induisant la substance chimique comme l’écran initial. En outre, les composés identifiés peuvent être davantage analysé in vitro dans le système de culture cellulaire des îlots pancréatiques isolé décrit dans le manuscrit. Nous avons montré les effets des xénobiotiques inductrices de ROS sur glucose stimulant la sécrétion d’insuline des îlots isolés, qui prévoient brièvement diabétogène données ces composés testés. Des îlots pancréatiques pré-traitées avec PCB126 et BPA a montré une diminution significative de la sécrétion d’insuline que le groupe de contrôle (Figure 5).

Figure 1
Figure 1 : Procédure de perfusion de pancréas de souris. La procédure se compose des étapes suivantes : (1) trouver l’ampoule et utiliser deux paires de pinces courbée afin de serrer l’ampoule. (2) insérer l’aiguille dans la bile commune. (3) lentement injecter 3 mL de stock solution collagénase dans la seringue de 5 mL. (4) recueillir le pancréas distendu à partir du duodénum.
 

Figure 2
Figure 2 : Isolé îlots souris. Les îlots pancréatiques isolés de souris au milieu de culture sont présentés. Echelle de 500 µm.

Figure 3
Figure 3 : La sécrétion d’insuline stimulée par le glucose des îlots pancréatiques isolés. La sécrétion d’insuline stimulée par le glucose de dose-dépendante (1, 3.3 et 16,7 mM, traités pendant 15 min) a été mesurée dans des îlots isolés (en moyenne 5 îlots / puits), à l’aide d’une insuline de souris ELISA kit. Barres d’erreur indiquent des écarts-types. p < 0,05.

Figure 4
Figure 4 : Induction de ROS par xénobiotiques dans les îlots isolés de souris C57BL/6. (A) des îlots isolés ont été traités pendant 12 h et teint avec des colorants de fluorescence 2', 7'-dichlorofluorescéine (DHFC-DA) pendant 1 h. La fluorescence a été déterminée par un lecteur de fluorescence. ROS (B) induite par les produits chimiques ont été piégés par CNA (5 mM). (AFB1 : 3 µM, Atrazine : 100µm, BaP : 10 µM, BPA : 100µm, PCB126 : 10 µM, nonylphénol, BPA : 100 µM et NAC : 5 mM). Barres d’erreur indiquent des écarts-types. p < 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Xénobiotiques effets sur la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose des îlots isolés. Les îlots isolés ont été pré-traitées avec PCB126, β-oestrogène et BPA (4 h) et conservés dans un milieu de culture îlot pendant 1 h. Le surnageant des îlots ont été recueilli pour la mesure de l’insuline par une insuline disponibles dans le commerce de la souris ELISA Test. Barres d’erreur indiquent des écarts-types. p < 0,05.

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Discussion

Accumulant les preuves suggère que l’exposition aux produits chimiques environnementaux joue un rôle important dans le développement de T2DM. Induite par le xénobiotiques ROS a été reconnue comme un facteur étiologique potentiel, contribuant au développement de T2DM. Les humains sont exposés à un large éventail de produits chimiques xénobiotiques et il y a un grand besoin de techniques de recherche novateurs pour identifier efficacement les substances toxiques du pancréas et d’étudier le mécanisme de toxicité spécifique aux cellules pancréatiques.

Dans cette étude, basée sur les procédures publiées14, nous avons développé un protocole pour isoler des îlots pancréatiques de souris et écran les cellules avec des produits chimiques xénobiotiques pour induite par le stress oxydatif dans les cellules du pancréas. Nous avons également utiliser cette procédure pour enquêter sur les réactions toxiques spécifiques pancréatiques induites par les composés xénobiotiques. Pour obtenir le pancréas de souris, nous préférons utiliser avertin sur autre anesthésie car il ne modifie pas le taux de glucose sanguin et n’affecte pas le système vasculaire du pancréas15,16,17. Nous avons trouvé que l’étape de centrifugation en gradient de densité est critique pour l’isolement de l’îlot avec haute pureté. Il faut obtenir la couche distincte entre la phase polysucrose/sodium et isolement de tampon pour obtenir un échantillon des îlots pure, dépourvu de débris et de cellules/tissus exocrines. La méthode peut être utilisée pour l’analyse in vitro des effets chimiques environnementaux sur la physiologie des îlots pancréatiques, tels que l’essai GSIS (tel qu’illustré à la Figure 3). Les îlots doivent être soigneusement dispersées avec répétées pipettant également, dans des cellules séparées pour assurer le nombre de cellules en uniforme dans la plaque de culture cellulaire-96. La méthode décrite ici combinés l’isolement de l’îlot et un test rapide pour la production de ROS et est donc un écran initial simple et efficace pour les potentiels chimiques nocifs du pancréas.

Nous avons utilisé la sécrétion d’insuline en réponse au défi de glucose pour confirmer l’identité des îlots pancréatiques isolés. La procédure est extrêmement adaptable pour l’analyse des changements dans les paramètres, y compris la sécrétion d’insuline (Figure 3) et génération de cAMP, en réponse aux xénobiotiques traitements18.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par une subvention de projet pilote du CREH Centre parrainé par NIEHS et par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 31572626).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10×Hank’s balanced salt solution  GIBCO 14185-052
Collagenase Type 4 Worthington Biochemical Corporation CLS-4
polysucrose/sodium diatrizoate solution  Sigma 10771
2’,7’-dichlorofluorescein (DCFH-DA) Sigma D6883-50MG
fluorescence microplate reader  Biotek
L-glutamine Sigma G8540-25G
streptomycin GIBCO 15140148
FBS GIBCO 26140079
RPMI 1640 GIBCO 11875-085
avertin Sigma T48402-25G
Rat/Mouse Insulin ELISA Kit Millipore EZRMI-13K
Centrifuge Sorval Sorval RT7 for 96-well plate centrifuge
Microplate reader Biotek Epoch 2 for fluorescence reading

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References

  1. Maruthur, N. M. The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival? Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).
  2. Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).
  3. Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus. Exp Diabetes Res. , 703538 (2012).
  4. Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants. Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).
  5. Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. Glucose toxicity in β-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection. Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).
  6. Kaneto, H., et al. Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction. Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).
  7. Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).
  8. Gao, D., et al. The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).
  9. Efendić, S., et al. Pancreastatin and islet hormone release. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).
  10. Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. Ah receptor and NF-κB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity. Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).
  11. Cui, H., et al. Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[α]-pyrene-induced DNA damage. Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).
  12. Li, L. A., Wang, P. W. PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells. Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).
  13. Asahi, J., et al. Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes. Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).
  14. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255 (2007).
  15. Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).
  16. Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).
  17. Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).
  18. Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).

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Chen, J., Zhong, L., Wu, J., Ke, S., More

Chen, J., Zhong, L., Wu, J., Ke, S., Morpurgo, B., Golovko, A., Ouyang, N., Sun, Y., Guo, S., Tian, Y. A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals. J. Vis. Exp. (136), e57327, doi:10.3791/57327 (2018).

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