Summary
ここで潜在的な糖尿病誘発異物化学物質を識別するために、化学物質によって ROS の帰納法をスクリーニングするためのマウスの膵島細胞を分離するためのプロトコルを提案する.
Abstract
人間や動物の特定の環境化学物質への暴露は、2 型糖尿病 (2 型糖尿病) の開発につながる膵臓 β 細胞の細胞損傷を引き起こす発見されています。化学的に誘導 β 細胞障害のメカニズムが明白でなく、複雑になる可能性があります、1 つの定期的な発見は、これらの化学物質への損傷を引き起こす過剰な活性酸素種 (ROS) の生成につながる酸化ストレスを誘発します。β 細胞。C57bl/6 マウスの膵島細胞および 96 ウェルの細胞培養プレートに培養膵島細胞は、潜在的な糖尿病誘発環境化学物質を識別するに分離されました。膵島細胞が化学物質を投与し、2', 7'-ジクロルフルオレッセン (DCFH-DA) 蛍光色素による活性酸素生成が検出されました。このメソッドを使用すると、我々 は [] ピレン (BaP) やポリ塩化ビフェニル (Pcb) そのビスフェノール A (BPA)、ベンゾを発見、彼らは潜在的膵島細胞の損傷を引き起こす可能性があります示唆 ROS の高レベルを引き起こすことができます。このメソッドは、糖尿病誘発物質をスクリーニングするために役立ちます。さらに、培養された膵島細胞膵臓細胞に毒性を化学的に誘導の in vitro解析の適応もあります。
Introduction
2 型糖尿病の有病率の増加は、近年公衆衛生1に深刻な脅威に地球規模の健康危機をなっています。多くの要因が見つかっている間、2 型糖尿病の開発にリンク作因的に定期的な示唆これらの要因の 1 つの一般的な収束点である過剰な活性酸素2の世代につながる酸化ストレス誘導,3。
Pcb、ダイオキシン、BaP など環境化学物質の広いスペクトルは、膵 β 細胞の機能を損なうし、インスリン抵抗性と 2 型糖尿病4につながる可能性のある酸化ストレスを誘導するために発見されています。活性酸素の生理学的なレベルでは、細胞機能に重要な役割を果たしている、抗酸化システムの容量を超える ROS への暴露細胞/組織に損傷の結果、5疾患に 。膵 β 細胞抗酸化酵素の低レベルを表現、従って酸化ストレスを介した損傷6、7のための敏感なターゲット。ストレスによる膵細胞機能不全5が発生する活性酸素の高レベルへの慢性露出が示されている8の肝臓や脂肪組織でのインスリン抵抗性と同様。
このプロジェクトの全体的な目標は、膵臓の細胞内活性酸素の誘導に基づく彼らの糖尿病誘発電位のスクリーン化学物質に細胞ベースのアッセイを開発することです。膵臓は、代謝解毒を欠いているし、異物による損傷6,7の重要なターゲットであります。したがって、膵臓細胞で生成された ROS を直接測定することにより、この試金は化学的に誘導膵損傷の直接近似を提供しなければなりません。このメソッドを開発するには、マウス膵ランゲルハンス島の分離、化学物質、細胞培養条件下で分離膵島を培養し、読み出しとして化学誘導活性酸素生成を利用します。この手順はシンプルで孤立した小島に ROS を誘発する化学物質を識別するに効果的膵臓体外に固有の毒性発現機構の解明にはさらに開発できます。
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Protocol
すべての動物実験は、すべての関連するガイドライン、規制、規制機関に準拠して実行されました。例示されているプロトコルは、指導と承認機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、テキサス A & M 研究所のゲノム医学の下で行った。
1. ソリューションの準備
- ダブル蒸留 H2O, 1 x 10 x ハンクのバランスの取れた塩溶液を希釈し、4 ° C で保存
- HEPES (10 mM)、MgCl2 (1 mM)、グルコース (5 mM) を追加して、分離ソリューションを準備します。PH 7.4 に調整して氷の上。
- コラゲナーゼ タイプ 4 からコラゲナーゼの解決を準備します。
注:具体的には、コラゲナーゼ タイプ 4 には、乾燥重量の mg 当たり 160 U が含まれています。1 グラム コラゲナーゼ タイプ 4 は 5 mL 二重蒸留 H2O 200 Mg/ml の濃度で希釈しました。30 mL の氷冷分離ソリューションに希薄のコラゲナーゼの 2 mL が追加され、コラゲナーゼ溶液 6 mL が各マウスの 50 mL チューブに転送されます。 - 1 mM CaCl2を分離ソリューションに追加することで洗浄液を準備します。
- 浄化液の冷たい polysucrose/ナトリウム diatrizoate (1.1119 g/mL、5 mL) を準備します。
- RPMI 培地への L-グルタミン (20 mM)、(100 U/mL) ペニシリン、ストレプトマイシン (100 μ g/mL)、ウシ胎児血清 (FBS) (10%) の追加によって膵島培養液 500 mL を準備します。
- 蒸留水 200 μ M で、-20 ° C で店で粉体を溶解することにより DCFH DA 原液を準備します。
注:染色液ロスたて、DCFH DA RPMI で 5 μ M の最終的な集中に原液を希釈することによって行われます。この試薬は、光から保護する必要があります。
2. 手術の準備
- 腹腔内注入 (i. p.) タヴェルタン (2.5% タヴェルタン、0.4 mL/20 g) 付きのマウス。マウス麻酔が完全に応答しなくなった後ハインドに足をつまみ、マウスを安楽死させるし、生物のフードに移動します。
- 腹部側を上に euthanized のマウスを置き、殺菌のための 70% のエタノールで皮膚をスプレーします。
- 腹部に 1 cm U 切開で腹腔内を開き、腹腔内を公開する胸の上の吻側方向に皮膚を撤回します。
3. 膵灌流と除去
- 図 1に示すように、乳頭部の場所を見つけます。オディ括約筋の位置の近くに十二指腸をクランプするのにカーブタイプ鉗子のペアを使用します。十二指腸に胆汁経路をブロックするのに十二指腸の壁をクランプするのにカーブタイプ鉗子の別のペアを使用します。
注:この手順では、乳頭が挿入されていません。この手順は、十二指腸で胆汁の経路をブロックするものです。 - 頭の近位と遠位研究者に関しての足を使って、マウスの位置を変更します。
- 総胆管を見つけるし、30 G 針、5 mL 注射器でゆっくりとコラゲナーゼ溶液 3 mL を注入します。総胆管と膵臓注入後膨張していることを確認します。
- 下降結腸、腸、胃と脾臓から分離するカーブタイプ鉗子と罰金のはさみを使用して膨張した膵臓を削除します。コラゲナーゼ溶液 3 mL を含む 50 mL チューブに膵臓を置く氷の上保管してください。
4. 膵消化
- 37 ° C の水浴に各 50 mL チューブを配置します。15-20 分間インキュベート (ひずみとマウスの年齢時間異なります)。
- 渦を使用して管を振動させます。
- 4-5 大型滅菌シンク ストレーナーの消化膵臓をプール、スクープを使用して、徹底的にバラバラ膵臓。強制的に画面オフ消化細胞をピペットに 23 G 針、10 mL シリンジを含む洗浄液を使用します。50 mL チューブの洗浄ソリューションを収集します。
- 4 ° c 1 分 97 x g でチューブを遠心し、上清をデカントします。
- チューブに洗浄溶液 25 mL を追加し、再穏やかなボルテックスによって組織を中断します。4 ° c 1 分 97 x g で組織をスピンし、上清をデカントします。3 回繰り返します。ペレットの組織が外れないように注意してください。
5. 島の精製
- 洗浄組織ペレットに浄化溶液 10 mL を追加し、軽く内容を再懸濁します。
- 優しく浄化ソリューションに分離溶液 5 mL をオーバーレイします。2 つのソリューション間の鋭い液体インターフェイスを保つように注意します。
- 低速の加速と 15 分のための 4 ° C で g x 560 でないブレーキ管を遠心します。インターフェイスにピペットを挿入し、新しい 50 mL チューブに小島層を収集します。
- 3.5 の手順で説明されているように島を洗います。
6. メッキと膵島細胞の治療
- 膵島培養液の 10 mL で小島を再懸濁します、ゆっくり、混ぜると、96 ウェル プレートにマルチ チャンネル ピペットを 100 μ L/ウェル。まあ 96 あたり約 5 小島を配置します。
- 12 h の組織文化のインキュベーターでプレートを配置します。
- 遠心分離機 (112 x g) の 96 ウェル プレート、培養培地を取り外します。
- 膵島培養液中の環境汚染物質を希釈します。プレートの別の井戸に化学の希釈剤のそれぞれの 100 μ L を追加します。各ウェル中の小島を再懸濁します、37 ° C (異なる環境化学物質の濃度変化) で 12 時間孵化させなさい。
7. ROS 染色と測定
- 1x PBS で洗浄小島治療後 (各 96 ウェルの 200 μ L)。
注:化学物質の濃度は以下の通りです: AFB1: 3 μ M、アトラジン: 100 μ M、BaP: 10 μ M、BPA: 100 μ M, PCB126 β エストロゲン: 10 μ M、ノニルフェノール、ビスフェノール A: 100 μ M。 - 活性酸素を抑制するのに抗酸化物質として N アセチルのシステイン (NAC) を使用します。ROS 誘起化学希釈剤に NAC の 5 mM を追加し、37 ° C で 12 時間インキュベート
- 112 x g で 96 ウェル プレートを遠心し、37 ° C, 60 分で蛍光プローブ (H2 DCFH DA RPMI メディアで解散) の 5 μ M 溶液で孵化させなさい。
- PBS で 3 回処理した膵島細胞を洗浄し、488 のマイクロ プレート リーダーで蛍光を測定 nm。
注:530 で蛍光性の増加によって測定されるセルの DCF の蓄積サンプルは 488 で興奮すると nm nm。 - 活性酸素を誘発する異物にグルコース刺激によるインスリン分泌 (GSIS) 試金9を実行膵島の生理機能上異物の影響を測定する未処理の島と島を扱われます。
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Representative Results
健全な分離膵島の顕微鏡写真に示す図 2小島が (ただし、サイズ均一性ひずみに異なります) サイズを比較的均一に円形または楕円形をしています。次に膵島を分離し、文化島のインスリン分泌を刺激することでの in vitroアッセイにおける膵島機能を調べた。3.3 〜 16.7 mM グルコース9による C57BL/6 マウス孤立島から情報科学研究科試金の典型的な分析を図 3に示します。
プレート形式画面メソッドを使用して、膵島細胞 (図 4) で ROS の重要な誘導を引き起こしたいくつかの化学物質を同定しました。Β エストロゲンが膵島を10、11,12に ROS の重要な誘導を原因と我々 は膵島を 12 h のさまざまな化学物質を扱い、その除草剤アトラジン、BPA、BaP、および PCB126, を発見,13。
活性酸素は糖尿病誘発誘導に等しいが、2 型糖尿病8につながる膵 β 細胞の生理的機能に被害で ROS の重要な役割を示す十分な証拠があります。したがって、作業の値は初期画面として化学を誘発するこれらの ROS を識別するためにです。さらに、同定された化合物は原稿で説明した分離膵島細胞培養系でさらに分析された体外にすることができます。我々 は簡単にこれらのテストの化合物の糖尿病誘発のデータを提供する膵島のインスリン分泌を血糖刺激に ROS を誘発する化学物質の影響を示しています。BPA と, PCB126 前処理膵インスリン分泌制御グループ (図 5) よりも有意に減少を示した。
図 1: マウス膵灌流のプロシージャです。手順は、次の手順で構成されます: (1)膨大部を検索し、膨大部をクランプするカーブタイプ鉗子の 2 つのペアを使用します。(2) 共通の胆管に針を刺してを挿入します。(3) ゆっくりとコラゲナーゼ ソリューション入荷 5 mL シリンジ 3 mL を注入します。(4) 十二指腸から膨張した膵臓を収集します。
図 2: マウスの膵島を分離します。マウス単離膵島培養培地が表示されます。500 μ m のスケール バー。
図 3: 単離膵島のグルコース刺激によるインスリン分泌します。用量依存性グルコース刺激によるインスリン分泌 (15 分の 1、3.3、および 16.7 mM 扱われます) 膵島 (平均ウェルあたり 5 小島)、マウス インシュリン elisa 法を使用して測定したキット。エラーバーは標準偏差をあらわします。p < 0.05。
図 4: C57bl/6 マウスから隔離された島で化学物質による活性酸素の誘導します。(A) 膵島が 12 h に扱われ、2', 7'-ジクロルフルオレッセン (DCFH-DA) 1 h の蛍光色素で染色します。蛍光は、蛍光プレート リーダーによって決定されました。(B) 化学的に誘導 ROS は NAC (5 mM) で急冷しました。(AFB1: 3 μ M、アトラジン: 100 μ M、BaP: 10 μ M、BPA: 100 μ M、, PCB126: 10 μ M、ノニルフェノール、ビスフェノール A: 100 μ M と NAC: 5 mM)。エラーバーは標準偏差をあらわします。p < 0.05。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 膵島のグルコース刺激によるインスリン分泌に及ぼす影響異物。膵島と, PCB126, β-エストロゲンと BPA (4 h) 前処理、膵島培養培地の 1 h で保管します。市販のマウス インシュリン ELISA によるインスリンの測定収集された小島の上清のアッセイ。エラーバーは標準偏差をあらわします。p < 0.05。
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Discussion
環境化学物質への曝露を示唆している証拠の蓄積 2 型糖尿病の開発の重要な役割を果たしています。化学物質による活性酸素は、2 型糖尿病の発展に貢献する潜在的な病因因子として認識されています。人間は、生体異物の化学薬品の広い範囲にさらされている、膵毒性物質を効果的に識別し、膵臓の細胞に固有の毒性のメカニズムを調査する新しい研究技術のための大きい必要があります。
パブリッシュされた手順14、に基づいて、本研究で我々 は膵細胞への酸化ストレス誘起損傷の生体異物の化学物質と細胞マウスと画面から膵島を分離するためのプロトコルを開発しました。我々 はまた異物化合物による膵の特定の毒性反応を調査するのにこの手順を使用します。マウスから膵臓を取得、血糖値は変わりませんし、膵臓15,16,17の血管には影響しませんので、他の麻酔上タヴェルタンを使うことが望ましい。密度勾配遠心分離のステップは純度の高い膵島の分離の重要なことがわかった。破片および膵外分泌細胞/組織に欠けている、純粋な島のサンプルを得るため polysucrose/ナトリウムおよび分離バッファー フェーズの間異なるレイヤーを取得するには、注意が必要です。メソッドは、(図 3に示すように)、体外GSIS アッセイなどの膵生理に及ぼす影響環境化学分析のため使用できます。小島は、96 の細胞培養プレートの制服を着た細胞数を確保するため別々 のセルに繰り返しピペッティングを慎重に分散する必要があります。説明する方法ここ小島および ros の急速な試金の分離を組み合わせた、したがって、潜在的な膵臓にダメージを与える化学物質のシンプルで効果的な初期画面。
単離膵島の身元を確認するのにグルコース チャレンジへの応答でインスリン分泌を使用しました。手順は異物治療18に対してインスリン分泌 (図 3) およびキャンプの世代を含むパラメーターの変化の分析の適応性の高いです。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、CREH センター主催 NIEHS、国家自然科学基金の中国 (第 31572626) からパイロット プロジェクトの助成金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×Hank’s balanced salt solution | GIBCO | 14185-052 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corporation | CLS-4 | |
| polysucrose/sodium diatrizoate solution | Sigma | 10771 | |
| 2’,7’-dichlorofluorescein (DCFH-DA) | Sigma | D6883-50MG | |
| fluorescence microplate reader | Biotek | ||
| L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| streptomycin | GIBCO | 15140148 | |
| FBS | GIBCO | 26140079 | |
| RPMI 1640 | GIBCO | 11875-085 | |
| avertin | Sigma | T48402-25G | |
| Rat/Mouse Insulin ELISA Kit | Millipore | EZRMI-13K | |
| Centrifuge | Sorval | Sorval RT7 | for 96-well plate centrifuge |
| Microplate reader | Biotek | Epoch 2 | for fluorescence reading |
References
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