Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att isolera mus bukspottkörtelns cellöar för screening av ROS induktioner av xenobiotika för att identifiera potentiella diabetogent xenobiotiska kemikalier.
Abstract
Exponering för vissa miljömässiga kemikalier i människa och djur har visat sig orsaka cellskada i pankreas β-celler som kommer att leda till utvecklingen av typ 2-diabetes mellitus (T2DM). Även om mekanismerna för de kemisk-inducerad β cellskador var oklart och kan vara komplexa, är ett återkommande fynd att dessa kemikalier inducera oxidativ stress leder till generation av överdriven reaktiva syreradikaler (ROS) som inducerar skador till β-cellen. För att identifiera potentiella diabetogent miljö kemikalier, isolerat vi bukspottkörtelns cellöar från C57BL/6 möss och odlade cellöar i 96 brunnar cell kultur plåtar. sedan cellöar doserades med kemikalier och den ROS generationen upptäcktes av 2', 7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA) fluorescerande färg. Med den här metoden, Vi hittade att bisfenol A (BPA), bens [a] pyren och polyklorerade bifenyler (PCB), kunde framkalla höga nivåer av ROS, vilket tyder på att de potentiellt kan orsaka skador i cellöar. Denna metod bör vara användbar för screening diabetogent xenobiotika. Dessutom, kan de odlade cellöar också anpassas för in vitro- analys av kemisk-inducerad toxicitet i bukspottkörtelns celler.
Introduction
Ökningar i förekomsten av T2DM har blivit en global hälsa kris under de senaste åren innebär ett allvarligt hot mot folkhälsan1. Många faktorer har konstaterats vara kausalt kopplat till utvecklingen av T2DM, bland vilka återkommande fynd tyder på att en gemensam konvergerande punkt för dessa faktorer är induktion av oxidativ stress som leder till generation av överdriven ROS2 , 3.
Ett brett spektrum av miljömässiga kemikalier inklusive PCB, dioxiner och BaP har konstaterats för att inducera oxidativ stress, vilket kan försämra funktionen av pankreas β-celler och leda till insulinresistens och T2DM4. Även om den fysiologiska nivån av ROS spelar en viktig roll i cellulära funktioner, exponering för ROS som överskrider kapaciteten hos antioxidant systemet resulterar i skador på cellerna eller vävnaderna och leder till sjukdomar5. Pankreas β-celler uttrycker en låg nivå av antioxidant enzym och således är måltavla känslig för oxidativ stress-medierad skada6,7. Kronisk exponering för höga nivåer av ROS har visat sig orsaka stressinducerade bukspottskörteln cell dysfunktion5 samt insulinresistens i levern och fettväv8.
Det övergripande målet med detta projekt är att utveckla en cellbaserade test för skärmen kemikalier för deras diabetogent potential baserat på deras induktion av ROS i bukspottkörtelns celler. Bukspottkörteln saknar metabola avgiftning och är en känslig mål för xenobiotiska-inducerad skada6,7. Denna analys bör därför, genom att direkt mäta ROS genereras i bukspottkörtelns celler, innehålla en direkt uppskattning av den kemiska-inducerad skadan i bukspottkörteln. För att utveckla denna metod, vi isolerade mus Langerhanska odlade den isolerade islet cell kultur villkor med kemikalier och utnyttjade den kemisk-inducerad ROS generationen som utslaget. Proceduren är enkel och effektiv att identifiera ROS-inducerande kemikalier i isolerade Holmen; Det kan vidareutvecklas för undersökning av toxicitet mekanismer som är specifika för bukspottkörteln in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök avrättades i enlighet med alla relevanta riktlinjer, bestämmelser och tillsynsmyndigheter. Protokollet som demonstreras utfördes under vägledning och godkännande av institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av Texas A & M Institutet för genomisk medicin.
1. lösningen förberedelse
- Späd 10 x Hanks balanserad saltlösning till 1 x med dubbel destillerat H2O, och förvaras vid 4 ° C.
- Bered den isolering genom att lägga till HEPES (10 mM), MgCl2 (1 mM) och glukos (5 mM). Justera pH till 7,4 och hålla på is.
- Bered den kollagenas från kollagenas typ 4.
Obs: I synnerhet innehåller kollagenas typ 4 160 U per mg torr vikt. 1 g av kollagenas typ 4 är utspätt i 5 mL dubbel destillerat H2O med en koncentration av 200 mg/mL. 2 mL av den utspädda kollagenas läggs till 30 mL is kallt isolering lösning och 6 mL kollagenas lösning överförs till en 50 mL tub för varje mus. - Förbered tvättlösningen genom att lägga till 1 mM CaCl2 isolering lösningen.
- Bered den rening med kall polysucrose, natrium diatrizoate lösning (1.1119 g/mL, 5 mL).
- Förbereda 500 mL holme odlingsmedium genom att lägga till L-glutamin (20 mM), penicillin (100 U/mL), streptomycin (100 µg/mL) och fetalt bovint serum (FBS) (10%) i RPMI medium.
- Förbereda DCFH-DA stamlösning av upplösning av pulvret i destillerat vatten vid 200 µM och förvaras vid-20 ° C.
Obs: ROS färgning lösning är nytillagade genom att späda ut DCFH-DA stamlösningen till 5 µM i RPMI slutliga koncentration. Denna reagens bör skyddas från ljus.
2. kirurgisk beredning
- Intraperitonealt injicera (I.P.) en mus med avertin (2,5% avertin, 0,4 mL/20 g). När musen är helt sövd och svarar inte längre att hind fot nypor, avliva musen och flyttar till biologiska huven.
- Placera euthanized musen med den buken uppåt och spraya huden med 70% etanol för sterilisering.
- Öppna bukhålan med en 1 cm U-snitt på övre delen av buken och dra in huden i rostralt riktning över bröstet för att exponera bukhålan.
3. bukspottkörteln Perfusion och borttagning
- Som illustreras i figur 1, hitta platsen för ampulla. Använd ett par böjda pincetten för att klämma tolvfingertarmen nära sphincter av Oddi ställning. Använd ett annat par böjd pincett för att klämma tolvfingertarmen väggen för att blockera den galla vägen i tolvfingertarmen.
Obs: Ampulla har inte satts i det här steget. Detta steg är tänkt att blockera den galla vägen i tolvfingertarmen. - Flytta musen med chefen proximala och distala när det gäller forskaren fötterna.
- Hitta gallgången och långsamt injicera 3 mL kollagenas lösning med 30 G nål och 5 mL spruta. Se till att den gemensamma gallgången och bukspottskörteln är uppblåst efter injektionen.
- Ta bort utspänd bukspottkörteln med hjälp av böjda pincetten och fin sax för att skilja det från den fallande kolon, tarmar, magsäck och mjälte. Placera bukspottkörteln i en 50 mL tub innehållande 3 mL kollagenas lösning och hålla det på is.
4. bukspottkörteln matsmältningen
- Placera varje 50 mL tub i 37 ° C vattenbad. Inkubera i 15-20 min (tiden varierar med belastningen och ålder av möss).
- Vibrera röret med en virvel.
- Pool 4-5 smält bukspottkörteln i en stor sterila diskbänk sil och använda en skopa för att göra bukspottkörteln falla sönder ordentligt. Använda en 23 G nål och 10 mL spruta innehåller tvättlösning att kraftfullt Pipettera smält cellerna utanför skärmen. Samla tvättlösningen i en 50 mL tub.
- Centrifugera rören på 97 x g vid 4 ° C i 1 min och Dekantera supernatanten.
- Tillsätt 25 mL tvättlösning till rören och slamma vävnaden av mild vortexa. Snurra ner vävnaderna på 97 x g vid 4 ° C i 1 min och Dekantera supernatanten. Upprepa 3 gånger. Var noga med att inte rubba pelleterat vävnaden.
5. rening av holmar
- Tillsätt 10 mL av rening lösning till tvättade vävnad pelleten och försiktigt Omsuspendera innehållet.
- Försiktigt overlay 5 mL isolering lösning på rening lösningen. Var noga med att hålla en skarp flytande gränssnitt mellan de två lösningarna.
- Centrifugera röret på 560 x g vid 4 ° C i 15 min med långsam acceleration och ingen broms. Sätt pipetten i interface och samla holmar lagret i nya 50 mL rör.
- Tvätta holmarna som beskrivs i steg 3.5.
6. plätering och behandling av cellöar
- Återsuspendera kobbar och skär i 10 mL holmar kultur lösning, försiktigt blanda väl och placera 100 µL per brunn med en flerkanalspipett till en plattan med 96 brunnar. Placera ca 5 holmar per 96 väl.
- Placera plattan i vävnadsodling inkubator för 12 h.
- Centrifugera (112 x g) plattan med 96 brunnar och ta bort odlingssubstratet.
- Späd miljö kemikalier i holmar odlingssubstratet. Tillsätt 100 µL av varje av de kemiska spädningsvätskor i separata brunnar i plattan. Omsuspendera kobbar och skär i varje brunn och inkubera i 12 timmar vid 37 ° C (koncentrationen varierar för de olika miljömässiga kemikalierna).
7. ROS färgning och mätning
- Efter holmar behandling, tvätta med 1 x PBS (200 µL för varje 96-brunn).
Obs: Koncentrationen av kemikalier är som följer: AFB1: 3 µM, atrazin: 100 µM, BaP: 10 µM, BPA: 100 µM, β-östrogen, PCB126: 10 µM, nonylfenol och BPA: 100 µM. - Använd N-Acetyl cystein (NAC) som en antioxidant för att släcka ROS. Lägg till 5 mM av NAC till de ROS-inducerad kemiska spädningsvätskor och inkubera i 12 timmar vid 37 ° C.
- Centrifugera plattan med 96 brunnar vid 112 x g och inkubera med 5 µM lösning av fluorescerande sonden (H2-DCFH-DA upplöst i RPMI media) vid 37 ° C i 60 min.
- Tvätta de behandlade cellöar 3 gånger med PBS och mäta fluorescensen med en microplate reader på 488 nm.
Obs: Ansamling av DCF i celler kan mätas genom en ökning i fluorescens på 530 nm när provet är glada på 488 nm. - Utföra glukos-stimulerad insulin utsöndringen (GSIS) test9 på ROS-inducerande xenobiotiska behandlade holmar och obehandlad kobbar att mäta xenobiotiska effekter på fysiologiska funktionen av Langerhanska.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En Mikrograf friska isolerade ön visas i figur 2, där holmar har en rund eller oval form med relativt enhetlig storlek (även om storlek enhetlighet kan variera från stam till stam). Vi undersökte nästa funktionerna bukspottskörteln holme i ett in vitro- test genom att isolera Holmen och stimulera insulinutsöndringen i kultur kobbar och skär. Figur 3 visar vår typiska analys GSIS analysens från C57BL/6 mus isolerade Langerhanska induceras av 3,3 mM och 16,7 mM glukos9.
Använder metoden platta format skärm har vi identifierat flera xenobiotika som orsakade betydande induktion av ROS i cellöar (figur 4). Vi behandlade de isolera öarna med olika kemikalier för 12 h och fann att atrazin, BPA, BaP och PCB126och β-östrogen kan orsaka betydande induktion av ROS i isolerade Langerhanska10,11,12 , 13.
Men ROS inte är lika med diabetogent induktion, finns det gott om belägg för den viktiga rollen som ROS i orsakar skador på fysiologiska funktioner av pankreas β-celler, vilket leder till T2DM8. Därför är värdet av arbetet att identifiera dessa ROS inducera kemiska som den första skärmen. Dessutom kan de föreningar som identifierats vara ytterligare analyseras i vitro i isolerade bukspottskörteln islet cell kultur systemet beskrivs i manuskriptet. Vi har visat effekter av ROS-inducerande xenobiotika på glukos-stimulerar insulinutsöndringen på de isolera öarna, som kortfattat ge diabetogent data för dessa testade föreningar. Langerhanska förbehandlade med PCB126 och BPA visade en signifikant minskning av insulininsöndring än kontrollgruppen (figur 5).
Figur 1 : Tillvägagångssättet av mus bukspottkörteln perfusion. Förfarandet består av följande steg: (1) hitta ampulla och använda två par böjd pincett för att klämma ampulla. (2) för in nålen genom gemensamma gallan. (3) långsamt injicera 3 mL kollagenas lösning lager i 5 mL spruta. (4) samla in utspänd bukspottkörteln start från tolvfingertarmen.
Figur 2 : Isolerade mus holmar. Isolerade mus Langerhanska i odlingsmedium visas. Skalstapeln 500 µm.
Figur 3 : Glukos-stimulerad insulinsekretion av isolerade Langerhanska. Dosberoende glukos-stimulerad insulinsekretion (1, 3.3 och 16,7 mM, behandlas i 15 min) mättes i isolerade holmar (genomsnitt 5 holmar per brunn), använda en mus insulin ELISA kit. Felstaplar visar standardavvikelser. p < 0,05.
Figur 4 : Induktion av ROS av xenobiotika i isolerade Langerhanska från C57BL/6 möss. (A) isolerade Langerhanska behandlades för 12 h och färgas med fluorescens färg 2', 7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA) för 1 h. Fluorescensen bestämdes av en Plattläsare med fluorescens. (B) den kemiska-inducerad ROS var släckas av NAC (5 mM). (AFB1: 3 µM, atrazin: 100 µM, BaP: 10 µM, BPA: 100 µM, PCB126: 10 µM, nonylfenol, BPA: 100 µM, och NAC: 5 mM). Felstaplar visar standardavvikelser. p < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Xenobiotiska effekter på glukos-stimulerad insulinsekretion av isolerade Langerhanska. Isolerade öar var förbehandlade med PCB126, β-östrogen och BPA (4 h) och förvaras i holme odlingsmedium för 1 h. Supernatanten av holmarna samlades för mätning av insulin av ett kommersiellt tillgängliga mus insulin ELISA test. Felstaplar visar standardavvikelser. p < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ackumulerande bevis tyder på att exponering för miljö kemikalier spelar en viktig roll i utvecklingen av T2DM. Xenobiotika-inducerad ROS har erkänts som en potentiell etiologisk faktor som bidrar till utvecklingen av T2DM. Människor utsätts för ett brett utbud av xenobiotiska kemikalier och det finns ett stort behov av ny forskningstekniker att effektivt identifiera de pankreas gifter och utreda mekanismen av toxicitet specifika för bukspottkörtelns celler.
I denna studie, utifrån publicerade förfaranden14, har vi utvecklat ett protokoll att isolera Langerhanska från mus och skärm cellerna med xenobiotiska kemikalier för oxidativ stress-inducerad skada på bukspottskörteln celler. Vi använder också detta förfarande för att undersöka pankreas specifika giftiga svar induceras av de xenobiotiska föreningarna. För att få bukspottkörteln från mus, föredrar vi att använda avertin över andra anestesi eftersom det förändrar inte glukos i blodet och påverkar inte vaskulatur av bukspottkörteln15,16,17. Vi hittade att det täthet lutning centrifugeringssteget är avgörande för isolering av Holmen med hög renhet. Vara bör försiktig att erhålla det distinkta lagret mellan fasen polysucrose, natrium och isolering buffert ren holmar provtagning, saknar skräp och exokrina cellerna eller vävnaderna. Metoden kan användas för in vitro- analys av kemiska miljöeffekter på bukspottskörteln holme fysiologi, såsom GSIS analysen (som visas i figur 3). Holmarna bör noggrant spridas med upprepad pipettering i separata celler att säkerställa uniformerade mobilnummer i 96-cell kultur plattan. Den metod som beskrivs ihop här isoleringen av Holmen och en snabb analys för ROS generation och därför är en enkel och effektiv inledande skärm för potentiella bukspottkörteln-skadliga kemikalier.
Vi använde insulinutsöndringen i svar glukos utmaningen för att bekräfta identiteten hos de isolerade Langerhanska. Förfarandet är mycket anpassningsbar för analys av förändringar i parametrar, inklusive insulinutsöndringen (figur 3) och cAMP generation, som svar på xenobiotiska behandlingar18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av ett pilotprojekt bidrag från CREH center sponsras av NIEHS och National Natural Science Foundation Kina (nr. 31572626).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×Hank’s balanced salt solution | GIBCO | 14185-052 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corporation | CLS-4 | |
| polysucrose/sodium diatrizoate solution | Sigma | 10771 | |
| 2’,7’-dichlorofluorescein (DCFH-DA) | Sigma | D6883-50MG | |
| fluorescence microplate reader | Biotek | ||
| L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| streptomycin | GIBCO | 15140148 | |
| FBS | GIBCO | 26140079 | |
| RPMI 1640 | GIBCO | 11875-085 | |
| avertin | Sigma | T48402-25G | |
| Rat/Mouse Insulin ELISA Kit | Millipore | EZRMI-13K | |
| Centrifuge | Sorval | Sorval RT7 | for 96-well plate centrifuge |
| Microplate reader | Biotek | Epoch 2 | for fluorescence reading |
References
- Maruthur, N. M. The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival? Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).
- Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).
- Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus. Exp Diabetes Res. , 703538 (2012).
- Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants. Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).
- Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. Glucose toxicity in β-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection. Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).
- Kaneto, H., et al. Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction. Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).
- Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).
- Gao, D., et al. The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).
- Efendić, S., et al. Pancreastatin and islet hormone release. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).
- Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. Ah receptor and NF-κB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity. Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).
- Cui, H., et al. Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[α]-pyrene-induced DNA damage. Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).
- Li, L. A., Wang, P. W. PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells. Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).
- Asahi, J., et al. Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes. Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255 (2007).
- Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).
- Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).
- Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).
