Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

آثار العوامل المشتقة من خلايا سرطان الجلد المزدوج على التمايز Adipocytes نخاع العظام

Published: August 23, 2018 doi: 10.3791/57329
Automatic Translation
1, 2, 1, 3
1Department of Rheumatology, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 2Department of Nephrology and Rheumatology, Yongchuan Hospital of Chongqing Medical University, 3Department of Medical Oncology, Fudan University Shanghai Cancer Center; Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University

Summary

وهنا، يقدم نظام موثوق بها ومباشرة كوكولتوري (2D) ثنائي الأبعاد لدراسة التفاعل بين الخلايا السرطانية ونخاع العظم adipocytes، الذي يكشف عن تأثير مزدوج للعوامل المشتقة من خلايا سرطان الجلد في adipocytes نخاع العظام التمايز ويطرح أيضا أسلوب كلاسيكي للدراسة الميكانيكية لورم خبيث العظام.

Abstract

الحديث المتبادل بين adipocytes نخاع العظام والخلايا السرطانية قد تلعب دوراً حاسما في عملية الانبثاث العظام. تتوفر مجموعة متنوعة من أساليب للدراسة الحديث المتبادل كبيرة؛ ومع ذلك، تظل نظام ثنائي الأبعاد ترانسويل كوكولتوري الكلاسيكية، وموثوق بها، وطريقة سهلة لهذه الدراسة الحديث المتبادل. نقدم هنا، هو بروتوكول مفصل يبين كوكولتوري adipocytes نخاع العظم وخلايا سرطان الجلد. ومع ذلك، نظام كوكولتوري يمكن أن تسهم في دراسة ترانسدوكشنز إشارة الخلية من الخلايا السرطانية الناجمة عن adipocytes نخاع العظام، بل أيضا إلى المستقبل آليا إلى دراسة لورم خبيث العظام التي قد تكشف الأهداف العلاجية الجديدة للعظام ورم خبيث.

Introduction

الانبثاث العظام منتشرة بين مرضى السرطان المتقدمة، ولكن علاج لا يزال غير متوفر. Adipocytes وراء متخصص في تخزين الطاقة الدهون ويمكن أن تدعم نمو الورم والانبثاث في نخاع العظام وسائر أجهزة1،2،3،4،،من56. وعلاوة على ذلك، adipocytes تلعب دوراً أساسيا في تنظيم سرطان خلية علم الأحياء7،،من89،10 والايض4،11،12 ،13،14،،من1516، كما جيدا كما هو الحال في العظام الانبثاث1،،من412. في مكانة نخاع العظام، adipocytes يمكن أن يؤثر أيضا على السلوك البيولوجي لسرطان خلايا4،،من617. التفاعل بين adipocytes نخاع العظام والخلايا السرطانية مع أوستيوتروبيسم مهم لفهم خبيث العظام. ومع ذلك، يعرف الكثير.

استناداً إلى الدراسات الحالية، يتم تطبيق الأساليب المختلفة adipocytes، بما في ذلك ثنائي أو ثلاثي الأبعاد (2/3D) و السابقين فيفو الثقافات17،،من1819،،من2021. في الآونة الأخيرة، هيرون et al. تصميم نهج 3D-ثقافة جديدة لدراسة التفاعلات بين adipocytes النخاع العظمى مع خلايا السرطان22. على الرغم من أن كوكولتوري 3D الأمثل لمحاكاة الفسيولوجية التفاعلات بين adipocytes وسرطان الخلايا في الجسم الحي، فإنه يعاني من ضعف إمكانية تكرار نتائج22،23. بالمقارنة مع نظام كوكولتوري 2D، قد توفر نظام كوكولتوري 3D تعمل الخلوية المختلفة، مثل خلية مورفولوجيا21،22،24،،من2526. علاوة على ذلك، يمكن أن يؤدي إلى نتيجة قوية ل adipocytes السابقين فيفو ثقافة الشظايا أنسجة العظام اسفنجي معزولة من خلايا نخاع العظام مثقف17.

خلافا لهذه النماذج السابقة، نموذج ثقافة الخلية 2D زال أسلوب الكلاسيكي وموثوق بها، وسهلة لمسح بسرعة جزيئات المرشح، وتعمل تغيير في adipocytes أو سرطان الخلايا في المختبر1، 4،،من612،15،27. لفهم أفضل الحديث المتبادل بين adipocytes نخاع العظم وخلايا سرطان الجلد، نحن نقدم بروتوكول مفصل لنظام كوكولتوري 2D adipocytes النخاع العظمى مع خلايا سرطان الجلد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: جميع الخلايا المستخدمة في هذا البروتوكول ينبغي نمت على الأقل ثلاثة أجيال بعد ذوبان الجليد من الخلايا الأرصدة المجمدة.

1-حصاد العوامل المشتقة من خلايا سرطان الجلد

  1. الأعمال التحضيرية
    1. الحصول على خلايا B16F10 وخط خلية سرطان الجلد ماوس.
      ملاحظة: لهذا البروتوكول، حصل خط خلية سرطان الجلد ماوس من بنك الخلايا الجذعية من الأكاديمية الصينية للعلوم.
    2. جعل وسيلة كاملة لثقافة الخلية B16F10 (100 مل). استخدام المتوسطة "تعديل النسر" دولبيكو (دميم) تستكمل مع 10% الجنيني البقري المصل (FBS)، 50 يو/مليلتر من البنسلين، و 50 ميكروغرام/مل من والستربتوميسين.
    3. جعل وسيلة خالية من المصل لتجويع الخلايا B16F10 (50 مل). استخدام المتوسط دون FBS و 50 يو/مليلتر من البنسلين 50 ميكروغرام/مل من ستربتوميسين دميم.
  2. إعداد مكيفة الميلانوما المتوسطة (سم)
    1. طبق البذور 2.0 × 105 B16F10 الخلايا في 100 ملم مع 10 مل من 10% FBS دميم. ثم احتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية في جو من 5% CO2 ح 24.
    2. عندما تصل الخلايا إلى حوالي 80 في المائة التقاء، إزالة المتوسطة الثقافة وتغسل الخلايا مرتين مع 5 مل من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS) (1 x، ودرجة الحموضة 7.4) واستبدالها المتوسطة مع 10 مل خالية من المصل متوسط للمجاعة.
    3. إعادة الخلايا إلى حاضنة ح 18 – 24.
    4. بعد التجويع، جمع المتوسطة مكيفة (سم) مع ماصة وتحويلها إلى أنبوب الطرد مركزي الطازج 50 مل.
      ملاحظة: هو المتوسط مكيفة المادة طافية الثقافات الخلية B16F10. تأكد من أن الخلايا B16F10 في حالة جيدة قبل جمع مجلس الوزراء.
    5. الطرد المركزي سم لمدة 5 دقائق في 1,000 س ز في 4 درجات مئوية.
    6. "الماصة؛" المادة طافية وتحويلها إلى أنبوب معقم الطازجة أو زجاجة.
      ملاحظة: تجنب بيبيتينج قبالة بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب.
    7. لإزالة الأنقاض الخلية، تصفية سم بتمريره من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر متصل بحقنه على رأس زجاجة معقمة أو أنبوب.
      ملاحظة: 0.22 ميكرون المرشحات الأمثل للتصفية سم.
    8. تخزين المادة طافية المصفاة في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: من الأفضل عدم تخزين المادة طافية في-20 درجة مئوية لمدة أكثر من شهر. وبدلاً من ذلك، تخزن سم في-80 درجة مئوية لفترات طويلة أكثر من مرة للتفريق بين adipocyte.

2-تحريض Adipocytes نخاع العظام بالعوامل المشتقة من خلايا سرطان الجلد

  1. الأعمال التحضيرية
    1. جعل 100 مل من أديبوجينيك التعريفي المتوسط28. استخدام دميم كاملة وتستكمل مع 5 ميكروغرام/مل من الأنسولين و 0.5 مم 3-إيسوبوتيل-1-زانتين 1 ميكرومتر الديكساميتازون. أن تخزين ما يصل إلى أسبوعين في 4 درجات مئوية.
    2. تحضير 100 مل من أديبوجينيك الصيانة المتوسطة. استخدام دميم كاملة أو مختلطة مع سرطان الجلد 50% سم وتستكمل مع 5 ميكروغرام/مل من الأنسولين.
    3. جعل حلاً مخزون "النفط الأحمر س". حل 30 ملغ مسحوق "س الأحمر النفط" في 10 مل الكحول (≥ 99.5 ٪) ومزجها جيدا بدوامة.
      ملاحظة: تخزين إلى 1 سنة في 4 درجات مئوية.
    4. جعل حلاً عامل "س الأحمر النفط". في غطاء الدخان، تمييع الحل مخزون "النفط الأحمر يا" (من الخطوة 2.1.3) مع المياه بنسبة 3:2. احتضان هذا الخليط لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتصفيته من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر قبل الاستخدام.
      ملاحظة: فقط استخدام الحل عمل جديدة ضمن ح 2.
  2. تمايز adipocyte
    1. خط الثقافة خلية stromal 14F1.1 من الماوس نخاع العظام29 في صحن 60 ملم مع دميم كاملة في كونفلوينسي 80% في حاضنة 37 درجة مئوية في جو من 5% CO2.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، استبدال 14F1.1 مع الخلايا الوسيطة الأولية المستمدة من نخاع العظام30.
    2. تريبسينيزي الخلايا مع 1.5 مل حل التربسين 0.25% في حاضنة لمدة 1 – 2 دقيقة.
    3. إضافة 5 مل من 10% FBS المتوسطة للخلايا وحساب الأرقام الخلية مع هيموسيتوميتير زجاج؛ ثم قم بضبط كثافة الخلية إلى حوالي 1 – 2 × 105/mL.
    4. البذور 5 × 104 خلايا 14F1.1 الواحدة وكذلك في لوحة 24-جيدا مع 0.5 مل من أديبوجينيك التعريفي المتوسطة. بعد يومين حضانة، تصل الخلايا إلى حوالي 90% التقاء.
      ملاحظة: هذه الخطوة حرجة للغاية. لا يمكن التي يسببها stromal خلايا نخاع العظام إلى adipocytes دون وسيط التعريفي أديبوجينيك.
    5. إزالة المتوسطة التعريفي وغسل الخلايا مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني في كل مرة.
    6. تغيير إلى 1 مل من أديبوجينيك الصيانة المتوسطة ولا تزال ثقافة الخلايا حتى نضوج adipocyte.
      ملاحظة: تحت مجهر، adipocytes تبدو وكأنها فقاعات الصابون كبيرة أو صغيرة وسهلة جداً للاعتراف. عادة, adipocytes ناضجة موجودة على 6th أو اليومال 8.
    7. وصمة عار adipocytes ناضجة مع "النفط الأحمر س" أو جمع adipocytes لتحليل كمية بوليميريز سلسلة من ردود فعل (قبكر).
  3. تلوين adipocyte
    1. أغسل 14F1.1 متمايزة خلايا x 2 مع برنامج تلفزيوني وإصلاحها في 3.7% فورمالدهايد ح 1.
    2. شطف الخلايا في الايزوبروبانول 60% والسماح لهم لتجف تماما.
    3. إضافة 0.2 مل الحل العامل "س الأحمر النفط" إلى الآبار واحتضان في درجة حرارة الغرفة ح 0.5 إلى 2.
    4. غسل الخلايا بالماء لإزالة الأصباغ غير منضم.
    5. صور adipocytes مصبوغ تحت مجهر خفيفة.

3-كوكولتوري Adipocytes النخاع العظمى مع خلايا سرطان الجلد

  1. الأعمال التحضيرية
    1. إعداد adipocytes نخاع العظم الناضجة: حمل الخلايا 14F1.1 في adipocytes BM ناضجاً في لوحات 24-جيدا مع المتوسط الاستقراء أديبوجينيك لمدة يومين ومن ثم الحفاظ عليها في الأجلين المتوسط وصيانة أديبوجينيك لمدة 6 – 8 يوما إضافيا.
    2. إعداد الخلايا B16F10: الثقافة الخلايا B16F10 في أطباق 60 ملم مع 5 مل متوسطة دميم.
    3. ترطيب إدراج غشاء (مثل ترانسويل): إضافة 150 ميليلتر من المتوسطة مجاناً FBS دميم لإدراج غشاء حجم المسام ميكرومتر 0.4 وتزج لهم عند الآبار 24-جيدا لوحات مليئة 500 ميليلتر من المتوسطة مجاناً FBS دميم.
  2. إعداد كوكولتوري
    1. ماصة ببطء قبالة المتوسط لكل إدراج.
      ملاحظة: لا تدمر الغشاء عند إزالة المتوسطة.
    2. إدراج بذور الخلايا B16F10 (0/103105106) في المسام ميكرومتر 0.4 من الخطوة 3.2.1.
    3. استبدال المتوسطة الصيانة أديبوجينيك في الآبار مع adipocytes نخاع العظم الناضجة من الخطوة 3.1.1. مع 600 ميليلتر الكامل دميم المتوسطة.
    4. نقل إدراج مليئة بالخلايا B16F10 (من الخطوة 3.2.2) عند الآبار مع adipocytes نخاع العظم الناضجة (من الخطوة 3.2.3) للتجارب كوكولتوري.
    5. احتضان كوكولتوريس في أول أكسيد الكربون 37 درجة مئوية و 5%2 لمدة يومين.
    6. بعد 48 ساعة حضانة، إزالة تدرج كوكولتوري ويغسل adipocytes 2 x مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x.
      ملاحظة: بشكل اختياري، جمع الخلايا B16F10 في إدراج لتحليل إذا لزم الأمر.
    7. وصمة عار adipocytes مع الحل العامل "س الأحمر النفط" أو جمع adipocytes لتحليل قبكر.
      ملاحظة: انظر الإجراء المصبوغة في الخطوة 2، 3.
    8. صور adipocytes مصبوغ تحت مجهر خفيفة.

4-تحليل التوقيع الجينات الخاصة Adipocyte qPCR

  1. إضافة 0.5 مل كاشف عزل الحمض النووي الريبي جاهزة للاستخدام كل بئر في صفيحة 24-جيدا في adipocyte الناضجة التي على استعداد للكشف.
  2. متابعة بروتوكول قياسي لاستخراج الحمض النووي الريبي و توليف كدنا31.
  3. استخدام الدليل التمهيدي ل 18S وجابده كعنصر التحكم، و CEBPα/β، PPARγ، FABP4، اللبتين، Pref-1، أو الاديبونكتين للتوقيع الجينات الخاصة adipocyte (الجدول 1).
  4. تشغيل الرد التالي في cycler حرارية: 95 درجة مئوية 20 ثانية، تليها دورات 40 من 95 درجة مئوية 1 s، و 60 درجة مئوية 20 s.
  5. استخدم الأسلوبΔΔCt –2 على حساب إضعاف التغييرات32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في نخاع العظام، يمكن أن تظهر adipocytes في ورم المكروية1،13،33،،من3435 في مرحلة مبكرة لدعم تطور الورم من خلال العوامل القابلة للذوبان أو تفعيل أوستيوكلاستوجينيسيس6،،من1236، لا سيما في سياق السمنة6،12 و/أو الشيخوخة37. لدينا الدراسات السابقة1 لاحظنا أن عدد adipocyte نخاع العظام تغييرات كبيرة خلال المرحلة المبكرة من الانبثاث سرطان الجلد للعظام1. وفي الواقع، تتراكم في منطقة الورم مبالغ adipocytes ودعم النمو للخلايا السرطانية في نخاع العظم عند الفئران التي تتغذى على حمية عالية الدهون6، مما يوحي بأن adipocytes نخاع العظام قد تلعب دوراً هاما في العظام المنتشر نخاع مكانة37. بيد أن الحديث المتبادل دينامية للخلايا السرطانية ونخاع العظم adipocyte لا يزال غير واضح. ولذلك، نحن كانت مخصصة للتصدي لهذه المشكلة عن طريق نظام 2D كوكولتوري خلايا نخاع العظم adipocyte وسرطان الجلد.

تعزيز العوامل المشتقة من ورم التفريق بين adipocytes نخاع العظام:
الشكل 1 يمثل سير عمل نموذجي لحمل adipocytes نخاع العظام مع مكيفة ورم المتوسطة (الطب الصيني التقليدي). تجربة ممثل يشير إلى خلايا 14F1.1، مطلي كخلايا مفردة في كثافة من 5 × 104 خلايا كل بئر حضور وسيلة تعريفية أديبوجينيك في أول يومين، وثم الاحتفاظ داخل المتوسطة صيانة أديبوجينيك (مع أو دون الطب الصيني التقليدي) 6 – 8 أيام. Adipocyte الناضجة تحتوي على قطيرات الدهن؛ ولذلك، adipocytes متمايزة يمكن بسهولة حددها "النفط الأحمر يا" تلطيخ (الشكل 1ب) والكمية التي قبكر مع توقيع جينات الخاصة adipocyte (الشكل 1ج).

التحميل الزائد لخلايا سرطان الجلد يدفع دي التمايز في adipocytes نخاع العظام:
يمكن تعديل الخلايا السرطانية بالبيئة البقاء على قيد الحياة، لا سيما في ظل ظروف التاكسج1،،من46. لمحاكاة تأثير عبء ورم ثانوي على adipocyte نخاع العظام، أجرينا في منظومة كوكولتوري 2D مع زيادة المستمرة في عدد خلايا سرطان الجلد في يدخل العلوي (الشكل 2). ويبين الشكل 2 أن تخزين الدهون في adipocytes يحرم بدرجة أكبر في أعلى كثافة من خلايا سرطان الجلد (6 10 خلايا/جيد) مقارنة مع الحرمان في تواتر أقل من خلايا سرطان الجلد (103 خلايا/ كذلك). الشكل 2 ج يعرض التنميط الجيني لهذه adipocytes في adipocytes في كوكولتوري. مقارنة مع كوكولتوري بكثافة أقل من خلايا سرطان الجلد، زيادة مستوى محافظة-1 من الواضح، وانخفض التعبير عن اللبتين، الاديبونكتين، FABP4، CEBPβ، و PPARγ، مما يوحي بأن تأثير عبء الورم الثانوي يمكن أن يعزى إلى عملية إزالة التمايز في adipocytes. وإلى جانب ذلك، يمكن أن تحفز زائد من الخلايا السرطانية نخر في adipocytes38.

في ملخص، لاحظنا تأثير يحركها خلية سرطان الجلد معاكس على adipocytes نخاع العظام بعوامل قابلة للذوبان. أثر عكسي على adipocytes نخاع العظم من الفوائد المرتفعة، مما يوحي بأن نخاع العظم adipocytes دينامية المنظمين خلية الورم السرطاني بنخاع العظام.

Figure 1
الشكل 1 : تعزيز العوامل المشتقة من ورم تمايز adipocyte. () هذا الفريق يوضح طريقة عرض تخطيطي لإعداد تجريبية فيها خطوط الخلايا 14F1.1 الأغراض ومتوسطة مكيفة المستمدة من سرطان الجلد. (ب) يظهر هذا الفريق تصوير adipocyte نخاع العظم متمايزة. (ج) يظهر هذا الفريق تحليل التوقيع الجينات الخاصة adipocyte حسب qPCR. الطب الصيني التقليدي = مكيفة ورم المتوسطة. قبكر: كمية تفاعل البوليميراز المتسلسل. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من وانغ et al. 1- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Figure 2
الشكل 2 : آثار عبء الورم adipocyte. () يظهر هذا الفريق وجهة تخطيطي للإعداد التجريبية: كوكولتوري 14F1.1 خطوط الخلايا وخلايا سرطان الجلد. (ب) يظهر هذا الفريق تصوير adipocyte نخاع العظام في النظام كوكولتوري. (ج) يظهر هذا الفريق الجينات التنميط في adipocytes التي قبكر. قبكر: كمية تفاعل البوليميراز المتسلسل. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من وانغ et al. 1- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

كبسولة تفجير
اسم الجين إلى الأمام تسلسل (5 'إلى 3') عكس تسلسل (5 'إلى 3')
PPARΓ كتجاتجكاكتجككتاتجاجك ججتكاجكتكتجتجاتج
CEBPΑ AAG AGC كجك GAC AAG GC GTC AGC TCC AGC لجنة التنسيق الإدارية وافق به تيراغرام
CEBPΒ كاككتجاجاكجكاجكاكاج جكتتجاكاجتككجكاغغت
FABP4 تجااتكاككجكاجاكجاكاج جكتجتكاككاتكتكجتتتكتك
اللبتين المنسوجات والملابس TGA AGC AAG التقييم القطري المشترك TCA GC التقييم القطري المشترك غيغاطن لجنة التنسيق الإدارية أغا GGT الجهاز المركزي للمحاسبات GC
محافظة-1 جاكاكتكجاجكتكاككتج جاجكتججاكججاات
الاديبونكتين فريق التنسيق العالمي آتا آتا القط AGC السواقين عقاري T السواقين الائتلاف اتفاق المنسوجات والملابس التقييم القطري المشترك GGA ج القط

الجدول 1: جدول للإشعال المستخدمة ل qPCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

كوكولتوريس مع إدراج قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة التفاعلات خلية بخلية. 2D كوكولتوري النظام وسيلة فعالة لمراقبة كيف اثنين أجزاء الحديث المتبادل في المختبر، الذي نحن هنا أظهرت آثار يحركها خلية سرطان مختلفة اثنين على adipocytes نخاع العظام. وقد استخدمت العديد من مختبرات هذا الأسلوب للتحقيق الحديث المتبادل بين adipocytes وسرطان خلايا6،12،،من2739.

وبصفة عامة، ولذلك، كوكولتوري 2D هو أفضل نهج واضحة لدراسة الحديث المتبادل خلية إلى خلية. ومع ذلك، عندما يتعلق الأمر بإعداد خط خلايا غير متمايزة لإجراء مزيد من البحوث، هناك بعض التحديات الفريدة. في البروتوكول هو موضح هنا، الحالة الصحية والوظيفية للخلية stromal نخاع العظام حرج للغاية للتفريق بين adipocytes. ويمكن تعديل البروتوكول لاستبدال الخلايا 14F1.1 بالخلايا الجذعية الوسيطة نخاع العظام الأولية. وعلاوة على ذلك، الحضانة قبل الخلايا 14F1.1 في المتوسط أديبوجينيك التعريفي لعدة أيام خطوة حاسمة أخرى. دون هذا ما قبل الحضانة، ستفشل الخلايا اللحمية في النخاع للتفريق في adipocytes، التي تم الكشف عن في أعمالنا والآخرين الدراسات40. هذه الظواهر يفسر أيضا لماذا قد ينتج مختلفة أو حتى عكس آثار بعض بروتوكولات مماثلة وتسليط الضوء على أهمية هذا البروتوكول سهلة وقابلة للتكرار، ومفصلة لدراسة الحديث المتبادل adipocytes نخاع العظام والخلايا السرطانية.

على الرغم من أن كوكولتوري 2D قد تفقد بعض المعلومات الهامة بالمقارنة مع الثقافات 3D أو السابقين فيفو ، يبقى من السهل تكون موحدة، ورصد، والتلاعب في نهاية المطاف لمواصلة استخدام20،،من2141. قد تقرر تطبيق التقنية مستقبل كيف أوستيوبلاست التغييرات عند فإنه يتم كوكولتوريد مع الخلايا السرطانية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بإعلان.

Acknowledgments

نشكر دوف زيبوري (معهد وايزمان للعلوم، رحوفوت، إسرائيل) يرجى تزويدنا الخلية stromal مورين نخاع العظام خط 14F1.1. كان يؤيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من المؤسسة الوطنية الصينية للعلوم الطبيعية (رقم 81771729) وجامعة Yongchuan المستشفى من تشونغتشينغ الطبية (غ. YJQN201330؛ YJZQN201527).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen Inc. 11965092
Fetal Bovine Serum Invitrogen Inc. 16000–044
Phosphate Buffered Saline Invitrogen Inc. 14190-144
Insulin Sigma-Aldrich 91077C
3-isobutyl-1-methyl-xanthine Sigma-Aldrich I5879
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
Oil Red o Sigma-Aldrich O0625
24-well plate Corning CLS3527
Transwell insert Millipore MCHT24H48
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
isopropanol Sigma-Aldrich I9516
0.25% trypsin Thermo Scientific 25200056
hemocytometer Bio-Rad 1450016
Culture incubator Thermo Scientific
50 mL falcon Corning CLS430828
Clean Bench Thermo Scientific -
Microscopy Olympus -
200 μL pipet tips BeyoGold FTIP620
1,000 mL pipet tips BeyoGold FTIP628

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, J., et al. Adipogenic niches for melanoma cell colonization and growth in bone marrow. Laboratory Investigation. 97 (6), 737-745 (2017).
  2. Trotter, T. N., et al. Adipocyte-Lineage Cells Support Growth and Dissemination of Multiple Myeloma in Bone. The American Journal of Pathology. 186 (11), 3054-3063 (2016).
  3. Morris, E. V., Edwards, C. M. The role of bone marrow adipocytes in bone metastasis. Journal of Bone Oncology. 5 (3), 121-123 (2016).
  4. Diedrich, J. D., et al. Bone marrow adipocytes promote the Warburg phenotype in metastatic prostate tumors via HIF-1alpha activation. Oncotarget. 7 (40), 64854-64877 (2016).
  5. Chkourko Gusky, H., Diedrich, J., MacDougald, O. A., Podgorski, I. Omentum and bone marrow: how adipocyte-rich organs create tumour microenvironments conducive for metastatic progression. Obesity Reviews. 17 (11), 1015-1029 (2016).
  6. Chen, G. L., et al. High fat diet increases melanoma cell growth in the bone marrow by inducing osteopontin and interleukin 6. Oncotarget. 7 (18), 26653-26669 (2016).
  7. Balaban, S., et al. Adipocyte lipolysis links obesity to breast cancer growth: adipocyte-derived fatty acids drive breast cancer cell proliferation and migration. Cancer & Metabolism. 5, 1 (2017).
  8. Huang, C. K., et al. Adipocytes promote malignant growth of breast tumours with monocarboxylate transporter 2 expression via beta-hydroxybutyrate. Nature Communications. 8, 14706 (2017).
  9. Wang, Y. Y., et al. Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells. JCI Insight. 2 (4), 87489 (2017).
  10. Wang, C., Gao, C., Meng, K., Qiao, H., Wang, Y. Human adipocytes stimulate invasion of breast cancer MCF-7 cells by secreting IGFBP-2. PLoS One. 10 (3), 0119348 (2015).
  11. Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).
  12. Herroon, M. K., et al. Bone marrow adipocytes promote tumor growth in bone via FABP4-dependent mechanisms. Oncotarget. 4 (11), 2108-2123 (2013).
  13. Tabe, Y., et al. Bone Marrow Adipocytes Facilitate Fatty Acid Oxidation Activating AMPK and a Transcriptional Network Supporting Survival of Acute Monocytic Leukemia Cells. Cancer Research. 77 (6), 1453-1464 (2017).
  14. Wen, Y. A., et al. Adipocytes activate mitochondrial fatty acid oxidation and autophagy to promote tumor growth in colon cancer. Cell Death & Differentiation. 8 (2), 2593 (2017).
  15. Liu, Z., et al. Mature adipocytes in bone marrow protect myeloma cells against chemotherapy through autophagy activation. Oncotarget. 6 (33), 34329-34341 (2015).
  16. Ye, H., et al. Leukemic Stem Cells Evade Chemotherapy by Metabolic Adaptation to an Adipose Tissue Niche. Cell Stem Cell. 19 (1), 23-37 (2016).
  17. Templeton, Z. S., et al. Breast Cancer Cell Colonization of the Human Bone Marrow Adipose Tissue Niche. Neoplasia. 17 (12), 849-861 (2015).
  18. Daquinag, A. C., Souza, G. R., Kolonin, M. G. Adipose tissue engineering in three-dimensional levitation tissue culture system based on magnetic nanoparticles. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (5), 336-344 (2013).
  19. Emont, M. P., et al. Using a 3D Culture System to Differentiate Visceral Adipocytes In Vitro. Endocrinology. 156 (12), 4761-4768 (2015).
  20. Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
  21. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  22. Herroon, M. K., Diedrich, J. D., Podgorski, I. New 3D-Culture Approaches to Study Interactions of Bone Marrow Adipocytes with Metastatic Prostate Cancer Cells. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 7, 84 (2016).
  23. Lee, J. M., et al. A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro. Laboratory Investigation. 93 (5), 528-542 (2013).
  24. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  25. Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene expression perturbation in vitro--a growing case for three-dimensional (3D) culture systems. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).
  26. Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
  27. Dirat, B., et al. Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion. Cancer Research. 71 (7), 2455-2465 (2011).
  28. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  29. Zipori, D., Toledo, J., von der Mark, K. Phenotypic heterogeneity among stromal cell lines from mouse bone marrow disclosed in their extracellular matrix composition and interactions with normal and leukemic cells. Blood. 66 (2), 447-455 (1985).
  30. Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice. Journal of Visualized Experiments. (131), e56750 (2018).
  31. Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR. Journal of Visualized Experiments. (132), e56850 (2018).
  32. Bozec, A., Hannemann, N. Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis. Journal of Visualized Experiments. (112), e53822 (2016).
  33. Shafat, M. S., et al. Leukemic blasts program bone marrow adipocytes to generate a protumoral microenvironment. Blood. 129 (10), 1320-1332 (2017).
  34. Gazi, E., et al. Direct evidence of lipid translocation between adipocytes and prostate cancer cells with imaging FTIR microspectroscopy. The Journal of Lipid Research. 48 (8), 1846-1856 (2007).
  35. Brown, M. D., et al. Influence of omega-6 PUFA arachidonic acid and bone marrow adipocytes on metastatic spread from prostate cancer. British Journal of Cancer. 102 (2), 403-413 (2010).
  36. Hardaway, A. L., Herroon, M. K., Rajagurubandara, E., Podgorski, I. Marrow adipocyte-derived CXCL1 and CXCL2 contribute to osteolysis in metastatic prostate cancer. Clinical & Experimental Metastasis. 32 (4), 353-368 (2015).
  37. Aebi, M. Spinal metastasis in the elderly. European Spine Journal. 12, Suppl 2 202-213 (2003).
  38. Wagner, M., Bjerkvig, R., Wiig, H., Dudley, A. C. Loss of adipocyte specification and necrosis augment tumor-associated inflammation. Adipocyte. 2 (3), 176-183 (2013).
  39. Bochet, L., et al. Cancer-associated adipocytes promotes breast tumor radioresistance. Biochemical and Biophysical Research Communications. 411 (1), 102-106 (2011).
  40. Hirano, T., et al. Enhancement of adipogenesis induction by conditioned media obtained from cancer cells. Cancer Letters. 268 (2), 286-294 (2008).
  41. Gordeev, A. A., Chetverina, H. V., Chetverin, A. B. Planar arrangement of eukaryotic cells in merged hydrogels combines the advantages of 3-D and 2-D cultures. Biotechniques. 52 (5), 325-331 (2012).

Tags

أبحاث السرطان، 138 قضية، adipocyte نخاع العظام، ورم خبيث العظام، وسرطان الجلد، كوكولتوري، التمايز، إدراج غشاء
آثار العوامل المشتقة من خلايا سرطان الجلد المزدوج على التمايز Adipocytes نخاع العظام
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, J., Wen, J., Chen, X. X.,… More

Wang, J., Wen, J., Chen, X. X., Chen, G. L. Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation. J. Vis. Exp. (138), e57329, doi:10.3791/57329 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter