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Cancer Research

Double effet de facteurs dérivés de cellules de mélanome sur la différenciation des Adipocytes médullaires

Published: August 23, 2018 doi: 10.3791/57329

Summary

Nous présentons ici un système fiable et simple à deux dimensions co-culture (2D) pour étudier l’interaction entre les cellules tumorales et les adipocytes de la moelle osseuse, qui révèle un double effet de facteurs dérivés des cellules de mélanome sur les adipocytes de la moelle osseuse différenciation et constitue également une méthode classique pour l’étude mécanistique de métastase osseuse.

Abstract

La diaphonie entre les adipocytes de la moelle osseuse et les cellules tumorales peut-être jouer un rôle crucial dans le processus de métastase osseuse. Diverses méthodes sont disponibles pour l’étude de la diaphonie significative ; Toutefois, un système bidimensionnel transwell coculture reste un classique, fiable et un moyen facile pour cette étude de diaphonie. Nous présentons ici un protocole détaillé qui montre la coculture des adipocytes de la moelle osseuse et de cellules de mélanome. Néanmoins, un tel système de co-culture pourrait non seulement contribuer à l’étude de transductions signal cellulaire des cellules cancéreuses induites par les adipocytes de la moelle osseuse, mais aussi à l’avenir mécaniste étude de métastase osseuse qui peut révéler de nouvelles cibles thérapeutiques pour OS métastase.

Introduction

Les métastases osseuses sont très répandus chez les patients atteints de cancer avancé, mais un traitement curatif n’est pas encore disponible. Au-delà se spécialisant dans le stockage de l’énergie sous forme de graisse, les adipocytes peuvent prendre en charge la croissance tumorale et les métastases dans la moelle osseuse et les autres organes1,2,3,4,5,6. En outre, les adipocytes jouent un rôle essentiel dans la régulation du cancer cell biology7,8,9,10 et métabolisme4,11,12 ,13,14,15,16, tel qu’il est bien comme dans OS métastase1,4,12. Dans le créneau de la moelle osseuse, les adipocytes peuvent aussi affecter le comportement biologique du cancer cellules4,6,17. L’interaction entre les adipocytes de la moelle osseuse et les cellules cancéreuses avec osteotropism est importante pour la compréhension des métastases osseuses. Cependant, on connaît peu.

Se fondant sur les études actuelles, différentes méthodes sont appliquées aux adipocytes, y compris deux ou trois dimensions (2/3D) et ex vivo cultures17,18,19,20,21. Récemment, Herroon et coll. conçu une nouvelle approche de la 3D-culture pour étudier les interactions entre les adipocytes de la moelle osseuse et de cellules de cancer22. Bien que la co-culture 3D est optimale pour imiter physiologique des interactions entre les adipocytes et le cancer cells in vivo, il souffre d’une mauvaise reproductibilité22,23. Par rapport à un système de co-culture 2D, un système de co-culture 3D peut fournir différents phénotypes cellulaires, comme la cellule morphologie21,22,24,25,26. Par ailleurs, la culture ex vivo des fragments de tissus isolés d’os spongieux peut entraîner une excroissance robuste des adipocytes cultivées la moelle osseuse des cellules17.

Contrairement à ces prédécesseurs, cependant, le modèle de culture cellulaire 2D reste une technique classique, fiable et facile pour numérisation rapidement des molécules de candidat et les phénotypes changés en adipocytes ou cancer des cellules in vitro1, 4,6,12,15,27. Pour mieux comprendre la diaphonie entre les adipocytes de la moelle osseuse et des cellules du mélanome, nous fournissons un protocole détaillé pour un système de co-culture 2D des adipocytes de la moelle osseuse avec des cellules de mélanome.

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Protocol

Remarque : Toutes les cellules utilisées dans le présent protocole devraient être cultivés depuis au moins trois générations après décongélation de cellules congelées de stock.

1. récolter les facteurs dérivés de cellules de mélanome

  1. Préparations
    1. Obtenir les cellules B16F10 et une lignée de cellules de mélanome de souris.
      Remarque : Pour ce protocole, une lignée de cellules de mélanome de souris a été obtenue auprès de la Banque de cellules souches de l’Académie chinoise des Sciences.
    2. Faire un support complet pour la culture de cellules de B16F10 (100 mL). Utilisez le support de l’aigle de la modification de Dulbecco (DMEM) additionné de 10 % bovine sérum fœtal (SVF), 50 U/mL de pénicilline et 50 µg/mL de streptomycine.
    3. Faire un milieu sans sérum pour la famine des cellules B16F10 (50 mL). Utilisez DMEM moyen sans FBS, 50 U/mL de pénicilline et 50 µg/mL de streptomycine.
  2. Préparer le milieu conditionné par mélanome (CM)
    1. Cellules de5 B16F10 de semences 2,0 x 10 dans un 100 mm plat avec 10 mL de 10 % DMEM FBS. Puis incuber les cellules dans un incubateur à 37 ° C dans une atmosphère de 5 % de CO2 pendant 24 h.
    2. Lorsque les cellules atteignent environ 80 % de confluence, enlevez le milieu de culture, laver les cellules deux fois avec 5 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (1 x, pH 7,4) et remplacer le support avec un 10 mL sans sérum moyen pour la famine.
    3. Remettez les cellules dans l’incubateur pendant 18 à 24 h.
    4. Après la famine, recueillir le milieu conditionné (CM) avec une pipette et transférez-le dans un tube à centrifuger frais 50 mL.
      Remarque : Le milieu conditionné est le surnageant de cultures de cellules de la B16F10. Assurez-vous que les cellules B16F10 sont en bon état avant de prélever la CM.
    5. Centrifuger le CM pendant 5 min à 1 000 x g à 4 ° C.
    6. Pipeter le surnageant et transférer dans un nouveau tube stérile ou une bouteille.
      NOTE : Évitez de pipetage au large de la pastille au fond du tube.
    7. Pour supprimer les débris cellulaires, filtrer la CM en le faisant passer à travers un filtre de 0,45 µm relié à la seringue sur le dessus une bouteille stérile ou un tube.
      NOTE : 0,22 µm filtres sont optimales pour le filtrage de la CM.
    8. Conserver le surnageant filtré à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.
      Remarque : Il est préférable de ne pas conserver le surnageant à-20 ° C pendant plus d’un mois. Vous pouvez également stocker les CM à-80 ° C pour plus longues périodes de temps pour la différenciation des adipocytes.

2. induction des Adipocytes de la moelle osseuse par facteurs dérivés de cellules de mélanome

  1. Préparations
    1. Faire 100 mL d’adipocytaire induction moyenne28. Utilisez un DMEM complet additionné de 5 µg/mL d’insuline, 0,5 mM 3-isobutyl-1-méthylxanthine et 1 µM de dexaméthasone. Il stocker jusqu'à deux semaines à 4 ° C.
    2. Préparation de 100 mL de milieu d’entretien adipocytaire. Utiliser un DMEM complet ou en mélange avec 50 % de mélanome CM additionné de 5 µg/mL d’insuline.
    3. Faire une solution d’huile rouge O. Dissoudre 30 mg de poudre de Oil Red O dans 10 mL d’isopropanol (≥ 99,5 %) et mélangez-les bien par vortex.
      Remarque : Il stocker jusqu'à 1 an à 4 ° C.
    4. Faire une solution de travail Oil Red O. Sous la hotte, diluer la solution mère d’huile rouge O (de l’étape 2.1.3) avec de l’eau déionisée dans un ratio de 3:2. Incuber le mélange à température ambiante pendant 15 minutes et filtrer à travers un filtre de 0,22 µm avant utilisation.
      Remarque : Utilisez uniquement la solution de travail frais moins de 2 h.
  2. Différenciation adipocytaire
    1. Culture un stromal cell line 14F1.1 de la moelle osseuse de souris29 dans un plat de 60 mm avec un DMEM complet à la confluence de 80 % dans un incubateur à 37 ° C dans une atmosphère de 5 % de CO2.
      NOTE : Sinon, remplacez 14F1.1 primaires dérivés de la moelle osseuse des cellules mésenchymateuses30.
    2. Trypsinize les cellules avec 1,5 mL d’une solution de trypsine de 0,25 % dans un incubateur pendant 1 à 2 min.
    3. Ajouter 5 mL de milieu FBS de 10 % pour les cellules et compter le nombre de cellules avec un hémocytomètre verre ; puis régler la densité de cellules à environ 1 à 2 x 105/ml.
    4. Graines de 5 x 104 de 14F1.1 cellules / puits dans une plaque 24 puits avec 0,5 mL de milieu d’induction adipocytaire. Après deux jours d’incubation, les cellules atteignent environ 90 % de confluence.
      Remarque : Cette étape est très critique. Cellules stromales de la moelle osseuse ne peuvent être induites aux adipocytes sans un milieu d’induction adipocytaire.
    5. Enlever le milieu inducteur et laver les cellules deux fois avec 1 mL de PBS chaque fois.
    6. 1 mL de milieu d’entretien adipocytaire, continuer à la culture des cellules jusqu'à la maturation de l’adipocyte.
      Remarque : Sous un microscope, ressemblent à petites ou grandes bulles de savon et les adipocytes sont très faciles à reconnaître. Habituellement, les adipocytes matures sont présents sur la 6ème ou 8ème jour.
    7. Teindre les adipocytes matures avec de l’huile rouge O ou recueillir les adipocytes pour une analyse (qPCR) réaction en chaîne de polymérase quantitative.
  3. Coloration des adipocytes
    1. Laver la 14F1.1 différencié cellules 2 x avec PBS et fixez-les à 3,7 % de formaldéhyde pendant 1 h.
    2. Rincer les cellules en 60 % isopropanol et laissez-les sécher complètement.
    3. Ajouter 0,2 mL de la solution de travail Oil Red O dans les puits et il incuber à température ambiante pendant 0,5 à 2 h.
    4. Laver les cellules avec l’eau pour enlever les colorants non liés.
    5. Photo les teints adipocytes sous un microscope optique.

3. coculture des Adipocytes de la moelle osseuse avec des cellules de mélanome

  1. Préparations
    1. Préparer les os mature adipocytes de moelle osseuse : induire les cellules 14F1.1 en adipocytes matures de BM en plaques 24 puits avec le milieu d’induction adipocytaire pendant 2 jours et puis leur maintien dans le milieu de maintenance adipocytaire pour une période supplémentaire de 6 à 8 jours.
    2. Préparer les B16F10 des cellules : les cellules de B16F10 dans des boîtes de 60 mm avec 5 mL de milieu DMEM la culture.
    3. Humidifier l’insert membrane (p. ex. transwell) : Ajouter 150 µL de milieu DMEM FBS-gratuit pour les inserts de pores membranaires 0,4 µm et immerge-les sur les puits de plaques 24 puits remplis de 500 µL de milieu DMEM FBS-libre.
  2. Réglage de la co-culture
    1. Pipetter lentement hors du milieu de chaque insertion.
      Remarque : Ne pas détruire la membrane lorsque vous retirez le support.
    2. Graine de cellules B16F10 (0/103105106) dans le pore de 0,4 µm insère de l’étape 3.2.1.
    3. Remplacer le support de maintenance adipocytaire dans les puits avec les adipocytes matures la moelle osseuse de l’étape 3.1.1. avec 600 µL de milieu DMEM complet.
    4. Transférer les inserts remplis avec les cellules de B16F10 (de l’étape 3.2.2) sur les puits avec les adipocytes matures la moelle osseuse (de l’étape 3.2.3) pour les expériences de coculture.
    5. Incuber les cocultures à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 2 jours.
    6. Après 48 h d’incubation, enlever les inserts de la co-culture et puis laver les adipocytes 2 x avec 500 µL de PBS 1 x.
      Remarque : Recueillir éventuellement, les cellules de B16F10 dans les encarts pour analyse si nécessaire.
    7. Teindre les adipocytes avec la solution de travail Oil Red O ou recueillir les adipocytes pour analyse qPCR.
      Remarque : Voir la procédure de marquage à l’étape 2.3.
    8. Photo les teints adipocytes sous un microscope optique.

4. qPCR analyse de la Signature de gènes adipocytaires spécifiques

  1. Ajouter 0,5 mL de réactif d’isolement d’ARN prêt à l’emploi / puits dans une plaque 24 puits dans lequel adipocyte mature est prêt à détecter.
  2. Suivre un protocole standard pour l’extraction de l’ARN et la synthèse de cDNA31.
  3. Utiliser l’apprêt pour 18 et GAPDH comme le contrôle et CEBPα/β, PPARγ, FABP4, leptine, Pref-1 ou adiponectine pour la signature de gènes adipocytaires spécifiques (tableau 1).
  4. Exécutez la réaction suivante dans un thermocycleur : 95 ° C pendant 20 s, suivi de 40 cycles de 95 ° C pendant 1 s et 60 ° C pendant 20 s.
  5. La méthode deΔΔCt 2 permet de calculer que le giron change32.

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Representative Results

Dans la moelle osseuse, les adipocytes peuvent apparaître dans la tumeur microenvironnement1,13,33,34,35 à un stade précoce pour soutenir la progression de la tumeur par l’intermédiaire de facteurs solubles ou activation de12,6,osteoclastogenesis36, surtout dans le contexte de vieillissement37et/ou d’obésité6,12 . Nos études précédentes1 ont noté que le nombre d’adipocytes de la moelle osseuse change radicalement durant la phase précoce des métastases de mélanome à l’OS1. En effet, les montants des adipocytes s’accumulent dans la zone de la tumeur et soutiennent la croissance des cellules tumorales dans la moelle osseuse lorsque les souris nourris avec une alimentation riche en graisses6, ce qui suggère que les adipocytes de la moelle osseuse pourraient jouer un rôle significatif dans l’OS métastatique moelle osseuse niche37. La diaphonie dynamique de cellules tumorales et de la moelle osseuse adipocyte reste toutefois incertaine. Donc, nous avons été consacrés à aborder cette question par le système de co-culture 2D de la moelle osseuse des cellules adipocytaires et le mélanome.

Dérivées de tumeurs facteurs promouvoir la différenciation des adipocytes de la moelle osseuse :
Figure 1 un représente un flux de travail typique pour induire les adipocytes de la moelle osseuse avec tumeur conditionnée moyenne (TCM). Une expérience représentative indique les cellules 14F1.1, plaqué comme des cellules individuelles à une densité de 5 x 104 cellules / puits en présence d’un milieu d’induction adipocytaire dans les 2 premiers jours et puis maintenue dans le support de maintenance adipocytaire (avec ou sans les TCM) pour 6 à 8 jours. Adipocyte mature contient des gouttelettes de lipides ; donc, les adipocytes différenciés peuvent être facilement identifiés par Oil Red O coloration (Figure 1b) et quantifiés par qPCR avec une signature de gènes adipocytaires spécifiques (Figure 1c).

Surcharge des cellules du mélanome induit la dédifférenciation dans les adipocytes de la moelle osseuse :
Les cellules tumorales peuvent modifier l’environnement pour survivre, surtout sous des conditions hypoxiques1,4,6. Pour simuler un effet secondaire de tumeur-fardeau sur un adipocyte de moelle osseuse, nous avons réalisé le système de co-culture 2D avec une augmentation continue du nombre de cellules de mélanome dans les encarts supérieurs (Figure 2a). Figure 2 b montre que le stockage des lipides dans les adipocytes est privé dans une mesure supérieure à la plus forte densité de cellules de mélanome (106 cellules/puits) par rapport à la privation, à la fréquence la plus basse des cellules du mélanome (10 cellules3 / Eh bien). Figure 2 c présente un profil de gènes de ces adipocytes en adipocytes dans la coculture. En comparaison avec la coculture avec la plus faible densité des cellules du mélanome, pref-1 niveau augmenté évidemment, et l’expression de la leptine, adiponectine, FABP4, CEBPβ et PPARγ est diminuée, ce qui suggère que l’effet secondaire de la tumeur-fardeau peut être attribuée à le processus de dédifférenciation dans les adipocytes. En outre, une surcharge des cellules tumorales pouvait induire une nécrose dans les adipocytes,38.

En résumé, nous avons observé un effet d’axée sur les cellules de mélanome inverse sur les adipocytes de la moelle osseuse par des facteurs solubles. L’effet inverse sur les adipocytes de la moelle osseuse est d’un grand intérêt, ce qui suggère que les adipocytes de la moelle osseuse sont dynamiques régulateurs de la cellule tumorale métastaser vers la moelle osseuse.

Figure 1
Figure 1 : Facteurs dérivées de tumeurs promouvoir une différenciation adipocytaire. (a) ce panneau montre une vue schématique de la création expérimentale qui utilise des lignes 14F1.1 cellulaire et un milieu conditionné dérivé de mélanome. (b) ce panneau montre l’imagerie d’un adipocyte moelle différenciée. (c) ce panneau montre l’analyse d’une signature de gènes spécifiques adipocytaire par qPCR. TCM = milieu conditionné à la tumeur. qPCR : réaction en chaîne de polymérase quantitative. Echelle = 50 µm. Ce chiffre a été modifié par Wang et al. 1. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 2
Figure 2 : Effets de la tumeur-fardeau sur adipocytes. (a) ce panneau montre une vue schématique du paramètre expérimental : une co-culture de lignées de cellules 14F1.1 et des cellules du mélanome. (b) ce panneau montre l’imagerie d’un adipocyte de moelle osseuse dans le système de co-culture. (c) ce panneau montre un gène profilage des adipocytes par qPCR. qPCR : réaction en chaîne de polymérase quantitative. Echelle = 50 µm. Ce chiffre a été modifié par Wang et al. 1. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Amorces
Nom de gène Faire parvenir la séquence (5'-3') Inverser la séquence (5'-3')
PPARΓ CTGATGCACTGCCTATGAGC GGGTCAGCTCTTGTGAATGG
CEBPΑ AAG AGC CCG GAC AAG GC GTC AGC STC CAG ACC TTG TG
CEBPΒ CAACCTGGAGACGCAGCACAAG GCTTGAACAAGTTCCGCAGGGT
FABP4 TGAAATCACCGCAGACGACAGG GCTTGTCACCATCTCGTTTTCTC
Leptine ATC TGA AGC AAG CCA TCA GC CCA, CAC GTC AGA GGT CAA GC
Pref-1 GACACTCGAAGCTCACCTGG GGAAGGCTGGGACGGGAAAT
Adiponectine GCG ATA ATA CAT AGC GGC TTC T GCA GGC ATC CCA GGA CAT C

Tableau 1 : Tableau des amorces utilisées pour qPCR.

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Discussion

Cocultures avec inserts ont été largement utilisés pour étudier les interactions cellule-cellule. Le système de co-culture 2D est un moyen efficace d’observer comment les deux pièces de diaphonie in vitro, par lequel nous avons montré ici deux différente axée sur la cellule les effets cancérogènes sur les adipocytes de la moelle osseuse. Plusieurs laboratoires ont utilisé cette méthode pour étudier la diaphonie entre les adipocytes et les cellules de cancer6,12,27,39.

En général, par conséquent, une co-culture 2D est la meilleure approche simple à l’étude de la cellule-cellule diaphonie. Toutefois, lorsqu’il s’agit de préparer une lignée de cellules indifférenciées de poursuivre les recherches, il y a certains défis uniques. Dans le protocole décrit ici, la santé et l’état fonctionnel de la cellule stromales de la moelle osseuse est très critique pour la différenciation des adipocytes. Le protocole peut être modifié pour remplacer les cellules 14F1.1 par primaire la moelle osseuse des cellules souches mésenchymateuses. En outre, la pré-incubation des cellules 14F1.1 dans le milieu d’induction adipocytaire pendant plusieurs jours est une autre étape critique. Sans ce pré incubation, les cellules stromales de la moelle osseuse vont échouer à se différencier en adipocytes, qui a été détecté dans notre et celle des autres études40. Ces phénomènes expliquent également pourquoi certains protocoles similaires peuvent entraîner différents ou même effets opposés et soulignent l’importance d’un tel protocole facile, reproductible et détaillé pour l’étude de diaphonie des cellules tumorales et les adipocytes de la moelle osseuse.

La co-culture 2D peut perdre certaines informations critiques par rapport aux cultures 3D ou ex vivo , il reste facile à être normalisé, contrôlés et éventuellement manipulés pour plus utilisation20,21,41. Une application future de cette technique peut décider comment un ostéoblaste change quand il est co-cultivées avec des cellules cancéreuses.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à déclarer.

Acknowledgments

Nous remercions Dov Zipori (The Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israël) gentiment pour nous donner la cellule stromales de moelle épinière murin ligne 14F1.1. Cette étude a été financée par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles chinoises (nos 81771729) et l’Université Yongchuan hôpital de Chongqing Medical (Nos. YJQN201330 ; YJZQN201527).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen Inc. 11965092
Fetal Bovine Serum Invitrogen Inc. 16000–044
Phosphate Buffered Saline Invitrogen Inc. 14190-144
Insulin Sigma-Aldrich 91077C
3-isobutyl-1-methyl-xanthine Sigma-Aldrich I5879
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
Oil Red o Sigma-Aldrich O0625
24-well plate Corning CLS3527
Transwell insert Millipore MCHT24H48
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
isopropanol Sigma-Aldrich I9516
0.25% trypsin Thermo Scientific 25200056
hemocytometer Bio-Rad 1450016
Culture incubator Thermo Scientific
50 mL falcon Corning CLS430828
Clean Bench Thermo Scientific -
Microscopy Olympus -
200 μL pipet tips BeyoGold FTIP620
1,000 mL pipet tips BeyoGold FTIP628

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Recherche sur le cancer numéro 138 adipocytes de la moelle osseuse métastase osseuse mélanome coculture différenciation insert membrane
Double effet de facteurs dérivés de cellules de mélanome sur la différenciation des Adipocytes médullaires
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Wang, J., Wen, J., Chen, X. X.,More

Wang, J., Wen, J., Chen, X. X., Chen, G. L. Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation. J. Vis. Exp. (138), e57329, doi:10.3791/57329 (2018).

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