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Cancer Research

Effetti doppi di fattori derivati da cellule di Melanoma su differenziazione adipociti del midollo osseo

Published: August 23, 2018 doi: 10.3791/57329

Summary

Qui, presentiamo un sistema affidabile e semplice coculture bidimensionale (2D) per studiare l'interazione tra le cellule del tumore e adipociti del midollo osseo, che rivela un duplice effetto di fattori derivati da cellule di melanoma su adipociti del midollo osseo differenziazione e pone anche un metodo classico per lo studio meccanicistico della metastasi dell'osso.

Abstract

Il crosstalk tra adipociti del midollo osseo e le cellule del tumore può giocare un ruolo critico nel processo di metastasi ossee. Una varietà di metodi sono disponibili per studiare il crosstalk significativo; Tuttavia, un sistema di transwell bidimensionale per coculture rimane un classico, affidabile e facile modo per questo studio di diafonia. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che mostra il coculture delle adipociti del midollo osseo e le cellule del melanoma. Tuttavia, un tale sistema di coculture potrebbe non solo contribuire allo studio di trasduzioni segnale cellulare delle cellule di cancro indotte dagli adipociti del midollo osseo, ma anche per il futuro meccanicistico studio della metastasi dell'osso che può rivelare nuovi bersagli terapeutici per osso metastasi.

Introduction

Le metastasi dell'osso sono diffuse fra i pazienti di cancro avanzato, ma un trattamento curativo non è ancora disponibile. Di là di specializzata nella conservazione di energia come grasso, adipociti è in grado di supportare la crescita del tumore e metastasi nel midollo osseo e altri organi1,2,3,4,5,6. Inoltre, adipociti svolgono un ruolo essenziale nella regolazione del cancro cellula biologia7,8,9,10 e metabolismo4,11,12 ,13,14,15,16, come bene come in osso metastasi1,4,12. Nella nicchia del midollo osseo, adipociti possono anche influenzare il comportamento biologico del cancro cellule4,6,17. L'interazione tra adipociti del midollo osseo e le cellule tumorali con osteotropism è significativo per la comprensione della metastasi dell'osso. Tuttavia, piccolo è conosciuto.

Basati sugli studi di correnti, vari metodi vengono applicati ai adipocytes, tra cui bi - o tri - dimensionale (2/3D) ed ex vivo culture17,18,19,20,21. Recentemente, Herroon et al. progettato un nuovo approccio di 3D-cultura per studiare le interazioni degli adipociti del midollo osseo con cancro cellule22. Anche se il 3D coculture è ottimale per mimare fisiologiche interazioni tra adipociti e cancro cellule in vivo, soffre di scarsa riproducibilità22,23. Rispetto ad un sistema di coculture 2D, un sistema di coculture 3D può fornire diversi fenotipi cellulari, come ad esempio cellule morfologia21,22,24,25,26. Inoltre, la cultura ex vivo di frammenti di tessuto isolato cancellous dell'osso può portare a un'escrescenza robusta degli adipociti dal midollo osseo coltivate cellule17.

In contrasto con questi modelli precedenti, tuttavia, il modello della coltura cellulare 2D rimane una tecnica classica, affidabile e facile scansione rapidamente molecole candidate e i fenotipi cambiati in adipociti o cancro cellule in vitro1, 4,6,12,15,27. Per comprendere meglio il crosstalk tra adipociti del midollo osseo e le cellule del melanoma, forniamo un protocollo dettagliato per un sistema di coculture 2D degli adipociti del midollo osseo con cellule di melanoma.

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Protocol

Nota: Tutte le celle utilizzate nel presente protocollo dovrebbero essere cresciute da almeno tre generazioni dopo lo scongelamento da cellule stock congelate.

1. raccogliere i fattori derivati da cellule di Melanoma

  1. Preparazioni
    1. Ottenere le cellule B16F10 e una linea cellulare di melanoma del topo.
      Nota: Per questo protocollo, una linea cellulare di melanoma del topo è stata ottenuta dalla banca della cellula formativa dell'Accademia cinese delle scienze.
    2. Rendere un supporto completo per la coltura delle cellule B16F10 (100 mL). Utilizzare medium dell'Aquila per volta di Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS), 50 U/mL di penicillina e 50 µ g/mL di streptomicina.
    3. Rendere un medium senza siero per l'inedia delle cellule B16F10 (50 mL). Utilizzare Media senza FBS DMEM, 50 U/mL di penicillina e 50 µ g/mL di streptomicina.
  2. Preparare il melanoma-condizionato medio (CM)
    1. Seme 2.0 x 105 B16F10 cellule in un 100mm piatto con 10 mL di 10% FBS DMEM. Incubare le cellule in un incubatore a 37 ° C in un'atmosfera di 5% CO2 per 24 h.
    2. Quando le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza, rimuovere il terreno di coltura, lavare le cellule due volte con 5 mL di tampone fosfato salino (PBS) (x 1, pH 7.4) e sostituire il mezzo con un 10 mL privo di siero medio per la fame.
    3. Riporre le cellule nell'incubatore per 18 – 24 h.
    4. Dopo l'inedia, raccogliere il medium condizionato (CM) con una pipetta e trasferirlo in una provetta da centrifuga fresca 50 mL.
      Nota: Il medium condizionato è il sovranatante delle colture cellulari B16F10. Assicurarsi che le cellule B16F10 sono in buone condizioni prima di raccogliere i CM.
    5. Centrifugare il CM per 5 min a 1.000 x g a 4 ° C.
    6. Pipettare il supernatante e trasferirlo in una provetta sterile fresco o bottiglia.
      Nota: Evitare di pipettaggio fuori la pallina nella parte inferiore del tubo.
    7. Per rimuovere i detriti cellulari, è possibile filtrare i CM facendolo passare attraverso un filtro da 0,45 µm siringa-collegato sulla cima di un tubo o bottiglia sterile.
      Nota: 0,22 µm filtri sono ottimali per il filtraggio del CM.
    8. Conservare il surnatante filtrato a-20 ° C fino all'utilizzo.
      Nota: Si consiglia di non conservare il supernatante a-20 ° C per più di un mese. In alternativa, è possibile memorizzare i CM a-80 ° C per più lunghi periodi di tempo per la differenziazione degli adipociti.

2. induzione degli adipociti del midollo osseo da fattori derivati da cellule di Melanoma

  1. Preparazioni
    1. Portare a 100 mL di adipogenico induzione media28. Utilizzare un completo DMEM completate con 5 µ g/mL di insulina, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine e 1 µM desametasone. Memorizzare a due settimane a 4 ° C.
    2. Preparare 100 mL di mezzo di manutenzione adipogenico. Utilizzare un DMEM completo o miscelato con il 50% del melanoma CM completati con 5 µ g/mL di insulina.
    3. Fare una soluzione di riserva di Oil Red O. Sciogliere 30 mg di polvere di Oil Red O in 10 mL di isopropanolo (≥ 99.5%) e mescolarli bene dal vortice.
      Nota: E ' memorizzare fino a 1 anno a 4 ° C.
    4. Fare una soluzione di lavoro Oil Red O. In cappa, diluire la soluzione di riserva di Oil Red O (dal punto 2.1.3) con acqua deionizzata in un rapporto di 3:2. Incubare la miscela per 15 min a temperatura ambiente e filtrare attraverso un filtro da 0,22 µm prima dell'uso.
      Nota: Utilizzare solo la soluzione fresca di lavoro all'interno di 2 h.
  2. Differenziazione degli adipociti
    1. Cultura una cella stromal linea 14F1.1 dal mouse del midollo osseo29 in un piatto di 60 mm con un completo DMEM al confluency di 80% in un incubatore a 37 ° C in un'atmosfera di 5% CO2.
      Nota: In alternativa, sostituire 14F1.1 con cellule mesenchimali derivate da midollo osseo primario30.
    2. Tripsinizzano le cellule con 1,5 mL di una soluzione di tripsina 0.25% in un'incubatrice per 1 – 2 min.
    3. Aggiungere 5 mL di terreno di 10% FBS alle celle e contare i numeri di cellulare con un emocitometro di vetro; quindi regolare la densità delle cellule a circa 1 – 2 x 105/ml.
    4. 5 x 104 di 14F1.1 cellule per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti con 0,5 mL di mezzo di induzione adipogenico del seme. Dopo due giorni di incubazione, le cellule raggiungono circa il 90% di confluenza.
      Nota: Questo passaggio è molto critico. Cellule stromali del midollo osseo non possono essere indotto a adipociti senza un mezzo di induzione adipogenic.
    5. Rimuovere il mezzo di induzione e lavare le cellule due volte con 1 mL di PBS ogni volta.
    6. Cambiare a 1 mL di mezzo di manutenzione adipogenico e continuare a coltivare le cellule fino alla maturazione degli adipociti.
      Nota: Sotto un microscopio, adipociti apparire come piccole o grandi bolle di sapone e sono molto facili da riconoscere. Di solito, adipocytes maturi sono presenti 6th o 8° giorno.
    7. Macchiare i adipocytes maturi con Oil Red O o raccogliere gli adipociti per un'analisi di reazione a catena (qPCR) della polimerasi quantitativa.
  3. Macchiatura del adipocyte
    1. Lavare il 14F1.1 differenziato cellule 2 volte con PBS e correggerli in formaldeide del 3,7% per 1 h.
    2. Sciacquare le cellule in 60% isopropanolo e lasciarli asciugare completamente.
    3. Aggiungere 0,2 mL di soluzione di lavoro di Oil Red O pozzetti e incubare a temperatura ambiente per 0,5-2 h.
    4. Lavare le cellule con acqua per rimuovere i coloranti non associati.
    5. Foto gli adipociti tinti sotto un microscopio chiaro.

3. coculture degli adipociti del midollo osseo con cellule di Melanoma

  1. Preparazioni
    1. Preparare l'osso maturo adipociti del midollo: indurre le cellule 14F1.1 in adipociti maturi BM in piastre da 24 pozzetti con il mezzo di induzione adipogenico per 2 giorni e poi mantenerli nel medium adipogenico manutenzione per ulteriori 6-8 giorni.
    2. Preparare le cellule B16F10: coltura le cellule B16F10 in piastre da 60 mm con 5 mL di terreno DMEM.
    3. Inumidire l'inserto di membrana (ad es. transwell): aggiungere 150 µ l di terreno DMEM privo di FBS per gli inserti di formato del poro della membrana 0,4 µm e immergerli su pozzetti di piastre da 24 pozzetti riempite con 500 µ l di terreno DMEM privo di FBS.
  2. Impostazione di coculture
    1. Pipettare lentamente fuori il mezzo di ciascun frutto.
      Nota: Non distruggono la membrana quando si rimuove il mezzo.
    2. Seme le cellule B16F10 (0/103105106) nel poro 0,4 µm inserisce dal punto 3.2.1.
    3. Sostituire il mezzo di manutenzione adipogenico nei pozzetti con gli adipociti maturi del midollo osseo dal punto 3.1.1. con 600 µ l di terreno DMEM completo.
    4. Trasferire gli inserti riempiti con le cellule B16F10 (dal punto 3.2.2) sui pozzetti con gli adipociti maturi del midollo osseo (dal punto 3.2.3) per gli esperimenti di coculture.
    5. Incubare i cocultures a 37 ° C e 5% CO2 per 2 giorni.
    6. Dopo 48 h di incubazione, rimuovere gli inserti del coculture e poi lavare gli adipociti 2 x con 500 µ l di PBS 1X.
      Nota: Facoltativamente, raccogliere le cellule B16F10 negli inserti per analisi se necessario.
    7. Gli adipociti con la soluzione di lavoro Oil Red O di macchia o raccogliere gli adipociti per analisi qPCR.
      Nota: Vedere la procedura di colorazione al punto 2.3.
    8. Foto gli adipociti tinti sotto un microscopio chiaro.

4. qPCR analisi del Adipocyte-specific Gene Signature

  1. Aggiungere 0,5 mL di reagente di isolamento di RNA ready-to-use per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti in cui adipocita maturo è pronto a rilevare.
  2. Seguire un protocollo standard per l'estrazione di RNA e la sintesi di cDNA31.
  3. Utilizzare il primer per 18S e GAPDH come controllo e CEBPα/β, PPARγ, FABP4, leptina, Pref-1 o adiponectin per la firma genica adipocyte-specifica (tabella 1).
  4. Eseguire la seguente reazione in un termociclatore: 95 ° C per 20 s, seguiti da 40 cicli di 95 ° C per 1 s e 60 ° C per 20 s.
  5. Utilizzare il metodo diΔΔCt 2 per calcolare che la piega cambia32.

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Representative Results

Nel midollo osseo, adipociti possono apparire nel tumore microambiente1,13,33,34,35 in una fase precoce per sostenere la progressione del tumore attraverso fattori solubili o attivazione12,6,osteoclastogenesis36, soprattutto nel contesto dell'obesità6,12 e/o invecchiamento37. Nostri studi precedenti1 hanno notato che il numero di adipociti del midollo osseo cambia drammaticamente durante lo stadio precoce di metastasi di melanoma all'osso1. Infatti, la quantità di adipociti si accumulano nella zona del tumore e sostenere la crescita delle cellule del tumore nel midollo osseo quando i topi alimentati con una dieta ad alta percentuale di grassi6, suggerendo che adipociti del midollo osseo potrebbero svolgere un ruolo significativo nell'osso metastatico midollo di nicchia37. Tuttavia, il crosstalk dinamico delle cellule del tumore e degli adipociti del midollo osseo rimane poco chiaro. Pertanto, noi stavamo dedicate ad affrontare questo problema dal sistema 2D coculture delle cellule del midollo osseo del adipocyte e del melanoma.

Tumore-derivato fattori promuovono la differenziazione degli adipociti del midollo osseo:
Figura 1 una rappresenta un flusso di lavoro tipico per l'induzione di adipociti del midollo osseo con il mezzo di tumore-condizionato (TCM). Un esperimento rappresentanza indica cellule 14F1.1, placcato come singole cellule ad una densità di 5 x 104 cellule per pozzetto in presenza di un medium di induzione adipogenico nei primi 2 giorni e poi mantenuto all'interno del mezzo di manutenzione adipogenico (con o senza TCM) per 6 – 8 giorni. Adipocita maturo contiene le goccioline del lipido; di conseguenza, gli adipociti differenziati possono essere facilmente identificati dall'Oil Red O macchiatura (Figura 1b) e quantificati mediante qPCR con una firma genica adipocyte-specifica (Figura 1c).

Sovraccarico delle cellule del melanoma induce la de-differenziazione in adipociti del midollo osseo:
Le cellule del tumore possono modificare l'ambiente per sopravvivere, soprattutto in condizioni di ipossia1,4,6. Per simulare un effetto secondario di carico del tumore su degli adipociti del midollo osseo, abbiamo effettuato il sistema 2D coculture con un continuo aumento del numero delle cellule del melanoma negli inserti superiori (Figura 2a). Figura 2b Mostra che il deposito di lipidi negli adipociti è privato in misura maggiore alla massima densità di cellule di melanoma (106 cellule/pozzetto) confrontata con la privazione alla frequenza più bassa delle cellule del melanoma (103 celle / bene). Figura 2 c presenta un genica di questi adipociti in adipociti nel coculture. Confrontato con il coculture con la più bassa densità delle cellule del melanoma, pref-1 livello aumentato ovviamente, e l'espressione della leptina, adiponectina, FABP4, CEBPβ e PPARγ è stata diminuita, che suggerisce che l'effetto secondario di carico del tumore può essere attribuita alla il processo di-differenziazione in adipociti. Inoltre, un sovraccarico delle cellule del tumore potrebbe indurre necrosi in adipociti38.

In sintesi, abbiamo osservato un effetto opposto di basati su cellule di melanoma sugli adipociti del midollo osseo di fattori solubili. L'effetto opposto sugli adipociti del midollo osseo è di grande interesse, suggerendo che il midollo osseo adipociti sono dinamiche regolatori della cellula del tumore riprodurrsi per metastasi al midollo osseo.

Figure 1
Figura 1 : Fattori derivati dal tumore promuovono una differenziazione del adipocyte. (un) questo pannello mostra una vista schematica dell'impostazione sperimentale, quali linee di cellule 14F1.1 usi e un medium condizionato del melanoma-derivato. (b) questo pannello mostra l'imaging di un adipocita differenziato del midollo osseo. (c) questo pannello mostra l'analisi di una firma genica adipocyte-specifica di qPCR. TCM = medio del tumore-condizionati. qPCR: reazione a catena della polimerasi quantitativa. Barra della scala = 50 µm. Questa figura è stata modificata da Wang et al. 1. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figure 2
Figura 2 : Effetti di carico del tumore sull'adipocita. (un) questo pannello mostra una vista schematica dell'impostazione sperimentale: un coculture delle linee cellulari 14F1.1 e cellule del melanoma. (b) questo pannello mostra l'imaging di un adipocita del midollo osseo nel sistema di coculture. (c) questo pannello mostra un genica degli adipociti di qPCR. qPCR: reazione a catena della polimerasi quantitativa. Barra della scala = 50 µm. Questa figura è stata modificata da Wang et al. 1. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Primer
Nome del gene Trasmettere la sequenza (5' a 3') Invertire la sequenza (5' a 3')
PPARΓ CTGATGCACTGCCTATGAGC GGGTCAGCTCTTGTGAATGG
CEBPΑ AAG AGC CGC GAC AAG GC GTC AGC TCC AGC ACC TTG TG
CEBPΒ CAACCTGGAGACGCAGCACAAG GCTTGAACAAGTTCCGCAGGGT
FABP4 TGAAATCACCGCAGACGACAGG GCTTGTCACCATCTCGTTTTCTC
Leptina ATC TGA AGC AAG CCA TCA GC CCA GTC ACC AGA GGT CAA GC
Pref-1 GACACTCGAAGCTCACCTGG GGAAGGCTGGGACGGGAAAT
Adiponectina GCG ATA ATA GATTO AGC GGC TTC T GCA GGC ATC CCA GGA CAT C

Tabella 1: Tabella di primers utilizzati per qPCR.

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Discussion

Cocultures con inserti sono stati ampiamente usati per studiare le interazioni cellula--cellula. Il sistema di coculture 2D è un modo efficace per osservare come le due parti diafonia in vitro, mediante il quale abbiamo mostrato qui due differenti del cancro delle cellule-guidati effetti sugli adipociti del midollo osseo. Molti laboratori hanno utilizzato questo metodo per indagare il crosstalk tra adipociti e cancro cellule6,12,27,39.

In generale, pertanto, un coculture 2D è il migliore approccio diretto allo studio area interattiva cellula--cellula. Tuttavia, quando si tratta di preparare una linea cellulare indifferenziato per ulteriori ricerche, ci sono alcune sfide uniche. Nel protocollo descritto qui, la salute e lo stato funzionale della cellula stromal del midollo osseo è molto critico per la differenziazione di adipociti. Il protocollo potrebbe essere modificato per sostituire le cellule 14F1.1 con cellule staminali mesenchimali del midollo osseo primario. Inoltre, la pre-incubazione delle cellule 14F1.1 nel mezzo di induzione adipogenico per diversi giorni è un altro passo fondamentale. Senza questa pre-incubazione, le cellule stromali del midollo osseo riuscirà a differenziare in adipociti, che è stato rilevato nel nostro e degli altri studi40. Questi fenomeni anche spiegano perché alcuni protocolli simili possono causare diverse o anche effetti opposti e sottolineano l'importanza di tale protocollo semplice, ripetibile e dettagliato per lo studio di diafonia di cellule tumorali e adipociti del midollo osseo.

Anche se il coculture 2D potrebbe perdere alcune informazioni critiche rispetto alle culture 3D o ex vivo , rimane facile da essere standardizzata, monitorato ed eventualmente manipolati per ulteriore uso20,21,41. Una futura applicazione della tecnica può decidere come un osteoblast cambia quando esso è cocultured con le cellule tumorali.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Acknowledgments

Ringraziamo gentilmente Dov Zipori (The Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israele) per averci fornito le cellule stromali del midollo osseo murino linea 14F1.1. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni da Fondazione Scienza naturale nazionale cinese (nn. 81771729) e l'Università ospedale di Chongqing Yongchuan medica (Nos. YJQN201330; YJZQN201527).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen Inc. 11965092
Fetal Bovine Serum Invitrogen Inc. 16000–044
Phosphate Buffered Saline Invitrogen Inc. 14190-144
Insulin Sigma-Aldrich 91077C
3-isobutyl-1-methyl-xanthine Sigma-Aldrich I5879
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
Oil Red o Sigma-Aldrich O0625
24-well plate Corning CLS3527
Transwell insert Millipore MCHT24H48
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
isopropanol Sigma-Aldrich I9516
0.25% trypsin Thermo Scientific 25200056
hemocytometer Bio-Rad 1450016
Culture incubator Thermo Scientific
50 mL falcon Corning CLS430828
Clean Bench Thermo Scientific -
Microscopy Olympus -
200 μL pipet tips BeyoGold FTIP620
1,000 mL pipet tips BeyoGold FTIP628

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Ricerca sul cancro problema 138 degli adipociti del midollo osseo metastasi ossee melanoma coculture differenziazione inserto di membrana
Effetti doppi di fattori derivati da cellule di Melanoma su differenziazione adipociti del midollo osseo
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Wang, J., Wen, J., Chen, X. X.,More

Wang, J., Wen, J., Chen, X. X., Chen, G. L. Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation. J. Vis. Exp. (138), e57329, doi:10.3791/57329 (2018).

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