Summary
כאן, אנו מראים את התהליך של יצירת קו דג זברה כתב מתח חשמלי הסלולר להמחיש את התפתחות, תנועה, דגים גידול תאים ויוו.
Abstract
ביו, איתות חשמלי אנדוגני מתווך על ידי תעלות יונים, משאבות ממוקם על קרום התא, משחק תפקידים חשובים באיתות תהליכים של תאים עצביים ושרירי טמפרמנט של תהליכים ביולוגיים רבים אחרים, כגון עובריים המתבנת התפתחותית. עם זאת, יש צורך ויוו פעילות חשמלית מהפיקוח מופרה חוליות. ההתקדמות של מקודדים גנטית פלורסנט מחוני מתח (GEVIs) הפכו אותה ניתן לספק פתרון עבור האתגר הזה. כאן, אנו נתאר כיצד ליצור דג מחוון הטרנסגניים מתח באמצעות מחוון ויצר מתח, ASAP1 (האצת חיישן של פוטנציאל פעולה 1), כדוגמה. ערכת Tol2, מקדם דג זברה בכל מקום, ubi, נבחרו במחקר זה. נסביר גם את התהליכים של שיבוט בייעודי לאתר שער Tol2 דג זברה מבוסס-transposon transgenesis, את תהליך ההדמיה בשלב מוקדם דגים עוברי ודגים גידולים באמצעות מיקרוסקופ פלורסנטי רגיל. באמצעות קו דגים, מצאנו כי ישנם שינויים מתח חשמלי הסלולר במהלך דג זברה מופרה והתנועה זחל דגים. יתר על כן, זה היה ציין כי כמה דג זברה ממאיר במערכת העצבים ההיקפית נדן גידולים, הגידול התאים היו בדרך כלל מקוטב בהשוואה ל נורמלי הרקמות הסובבות.
Introduction
ביו מתייחס אנדוגני איתות חשמלי מתווך על ידי תעלות יונים ומשאבות ממוקם על קרום התא1. חילופי יוניים על פני הממברנה התאית, והשינויים בשילוב חשמל פוטנציאלית ועדכניים, חיוניים עבור איתות תהליכים של טמפרמנט תאים עצביים ושרירי. בנוסף, ביו ומעברי יון יש מגוון רחב של תפקודים ביולוגיים חשובים אחרים כולל אחסון אנרגיה, ביוסינטזה של המטבוליט תחבורה. איתות הביו-חשמליות התגלה גם כרגולטור של היווצרות תבנית עובריים, כגון צירים הגוף, מחזור התא, תא בידול1. לפיכך, חיוני להבנת מחלות מולדות אנושיים רבים הנובעים התקנה שגויה של סוג זה של איתות. למרות מלחציים תיקון כבר בשימוש נרחב עבור הקלטה תאים בודדים, הוא עדיין רחוק מלהיות אידיאלי בו זמנית פיקוח על תאים מרובים במהלך התפתחות עובריים בתוך vivo. יתר על כן, מולקולות קטנות רגיש מתח אינם גם אידיאלי עבור יישומים ויוו שלהם specificities, רגישויות וכתוצאה רעילות.
היצירה של מגוון רחב של גנטית מקודד מתח פלורסנט אינדיקטורים (GEVIs) מציע מנגנון חדש כדי להתגבר על בעיה זו, והיא מאפשרת יישום קל ללמוד התפתחות עובריים, למרות שהם נועדו במקור עבור ניטור עצבית תאים2,3. אחד GEVIs זמין כעת הוא האצת חיישן של פוטנציאל פעולה 1 (ASAP1)4. הוא מורכב ללולאה חוץ-תאי של תחום חישה מתח של מתח פוספטאז רגיש, חלבון פלואורסצנטי ירוק permuted באופן מעגלי. לכן, ASAP1 מאפשר הדמיה של שינויים סלולריים פוטנציאל חשמלי (קיטוב: ירוק בהיר; דפולריזציה: ירוק כהה). ASAP1 יש 2 מילי-שניות על לסירוגין קינטיקה, ולא ניתן לעקוב אחר שינוי פוטנציאליים subthreshold4. לכן, כלי גנטי זה מאפשר רמה חדשה של יעילות ניטור בזמן אמת הקינטיות בתאים חיים. הבנה נוספת של התפקידים של ביו בתחום הפיתוח עובריים למחלות רבות, כגון סרטן, שופכים אור חדש על המנגנון הבסיסי, אשר הוא קריטי עבור מחלת טיפול ומניעה.
דג זברה הוכחו במודל בעלי חיים רב עוצמה ללמוד ביולוגיה התפתחותית ו האדם מחלות כולל סרטן5,6. הם חולקים גנים orthologous 70% עם בני אדם, ויש להם ביולוגיה חוליות דומות7. דג זברה מספקים טיפול קל יחסית, בגודל גדול מצמד של ביצים, גנטיקה צייתן, transgenesis קל ופיתוח שקופים חיצוני עובריים, ההופכים אותם מערכת מעולה עבור ויוו הדמיה5,6. עם מקור גדול של דגים מוטנטים קווים כבר נוכח, גנום מלא ברצף, דג זברה תספק מגוון מוגבל יחסית של תגלית מדעית.
כדי לחקור את ויוו בזמן אמת הפעילות החשמלית של תאים, עלינו לנצל של דג זברה מודל המערכת ASAP1. בנייר זה, אנו מתארים כיצד לשלב את החיישן מתח פלורסנט ASAP1 הגנום דג זברה באמצעות Tol2 transposon transgenesis, ותנסו לדמיין את הפעילות החשמלית הסלולר במהלך התפתחות, תנועה זחל דגים, ובבתי גידול בשידור חי .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דג זברה מוחזקים במתקן בעל חיים שאושרו על-ידי AAALAC, כל הניסויים בוצעו לפי הפרוטוקולים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים פרדו שימוש הוועדה (PACUC).
1. Tol2 Transposon פלסמיד לבנות הכנה
הערה: Tol2, transposon שנתגלה בשנת medaka דגים, נרחב שימש ב8,9קהילת המחקר דג זברה. כבר בהצלחה לאמץ את שער ספציפי לאתר רקומבינציה מערכת מבוססת-שיבוט, המכונה ערכת Tol210. ערכת Tol2 מאפשר דרך נוחה יותר של יצירת ביטוי אישית בונה, בעת גם להגדיל את היעילות של transgenesis. לכן היה החלטה קלה כדי לנצל את היתרון של מערכת זו, וליצור בכל מקום ASAP1 ביטוי דג זברה קו באמצעות מקדם המאומת אוביקוויטין לנהוג ASAP111.
- יצירת מבנה התיכון כניסה ASAP1: pDONR221-ASAP1
- רוכשים הבונה חיישן ASAP1 מתח מקודדים גנטית, pcDNA3.1/פורו-חטיבתי-ASAP1 (פלסמיד #52519), מ- Addgene. כדי להגביר את האזור קידוד ASAP1, להגדיר PCR באמצעות את אישית תחל (attB1-ASAP1F ו- attB2-ASAP1R) תמר מוקף עם רצפים attB בקצה 5' של תחל (איור 1). Phusion DNA פולימראז נבחרתי שלה יעילות גבוהה, תנאי ה-PCR אופטימציה בהתבסס על פרוטוקול שפורסמו בעבר12.
- טען את המוצרים PCR µL 50 % 1 טה ג'ל באמצעות פיפטה רגיל עם טיפים µL 200, ולבצע אלקטרופורזה-160 V במיכל אופקי ג'ל למשך כ- 30 דקות.
- בדוק את הג'ל תחת transilluminator UV (353 nm), לסלק את הלהקה הרצוי באמצעות אזמל/להב תחת transilluminator UV שפורסמו בעבר13,14ו להכניס המכיל ג'ל לדנ microcentrifuge mL 1.5 נקי שפופרת.
- לבצע טיהור ג'ל עבור המוצרים ASAP1 PCR. לשחזר את ה-DNA הג'ל נכרת שימוש מסחרי DNA ג'ל ערכת טיהור בעקבות ההוראה של היצרן, elute את ה-DNA לתוך 20 µL של מים. קח 1 µL כמדגם, מודדים את ריכוז הדנ א באמצעות ספקטרופוטומטרים. זורמים ההוראות תוכנה באמצעות מים כמו בקרה הריק15.
- קח 100 ננוגרם של לטהר המוצר PCR ומערבבים אותו עם 150 ng של פלסמיד pDONR221 ב- 10 µL של טה מאגר (10 מ מ טריס, 1 מ מ EDTA pH 8.0)16. להוסיף 2 µL של BP Clonase השני לתוך התגובה, דגירה התגובה בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
- ביום השני, להוסיף 1 µL של proteinase K לתוך התגובה, דגירה התגובה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- לבצע טרנספורמציה. להעביר את התגובה ומערבבים אותו עם µL 50 של Top10 המוסמכת e. coli תאים, דגירה התאים על קרח למשך 30 דקות. אז, העברת הצינור התגובה לתוך אמבט מים 42 ° C עבור מינימלית 1 מיד להסיר את הצינור, דגירה על קרח למשך 2 דקות. בשלב הבא, לשים את הצינור לתוך מטרף 37 ° C, דגירה זה מאובטח.
- תוציאי את הצינור, צלחת התאים לצלחת kanamycin ליברות. בשלב הבא, דגירה את הצלחת בן לילה (16-18 h) ב 37 º C.
- לבחור אחת, מופרדים היטב מושבות, לחסן אותם לתוך צינורות תרבות תא 14 מ עם 3 מ ל LB בינוני. תרבות אותם בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס ב שייקר עם מהירות סיבוב של 250 סל"ד (סיבוב לדקה).
- לבצע miniprep באמצעות ערכת miniprep מסחרי בעקבות ידנית את ההוראה17.
- רצף פלסמידים 3-4 עם סנגר רצף לזהות pDONR221 חיובי-ASAP1 שיבוטים באמצעות תחל רצף M13F ו- M13R.
- יצירת הבונה Tol2 עבור microinjection: pDestTol2 -ubi-ASAP1
- לבחור שהרצף לאמת pDONR221-ASAP1 שיבוט ולמדוד את ריכוז הדנ א באמצעות קהל מעריצים ספקטרופוטומטרים ההוראה תוכנה באמצעות מים כפי ריק לשלוט15.
- קח 100 µg של pDONR221-ASAP1, ולערבב עם 100 µg של Tol2 ערכת 5-end פלסמיד (pENTR5'_ubi, Addgene #27320), 100 µg של p3E-תיקים עשויים (ערכת Tol2 #302) ו- 150 µg של pDestTol2pA2 (Tol2 ערכת #394). להתאים את הנפח הכולל כדי 8 µL באמצעות מאגר TE (10 מ מ טריס, 1 מ"מ EDTA, pH 8.0) ב- microcentrifuge 1.5 מ ל צינור ומערבבים היטב על ידי מערבולת קצרה של s 2-5. לאחר מכן, להוסיף 2 µL LR Clonase השנייה פלוס, דגירה התגובה בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
- ביום השני, להוסיף 1 µL של proteinase K לתוך התגובה באמצעות פיפטה 10 µL, דגירה התגובה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- לבצע טרנספורמציה ולזהות שיבוטים חיובי כפי שתואר לעיל (צעדים 1.1.7-11).
- מדד ריכוז ה-DNA רצף לאמת שיבוט pDestTol2-ubi-ASAP1 (איור 1B) באמצעות ספקטרופוטומטרים15. בדרך כלל הריכוז הוא סביב 200ng/µL.
2. מכינים Tol2 Transposase mRNA והפתרון הזרקה
- רצף של e. coli גליצרול מלאי של פלסמיד pCS2FA-transposase (Tol2 ערכת #396) על צלחת ליברות (עם 100 אמפיצילין µg/mL) באמצעות לולאה חיסון מעוקר. דגירה בן לילה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור. למחרת, לבחור שמושבה בודדת, לחסן אותו לתוך 3 מ"ל של ליברות (אמפיצילין µg 100/mL) באמצעות טיפ פיפטה של 10 µL מעוקר. תרבות זה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס ב שייקר עם מהירות סיבוב של 250 סל"ד.
- מבצע miniprep התרבות החיידק באמצעות ערכת miniprep מסחרי בעקבות ההדרכה שלה. Elute דנ א פלסמיד לתוך 30-50 µL טה מאגר על ידי צנטריפוגה דקה-14,000 סל ד, מודדים את ריכוז הדנ א שלה עם ספקטרופוטומטרים.
- Linearize µg 1-2 של פלסמיד עם לא אני endonuclease ולטהר ה-DNA עם ה-DNA בעקבות ההדרכה שלה אחרי לא ערכת ניקוי מערכת העיכול. Elute ה-DNA לתוך 5 µL של מים על ידי צריך שתוציאו ב 14,000 rpm במשך דקה אחת. ריכוז הצפוי הוא על 200-300 ng/µL.
- לבצע תמלול במבחנה עם לא אני לליניארית pCS2FA-transposase בתור תבנית ה-DNA באמצעות ערכת שעתוק SP6 מסחרי.
- לאחר סיום התגובה, לטהר transposase Tol2 mRNA באמצעות ניקוי RNA מסחרי קיט ההוראות של היצרן. לבסוף elute mRNA לתוך מים ללא RNAase µL 20, מודדים את ריכוז ה-RNA בספקטרופוטומטר. ריכוז הצפוי הוא על 1-3 µg / µL. דוגמאות שניתן לאחסן במקפיא-80 ° C במידת הצורך.
- להכין את הפתרון microinjection על ידי ערבוב 20 ng/µL pDestTol2 -ubi-transposase ASAP1, Tol2 ה-mRNA (100 ng/µL) צינור microcentrifuge על ידי pipetting. כדי למנוע השפלה חומצת גרעין הנגרמת על ידי מפשיר חוזרות ונשנות, refreezing, aliquot µL 6 למחזור ואחסן אותו במקפיא-80 ° C לשימוש עתידי.
3. microinjection
- להגדיר 4-6 טנקים רבייה לפחות 2 זכרים ו 2 נקבות אחר הצהריים לפני ההזרקה. הדגים האלה לא חייבים להיות מוזן בשעות אחר הצהריים. שלב זה להפחית את כמות הפסולת דגים ולחסוך זמן כדי לנקות אותם בבוקר שלמחרת, תוך שהיא מסייעת גם לגרום לתגובה הרבייה.
- למחרת בבוקר, להסיר את הפתרון הזרקת מוכן (pDestTol2 -ubi-ASAP1 לבנות, Tol2 mRNA) מהמקפיא-80 ° C, ומניחים אותו על קרח.
- . עצור את המחיצות הדג גידול טנקים ולאפשר את הדגים להזדווג. באופן כללי, דג טהור מטיל ביצים בתוך 20-30 דקות לאחר הוצאת על המפריד. אם לא, להמתין עוד 1-2 שעות. דגים מסוימים יכולים לא להטיל ביצים בכלל. במקרה זה, חזור על הניסוי הזה לאוסף העובר דגים.
- תוך כדי המתנה, ודא כי קיימים המוכנים הקצה נשבר בזווית יצירת קצה שקוע עם מלקחיים, או על ידי שבירת על מגב המשימה העדינה מחטים.
- . תמשכי מחטים נימי זכוכית פולר micropipette באמצעות הפרמטרים הבאים: חום 545; משוך 60; מהירות 80; זמן 250; הלחץ 500. תשבור את המחט עם מלקחיים מתחת טווח לנתיחה (עם העין-קטע סרגל עבור הערכה קוטר) על-ידי החזקת המלקחיים על זווית כ 45 °. מחט הרצוי קטרים יכולים להיות משתנה בהתאם להגדרות microinjector, אבל קוטר קטן הוא מועדף להפחתת תמותת העובר.
- ברגע הדג יש הטילו ביצים, לאסוף אותם ב 10-ס מ קוטר צלחת פטרי ולהביא אותם על הטווח לנתיחה. הסר כל העוברים לא נורמלי, דגים פסולת.
- Pipet העוברים מופרית לתוך הזריקה מוכנה 3% agarose עובש. הסרת עודפי מים כדי לשמור על העוברים במקום.
- ברגע כל השורות מלאים עם עוברים קיימא, לסדר אותם כך כל התאים פונים לאותו הכיוון לעבר המחט, וזה בערך בזווית של 45° אופקית. פעולה זו תגרום הזרקת קל יותר מאוחר יותר.
- כשאתה לובש כפפות, להשתמש pipet 20 µL הטעינה עצה 5 µL של הבונה מוכן ולהסיר הצינורית על קרח.
- הכנס בקפידה את הטיפ בקצה האחורי של צינור קפילרי שבור כל הדרך עד איפה זה מתחיל כדי מוזג הברים, גם לקבל הכימית קרוב הטיפ. אם יש עדיין בועות אוויר, לנער את המחט, מקפיד לא לשבור את הטיפ.
- את המחט ישר לתוך למחזיק המחט microinjection והדק בזהירות עד המחט נשאר במקום. להתאים את הזווית כדי בערך 45°.
- ברגע המחט הוא מוכן, מצורף, הפעל למיכל לחץ מיקרוסקופ וגז. מסחרית CO2 טנקים טובים בדרך כלל למטרה זו. האחסון ההזרקה מותאם על ידי הלחץ החזקה, הוצאה: משוער psi 0.5 להחזקת ו- 30 psi לניתוק. הקפד לבדוק כי הפתרון יוצא בעת לחיצה על הדוושה.
- באמצעות מיקרומטר על הבמה עם טיפה של שמן מינרלי, להתאים את עוצמת הקול ואת הזרימה של הפתרון מיקרומטר ~ 150 קוטר (על 2 nL). ודא כי הלחץ גב יאפשר כמות קטנה לטפטף החוצה של המחט. אם אין לחץ מספיק אחורי, נימיות תגרום נוזל מזין את המחט ולהשמיד את ה-mRNA.
- ברגע שהמחט מכויל, מתחילים הזרקת הבונה לתוך התא הבודד של העוברים מופרית.
הערה: פעולה זו מעבירה כמות גדולה של תרגול, סבלנות, עידון, עקב קרום התא קשה לחדור. חשוב להחדיר את הפתרון לתוך התא, לא החלמון, ליצירת דג זברה מהונדס. זה שונה מורפולינו הזרקה. זה לא משנה באיזה צד המחט חודרים לתא ככל הבונה נכנס לתא. Transgenesis יהיה שיעור נמוך מאוד של הצלחה אם מוזרק לתוך החלמון במקום התא. הזרקת תא בודד שלב חשוב גם, או דגים כמירה סומאטית ייווצר. פעולה זו תקטין את הסיכוי transgene נכנס אל תאי הנבט. - השתמש הקצה של החריץ ג'ל כדי לספק גיבוי כל הזמן העובר במקום ומאפשרת את המחט להפעיל לחץ מבלי להזיז את העובר. לאחר קצה המחט בתא בודד, לחץ על דוושת לשחרר את הכמות הרצויה של פתרון. חזור על תהליך זה עבור כל אחד מהעוברים.
- לאחר השלמת, העברת העוברים מוזרק לתוך תבשיל שכותרתו בהדחה מתוך החריץ agarose עם מערכת מים, פיפטה העברה של mL 3.4 חד פעמיות. אחסן את העוברים חממה 28.5 ° C כדי לתת להם לפתח. בדוק שוב במהלך היום הסרת עוברי דגים מתים ולהחליף מים עם 0.1% מתילן כחול במים דגים.
- כ- 6-8 שעות לאחר ההזרקה, קח 10 הפרט מוזרק דגים עוברי והכן DNA גנומי אותם באמצעות שיטה קטלנית18.
- למחרת בבוקר, להשתמש במיקרוסקופ לנתיחה עם מקור אור זריחה למיין את העוברים מציג GFP ברקמות שאינן-חלמון. אלה העוברים דגים צריך להכיל הבונה מוזרק.
- לבצע Tol2 assay בלו כדי לבדוק את פעילות transposon כפי שתואר לעיל19. אם נכרת פלסמיד יכול להתגלות, לשמור את מוזרק דגים עוברי ולגדל אותם. אם אין פלסמיד נכרת יכול להתגלות, חזור על סינתזת Tol2 mRNA את תהליך microinjection עד להשגת התוצאות החיוביות של Tol2 בלו וזמינותו.
4. הקמת ASAP1 הטרנסגניים דגים, Tg (ubi: ASAP1)
- מגדל את הדגים מוזרק (F0 הדור) לבגרות כמתואר קודם לכן הספר של דג זברה20. זה בדרך כלל לוקח כ 4 חודשים.
- קח יחיד של מבוגרים F0 דגים, לחצות אותו יחיד מול מין wildtype דגים. לאסוף דגים העוברים לאחר הרבייה בהמשך היום. שמור העוברים דגים שנאספו בחממה 28.5 ° C דגים מים עם 0.1% מתילן כחול.
- ביום השלישי, לבדוק את העוברים דגים מתחת למיקרוסקופ לנתיחה פלורסנט עם מסנן ה-GFP. למיין את עוברי דגים ירוק, אם יש כאלה, ולגדל אותם לבגרות כמו F1 ייצור הטרנסגניים דג, Tg (ubi: ASAP1).
הערה: יחס Mendelian לא צפויה שכן רוב הדגים0 F הורים כימרות גנטית בחיידקים-קו. - צלב למבוגרים-דג יחיד של F1 , עם דגים wildtype ולאסוף עוברי דגים. למיין את עוברי דגים ירוק ולגדל אותם לבגרות כמו דג דור2 F.
הערה: עוברי דגים-ירוק וירוק צריך להיות קרוב ל- 1:1 אם יש transgene יחיד. - כדי להציג שינויים פוטנציאל חשמלי בגידול כמו גידולים ממאירים במערכת העצבים ההיקפית נדן (MPNST), לחצות את הדור2 F Tg (ubi: ASAP1) דגים עם rpl35hi258/wt דגים. זה ידוע כי גלוי גידולים להתחיל למצוא בן 6-8 חודש מבוגרים21,22.
5. הדמיה
- תמונת דג זברה עוברי, לקחת מספר F2 הדור המייסד דגים, חוצים אותם עם דגים wildtype בזוגות בודדים. לאסוף דגים עוברי בשלבים התפתחותיים שונים הרצוי בהתאם דג זברה היערכות מדריך23.
- בשלבים המוקדמים של עוברי דגים, לקלף, להסיר chorions של העוברים בזהירות באמצעות זוג מלקחיים תחת טווח לנתיחה ב 10-ס מ קוטר צלחת פטרי עם דגים מערכת מים.
- העברת כמה עוברי דגים על זכוכית והקעורות עם 3% methylcellulose באמצעות פיפטה העברה חד פעמיות של 3.4 מ. התאם את העוברים למיקום הרצוי כדי להציג את הפעילות GFP הסלולר באמצעות מחט מתחת טווח לנתיחה פלורסנט.
- לשלבים נע של עוברי דגים (שגילן עולה על הבמה somite 12), להשתמש מסילייט tricaine 0.05% כדי עזים ומתנגד העוברים דגים לפני העברת שקופיות. בקצרה, עוברי דגים היו צמחו לתוך מסילייט tricaine 0.05% במים דגים עד שהפסיקו שחייה ואיזון הגוף אובדן. בנוסף, להוסיף טיפה של 0.05% מסילייט tricaine עם methylcellulose בשקופית.
- עבור פחות מ-12 somite שלב עוברי דגים, להשתמש במיקרוסקופ מתחם epi-זריחה עם המצלמה תואם, תוכנה עבור הדמיה. שגילן עולה על 12 somite הבמה דגים עוברי, להשתמש במיקרוסקופ לנתיחה קרינה פלואורסצנטית.
- תמונה מתח התא הגידול, תחילה לזהות את הדג עם גידולים MPNST. לאחר מכן, עזים ומתנגד הדג עם מסילייט tricaine 0.05%. עבור הדמיה הר שלמה, מכניסים את הדגים 10-ס מ קוטר צלחת פטרי. כדי להציג את הפעילות החשמלית של תאי הגידול, ייתכן ניסויים דגים גידולים החוצה לאחר כל הר הדמיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בזריקה מוצלחת, יותר מ 50% מוזרק דגים עוברי יציג מידה מסוימת של זריחה ירוק בתאים סומטיים ולא רובם יהיה חיובי על-ידי Tol2 transposon בלו assay (איור 2). אחרי 2-4 דורות של יותר לחצות עם דגים wildtype (עד הדג פלורסנט מגיעים 50%, היחס Mendelian הצפוי), הדג הטרנסגניים שימשו הניסוי הדמיה כדי לעקוב אחר פוטנציאל קרום התא במהלך התפתחות עובריים. ראשית, שינויי פוטנציאל ממברנה נבחנו במהלך מחזור התא בשלבים התפתחותיים עובריים מוקדם דג זברה. זה היה ציין כי התאים hyperpolarized לפני היווצרות פארו המחשוף (איור 3 א-3C, ו 1 וידאו משלימים). יתר על כן, ברקמות שונות הראה מגוון של פוטנציאל הממברנה ביום 1-3 עוברי דגים הישן. (איור 3D-3G). לדוגמה, somites ואת מיתר הגב הם בדרך כלל hyperpolarized, לעומת הרקמות/באיברים סמוכים. ברגע העוברים דג זברה הצליחו להזיז, היינו גם יכול לזהות את הפעילויות חשמל neuromuscular (איור 4, השלמה סרטון 2). כפי הקינטיות מאפייני תאים סרטניים יכול להשתנות, אנחנו ניצל לכתב ASAP1 דגים, והוא חצה אותו עם מוטציה ג'ין rpL35 , הנוטה לפתח ספונטנית ממאיר במערכת העצבים ההיקפית נדן גידולים21,24 ,25. למרות נבחנו רק כמה גידולים דגים, בשל תקופת הצמיחה זמן פוטנציאלי של המוטציה גידול דגים, זה היה מורגש שהיו הבדלים מתח בין גידולים לבין הרקמות הסובבות נושאות בשידור חי דג זברה (איור 5). לכן, התוצאות נציג הפגינו הדור מוצלחת של קו דגים תאית כתב חשמלי, ויישומו פוטנציאליים לביולוגיה התפתחותית, הסלולר.
איור 1: איור של הבנייה פלסמיד מבוסס-transposon Tol2.
(א) BP רקומבינציה שימש ASAP1 תת שיבוט לתוך הווקטור כניסה באמצע pDONR221. רצפים attB נוספו 5-סוף תחל עבור ASAP1. (B) דיאגרמה של Tol2 מבוססי transposon לבנות בהרכבת בהתבסס על רקומבינציה LR. צורת אליפסה סגולה מראה הפוכה Tol2 חוזר. קווים מקווקווים מציינים רקומבינציה הומולוגית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: תוצאות טיפוסיות של עוברי מוזרק על ידי epifluorescence ואת וזמינותו Tol2-בלו.
(א) לא-חיובי 1dpf דגים העובר. (B) מוזרק בהצלחה 1dpf דגים העובר. GFP כתמים ניכרות בתא המטען. (ג) לא-חיובי 2dpf דגים העובר. (ד) מוזרק בהצלחה 2dpf דגים העובר. GFP כתמים ניכרות בתא המטען. (ה) תוצאה נציג של Tol2 בלו וזמינותו. ליין ה-PCR 1-7 היו מוגבר 7 באופן אקראי שנבחרו עוברי דגים 8 שעות לאחר ההזרקה. האחרון הוא פקד שלילי (NC) ללא כל הדנ א. סרגל קנה מידה = 250 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: מתח דינמי משתנה במהלך התפתחות העובר דג זברה.
(א-ג) קוטביות מתח סלולארית דיפרנציאלי במהלך מיטוזה ב העוברים דגים. (א) שלב 2-תא דג זברה העובר. (ב) 4 תאים בשלב העובר. (ג) שמונה תאים בשלב העובר. ראשי החץ האדום מציינים את העמדות של התום המחשוף הפאנלים (A-C). השינויים ניכרות גם בסרט המתאים (1 וידאו משלימים). האזור סביב פארו המחשוף הוא יותר מקוטב בהשוואה לשאר התא. (D-G) מתח חשמלי דינמי משתנה בשלבים המוקדמים שונים של דג זברה העוברים. שלב 12-somite (D) . שלב 22-somite (E) . (נ) 48 שעות פוסט הפריה. (G) 72 שעות פוסט הפריה. e, עין; ht, לב; nt, מיתר הגב; אופ, שלפוחית אופטיים; ov, שלפוחית otic; pf, מקסימום; אז, somite; yk, חלמון. סרגל קנה מידה = 250 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: שינויי מתח חשמלי של הגוף דגים במהלך תנועת העובר דגים.
2 - בן יום דגים עוברי הצג neuro-שרירים חשמליים פעילויות במהלך התנועה. () - (נ) רציפים הדמיה של העובר דגים אותו. שינויי דחיסות צבע הם המתאימים התמרה חושית איתות חשמלי. מרווח הזמן בין שתי תמונות עוקבות הוא כ 12.4 אלפיות השניה. החיצים האדומים מציינים את העמדות זה מתח השתנה במהלך תקופת הדמיה. השינויים ניכרות גם בסרט המתאים (2 הסרטונים משלים). כל הלוחות הם באותו הסולם. סרגל קנה מידה = 250 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: תאים סרטניים נוטים יותר להיות מקוטב.
דג 10 - בת חודשים (rpL35hi258/wt; Tg (ubi: ASAP1) התפתח גידול ממאיר במערכת העצבים ההיקפית נדן בבטן. תמונת שדה (א) & ברייט (C) . (B) ותדמית (D) עם ערוץ ה-GFP. דג שלם (א) & (B) . (ג) & הבטן (D) הגידול היה גזור החוצה. תאים סרטניים נמצאים יותר מקוטב (בהיר ירוק) לעומת סביב רקמות (ירוק כהה). ראשי החץ הצג הגידולים. כל הלוחות הם באותו הסולם. סרגל קנה מידה = 25 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלים וידאו 1 . פלורסנטי הדמיה של איתות חשמלי בשלבים המחשוף ב Tg (ubi: ASAP1) העובר דגים. את הסרט הזה הוקלט המבט של חיה הקוטב. קרינה פלואורסצנטית ASAP1 מזוהה עם היווצרות של תאים המחשוף פארו, מבנה זמני במהלך חלוקת התא. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
וידאו משלים 2 . פלורסנטי הדמיה של אותות חשמליים Tg 2 - בן יום (ubi: ASAP1) דגים תנועת העובר. המהלך שנרשם היה מבט לרוחב של העובר דגים 2 - בן יום, לאחר ההרדמה. ASAP1 ידי קרינה פלואורסצנטית שינויים ניכרים רקמת עצב-שריר במהלך תהליך מרגש. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות הפעילות חשמל רמת הסלולר ורקמות במהלך התפתחות מחלות אנושיות התגלו לפני זמן רב, אין ויוו חשמל השינויים הדינמיים ותפקידיהם ביולוגי נותרו עדיין אינו מודע לקיומם. אחד האתגרים הגדולים הוא להמחיש ולכמת את השינויים חשמל. תיקון קלאמפ טכנולוגיה פריצת דרך עבור מעקב אחר תאים בודדים, אך את תחולת העוברים בעלי. החוליות מוגבל כי הם מורכבים של תאים רבים. צבעים מתח כימי הנוכחי הם גם לא אידיאלי שלהם רגישויות, specificities וכתוצאה רעילות. מאמצי על ההמצאה של GEVIs מספקים לנו נתיב חדש להמחיש פעילות חשמלית הסלולר ויוו ובזמן אמת. . הראנו את התהליך של יצירת קו כתב חשמלי דג זברה, Tg (ubi:ASAP1).
באמצעות קו דגים זה הכתב, אנחנו מראים הסלולר פעילויות חשמלי שניתן לפקח עליהם העוברים דג זברה. השינוי מתח חשמלי קשורה מאוד מחזור התא במהלך התפתחות עוברית מוקדמת. הבחנו ש-hyperpolarization הזה קורה לפני היווצרות של החטיבה פארו/תא המחשוף (איור 3). זאת בניגוד הידע הנוכחי דפולריזציה זה קורה לפני חלוקת התא26. לכן, עוד פרטים על קרום התא מתח משתנה במהלך מחזור התא של תאים אחרים, בעלי חיים, אדם, אם זה קשור להקשר רקמות, דרוש עוד מחקרים. מחקרים הקשורים הם כרגע בעיצומן במעבדה שלנו. יתר על כן, אימתנו כי ASAP1 הוא מסוגל לעקוב אחר שינויים פיזיולוגיים מתח למערכת העצבית-שרירית (איור 4), שבו משינוי הוא מהיר יחסית בהשוואה לשינויים במהלך מחזורי תא.
גם הוכח כי הכתב יכול לשמש גם כדי להמחיש דג זברה גידולים (איור 5). זה היה מעניין למצוא גידול התאים היו בדרך כלל יותר מקוטב בהשוואה נורמלי הרקמות הסובבות. עם זאת, אם זוהי תופעה כללית עבור כל רקמות ממאירות דורש בהמשך החקירה, עקב המגבלה של הגידול דוגמאות וסוגים של גידול דגים במחקר זה. חקירות בעתיד על קרום התא כימות קיטוב ומתח על סוגים אחרים של גידולים של תאים סרטניים אנושיים יהיה אינפורמטיבי להבנת יותר תפקידים שלה במהלך tumorigenesis.
ב פרוטוקול זה, בחרנו מקדם בכל מקום לנהוג ASAP1 ביטוי כדי לעקוב אחר כל התאים העוברים דגים. היזמים רקמה או איבר מסוים יכולה להיות אפשרות נוספת אם רק סוג התא/רקמות מסוים היא עדיפה. החיישן מתח ASAP1 הוא ביוסנסור מאופיין בצורה טובה יחסית, הוא מורכב תחום רגיש מתח של הים שפריץ מתח רגיש פוספטאז (S3-S4 הלולאה), תמורה מעגלית של GFP (ברירת המחדל היא קרינה פלואורסצנטית נמוך). דווח להתבטא על הממברנה התאית חוץ תאי נוירון האנושית ואת העכבר מוח פרוסות4,27,28. הבהירות של החיישן דומיננטית נקבעת לפי המיקומים הסתגלותי של לולאה S3-S4 ו- GFP. השינוי מהיר פלורסצנטיות ירוק היה לא סביר שנגרמו על ידי ריכוז חלבון, עקב הקצב של שינויים בהירות, סינתזה של חלבון. עם זאת, transgene, ASAP1, אולי שינתה ביטוי תאים סרטניים, בשל אופיו של אי יציבות גנומית. בנוסף ASAP1, GEVIs אחרים, כגון מחווני מתח המבוסס על archaerhodopsin (QuasAr1 ו- QuasAr2), עשוי גם להיות אפשרות טובה משלימים, מאז הם משתמשים מנגנון שונה לחלוטין, הם גם יש רגישות גבוהה ומהירות 29. בנוסף, פליטה שלהם הוא בטווח של צבע אדום. זה הופך אותם במיוחד ללא תשלום כדי ASAP1 הירוק, אם כבר קיים חלבון נמכרות אחר באותו התא. לדוגמה, ASAP1 של קוואזר יכול להיות משולב עם דג זברה Fucci30 עבור הקשר בין מחזור התא ושינויים פוטנציאל חשמלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודות המחקר דיווח בפרסום זה נתמך על ידי הלאומית המכון כללי רפואי למדעים של מכוני הבריאות הלאומיים תחת פרס מספר R35GM124913 PI4D מאוניברסיטת Purdue תמריץ התוכנית, PVM פנימי תחרותי תוכנית קרנות מחקר בסיסי. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של הסוכנים מימון. אנו מודים קואיצ'י Kawakami על Tol2 הבונה, מייקל לין עבור הבונה ASAP1, ולבנות לאונרד Zon ייצוג המקדם ubi דרך Addgene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14mL cell culture tubes | VWR | 60818-725 | E.Coli culture |
| Agarose electrophoresis tank | Thermo Scientific | Owl B2 | DNA eletrophoresis |
| Agarose RA | Amresco | N605-500G | For making the injection gels |
| Attb1-ASAP1-F primer | IDT DNA | GGGGACAAGTTTGTACAAAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA |
ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Attb2-ASAP1-R primer | IDT DNA | GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA |
ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Bright field dissection scope | Nikon | SMZ 745 | Dechorionation, microinjection, mounting |
| Color camera | Zeiss | AxioCam MRc | Fish embryo image recording |
| Concave slide | VWR | 48336-001 | For holding fish embryos during imaging process |
| Disposable transfer pipette 3.4 ml | Thermo Scientific | 13-711-9AM | Fish embryos and water transfer |
| Endonuclease enzyme, Not I | NEB | R0189L | For linearizing plasmid DNA |
| Epifuorescent compound scope | Zeiss | Axio Imager.A2 | Fish embryo imaging |
| Epifuorescent stereo dissection scope | Zeiss | Stereo Discovery.V12 | Fish embryo imaging |
| Fluorescent light source | Lumen dynamics | X-cite seris 120 | Light source for fluorescence microscopes |
| Forceps #5 | WPI | 500342 | Dechorionation and needle breaking |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Scientific | 11789020 | Gateway BP recombination cloning |
| Gateway LR Clonase II Plus enzyme | Thermo Scientific | 12538120 | Gateway LR recombination cloning |
| Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | DNA gel purification |
| Loading tip | Eppendorf | 930001007 | For loading injection solution into capilary needles |
| Methylcellulose (1600cPs) | Alfa Aesar | 43146 | Fish embryo mounting |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection |
| Microinjector | WPI | Pneumatic Picopump PV820 | Microinjection injector |
| Micro-manipulator | WPI | Microinjector MM3301R | Microinjection operation |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | For preparing capillary needle |
| Mineral oil | Amresco | J217-500ml | For calibrating injection volume |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Thermo Scientific | AM1340 | mRNA in vitro transcription |
| Monocolor camera | Zeiss | AxioCam MRm | Fish embryo image recording |
| Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4020 | Prepare small amount of plasmid DNA |
| Plastic Petri dishes | VWR | 25384-088 | For holding fish or fish embryos during imaging process |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | mRNA cleaning after in vitro transcription |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | For measuring DNA and RNA concentrations |
| Stage Micrometer | Am Scope | MR100 | Microinjection volume calibration |
| Thermocycler | Bio-Rad | T100 | DNA amplification for gene cloning |
| Thin wall glass capillaries | WPI | TW100F-4 | Raw glass for making cappilary needle |
| Tol2-exL1 primer | IDT DNA | GCACAACACCAGAAATGCCCTC | Tol2 excise assay |
| Tol2-exR primer | IDT DNA | ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG | Tol2 excise assay |
| TOP10 Chemically Competent E. coli | Thermo Scientific | C404006 | Used for transformation during gene cloning |
| Tricaine mesylate | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing fish or fish embryos |
| UV trans-illuminator 302nm | UVP | M-20V | DNA visualization |
| Water bath | Thermo Scientific | 2853 | For transformation process of gene cloning |
References
- Levin, M. Molecular bioelectricity: how endogenous voltage potentials control cell behavior and instruct pattern regulation in vivo. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3835-3850 (2014).
- Storace, D., et al. Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential. Trends in Neuroscience. 39 (5), 277-289 (2016).
- Inagaki, S., Nagai, T. Current progress in genetically encoded voltage indicators for neural activity recording. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 95-100 (2016).
- St-Pierre, F., et al. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nature Neuroscience. 17 (6), 884-889 (2014).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. , (2013).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science USA. 105 (50), 19827-19832 (2008).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Mosimann, C., et al. Ubiquitous transgene expression and Cre-based recombination driven by the ubiquitin promoter in zebrafish. Development. 138 (1), 169-177 (2011).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Ordovas, J. M. Separation of small-size DNA fragments using agarose gel electrophoresis. Methods in Molecular Biology. 110, 35-42 (1998).
- Downey, N. Extraction of DNA from agarose gels. Methods Mol Biol. 235, 137-139 (2003).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. 45 (45), (2010).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610, 612, 614 (2007).
- Kawakami, K., Koga, A., Hori, H., Shima, A. Excision of the tol2 transposable element of the medaka fish, Oryzias latipes, in zebrafish, Danio rerio. Gene. 225 (1-2), 17-22 (1998).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, Univ. of Oregon Press. (2000).
- Amsterdam, A., et al. Many ribosomal protein genes are cancer genes in zebrafish. PLoS Biology. 2 (5), E139 (2004).
- Lai, K., et al. Many ribosomal protein mutations are associated with growth impairment and tumor predisposition in zebrafish. Developmental Dynamics. 238 (1), 76-85 (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Zhang, G., et al. Comparative oncogenomic analysis of copy number alterations in human and zebrafish tumors enables cancer driver discovery. PLoS Genetics. 9 (8), e1003734 (2013).
- Zhang, G., et al. Highly aneuploid zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors have genetic alterations similar to human cancers. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107 (39), 16940-16945 (2010).
- Urrego, D., Tomczak, A. P., Zahed, F., Stuhmer, W., Pardo, L. A. Potassium channels in cell cycle and cell proliferation. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B. 369 (1638), 20130094 (2014).
- Yang, H. H., et al. Subcellular Imaging of Voltage and Calcium Signals Reveals Neural Processing In Vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
- Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 106 (49), 20812-20817 (2009).
