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Developmental Biology

ゼブラフィッシュ初期胚および腫瘍の細胞の電気的活動の可視化

Published: April 25, 2018 doi: 10.3791/57330

Summary

ここでは、胚の動きを可視化する携帯電話の電気電圧記者ゼブラフィッシュ ラインを作成するプロセスを示す、魚腫瘍細胞の生体内で

Abstract

生体電気、イオン チャネルを介する内因性電気シグナル伝達と細胞膜にあるポンプなど興奮性神経細胞と筋肉細胞のプロセスおよび他の多くの生物学的プロセスのシグナル伝達に重要な役割を果たしている萌芽期発達のパターン。しかし、生体内で電気的活動は、脊椎動物の胚発生の監視の必要性があります。遺伝的コード化蛍光電圧インジケーター (GEVIs) の進歩はこのような課題に対してソリューションを提供する可能にしました。ここでは、確立された電圧インジケーター、ASAP1 を用いたトランスジェニック電圧インジケーター ゼブラフィッシュを作成する方法について説明 (加速センサーの活動電位 1)、例として。メダカ Tol2 キットとユビキタス ゼブラフィッシュ プロモーター、ユービーアイは本研究で選ばれました。我々 はまた、ゲートウェイ サイト固有のクローニング、メダカ Tol2 トランスポゾンを用いたゼブラフィッシュ遺伝子と正規 epifluorescent 顕微鏡を使用して初期段階魚胚および魚腫瘍イメージング プロセスのプロセスを説明します。この魚のラインを使用すると、ゼブラフィッシュ胚発生と魚の幼虫の動きの間に細胞の電気電圧の変化があることがわかった。さらに、いくつかのゼブラフィッシュ悪性末梢神経鞘腫瘍の周囲の正常組織に腫瘍細胞が一般に偏極が比較して観察されました。

Introduction

生体電気は、イオン チャネルと1の細胞膜にあるポンプを介する内因性電気信号を指します。細胞膜と結合電気潜在的な現在の変化の間でイオン交換が興奮性神経細胞と筋肉細胞のプロセスを通知するに不可欠です。さらに、生体電気とイオン勾配エネルギー貯蔵、生合成および代謝産物の輸送を含む他の重要な生物学的機能のさまざまながあります。生体信号は、体軸、細胞周期、細胞分化1などの胚パターン形成の調節因子としても発見されました。したがって、シグナリングのこのタイプの誤規制から生じる多くの人間の先天性疾患を理解するために重要です。パッチク ランプは、単一のセルを記録するため広く使用されています、萌芽期の開発の生体の中に複数のセルの同時モニタリングのための理想には程遠いです。また、電圧敏感な小さな分子はまた生体内特異性、感度、毒性などのアプリケーションに最適ではありません。

多様性の創出遺伝子蛍光電圧インジケーター (GEVIs) を提供していますこの問題を克服するために新しいメカニズムをエンコードでき、萌芽期の開発の研究を簡単に適用にもかかわらず、本来神経を監視するためだった2,3のセルします。現在利用可能な GEVIs の 1 つは加速センサーの活動電位 1 (ASAP1)4です。それは電圧敏感なホスファターゼと円形に置換された緑色蛍光タンパク質の電位センサー ドメインの細胞外ループで構成されます。したがって、ASAP1 は、細胞電位変化の可視化 (偏波: 明るい緑色; 脱分極: ダーク グリーン)。ASAP1 が 2 ms オンとオフ反応ありサブスレッショルド潜在的な変更4を追跡することができます。したがって、この遺伝子解析ツールは生きているセルのリアルタイム生体監視機能の有効性の新しいレベルのことができます。萌芽期の開発で多くの人間の病気、癌などの生体電気の役割のさらなる理解が新しいに光を当てるメカニズム, 病気の治療と予防のために重大であります。

ゼブラフィッシュは、発生生物学、がん5,6を含む人間の病気の研究に強力な動物モデルを実証されています。彼らは、人間とオーソログ遺伝子の 70% を共有して同様の脊椎動物の生物学7。ゼブラフィッシュは、比較的簡単なケア、ラージ クラッチ サイズ卵、扱いやすい遺伝学、簡単な遺伝子、透明な外部萌芽期の開発、それらの生体内イメージング5,6の優れたシステムを作るを提供します。既に現在の突然変異体の魚行の大規模なソースと完全に配列されたゲノム、ゼブラフィッシュは科学的発見の比較的無制限の範囲を提供します。

生体内でリアルタイム電気細胞の活性を調べるためには、私たちはゼブラフィッシュ モデル システムと ASAP1 の活用します。本稿では、メダカ Tol2 トランスポゾン遺伝子導入を用いたゼブラフィッシュ ゲノムに電圧蛍光バイオ センサー ASAP1 を組み込む方法について説明し、萌芽期の開発、魚幼虫の動きの間にそしてライブ腫瘍細胞の電気活動を可視化します。.

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Protocol

ゼブラフィッシュ、AAALAC 承認の動物施設に収容され、パーデュー大学動物ケアおよび使用委員会 (PACUC) によって承認されたプロトコルに従ってすべての実験を行った。

1. メダカ Tol2 トランスポゾン プラスミド構築準備

注: メダカ Tol2 トランスポゾン、メダカに発見されたは、ゼブラフィッシュ研究コミュニティ8,9で広く使用されています。正常にゲートウェイ ・部位特異的組換えベース クローン システムに採用されており、メダカ Tol2 キット10として知られています。メダカ Tol2 キットも遺伝子導入の効率を向上させながら、カスタマイズされた式の構造物の作成のより便利な方法ことができます。したがって、このシステムの活用し、検証されたユビキチンプロモーターを使用して ASAP111をドライブするユビキタス ASAP1 式ゼブラフィッシュ行を作成する簡単な決断だった。

  1. 中間エントリ ASAP1 構造を作成: pDONR221 ASAP1
    1. Addgene から pcDNA3.1/Puro CAG ASAP1 (プラスミド #52519)、遺伝的コード化の電圧センサー ASAP1 構成要素を取得します。ASAP1 コーディング領域を増幅するには、プライマー (図 1) の 5' 端に attB 配列の両脇にカスタマイズされたプライマー (attB1 ASAP1F、attB2 ASAP1R) を使用して PCR を設定します。Phusion DNA ポリメラーゼはその高効率化のために選ばれた、以前に公開されたプロトコル12に基づいて PCR 条件を最適化します。
    2. TAE は、200 μ L のヒント、正規ピペットを使用してゲル 1% に 50 μ L の PCR の製品を読み込むし、約 30 分間水平ゲルタンクで 160 V で電気泳動を行います。
    3. UV transilluminator の下でゲルをチェック (353 nm)、以前に公開された13,14、UV transilluminator 下刃/メスを使用して目的のバンドを消費税し、含んでいるゲルの DNA のサンプルを入れてきれいな 1.5 mL 遠心機チューブ。
    4. ASAP1 PCR の製品のゲルの浄化を実行します。製造元の指示に従って商業 DNA ゲル精製キットを使用して摘出したゲルの DNA を回復し、水の 20 μ L に DNA を溶出します。サンプルとして 1 μ L をとり、分光光度計を用いた DNA 濃度を測定します。空白のコントロール15として水を使用してソフトウェアの指示を流れ。
    5. 100 を取る ng の PCR の製品の浄化し、150 混ぜる ng のテの 10 μ L の pDONR221 プラスミドのバッファー (10 mM トリス、1 mM EDTA pH 8.0)16。反応に BP Clonase II の 2 μ L を追加し、一晩室温で反応を孵化させなさい。
    6. 2 日目、反応にプロティナーゼ K の 1 μ L を追加し、30 分の 37 ° C で反応をインキュベートします。
    7. 変換を実行します。反応を転送し、有能なエシェリヒア属大腸菌のセルし、30 分間氷の上細胞をインキュベート Top10 の 50 μ L でそれをミックスします。その後、転送 1 分の 42 ° C の水浴に反応管はすぐにチューブを削除し、2 分間氷の上を孵化させなさい。次に、37 ° C のシェーカーにチューブを入れて、1 時間インキュベートします。
    8. チューブを取り出して、カナマイシン LB プレート上に細胞をプレートします。次に、プレート一晩 (16-18 h) 37 ° c. で孵化させなさい
    9. シングルと十分に分離コロニーをピックアップし、3 ml の LB 培地の 14 mL 細胞培養管にそれらを接種します。37 ° c 250 rpm (1 分あたり回転) の回転速度とシェーカーで一晩文化それら。
    10. Miniprep の次の命令マニュアル17商業 miniprep キットを使用してを実行します。
    11. 3-4 プラスミドをシーケンス サンガーと肯定的な pDONR221 ASAP1 を識別するシーケンスは M13F と M13R の配列のプライマーを使用してクローンします。
  2. マイクロインジェクションのメダカ Tol2 コンストラクトを作成する: pDestTol2-ubi-ASAP1
    1. シーケンスを検証 pDONR221 ASAP1 クローンと測定分光光度計の次に空白制御15として水を使用してソフトウェア命令を使用してその DNA 濃度を選択します。
    2. PDONR221 ASAP1 の 100 μ g を取るし、メダカ Tol2 キット 5 終わりプラスミドの 100 μ g と混ぜる (pENTR5'_ubi、Addgene #27320) 100、p3E polyA (メダカ Tol2 キット #302) の μ g と pDestTol2pA2 の 150 μ g (メダカ Tol2 キット #394)。8 μ L に容量を調整チューブ 1.5 mL 容マイクロで TE バッファー (トリス、1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0 10 mM) を使用し、2-5 秒の簡単な渦でよく混ぜます。プラス、LR Clonase II の 2 μ L を追加し、一晩室温で反応を孵化させなさい。
    3. 2 日目、10 μ L ピペットを使用して反応にプロティナーゼ K の 1 μ L を追加し、30 分の 37 ° C で反応をインキュベートします。
    4. 変換を実行して (手順 1.1.7-11) 上記のように肯定的なクローンを識別します。
    5. 測定シーケンスの DNA の集中を確認15分光光度計を用いた pDestTol2 ユービーアイ ASAP1 クローン (図 1 b)。通常、濃度は 200ng/μ L の周りです。

2. メダカ Tol2 トランスポザーゼ mRNA と注射溶液を準備します。

  1. 連勝大腸菌グリセロール ストック (100 μ g/mL アンピシリン) と LB プレート pCS2FA トランスポザーゼ プラスミド (メダカ Tol2 キット #396) の滅菌接種ループを使用して。インキュベーターの 37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。次の日、単一コロニーを拾うし、lb (100 μ g/mL アンピシリン) 3 mL に滅菌 10 μ L ピペット チップを使用してそれを接種します。一晩 250 rpm の回転速度とシェーカーで 37 ° C で培養します。
  2. その取扱説明書に続く商業 miniprep キットを使用してE. 大腸菌文化 miniprep を実行します。14,000 rpm で 1 分遠心分離機による TE バッファーの 30-50 μ L にプラスミド DNA を溶出し、その DNA 濃度を分光光度計で測定します。
  3. 私にプラスミッドの 1-2 μ g のエンドヌクレアーゼをリニア化し、浄化のクリーニング キットがなかった後の取扱説明書を次の DNA と DNA 消化。5 μ L の水に 1 分 14,000 rpm で遠心分離で DNA を溶出します。予想される濃度は約 200-300 ng/μ L。
  4. 生体外のトランスクリプションを実行しないと私は商業 SP6 転写キットを使用して DNA のテンプレートとして pCS2FA トランスポザーゼを線形化します。
  5. 反応が完了すると、mRNA 商業 RNA クリーニング キットの製造元の指示に従ってメダカ Tol2 転移を浄化します。最後に、mRNA を 20 μ L RNAase 無料水に溶出し、分光光度計で RNA 濃度を測定します。予想される濃度は 1-3 μ g/μ L のサンプルは、必要な場合-80 ° C のフリーザーで保存できます。
  6. 20 ng/μ L pDestTol2-ユービーアイを混合することによってマイクロインジェクション ソリューションを準備-ASAP1 とメダカ Tol2 トランスポザーゼ mRNA (100 ng/μ L) ピペットで遠心管に。繰り返し融解と凍結、分注 6 μ L チューブ/による核酸の劣化を防止し、将来使用するため-80 ° C のフリーザーで保存します。

3. マイクロインジェクション

  1. 注入前に午後 4-6 繁殖タンク男性少なくとも 2 名と女性 2 名を設定します。これらの魚は、午後に取り込まれないする必要があります。この手順は魚の無駄の量を減らす、繁殖応答を誘導しながらも、次の朝をそれらをきれいにする時間を節約します。
  2. 次の朝、削除準備注射液 (pDestTol2-ubi-ASAP1 構造とメダカ Tol2 mRNA)-80 ° C のフリーザーから氷の場所と。
  3. 魚のタンクを繁殖の仕切りを引き、魚の仲間を許可します。一般的に、魚は分割線から撤退した後 20-30 分以内の卵を産みます。そうでない場合は、1-2 時間以上を待ちます。いくつかの魚は、すべての卵を置くかもしれない。この場合、魚の胚のコレクションのこの実験を繰り返します。
  4. 待っている間、針の先端の鉗子、またはワイパーは繊細なタスクに分割することにより面取りを作成する角度で壊れたで準備があることを確認します。
    1. 次のパラメーターを使用してマイクロ ピペット引き手を引いて、毛細管ガラスから針: 熱 545;プル 60;速度 80;時間 250;圧力 500。(接眼部径推定法の定規) と郭清範囲の下に鉗子で角約 45 ° で鉗子を保持することによって針を破る。マイクロインジェクター設定によって変数をすることができます必要なニードル径が小さい直径、胚の死亡率を減少させるため推奨。
  5. 魚は、卵を産んでいる、一度 10 cm 径シャーレでそれらを収集し、郭清範囲にそれらをもたらします。すべて異常な胚を削除および魚の無駄。
  6. ピペットに準備された 3% の agarose 注入受精卵型します。場所に胚を保つために余分な水を削除します。
  7. すべての行は、実行可能な胚で満ちている、一度単一のすべてのセルが約 45 ° の角度で水平方向にある針に向かって同じ方向を向くように配置します。これする注入が簡単に後で。
  8. 手袋を着用しながら 20 μ L ロード ピペットを使用して、ヒントし、氷のチューブから準備された構成の 5 μ L を削除します。
  9. 慎重に先端近くに試薬を痛まなくて、タッパーを出すまで壊れた毛管チューブのバック エンドに先端を挿入します。空気の泡がある場合、は、先端を壊さないようにして、針を振る。
  10. マイクロインジェクション針ホルダーにまっすぐ針を挿入し、針の位置に固定されるまで慎重に締め。約 45 ° までの角度を調整します。
  11. 針が準備し、添付、顕微鏡およびガス圧力タンクを入れます。商業 CO2タンクは通常この目的に適しています。保持と射出圧力で噴射量を調整: 0.5 psi の保持のため、放出の 30 の psi を近似します。必ずペダルを押すときに解決策が出てくることを確認してください。
  12. ボリュームおよび 〜 150 μ m の解決策の流れ調整鉱物油のドロップでステージ マイクロメータを使用する (約 2 nL)。背圧針のうち点滴少量できるようになることを確認します。十分な背圧がない場合、毛細管は針を入力して mRNA を破壊する液体になります。
  13. 針が校正され、受精胚の単一のセルにコンストラクトを注入を開始します。
    注: これは大量の練習、忍耐力と繊細さ、細胞膜を貫通しにくいためかかります。セル、卵黄はない、トランスジェニックゼブラフィッシュを生成するために薬液を注入することが重要です。これは morpholino 注入から異なります。どっち針に入る限り構造体は、セル、セルの問題ではないです。セルではなく卵黄に注入される場合、遺伝子は非常に低い成功率を持ちます。単一セル段噴射も重要であるまたは体細胞キメラ魚が作成されます。これは生殖細胞に入る遺伝子の可能性が低くなります。
  14. 胚の場所で保持でき、胚を動かさずに圧力を適用するのに針の支持を提供するためにゲルのノッチのエッジを使用します。針の先端は、単一のセル、ソリューションの適切な量を解放するためにペダルを押します。胚のすべてに対してこのプロセスを繰り返します。
  15. 完了したら、魚システム水と使い捨て 3.4 mL 転送ピペット agarose の切り込みからそれらを洗浄によってラベル付けされた皿に注入された胚を転送します。胚を開発できるようにする 28.5 ° C の定温器に格納します。死んだ魚の胚を取り外し終日戻って確認し、魚の水に 0.1% メチレン ブルーと水を交換します。
  16. 注入後、約 6-8 時間取る 10 個々 の注入は胚を魚し、名手法18を使用してそれらからゲノム DNA を準備します。
  17. 次の朝は、卵黄以外の組織における GFP を示す胚を整理する蛍光光源を解剖顕微鏡を使用します。これらの魚の胚は、注入されたコンス トラクターを含める必要があります。
  18. 19を前述のように、トランスポゾン動作をチェックするメダカ Tol2 消費税分析を実行します。摘出したプラスミドを検出できる場合保持、注入された胚を魚し、それらを上げます。摘出したプラスミドを検出されない場合は、メダカ Tol2 物品税法の肯定的な結果を達成するまでメダカ Tol2 mRNA マイクロインジェクションの合成とプロセスを繰り返します。

4 遺伝子組換え ASAP1 魚、Tg の確立 (ubi: ASAP1)

  1. ゼブラフィッシュ本20で前述した成人に注入された魚 (F0世代) を上げます。これは通常約 4 ヶ月がかかります。
  2. シングル大人 F0に魚を取るし、反対の性別の野生型魚シングル クロスします。後の日に繁殖した魚の胚を収集します。0.1% メチレン ブルーと水の魚で 28.5 ° C の定温器で収集した魚の胚を維持。
  3. 3 日目、GFP フィルターと蛍光解剖顕微鏡の下に魚の胚を確認します。存在する場合、緑の魚の胚を整理し、F1世代遺伝子組換え魚、Tg として大人にそれらを上げる (ubi: ASAP1)。
    注: 親の F0魚のほとんどは細菌ライン遺伝子キメラ メンデル比は想定されていません。
  4. 野生型の魚の単一の F1成魚をクロスし、魚の胚を収集します。緑の魚の胚を整理し、F2世代魚として大人にそれらを上げます。
    注: 緑と非緑の魚の胚に近くなるはず 1:1 単一の遺伝子があるか。
  5. 悪性末梢神経鞘腫瘍 (鞘) のような腫瘍の電気潜在的な変更を表示するクロス F2世代 Tg (ubi: ASAP1) rpl35hi258/重量魚と魚。目に見える腫瘍が 6-8 ヶ月大人21,22を開始することが知られています。

5. イメージング

  1. ゼブラフィッシュ胚の画像、複数の F2世代創始者に魚を取る個々 のペアで野生型魚とそれらを交差します。ステージング ガイド23ゼブラフィッシュによると異なる必要な発達段階で魚の胚を収集します。
  2. 魚の胚の初期段階で、皮をむくし、慎重に 10 cm 径シャーレ魚システム水で郭清範囲下組の鉗子を用いた胚の絨毛を削除します。
  3. 3.4 mL 使い捨て可能な移動のピペットを使用して 3% セルロースと凹面ガラスのスライドにいくつかの魚の胚を転送します。蛍光郭清範囲の下に針を使用して携帯電話の GFP のアクティビティを表示する目的の位置に胚を調整します。
  4. 魚の胚 (12 体節期以前) の移動の段階では、スライドに転送する前に魚の胚を麻酔するのに 0.05 %tricaine 酸イマチニブを使用します。簡単に言えば、彼らはスイミングとボディ バランスの損失を停止するまで魚の胚が魚水 0.05 %tricaine 酸イマチニブに出現しました。また、スライドに 0.05 %tricaine メシル酸、セルロースとのドロップを追加します。
  5. 未満 12 体節期魚胚、互換性のあるカメラとソフトウェア イメージング用エピ蛍光顕微鏡を使用します。12 体節胚の魚よりも古い、蛍光解剖顕微鏡を使用します。
  6. 腫瘍のセル電圧をイメージ、最初鞘腫魚を識別します。その後、0.05 %tricaine 酸イマチニブで魚を麻酔します。全体のマウント用に、10 cm 径シャーレに魚を置きます。腫瘍細胞の電気的活動を表示するには、魚腫瘍のうち全台紙のイメージング後解剖にしたことがあります。

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Representative Results

成功した射出、以上 50% 注入魚胚体細胞に緑の蛍光性の程度が表示され、それらのほとんどはメダカ Tol2 トランスポゾン消費税法 (図 2) によってプラスになります。2 4 世代のアウトなしの野生型魚 (まで蛍光魚 50%、メンデルの予想比) とクロス後、遺伝子導入魚は、萌芽期の開発の間に細胞の膜電位を追跡するイメージングの実験のために使用されました。まず、膜電位変化は、ゼブラフィッシュ初期胚の発達段階の中に細胞周期を通じて調べた。胸の谷間形成 (3 a を図-3、および補足のビデオ 1) 前に細胞が過分極が観察されました。また、さまざまな組織を示したさまざまな膜電位 1-3 日で古い魚の胚。(図 3 Dより、3 g)。たとえば、距離と脊索が一般的に過分極、隣接組織/臓器と比較しています。Zebrafish の胚が移動することができると、また神経筋の電気的活動 (図 4補助ビデオ 2) を検出することができました。癌細胞の生体プロパティを変更ことができます、私たちの魚、この ASAP1 記者の利点を取った、自発的な悪性末梢神経鞘腫瘍21,24 を受けやすいので、 rpL35遺伝子の変異体と交差 ,25。魚腫瘍変異のため長い間潜在的な成長期のため、いくつか魚腫瘍のみを調べたライブ担ゼブラフィッシュ (図 5) 腫瘍と周囲の組織との間の電圧差があったこと顕著だった。したがって、これらの代表的な結果は、細胞の電気記者魚線、および発達と細胞生物学への潜在的な応用が正しく生成を示した。

Figure 1
図 1: メダカ Tol2 トランスポゾンを用いたプラスミド構築の図。
(A) BP の再結合は ASAP1 サブ pDONR221 中間エントリ ベクトルへのクローニングに使われました。attB 配列は、ASAP1 のプライマーの 5 最後に追加しました。(B)メダカ Tol2 トランスポゾン ベースのダイアグラムは、LR の再結合に基づく組立を構築します。紫の楕円形は、メダカ Tol2 反転を繰り返すを示しています。点線は相同組換え。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 落射蛍光とメダカ Tol2 物品税法によって注入された胚の典型的な結果。
(A)正の 1dpf 魚の胚。(B)正常に 1dpf 魚の胚に注入。GFP スポットはトランクに表れています。(C)非正 2dpf 魚胚。(D)正常に 2dpf 魚の胚に注入。GFP スポットはトランクに表れています。(E)メダカ Tol2 物品税法の代表的な結果です。1-7 PCR はランダムに 7 から増幅されたレーンは注射後 8 時間魚の胚を選択しました。最後の 1 つは、任意の DNA なし負の制御 (NC) です。スケール バー = 250 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 動的電圧はゼブラフィッシュ胚の開発の間に変更します。
(A ~ C)有糸分裂の魚類胚における差動細胞電圧極性。(A) 2 細胞期ゼブラフィッシュ胚。(B) 4 細胞期胚。(C) 8 細胞期胚.赤い矢印は、パネル (A~C) 胸の谷間溝の位置を示します。変更も対応する映画 (補助ビデオ 1) で明らかです。胸の谷間溝周辺の地域は、偏極よりはセルの残りの部分と比較してです。(D G)ゼブラフィッシュ胚の初期段階の動的電気電位が変化。(D) 12 体節期。(E) 22 体節期。(F) 48 時間後受精の。(G) 72 時間後受精の。e、目ht、心nt脊索;op光小胞;ov、耳胞;pf胸鰭;だから、体節;有限会社卵黄。スケール バー = 250 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: 魚の胚の動きの間に魚の体の電気電圧の変化。
2 日間の古い魚胚神経筋電気活動を表示する運動。(A) - (F)同じ魚胚の連続画像色の密度の変化、電気シグナル伝達に対応します。2 つ連続する画像間の間隔は約 12.4 ミリ秒です。赤い矢印は、イメージングの期間中に電圧の変更位置を示します。変更も対応する映画 (補助ビデオ 2) で明らかです。すべてのパネルが同じスケールです。スケール バー = 250 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: 腫瘍細胞より分極される傾向があります。
生後 10 ヶ月の魚(rpL35hi258/重量;Tg (ubi: ASAP1) 腹部の悪性末梢神経鞘腫瘍を開発しました。(A)(C)明るいフィールド画像。(B)(D) GFP のチャンネルに画像。(A)及び(B)そのまま魚。(C)及び(D)腹部の腫瘍を切開し。腫瘍細胞より偏光 (明るい緑) 周囲の組織 (ダーク グリーン) と比較して。矢印は、腫瘍を示しています。すべてのパネルが同じスケールです。スケール バー = 25 mm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

補足動画 1.Tg で胸の谷間段階で電気信号の Epifluorescent イメージング (ユービーアイ: ASAP1) 魚の胚。動物極のビューを記録したこの映画。ASAP1 蛍光細胞胸の谷間溝、細胞分裂時に一時的な構造体の形成に関連付けられます。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください

補足動画 2.2 日間の古い Tg の中に電気信号の Epifluorescent イメージング (ユービーアイ: ASAP1) 魚の胚の動き。移動は anesthetization 後 2 日間の古い魚胚の側面から記録されました。、ASAP1 の蛍光変化は移動プロセス中に筋組織に表れています。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください

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Discussion

萌芽期の開発および人間の病気中の細胞およびティッシュ レベル電気活動が長い時間前に発見されたが生体内での動的電気的変化とその生物学的役割まだ主は不明のまま。電気的変化を定量化を視覚化して主要な課題の 1 つです。パッチ ・ クランプの技術は単一のセルを追跡するため、休憩が、彼らは多くの細胞で構成されているために、脊椎動物の胚への応用は限られました。現在の電圧の化学染料も、感度、特異性、および毒性のために理想的ではありません。GEVIs の発明に関する最近の取り組み私たち体内細胞の電気活動を可視化する新しいパスを提供し、リアルタイムで。ここでは、我々 はゼブラフィッシュ電気記者ライン、Tg の作成のプロセスを示した (ユービーアイ:ASAP1)。

ゼブラフィッシュ胚における監視できる細胞の電気的活動を示す記者魚行を使用して、.電気の電圧変化は、初期胚の中に細胞周期に関連性の高い。我々 は、その過分極が起こる胸の谷間溝/細胞分裂 (図 3) の形成の前に観察しました。これは現在の知識と対照をなして、その消極性は細胞分裂26前に起こる。したがって、細胞膜電位の詳細については、他の動物と人間の細胞の細胞周期の変化、これは組織コンテキストに関連するかどうかさらに研究が必要があります。現在当研究室で研究がなされています。さらに、ASAP1 は、変化が比較的高速な細胞周期中の変更と比較して神経筋システム (図 4) の生理学的な電圧の変化を追跡することを検証しました。

この記者はゼブラフィッシュ腫瘍 (図 5) を視覚化するも使用できますをも示した。腫瘍細胞がより偏極一般的に周囲の正常組織に比較を見つけるは興味深いでした。しかし、これはすべて悪性組織の一般的な現象であるかどうか調べる必要がありますさらに、腫瘍のサンプルと本研究では魚の腫瘍のタイプの制限のため。腫瘍とひと癌細胞の他のタイプの細胞膜の分極と電圧の定量化に関する将来の調査はよりよい腫瘍の中にその役割の理解のために有益になります。

このプロトコルでは、魚の胚のすべてのセルを追跡する ASAP1 式を運転するユビキタス プロモーターを選んだ。組織や器官の特定のプロモーターは、場合にのみ特定の細胞・組織の種類をお勧め別のオプションかもしれない。ASAP1 電圧センサーが比較的よく特徴付けられるバイオ センサーとホヤ電位感受性ホスファターゼ (S3 S4 ループ) の電圧敏感なドメインと GFP の円順列で構成されます (デフォルトは低い蛍光性)。人間ニューロン細胞とマウスの脳スライス4,27,28外細胞膜に発現すること報告されました。センサーの明るさは、優性 S3 S4 ループと GFP の構造の位置によって決まります。急速な蛍光グリーンの変更は、輝度の変化とタンパク質合成の速度のための蛋白質の集中によって引き起こされる可能性ができませんでした。ただし、遺伝子、ASAP1、ゲノム不安定性の性質の腫瘍細胞における発現を変更可能性があります。ASAP1、に加えてアーキロドプシン ベース電圧インジケーター (QuasAr1 および QuasAr2) など、他の GEVIs もオプションがあります良い補完、以来、彼らは完全に別のメカニズムを使用して、彼らはまた、感度が高いと29を高速化します。さらに、排出量は赤い色範囲内です。これになります特にインター グリーンの ASAP1 に同じセルに既に別の蛍光蛋白質がある場合。たとえば、ASAP1 やクエーサーは、Fucci ゼブラフィッシュ30細胞周期と電位変化との関係を研究するためと組み合わせることができます。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この出版物で報告された研究がによって国立科学研究所の一般医療賞数 R35GM124913、パデュー大学 PI4D インセンティブ プログラム、および PVM 内部競争の下で健康の国民の協会のサポートされていた基本的な研究資金プログラムです。内容は著者の責任と資金調達エージェントの公式見解を必ずしも表さない。メダカ Tol2 構築、ASAP1 構造体のマイケル ・ リンありがとう川上浩一、 ubiプロモーターのレナード ・ ゾンを Addgene を構築します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
14mL cell culture tubes VWR 60818-725 E.Coli culture
Agarose electrophoresis tank Thermo Scientific Owl B2 DNA eletrophoresis
Agarose RA Amresco N605-500G For making the injection gels
Attb1-ASAP1-F primer IDT DNA GGGGACAAGTTTGTACAAAAAA
GCAGGCTTCACCATGGAGACGA
CTGTGAGGTATGAACA
ASAP1 coding region amplification for subcloning
Attb2-ASAP1-R primer IDT DNA GGGGACCACTTTGTACAAGAAA
GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC
AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA
ASAP1 coding region amplification for subcloning
Bright field dissection scope Nikon SMZ 745 Dechorionation, microinjection, mounting
Color camera Zeiss AxioCam MRc Fish embryo image recording
Concave slide VWR 48336-001 For holding fish embryos during imaging process
Disposable transfer pipette 3.4 ml Thermo Scientific 13-711-9AM Fish embryos and water transfer
Endonuclease enzyme, Not I NEB R0189L For linearizing plasmid DNA
Epifuorescent compound scope Zeiss Axio Imager.A2 Fish embryo imaging
Epifuorescent stereo dissection scope Zeiss Stereo Discovery.V12 Fish embryo imaging
Fluorescent light source Lumen dynamics X-cite seris 120 Light source for fluorescence microscopes
Forceps #5 WPI 500342 Dechorionation and needle breaking
Gateway BP Clonase II Enzyme mix Thermo Scientific 11789020 Gateway BP recombination cloning
Gateway LR Clonase II Plus enzyme Thermo Scientific 12538120 Gateway LR recombination cloning
Gel DNA Recovery Kit Zymo Research D4002 DNA gel purification
Loading tip Eppendorf 930001007 For loading injection solution into capilary needles
Methylcellulose (1600cPs) Alfa Aesar 43146 Fish embryo mounting
Methylene blue Sigma-Aldrich M9140 Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes
Microinjection mold Adaptive Science Tools TU-1 To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection
Microinjector WPI Pneumatic Picopump PV820 Microinjection injector
Micro-manipulator WPI Microinjector MM3301R Microinjection operation
Micropipette puller Sutter instrument P-1000 For preparing capillary needle
Mineral oil Amresco J217-500ml For calibrating injection volume
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Thermo Scientific AM1340 mRNA in vitro transcription
Monocolor camera Zeiss AxioCam MRm Fish embryo image recording
Plasmid Miniprep Kit Zymo Research D4020 Prepare small amount of plasmid DNA
Plastic Petri dishes VWR 25384-088 For holding fish or fish embryos during imaging process
RNA Clean & Concentrator-5 Zymo Research R1015 mRNA cleaning after in vitro transcription
Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 2000 For measuring DNA and RNA concentrations
Stage Micrometer Am Scope MR100 Microinjection volume calibration
Thermocycler Bio-Rad T100 DNA amplification for gene cloning
Thin wall glass capillaries WPI TW100F-4 Raw glass for making cappilary needle
Tol2-exL1 primer IDT DNA GCACAACACCAGAAATGCCCTC Tol2 excise assay
Tol2-exR primer IDT DNA ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG Tol2 excise assay
TOP10 Chemically Competent E. coli Thermo Scientific C404006 Used for transformation during gene cloning
Tricaine mesylate Sigma-Aldrich A5040 For anesthetizing fish or fish embryos
UV trans-illuminator 302nm UVP M-20V DNA visualization
Water bath Thermo Scientific 2853 For transformation process of gene cloning

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References

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今月はゼウス、問題 134、生体電気、細胞膜の潜在性、萌芽期の開発、ゼブラフィッシュ、ASAP1 (活動電位 1 の加速センサー)、GEVIs (遺伝子にエンコードされた電圧のポインター)
ゼブラフィッシュ初期胚および腫瘍の細胞の電気的活動の可視化
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Silic, M. R., Zhang, G.More

Silic, M. R., Zhang, G. Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors. J. Vis. Exp. (134), e57330, doi:10.3791/57330 (2018).

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