Summary
Ici, nous montrons le processus de création d’une ligne de poisson-zèbre de journaliste tension électrique cellulaire afin de visualiser le développement embryonnaire, mouvement, et des cellules de tumeur de poissons in vivo.
Abstract
Bioélectricité, signalisation électrique endogène véhiculée par les canaux ioniques et pompes situées sur la membrane cellulaire, joue un rôle important dans la signalisation des processus des cellules neuronales et musclés excitables et nombreux autres processus biologiques, tels qu’embryonnaire structuration du développement. Toutefois, il est nécessaire de in vivo , activité électrique suivi dans l’embryogenèse vertébré. Les avancées des indicateurs de tension fluorescents génétiquement encodé (GEVIs) ont permis d’apporter une solution à ce défi. Nous décrivons ici comment créer un zebrafish indicateur de tension transgéniques à l’aide de l’indicateur de tension établie, ASAP1 (accélération capteur de potentiels d’Action 1), à titre d’exemple. Le kit Tol2 et un promoteur omniprésent zebrafish, ubi, ont été choisis dans cette étude. Nous expliquons aussi les procédés de clonage à des fins spécifiques au site passerelle, transgenèse zebrafish axée sur le transposon Tol2 et le processus d’imagerie des tumeurs embryons et poisson poisson précoce, à l’aide de microscopes ordinaires épifluorescente. En utilisant cette ligne de poissons, nous avons constaté qu’il y a des variations de tension électrique cellulaire durant l’embryogenèse de poisson-zèbre et mouvement larves des poissons. En outre, il a été observé que dans les tumeurs de la gaine de nerf périphérique malin zebrafish quelques, la tumeur des cellules ont été généralement polarisées par rapport aux tissus normaux environnants.
Introduction
Bioélectricité se réfère à la signalisation électrique endogène véhiculée par les canaux ioniques et pompes situées sur la membrane de la cellule1. Échanges ioniques à travers la membrane cellulaire et les changements actuels et potentiels électriques couplés, sont essentiels pour la signalisation des processus des cellules neuronales et musclés excitables. En outre, bioélectricité et gradients ioniques ont une variété d’autres fonctions biologiques importantes, y compris le stockage de l’énergie, la biosynthèse et transport de métabolite. Signalisation bioélectrique a également été découvert en tant que régulateur de la formation embryonnaire, tels que les axes du corps, le cycle cellulaire et la différenciation des cellules1. Ainsi, il est essentiel pour la compréhension de nombreuses maladies et malformations congénitales humaines résultant de la mauvaise régulation de ce type de signalisation. Patch clamp d’a été largement utilisé pour l’enregistrement des cellules isolées, mais il est loin d’être idéal pour la surveillance simultanée de plusieurs cellules au cours du développement embryonnaire in vivo. En outre, sensibles petites molécules de tension ne sont également pas idéales pour des applications in vivo en raison de leurs spécificités et sensibilités des toxicités.
La création d’une variété de génétiquement encodé tension fluorescent indicateurs (GEVIs) propose un nouveau mécanisme pour régler ce problème et permet une application à l’étude du développement embryonnaire, même si elles étaient initialement destinées à surveillance neurale les cellules2,3. D'entre les GEVIs actuellement disponibles est le capteur accélération de potentiels d’Action 1 (ASAP1)4. Il est composé d’une boucle extracellulaire d’un domaine de détection de tension de phosphatase sensibles de tension et une protéine fluorescente verte circulairement permutée. Par conséquent, ASAP1 permet la visualisation des changements de potentiel électrique cellulaires (polarisation : vert vif ; dépolarisation : vert foncé). ASAP1 a 2 ms et-marche cinétique et peut suivre une éventuelle variation4. Ainsi, cet outil génétique permet à un nouveau niveau d’efficacité en temps réel de surveillance bioélectriques dans des cellules vivantes. Mieux comprendre les rôles de la bioélectricité dans le développement embryonnaire et de nombreuses maladies humaines, comme le cancer, mettra en lumière nouvelle sur les mécanismes sous-jacents, ce qui est essentiel pour la prévention et le traitement de la maladie.
Poisson zèbre ont fait leurs preuves un puissant modèle animal pour étudier la biologie du développement et des maladies humaines, y compris le cancer5,6. Ils partagent des gènes orthologues 70 % avec les humains, et ils ont biologie vertébrée similaire7. Poisson zèbre fournir relativement facile d’entretien, une grande couvée de œufs, tractable génétique, transgénèse facile et le développement embryonnaire externe transparent, qui en font un système supérieur pour in vivo d’imagerie5,6. Avec une source importante de lignées de poisson mutant déjà présentes et un génome entièrement séquencé, zebrafish fournira une gamme relativement illimitée de la découverte scientifique.
Pour étudier l’in vivo en temps réel l’activité électrique des cellules, nous profitons du système de modèle de poisson-zèbre et ASAP1. Dans cet article, nous décrivons comment incorporer le biocapteur de tension fluorescent ASAP1 dans le génome de poisson-zèbre à l’aide de Tol2 transposon transgénèse et visualiser l’activité électrique cellulaire durant le développement embryonnaire, mouvement larves de poisson et dans la tumeur direct .
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Protocol
Le poisson-zèbre sont logés dans une animalerie approuvé par AAALAC, et toutes les expériences ont été réalisées selon les protocoles approuvés par le Comité de l’emploi (PACUC) et de Purdue animalier.
1. Tol2 Transposon plasmide Construct préparation
Remarque : Tol2, un transposon qui a été découvert en poisson medaka, a été employé couramment dans le poisson-zèbre recherche communautaire8,9. Il a été avec succès adoptée pour le système de passage spécifique axée sur la recombinaison clonage et connu comme le kit de Tol210. Le kit Tol2 permet un moyen plus pratique de créer des constructions d’expression personnalisée, tout en augmentant l’efficacité de la transgenèse. Ainsi, il a été une décision facile à prendre avantage de ce système et créer une ligne de poisson-zèbre expression ASAP1 omniprésente en utilisant un promoteur validés ubiquitin à conduire ASAP111.
- Création d’une construction centrale entrée ASAP1 : pDONR221-ASAP1
- Acquérir la construction du capteur ASAP1 tension génétiquement encodé, pcDNA3.1/Puro-CAG-ASAP1 (plasmide #52519), de Addgene. Pour amplifier la région codante de ASAP1, mis en place un PCR avec des amorces personnalisés (attB1-ASAP1F et attB2-ASAP1R) flanqués de séquences attB à l’extrémité 5' des amorces (Figure 1). Phusion ADN polymérase a été choisi pour sa grande efficacité, et conditions de la PCR ont été optimisées basé sur le protocole publiées antérieurement12.
- Charger les produits PCR 50 µL dans un 1 % TAE gel à l’aide d’une pipette ordinaire avec 200 conseils µL et effectuer l’électrophorèse à 160 V dans un réservoir horizontal de gel pendant environ 30 min.
- Vérifier le gel sous un Transilluminateur UV (353 nm), l’accise sur la bande désirée à l’aide de lame/scalpel sous un Transilluminateur UV comme précédemment publiés13,14et mettre l’échantillon de gel contenant de l’ADN dans une microcentrifugeuse propre 1,5 mL tube.
- Accomplissent gel de purification pour les produits de PCR ASAP1. Récupérer l’ADN contenu dans le gel excisé en utilisant un kit de purification de gel ADN commercial suivant les instructions du fabricant et éluer l’ADN dans 20 µL d’eau. Prendre 1 µL comme un échantillon et mesurer la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre. Coulent les instructions du logiciel utilisant l’eau comme un contrôle à blanc15.
- Prenez 100 ng de purifié produit de PCR et mélangez-le avec 150 ng de plasmide pDONR221 dans 10 µL de TE mettre en mémoire tampon (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8.0)16. Ajouter 2 µL de II Clonase BP dans la réaction et incuber la réaction à la température ambiante pendant la nuit.
- Le deuxième jour, ajouter 1 µL de protéinase K dans la réaction et incuber la réaction à 37 ° C pendant 30 min.
- Effectuer la transformation. La réaction de transfert et le mélanger avec 50 µL de Top10 compétentes d' e. coli cellules et incuber les cellules sur la glace pendant 30 min. Puis, transfert immédiatement, le tube de réaction dans un bain-marie à 42 ° C pendant 1 min. Retirez le tube et incuber sur glace pendant 2 min. Ensuite, mettre le tube dans un shaker de 37 ° C et il incuber pendant 1 heure.
- Retirez le tube et plaque les cellules sur une plaque de kanamycine LB. Ensuite, incuber la plaque du jour au lendemain (16-18 h) à 37 ° C.
- Prélever des colonies simples et bien séparées et les ensemencer des tubes de culture de cellules de 14 mL avec 3 mL de milieu LB. Leur culture pendant une nuit à 37 ° C dans un shaker avec une vitesse de rotation de 250 tr/min (rotation par minute).
- Effectuer miniprep utilisant un kit commercial miniprep après son instruction manuel17.
- Séquence 3-4 plasmides avec Sanger séquençage d’identifier positive pDONR221-ASAP1 clones en utilisant des amorces de séquençage de M13F et M13R.
- Créer la construction Tol2 de microinjection : pDestTol2 -ubi-ASAP1
- Choisissez que le séquençage vérifiée mesure et pDONR221-ASAP1 clone sa concentration d’ADN utilisant un spectrophotomètre qui suit l’instruction de logiciels utilisant l’eau comme un blanc de contrôle15.
- Prendre 100 µg de pDONR221-ASAP1 et mélangez-le avec 100 µg de plasmide de Tol2 kit 5-fin (pENTR5'_ubi, Addgene #27320), 100 µg de p3E-polyA (Tol2 kit #302) et 150 µg de pDestTol2pA2 (Tol2 kit #394). Ajuster le volume total à 8 µL tampon TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) dans un microtubes de 1,5 mL tube et bien mélanger en un tourbillon brève de 2-5 s. Ensuite, ajouter 2 µL de LR Clonase II plus et incuber la réaction à la température ambiante pendant la nuit.
- Le deuxième jour, ajouter 1 µL de protéinase K dans la réaction à l’aide d’une pipette µL 10 et incuber la réaction à 37 ° C pendant 30 min.
- Exécuter la transformation et identifier les clones positifs tel que décrit ci-dessus (pas 1.1.7-11).
- Mesure la concentration d’ADN de séquençage vérifié pDestTol2-ubi-ASAP1 clone (Figure 1 b) à l’aide d’un spectrophotomètre à15. La concentration est généralement autour de 200ng/µL.
2. préparer Tol2 Transposase ARNm et Solution injectable
- Strie e. coli glycérol stock du plasmide pCS2FA-transposase (Tol2 kit #396) sur un plat de livre (avec 100 ampicilline µg/mL) en utilisant une boucle de l’inoculation stérilisé. Incuber les plaques à 37 ° C dans un incubateur pendant la nuit. Le lendemain, prélever une colonie unique et ensemencer il dans 3 mL de LB (ampicilline 100 µg/mL) à l’aide d’une pointe de pipette 10 µL stérilisé. Culture du jour au lendemain à 37 ° C dans un shaker avec une vitesse de rotation de 250 tr/min.
- Effectuer miniprep sur la culture d’e. coli en utilisant un kit commercial miniprep suivant le mode d’emploi. Éluer l’ADN de plasmide dans 30 à 50 µL de tampon TE en 1 minute centrifuger à 14 000 tr/min et mesurer la concentration d’ADN avec un spectrophotomètre.
- Linéariser 1 à 2 µg de plasmide avec pas j’ai endonucléase et purifier l’ADN avec un ADN kit pas j’ai après son mode d’emploi de nettoyage digestion. Éluer l’ADN dans 5 µL d’eau par centrifugation à 14 000 tr/min pendant 1 minute. La concentration prévue est d’environ 200-300 ng/µL.
- Effectuer en vitro transcription avec Not je linéarisé pCS2FA-transposase comme une matrice d’ADN à l’aide d’une trousse commerciale de transcription SP6.
- Une fois la réaction terminée, purifier Tol2 transposase ADN messagère utilisant un nettoyage commercial de RNA kit suivant les instructions du fabricant. Enfin, éluer les ARNm dans l’eau sans ARNase 20 µL et mesurer la concentration d’ARN dans un spectrophotomètre. La concentration prévue est d’environ 1 à 3 µg / µL. les échantillons peuvent être stockés dans un congélateur à-80 ° C si nécessaire.
- Préparer la solution de microinjection en mélangeant 20 ng/µL pDestTol2 -ubi-ASAP1 et Tol2 transposase ARNm (100 ng/µL) dans un tube de microcentrifuge de pipetage. Pour prévenir la dégradation de l’acide nucléique provoquée par le dégel répétés et de regel, aliquote de 6 µL par tube et le stocker dans un congélateur à-80 ° C pour une utilisation future.
3. microinjection
- Mettre en place les 4-6 réservoirs d’élevage au moins 2 mâles et 2 femelles l’après-midi avant l’injection. Ces poissons ne doivent pas être nourris dans l’après-midi. Cette étape va réduire la quantité de déchets de poisson et gagnez du temps à les nettoyer le lendemain matin, tout en aidant à induire une réponse de la reproduction.
- Le lendemain matin, enlever la solution injection préparés (pDestTol2 -ubi-ASAP1 construct et Tol2 mRNA) du congélateur à-80 ° C et placez-le sur la glace.
- Tirez les séparateurs dans les réservoirs de pisciculture et laisser le poisson s’accoupler. En général, poissons pondent dans 20 à 30 minutes après avoir tiré sur le diviseur. Si non, attendre 1 à 2 heures de plus. Certains poissons ne peuvent pas du tout pondent des œufs. Dans ce cas, répéter cette expérience de collecte d’embryons de poissons.
- En attendant, assurez-vous qu’il y a des aiguilles préparés avec le bout cassé à un angle créant un bord biseauté avec une pince ou en cassant sur un essuie-glace de tâche délicate.
- Tirer des aiguilles de verre capillaire sur un micropipettes utilisant les paramètres suivants : chauffer 545 ; tirer 60 ; Vitesse 80 ; temps 250 ; pression 500. Casser l’aiguille avec une pince sous une étendue de dissection (avec oculaire règle pour l’estimation de diamètre) en tenant la pince sous l’angle environ 45 °. Diamètre désiré de l’aiguille peut être variable selon les paramètres de microinjector, mais plus petit diamètre est préférable pour diminuer la mortalité des embryons.
- Une fois que les poissons ont pondu, les recueillir dans un diamètre de 10 cm boîte de Pétri et apportez-les à l’étendue de la dissection. Supprimer tous les embryons anormaux et des déchets de poissons.
- Pipette les embryons fécondés dans le prêt d’agarose à 3 % d’injection moule. Enlever l’excès d’eau pour aider à garder les embryons en place.
- Une fois que toutes les lignes sont remplis d’embryons viables, organisez-les afin que les cellules individuelles toutes face à la même direction vers l’aiguille, qui est un angle de 45° horizontalement. Cela facilitera injection beaucoup plus tard.
- Avec des gants, utiliser une pipette de 20 chargement µL Astuce et retirer 5 µL de la construction prête du tube sur la glace.
- Insérez soigneusement la pointe à l’extrémité arrière du tube capillaire rompu complètement vers où il commence à tapper, pour obtenir le réactif que près de la pointe. S’il y a toujours des bulles d’air, secouez l’aiguille, en veillant à ne pas casser la pointe.
- Insérez l’aiguille vers le porte-aiguille de microinjection et serrer avec précaution jusqu'à ce que l’aiguille reste en place. Ajuster l’angle à 45° environ.
- Une fois que l’aiguille est préparé et attaché, allumez le réservoir sous pression de microscope et de gaz. Commercial CO2 réservoirs sont généralement bonnes à cet effet. Le volume d’injection est réglé par la pression d’exploitation et d’éjection : environ 0,5 lb/po2 pour tenue et 30 lb/po2 pour l’éjection. N’oubliez pas de vérifier que la solution sort lorsque vous appuyez sur la pédale.
- À l’aide d’un micromètre avec une goutte d’huile minérale, régler le volume et l’écoulement de la solution à ~ 150 µm de diamètre (environ 2 nL). Veiller à ce que la contre-pression permettra une petite quantité de s’écouler hors de l’aiguille. S’il n’y a pas assez de contre-pression, capillarité provoquera liquide entrer dans l’aiguille et détruire l’ARNm.
- Une fois que l’aiguille est calibré, commencent à injecter la construction dans la cellule unique des embryons fécondés.
Remarque : Cela prend une grande quantité de pratique, de patience et finesse, en raison de la membrane cellulaire étant difficiles à percer. Il est important d’injecter la solution dans la cellule, pas le jaune, pour générer des poissons zèbres transgéniques. Ceci est différent de l’injection morpholino. Il n’importe pas quel côté l’aiguille pénètre dans la cellule en tant que la construction se passe dans la cellule. La transgénèse aura un très faible taux de réussite s’il est injecté dans le jaune au lieu de la cellule. Injection de stade unicellulaire est aussi importante, ou poisson chimère somatique sera créé. Cela réduira les chances du transgène va dans les cellules germinales. - Le bord de l’entaille de gel permet de fournir un support qui maintient l’embryon en place et permet à l’aiguille de pression sans bouger l’embryon. Une fois que la pointe de l’aiguille est dans la même cellule, appuyer sur la pédale pour libérer la quantité désirée de solution. Répétez ce processus pour tous les embryons.
- Une fois terminé, transférer les embryons injectés dans une boite marquée en les rinçant hors de l’encoche d’agarose avec l’eau du système de poissons et une pipette de transfert jetable 3,4 mL. Stocker les embryons dans un incubateur à 28,5 ° C pour les laisser se développer. Vérifiez retour toute la journée retirer les embryons de poissons morts et remplacez l’eau par 0,1 % de bleu de méthylène dans l’eau du poisson.
- Environ 6-8 heures après l’injection, prenez 10 personne injecté des embryons de poisson et préparer l’ADN génomique d’eux à l’aide de la méthode de Hotshot18.
- Le lendemain matin, utiliser un microscope à dissection avec une source de lumière de fluorescence à trier les embryons montrant GFP dans les tissus non-jaune d’oeuf. Ces embryons de poisson doivent contenir la construction injectée.
- Effectuer le test d’accise Tol2 pour vérifier l’activité de transposon comme décrit plus haut19. Si le plasmide excisée peut être détecté, garder l’injection des embryons de poissons et de les élever. Si aucun plasmide excisée ne peut être détecté, répétez le processus de synthèse et de microinjection Tol2 ARNm jusqu'à obtenir les résultats positifs du test de l’accise Tol2.
4. établir des poissons transgéniques ASAP1, Tg (ubi: ASAP1)
- Soulever le poisson injecté (génération de0 F) à l’âge adulte comme décrit précédemment dans le livre de poisson-zèbre20. Cela prend habituellement environ 4 mois.
- Prenez un seul adulte F0 poissons et traversez-la en un seul en face de poisson de type sauvage de sexe. Recueillir des embryons de poisson après reproduction plus tard dans la journée. Garder les embryons de poissons recueillis dans l’incubateur de 28,5 ° C chez les poissons de l’eau avec 0,1 % de bleu de méthylène.
- Le troisième jour, vérifier les embryons de poissons sous un microscope à dissection fluorescent avec un filtre GFP. Trier les embryons de poisson vert, s’il y en a et de les élever jusqu'à l’âge adulte comme F1 génération les poissons transgéniques, Tg (ubi: ASAP1).
NOTE : Mendélienne ratio ne devrait pas puisque la plupart des poissons0 F parentales sont des chimères génétiques germinales. - Traverser les poissons adultes isolés F1 avec les poissons de type sauvage et collecter des embryons de poisson. Trier les embryons de poisson vert et les élever jusqu'à l’âge adulte comme poisson de génération2 F.
Remarque : Vert et des embryons de poisson non écologiques devraient être proche de 1:1 s’il y a un transgène unique. - Pour afficher les changements de potentiel électrique dans la tumeur comme des tumeurs malignes de nerf périphérique gaine (MPNST), traverser la génération de2 F Tg (ubi: ASAP1) poisson poisson rpl35hi258/wt . On sait que les tumeurs visibles commencent à être trouvé dans les 6-8 mois vieux adultes21,22.
5. imagerie
- Image des embryons de poisson-zèbre, prendre plusieurs fondateur de génération2 F poisson et croiser avec des poissons de type sauvage en paires individuelles. Recueillir des embryons de poissons à différents stades de développement désirés selon le poisson-zèbre, mise en scène de guide23.
- Pour les premiers stades des embryons de poisson, peler et retirer les chorions des embryons soigneusement à l’aide d’une paire de pinces sous une étendue de dissection dans un diamètre de 10 cm boîte de Pétri avec de l’eau système de poissons.
- Transférer quelques embryons de poisson sur une lame de verre concave avec 3 % de méthylcellulose à l’aide d’une pipette de transfert jetable 3,4 mL. Ajuster les embryons pour les positions souhaitées pour afficher l’activité cellulaire de la GFP en utilisant une aiguille sous une étendue de dissection fluorescent.
- Pour les stades mobiles des embryons de poisson (plus de 12 somite étape), utilisez mésylate de tricaïne 0.05 % pour anesthésier les embryons de poissons avant de les transférer aux diapositives. Brièvement, les embryons de poisson ont été a émergé dans mésylate de tricaïne 0.05 % dans l’eau du poisson jusqu'à ce qu’ils ont arrêté la natation et la balance du corps perte. En outre, ajouter une goutte de mésylate de tricaïne 0.05 % avec la méthylcellulose sur la diapositive.
- Pour les moins de 12 embryons poissons au stade somite, utiliser un microscope composé d’épifluorescente avec un appareil photo compatible et un logiciel d’imagerie. Pour plus de 12 embryons de poissons étape somite, utiliser un microscope à fluorescence dissection.
- À l’image de tension de la cellule tumorale, d’abord identifier les poissons atteints de tumeurs MPNST. Puis, anesthésier les poissons avec mésylate de tricaïne 0,05 %. Pour l’imagerie support entier, mettre le poisson dans un diamètre de 10 cm boîte de Pétri. Pour visualiser l’activité électrique de cellules de tumeur, tumeurs de poissons peuvent être disséqués dehors après l’imagerie support entier.
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Representative Results
En une injection réussie, plus que des embryons de poisson 50 % injecté affiche une certaine fluorescence verte dans les cellules somatiques et la plupart d'entre eux seront positif par le test de Tol2 transposon d’accise (Figure 2). Après que 2 à 4 générations de out-croix avec poissons de type sauvage (jusqu'à ce que le poisson fluorescent atteint 50 %, le ratio mendéliens prévues), les poissons transgéniques ont été utilisés pour l’expérimentation d’imagerie pour effectuer le suivi des potentiels de membrane cellulaire durant le développement embryonnaire. Tout d’abord, les changements potentiels de membrane ont été examinés au cours du cycle cellulaire au cours des premiers stades du développement embryonnaire zebrafish. Il a été observé que les cellules hyperpolarisé avant la formation de sillon de clivage (Figure 3 a-3Cet supplémentaire vidéo 1). De plus, différents tissus montrent une variété des potentiels de membrane en 1-3 jours vieux embryons de poisson. (Figure 3D-3G). Par exemple, les somites et notochorde sont généralement hyperpolarisés, comparativement aux tissus/organes adjacents. Une fois que les embryons de poisson-zèbre ont pu se déplacer, nous étions aussi capables de détecter les activités électriques neuromusculaires (Figure 4, supplémentaires vidéo 2). Comme les propriétés bioélectriques des cellules cancéreuses pourraient être modifiées, nous ont profité de ce journaliste de ASAP1 poisson et il croisé avec un mutant gène rpL35 , qui est sujets à des nerfs périphériques maligne spontanée des tumeurs gaine21,24 ,,25. Seulement quelques tumeurs de poissons ont été examinés, en raison de la période de croissance longue potentielle pour le mutant de tumeur de poisson, mais il est notable qu’il y a des différences de tension entre les tumeurs et les tissus environnants en direct avec tumeur poisson-zèbre (Figure 5). Ainsi, ces résultats représentatifs ont démontré la génération réussie d’une ligne de poissons de journaliste électrique cellulaire et de son application potentielle à la biologie cellulaire et du développement.
Figure 1 : Illustration de la construction plasmidique axée sur le transposon de Tol2.
(A) la recombinaison de BP a été utilisée pour ASAP1 sous clonage dans le vecteur d’entrée moyen de pDONR221. attB séquences ont été ajoutés à la 5-fin des amorces pour ASAP1. (B) schéma pour Tol2 axée sur le transposon construire assemblage issu de la recombinaison de LR. Forme ovale violet montre Tol2 inversé se répète. Les lignes tiretées indiquent la recombinaison homologue. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Résultats typiques d’embryons injectées par épifluorescence et Tol2-accise dosage.
Embryon poisson de (A) Non séropositifs au 1dpf. (B) injecté avec succès 1dpf embryons de poissons. Taches GFP sont évidentes dans le coffre. Embryon poisson de (C) Non séropositifs au 2dpf. (D) injecté avec succès 2dpf embryons de poissons. Taches GFP sont évidentes dans le coffre. (E) un résultat représentatif de dosage d’accise Tol2. Voie 1-7 PCR ont été amplifiées du 7 au hasard sélectionné des embryons de poisson 8 heures après l’injection. Le dernier est un contrôle négatif (NC) sans aucun ADN génomique. Echelle = 250 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Les variations de tension dynamique au cours du développement de l’embryon de poisson zèbre.
(A-C) Prime de polarité cellulaire au cours de la mitose chez les embryons de poissons. (A) embryon de poisson zèbre stade 2 cellules. (B) embryon stade 4 cellules. Embryon de 8 cellules stade (C) . Les flèches rouges indiquent les positions des sillons de clivage dans les panneaux (A-C). Les changements sont aussi évidentes dans le film correspondant (supplémentaire vidéo 1). La région autour du sillon de clivage est plus polarisée par rapport au reste de la cellule. (D-G) Changements de tension électrique dynamique aux différents stades précoce d’embryons de poisson-zèbre. Stade de 12 segments (D) . (E) 22-somite étape. (F) 48 heures après la fécondation. (G) 72 heures après la fécondation. e, œil ; ht, cœur ; NT, la notochorde ; op, vésicule optique ; ov, vésicule otique ; pf, nageoire pectorale ; donc, somite ; yk, jaune d’oeuf. Echelle = 250 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Les variations de tension électrique du corps du poisson durant le mouvement embryon de poisson.
2 - jour vieux poissons embryons Voir le neuro-musculaire de l’électrique activités durant le mouvement. (A) - (F) l’imagerie séquentielle de l’embryon de poisson même. Changements de densité de couleur correspondent à la transduction de signalisation électrique. L’intervalle de temps entre deux images consécutives est environ 12,4 millisecondes. Les flèches rouges indiquent les positions que tension changé pendant la période d’imagerie. Les changements sont aussi évidentes dans le film correspondant (complémentaire Video 2). Tous les panneaux sont à la même échelle. Echelle = 250 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Les cellules tumorales ont tendance à être plus polarisée.
Un vieux de 10 mois, poisson (rpL35hi258/wt; TG (ubi: ASAP1) mis au point une tumeur de gaine de nerf périphérique malin dans l’abdomen. (A) & (C) Bright champ image. (B) et (D) Image avec canal GFP. (A) et (B) poisson intacts. (C) et (D) Abdomen tumeur a été disséqué dehors. Les cellules tumorales sont plus polarisée (vert plus lumineux) par rapport aux tissus (vert foncé). Flèches indiquent les tumeurs. Tous les panneaux sont à la même échelle. Echelle = 25 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Vidéo supplémentaire 1 . Épifluorescente imagerie de la signalisation électrique au cours des stades du clivage en Tg (ubi: ASAP1) embryons de poissons. Ce film a été enregistré sur la vue du pôle animal. La fluorescence ASAP1 est associée à la formation du sillon de clivage cellulaire, une structure temporaire pendant la division cellulaire. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
Vidéo supplémentaire 2 . Épifluorescente imagerie de la signalisation électrique pendant 2 - vieux jour gé (ubi: ASAP1) mouvement de l’embryon de poisson. Le déménagement a été enregistré sur la vue latérale de l’embryon de poisson 2 - vieux jour après anesthetization. The ASAP1 altérations de fluorescence sont évidentes dans le tissu neuromusculaire pendant le processus de déplacement. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Bien que les activités électriques niveau cellulaire et tissulaire au cours du développement embryonnaire et la maladie humaine ont été découverts il y a longtemps, en vivo électrique changements dynamiques et leurs rôles biologiques restent encore largement inconnus. Un des défis majeurs est de visualiser et de quantifier les variations électriques. Patch clamp technique est une brèche pour le suivi des cellules isolées, mais son application à des embryons de vertébrés est limitée car ils sont composés de plusieurs cellules. Les colorants chimiques tension actuelles ne sont pas idéales en raison de leurs sensibilités et spécificités des toxicités. Les efforts récents sur l’invention de GEVIs nous fournissent un nouveau chemin d’accès pour visualiser les activités électriques cellulaires in vivo et en temps réel. Ici, nous avons montré le processus de création d’une ligne de journaliste électrique de poisson-zèbre, Tg (ubi :ASAP1).
En utilisant cette ligne de poissons de journaliste, nous montrons les activités électriques cellulaires pouvant être analysés dans des embryons de poisson-zèbre. Le changement de tension électrique est fortement lié à du cycle cellulaire au cours du développement embryonnaire précoce. Nous avons observé que l’hyperpolarisation se produit avant la formation de la division de sillon/cellule de clivage (Figure 3). Cela fait contraste avec les connaissances actuelles que la dépolarisation se produit avant la division cellulaire,26. Ainsi, plus de détails sur la tension de la membrane cellulaire est modifiée au cours du cycle cellulaire des autres cellules animales et humaines et si cela est lié au contexte de tissu, besoin de plus amples études. Des études sont actuellement en cours dans notre laboratoire. En outre, nous avons vérifié que ASAP1 est capable de suivre l’évolution de la tension physiologique dans le système neuronal-musculaire (Figure 4), dans laquelle la modification est relativement rapide par rapport aux changements au cours des cycles cellulaires.
On a également démontré que ce journaliste peut également être utilisé pour visualiser le poisson-zèbre, tumeurs (Figure 5). Il était intéressant de constater la tumeur des cellules ont été généralement plus polarisées par rapport aux tissus normaux environnants. Toutefois, s’il s’agit d’un phénomène général pour tous les tissus malins exige davantage enquête, en raison de la limitation des échantillons de tumeur et le type de tumeur poisson dans cette étude. Les enquêtes futures sur la quantification de la polarisation et la tension de membrane cellulaire sur d’autres types de tumeurs et les cellules cancéreuses humaines sera instructifs pour mieux comprendre ses rôles au cours de la tumorigenèse.
Dans ce protocole, nous avons choisi un promoteur omniprésent de conduire ASAP1 expression pour suivre toutes les cellules dans des embryons de poissons. Tissu ou organe de promoteurs spécifiques pourraient être une autre option, si seulement un certain type de cellules et les tissus est préféré. Le capteur de tension de ASAP1 est un biocapteur relativement bien caractérisé, et il est composé d’un domaine sensible de tension de la phosphatase de sensibles au voltage ascidie (S3-S4 boucle) et une permutation circulaire des GFP (valeur par défaut est faible fluorescence). On a appris à s’exprimer sur la membrane cellulaire externe dans les cellules de neurone humain et de souris cerveau tranches4,27,28. La luminosité du capteur est principalement déterminée par les positions conformationnelles de la boucle de S3-S4 et GFP. Le changement rapide de fluorescence verte était improbable provoquée par la concentration en protéines, en raison de la vitesse des changements de luminosité et la synthèse des protéines. Toutefois, le transgène, ASAP1, a pu modifier expression dans les cellules tumorales, en raison de la nature de l’instabilité génomique. En plus de ASAP1, autres GEVIs, tels que des indicateurs de tension basé sur archaerhodopsin (QuasAr1 et QuasAr2), peuvent également être une bonne option complémentaire, puisqu’ils utilisent un mécanisme entièrement différent et ils ont une grande sensibilité et vitesse du 29. En outre, leur émission est dans la gamme de couleur rouge. Cela les rend particulièrement gratuits à le vert ASAP1, s’il y a déjà une autre protéine fluorescente dans la même cellule. Par exemple, ASAP1 et QuasAr est cumulable avec Fucci zebrafish30 pour étudier la relation entre le cycle cellulaire et les changements de potentiel électrique.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les travaux de recherche rapporté dans cette publication a été pris en charge par le National Institute of General Medical Sciences, de la National Institutes of Health, sous le prix nombre R35GM124913, programme d’incitation pour PI4D de l’Université de Purdue et PVM interne concurrentiel Programme de fonds de la recherche fondamentale. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des agents de financement. Nous remercions la construction Tol2, Michael Lin pour la construction de ASAP1, Koichi Kawakami et Leonard Zon pour le promoteur ubi construire par l’intermédiaire de Addgene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14mL cell culture tubes | VWR | 60818-725 | E.Coli culture |
| Agarose electrophoresis tank | Thermo Scientific | Owl B2 | DNA eletrophoresis |
| Agarose RA | Amresco | N605-500G | For making the injection gels |
| Attb1-ASAP1-F primer | IDT DNA | GGGGACAAGTTTGTACAAAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA |
ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Attb2-ASAP1-R primer | IDT DNA | GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA |
ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Bright field dissection scope | Nikon | SMZ 745 | Dechorionation, microinjection, mounting |
| Color camera | Zeiss | AxioCam MRc | Fish embryo image recording |
| Concave slide | VWR | 48336-001 | For holding fish embryos during imaging process |
| Disposable transfer pipette 3.4 ml | Thermo Scientific | 13-711-9AM | Fish embryos and water transfer |
| Endonuclease enzyme, Not I | NEB | R0189L | For linearizing plasmid DNA |
| Epifuorescent compound scope | Zeiss | Axio Imager.A2 | Fish embryo imaging |
| Epifuorescent stereo dissection scope | Zeiss | Stereo Discovery.V12 | Fish embryo imaging |
| Fluorescent light source | Lumen dynamics | X-cite seris 120 | Light source for fluorescence microscopes |
| Forceps #5 | WPI | 500342 | Dechorionation and needle breaking |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Scientific | 11789020 | Gateway BP recombination cloning |
| Gateway LR Clonase II Plus enzyme | Thermo Scientific | 12538120 | Gateway LR recombination cloning |
| Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | DNA gel purification |
| Loading tip | Eppendorf | 930001007 | For loading injection solution into capilary needles |
| Methylcellulose (1600cPs) | Alfa Aesar | 43146 | Fish embryo mounting |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection |
| Microinjector | WPI | Pneumatic Picopump PV820 | Microinjection injector |
| Micro-manipulator | WPI | Microinjector MM3301R | Microinjection operation |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | For preparing capillary needle |
| Mineral oil | Amresco | J217-500ml | For calibrating injection volume |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Thermo Scientific | AM1340 | mRNA in vitro transcription |
| Monocolor camera | Zeiss | AxioCam MRm | Fish embryo image recording |
| Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4020 | Prepare small amount of plasmid DNA |
| Plastic Petri dishes | VWR | 25384-088 | For holding fish or fish embryos during imaging process |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | mRNA cleaning after in vitro transcription |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | For measuring DNA and RNA concentrations |
| Stage Micrometer | Am Scope | MR100 | Microinjection volume calibration |
| Thermocycler | Bio-Rad | T100 | DNA amplification for gene cloning |
| Thin wall glass capillaries | WPI | TW100F-4 | Raw glass for making cappilary needle |
| Tol2-exL1 primer | IDT DNA | GCACAACACCAGAAATGCCCTC | Tol2 excise assay |
| Tol2-exR primer | IDT DNA | ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG | Tol2 excise assay |
| TOP10 Chemically Competent E. coli | Thermo Scientific | C404006 | Used for transformation during gene cloning |
| Tricaine mesylate | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing fish or fish embryos |
| UV trans-illuminator 302nm | UVP | M-20V | DNA visualization |
| Water bath | Thermo Scientific | 2853 | For transformation process of gene cloning |
References
- Levin, M. Molecular bioelectricity: how endogenous voltage potentials control cell behavior and instruct pattern regulation in vivo. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3835-3850 (2014).
- Storace, D., et al. Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential. Trends in Neuroscience. 39 (5), 277-289 (2016).
- Inagaki, S., Nagai, T. Current progress in genetically encoded voltage indicators for neural activity recording. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 95-100 (2016).
- St-Pierre, F., et al. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nature Neuroscience. 17 (6), 884-889 (2014).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. , (2013).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science USA. 105 (50), 19827-19832 (2008).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Mosimann, C., et al. Ubiquitous transgene expression and Cre-based recombination driven by the ubiquitin promoter in zebrafish. Development. 138 (1), 169-177 (2011).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Ordovas, J. M. Separation of small-size DNA fragments using agarose gel electrophoresis. Methods in Molecular Biology. 110, 35-42 (1998).
- Downey, N. Extraction of DNA from agarose gels. Methods Mol Biol. 235, 137-139 (2003).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. 45 (45), (2010).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610, 612, 614 (2007).
- Kawakami, K., Koga, A., Hori, H., Shima, A. Excision of the tol2 transposable element of the medaka fish, Oryzias latipes, in zebrafish, Danio rerio. Gene. 225 (1-2), 17-22 (1998).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, Univ. of Oregon Press. (2000).
- Amsterdam, A., et al. Many ribosomal protein genes are cancer genes in zebrafish. PLoS Biology. 2 (5), E139 (2004).
- Lai, K., et al. Many ribosomal protein mutations are associated with growth impairment and tumor predisposition in zebrafish. Developmental Dynamics. 238 (1), 76-85 (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Zhang, G., et al. Comparative oncogenomic analysis of copy number alterations in human and zebrafish tumors enables cancer driver discovery. PLoS Genetics. 9 (8), e1003734 (2013).
- Zhang, G., et al. Highly aneuploid zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors have genetic alterations similar to human cancers. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107 (39), 16940-16945 (2010).
- Urrego, D., Tomczak, A. P., Zahed, F., Stuhmer, W., Pardo, L. A. Potassium channels in cell cycle and cell proliferation. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B. 369 (1638), 20130094 (2014).
- Yang, H. H., et al. Subcellular Imaging of Voltage and Calcium Signals Reveals Neural Processing In Vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
- Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 106 (49), 20812-20817 (2009).
