Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Visualisering af cellulære elektriske aktivitet i zebrafisk tidlige embryoner og tumorer

Published: April 25, 2018 doi: 10.3791/57330

Summary

Her, vi viser processen med at skabe en cellulær elektrisk spænding reporter zebrafisk linje for at visualisere fosterudviklingen, bevægelse, og fisk tumor celler i vivo.

Abstract

Bioelektromagnetisme, endogene elektrisk signalering medieret af ionkanaler og pumper beliggende på cellemembranen, spiller vigtige roller i signalering processer af overgearet neuronal og muskuløs celler og mange andre biologiske processer, såsom embryonale udviklingsmæssige mønstre. Der er imidlertid behov for i vivo elektriske aktivitetsovervågning i hvirveldyr embryogenese. Fremskridt i genetisk kodet fluorescerende spænding indikatorer (GEVIs) har gjort det muligt at give en løsning på denne udfordring. Her, vi beskriver, hvordan du opretter en transgene spænding indikator zebrafisk ved hjælp af etablerede spænding indikator, ASAP1 (accelereret Sensor af handling potentialer 1), som et eksempel. Tol2 kit og en allestedsnærværende zebrafisk promotor, ubi, blev valgt i denne undersøgelse. Vi forklarer også processerne af Gateway lokationsspecifikke kloning, Tol2 transposon-baserede zebrafisk transgenese og billedprocessen for tidligt fisk embryoner og fisk tumorer ved hjælp af regelmæssig epifluorescerende mikroskoper. Bruger denne fisk linje, fandt vi, at der er cellulære elektrisk spændingsændringer under zebrafisk embryogenese og fisk larve bevægelse. Det konstateredes desuden, at tumor celler var generelt polariseret i et par zebrafisk maligne perifere nerve kappe tumorer, i forhold til det omgivende normale væv.

Introduction

Bioelektromagnetisme refererer til endogene elektrisk signalering medieret af ionkanaler og pumper beliggende på cellemembranen1. Ionisk udvekslinger på tværs af den cellulære membran, og de koblede elektriske potentielle og aktuelle ændringer, er afgørende for signalering processer af overgearet neuronal og muskuløs celler. Bioelektromagnetisme og ion forløb har derudover en række andre vigtige biologiske funktioner herunder energilagring, biosyntese og metabolitten transport. Bioelektriske signaler blev også opdaget som en regulator af embryonale mønster dannelse, som kroppen akser, celle cyklus og celle differentiering1. Det er således afgørende for at forstå mange menneskelige medfødte sygdomme, der skyldes mis forordning af denne type signalering. Selvom patch klemme har været almindeligt brugt til registrering af enkelt celler, er det stadig langt fra ideel til samtidig overvågning af flere celler under fosterudviklingen in vivo. Desuden er spænding følsomme små molekyler også ikke ideel til i vivo ansøgninger på grund af deres særlige karakteristika, følsomheder og toksicitet.

Oprettelsen af en række genetisk kodet fluorescerende spænding indikatorer (GEVIs) tilbyder en ny mekanisme til at afhjælpe dette problem, og giver mulighed for nem anvendelse til at studere embryonale udvikling, selv om de var oprindeligt beregnet til overvågning neurale celler2,3. En af de foreliggende GEVIs er accelereret Sensor af handling potentialer 1 (ASAP1)4. Det er sammensat af en ekstracellulære loop af en spænding-sensing domæne af spænding følsomme fosfatase og et cirkulært den ombyttede grøn fluorescerende proteiner. Derfor, ASAP1 giver mulighed for visualisering af cellulære elektriske potentielle ændringer (polarisering: lys grøn, depolarisering: mørk grøn). ASAP1 har 2 ms tænd og sluk kinetik, og kan spore subthreshold potentielle ændring4. Således, denne genetiske værktøj giver mulighed for et nyt niveau af effektivitet i real-time bioelektrisk overvågning i levende celler. Yderligere forståelse af rollerne som bioelektromagnetisme i embryonale udvikling og mange menneskelige sygdomme, såsom kræft, vil kaste nyt lys over de underliggende mekanismer, som er kritiske for sygdom behandling og forebyggelse.

Zebrafisk har bevist en stærk dyremodel til at studere udviklingsmæssige biologi og humane sygdomme herunder kræft5,6. De deler 70% orthologous gener med mennesker, og de har lignende hvirveldyr biologi7. Zebrafisk giver relativt nem pleje, en stor kobling størrelse af æg, tractable genetik, let transgenese og gennemsigtig eksterne embryonale udvikling, hvilket gør dem en overlegen system til i vivo billeddannelse5,6. Med en stor kilde til mutant fisk linjer allerede er til stede og en fuldt sekventeret genom, vil zebrafisk give en relativt ubegrænset vifte af videnskabelige opdagelser.

For at undersøge den i vivo real-time elektriske aktivitet i cellerne, drage vi fordel af zebrafisk modelsystem og ASAP1. I dette papir, vi beskriver, hvordan at indarbejde zebrafisk genom ved hjælp af Tol2 transposon transgenese fluorescerende spænding biosensor ASAP1 og visualisere cellulære elektriske aktivitet under fosterudviklingen, fisk larve bevægelse, og i levende tumor .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Zebrafisk er opstaldet i en AAALAC-godkendt dyr facilitet, og alle eksperimenter blev udført efter protokoller, godkendt af Purdue Animal Care og brug udvalg (PACUC).

1. Tol2 Transposon Plasmid konstruere forberedelse

Bemærk: Tol2, en transposon, der blev opdaget i medaka fisk, har været udbredt i zebrafisk forskning Fællesskabet8,9. Det er med held vedtaget til Gateway lokationsspecifikke rekombination-baserede kloning systemet og kendt som Tol2 kit10. Tol2 kit giver mulighed for en mere praktisk måde at skabe brugerdefinerede udtryk konstruktioner, samtidig øge effektiviteten af transgenese. Således var det en nem beslutning at drage fordel af denne ordning, og skabe en allestedsnærværende ASAP1 udtryk zebrafisk linje ved hjælp af en valideret ubiquitin initiativtageren til at drive ASAP111.

  1. At skabe en midterste post ASAP1 konstruktion: pDONR221-ASAP1
    1. Erhverve genetisk kodet spænding sensor ASAP1 konstruktion, pcDNA3.1/Puro-CAG-ASAP1 (Plasmid #52519), fra Addgene. For at forstærke ASAP1 kodende region, oprette en PCR ved hjælp af de tilpassede primere (attB1-ASAP1F og attB2-ASAP1R) flankeret med attB sekvenser i 5' slutningen af primere (figur 1). Phusion DNA polymerase blev valgt for sin høje effektivitet, og PCR betingelser var optimeret, baseret på tidligere udgivne protokol12.
    2. Indlæse 50 µL PCR produkter i en 1% TAE gel ved hjælp af en regelmæssig pipette med 200 µL tips, og udføre elektroforese på 160 V i en vandret gel tank i ca 30 min.
    3. Kontrollere gel under en UV transilluminator (353 nm), punktafgifter ud bølgeområde ved hjælp af en vinge/skalpel under en UV transilluminator som tidligere udgivne13,14, og sætte den DNA-prøve, der indeholder gel i en ren 1,5 mL microcentrifuge rør.
    4. Udføre gel rensning for ASAP1 PCR-produkter. Genskab DNA i skåret gel ved hjælp af en kommerciel DNA gel rensning kit efter fabrikantens anvisninger, og elueres DNA i 20 µL vand. Tage 1 µL som en prøve, og måle DNA koncentrationen ved hjælp af et spektrofotometer. Flow software instruktionerne bruger vand som en blindkontroller15.
    5. Tage 100 ng af renset PCR produkt og bland det med 150 ng af pDONR221 plasmid i 10 µL af TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8,0)16. Tilføj 2 µL af BP Clonase II i reaktionen og inkuberes reaktion ved rumtemperatur natten over.
    6. På andendagen tilsættes 1 µL af proteinase K i reaktionen og der inkuberes reaktion ved 37 ° C i 30 min.
    7. Udføre transformation. Overføre reaktionen og bland det med 50 µL af Top10 kompetente E. coli celler og inkuberes celler på is i 30 min. Derefter overføre reaktion røret ind i vandbad 42 ° C i 1 min. straks fjerne røret og der inkuberes i isbad i 2 min. Dernæst lægge røret i et 37 ° C shaker og Inkuber i 1 time.
    8. Tag røret og plade celler på en kanamycin LB tallerken. Næste, inkuberes plade natten (16-18 h) ved 37 ° C.
    9. Vælge enkelt og vel adskilte kolonier og podes dem i 14 mL celle kultur rør med 3 mL af LB medium. Kultur dem natten over ved 37 ° C i en shaker med en rotationshastighed på 250 rpm (rotation pr. minut).
    10. Udføre miniprep ved hjælp af en kommerciel miniprep kit efter sine instruktion manuel17.
    11. Sekvens 3-4 plasmider med Sanger rækkefølge for at identificere positive pDONR221-ASAP1-kloner ved hjælp af M13F og M13R-sekventering primere.
  2. Oprettelse af Tol2 konstruktion for mikroinjektion: pDestTol2 -ubi-ASAP1
    1. Vælg Sekventeringen kontrolleret pDONR221-ASAP1 klon og måle dens DNA koncentration bruger et spektrofotometer følgende software Instruktionen ved hjælp af vand som en tom styre15.
    2. Tag 100 µg for pDONR221-ASAP1 og bland det med 100 µg af Tol2 kit 5-ende plasmid (pENTR5'_ubi, Addgene #27320), 100 µg for p3E-polyA (Tol2 kit #302) og 150 µg for pDestTol2pA2 (Tol2 kit #394). Justere samlede volumen til 8 µL bruger TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) i en 1,5 mL microcentrifuge tube og bland godt med en 2-5 s kort vortex. Derefter tilsættes 2 µL af LR Clonase II plus, og Inkuber reaktion ved rumtemperatur natten over.
    3. På andendagen tilsættes 1 µL af proteinase K i reaktionen ved hjælp af en 10 µL pipette, og der inkuberes reaktion ved 37 ° C i 30 min.
    4. Udføre transformation og identificere positive kloner, som beskrevet ovenfor (trin 1.1.7-11).
    5. Foranstaltning DNA koncentrationen af sekventering kontrolleret pDestTol2-ubi-ASAP1 klon (figur 1B) ved hjælp af et spektrofotometer15. Koncentrationen er normalt omkring 200ng/µL.

2. klargør Tol2 Transposase mRNA og injektion løsning

  1. Streak E. coli glycerol bestand af pCS2FA-transposase plasmid (Tol2 kit #396) på en LB tallerken (med 100 µg/mL ampicillin) ved hjælp af en steriliseret podning løkke. Inkuber plade ved 37 ° C i en inkubator natten over. Den næste dag, vælge en enkelt koloni og podes det i 3 mL af LB (100 µg/mL ampicillin) ved hjælp af en steriliseret 10 µL pipette tip. Kultur det natten over ved 37 ° C i en shaker med en rotationshastighed på 250 rpm.
  2. Udføre miniprep på E. coli kultur ved hjælp af en kommerciel miniprep kit efter sine instruktionsbog. Elueres plasmid DNA ind i 30-50 µL af TE buffer af 1 minuts centrifugeres ved 14.000 rpm, og måle dens DNA koncentration med et spektrofotometer.
  3. Linearize 1-2 µg af plasmid med jeg ikke liv1975 og rense DNA med en DNA rengøring kit efter sine brugsanvisning efter jeg ikke fordøjelsen. Elueres DNA i 5 µL vand ved centrifugering ved 14.000 rpm i 1 minut. Den forventede koncentration er omkring 200-300 ng/µL.
  4. Udføre i vitro transskription med ikke jeg lineariseret pCS2FA-transposase som en DNA-skabelon ved hjælp af en kommerciel SP6 transskription kit.
  5. Når reaktionen er færdig, rense Tol2 transposase mRNA ved hjælp af en kommerciel RNA rengøring kit efter fabrikantens anvisninger. Endelig elueres mRNA i 20 µL RNAase-gratis vand og måle RNA-koncentrationen i et spektrofotometer. Den forventede koncentration er om 1-3 µg / µL. prøver kan opbevares i et-80 ° C fryser, hvis nødvendigt.
  6. Forberede mikroinjektion løsning ved at blande 20 ng/µL pDestTol2 -ubi-ASAP1 og Tol2 transposase mRNA (100 ng/µL) i et microcentrifuge rør af pipettering. For at forhindre nukleinsyre nedbrydning forårsaget af gentagne optøning og genindfrysning, alikvot 6 µL pr. tube og gemme det i et-80 ° C fryser til fremtidig brug.

3. mikroinjektion

  1. Konfigurer 4-6 opdræt tanke med mindst 2 hanner og 2 tæver eftermiddag før injektion. Disse fisk skal ikke fodres i eftermiddag. Dette trin vil reducere mængden af fiskeaffald og spare tid til at rydde dem ud næste morgen, samtidig også medvirke til at fremkalde en avl svar.
  2. Den følgende morgen, fjerne den forberedte injektion løsning (pDestTol2 -ubi-ASAP1 konstruktion og Tol2 mRNA) fra-80 ° C fryser, og placere den på is.
  3. Trække skillelinjerne i fisk opdræt tanke og tillader fisk at parre. I almindelighed, lægge fisk æg inden for 20-30 minutter efter at trække ud på opdeleren. Hvis ikke, skal du vente 1-2 timer længere. Nogle fisk kan ikke lægge æg på alle. I dette tilfælde gentage dette eksperiment for fisk indsamlingsstedet.
  4. Mens vi venter, Sørg for der er nåle tilberedt med spidsen brudt i en vinkel, at skabe en skrå kant med pincet eller ved at bryde på en delikat opgave vinduesvisker.
    1. Trække nåle fra kapillær glas på en mikropipette puller ved hjælp af følgende parametre: varme 545; trække 60; hastighed 80; tid 250; pres 500. Bryde nålen med pincet nedenunder en dissektion anvendelsesområde (med lup lineal for diameter skøn) ved at holde pincet på en vinkel ca 45 °. Ønskede nål diametre kan være variabel afhængig af indstillingerne i microinjector, men mindre diameter foretrækkes for faldende embryo dødelighed.
  5. Når fisken har lagt æg, samle dem i et 10-cm diameter petriskål og bringe dem til dissektion anvendelsesområde. Fjerne alle abnorme embryoner og fisk affald.
  6. Med pipette overfoeres befrugtede embryoner til rede 3% Agarosen injektion skimmel. Fjern overskydende vand for at hjælpe med at holde embryonerne på plads.
  7. Når alle rækker er fyldt med levedygtige embryoner, arrangere dem således at de enkelte celler alle ansigt den samme retning mod nål, som er omkring en 45° vinkel vandret. Dette vil gøre injektion meget lettere senere.
  8. Mens iført handsker, bruge en 20 µL lastning afpipetteres tip og fjerne 5 µL af den rede konstruktion fra røret på is.
  9. Omhyggeligt indsætte aflæsse i den bagerste ende af den knækkede kapillarrør hele vejen til hvor det begynder at tapper, at få reagenset så tæt på spidsen. Hvis der stadig er luftbobler, ryste nålen, og sørg for at ikke bryde aflæsse.
  10. Indsætte nålen lige ind mikroinjektion nål indehaveren og omhyggeligt stramme indtil nålen forbliver på plads. Justere vinkel på ca 45°.
  11. Når nålen er forberedt og knyttet, tænde tryktank mikroskop og gas. Kommercielle CO2 kampvogne er generelt gode til dette formål. Injektionsvolumen reguleres af bedrift og udslyngning pression: anslået 0.5 psi for bedriften og 30 psi for udslyngning. Skal du kontrollere, at løsningen kommer ud, når du trykker på pedalen.
  12. Ved hjælp af en objektsmikrometeret med en dråbe af mineralsk olie, justere lydstyrken og flow af løsningen på ~ 150 µm i diameter (ca 2 nL). Sikre at modtrykket vil lade en lille mængde drypper ud af nålen. Hvis der ikke er nok modtryk, vil kapillær handling medføre væske til at angive nålen og ødelægge mRNA.
  13. Når nålen er kalibreret, begynde at indsprøjte konstruktionen i den enkelte celle i de befrugtede embryoner.
    Bemærk: Det tager en stor mængde af praksis, tålmodighed og finesse, på grund af cellemembranen bliver svært at gennembore. Det er vigtigt at tilføre løsningen ind i cellen, ikke æggeblomme, for at skabe transgene zebrafisk. Dette er forskelligt fra morpholino injektion. Det er ligegyldigt, hvilken side nålen ind så længe konstruktionen går i cellen cellen. Transgenese har en meget lav grad af succes, hvis injiceres æggeblomme i stedet for cellen. Enkelt-celle stadium injektion er også vigtige, eller somatiske chimera fisk vil blive oprettet. Dette vil reducere risikoen for transgenet gå ind til kønsceller.
  14. Bruge kanten af gel hak til at levere en opbakning, der holder embryoet på plads og giver mulighed for nål til at udøve pres uden at flytte embryoner. Når spidsen af nålen er i en enkelt celle, tryk på pedalen til at frigive den ønskede mængde af løsning. Gentag denne proces for alle embryoner.
  15. Når afsluttet, skal du overføre de injicerede embryoner i en mærket skål ved at skylle dem ud af Agarosen notch med fisk system vand og en engangs 3,4 mL overførsel pipette. Opbevare embryoner i en 28,5 ° C inkubator til at lade dem udvikle. Kontrollere tilbage i løbet af dagen, fjernelse af døde fisk embryoner og erstatte vand med 0,1% methylenblåt i fiskevand.
  16. Omkring 6-8 timer efter injektion, tage 10 individuelle injiceres fiske embryoner og forberede genomisk DNA fra dem ved hjælp af Hotshot metode18.
  17. Den følgende morgen, bruge en dissektion mikroskop med et fluorescens lyskilde til at sortere ud embryoner viser normal god landbrugspraksis i de ikke-æggeblomme væv. Disse fisk embryoner skal indeholde den injicerede konstruktion.
  18. Udføre Tol2 punktafgifter assay for at kontrollere transposon aktivitet som beskrevet tidligere19. Hvis skåret plasmid kan påvises, holde den injicerede fiske embryoner og hæve dem. Hvis ingen skåret plasmid kan påvises, skal du gentage Tol2 mRNA-syntese og mikroinjektion processen indtil de positive resultater af Tol2 punktafgifter assay.

4. etablere transgene ASAP1 fisk, Tg (ubi: ASAP1)

  1. Hæve den injicerede fisk (F0 generation) til voksenalderen, som tidligere beskrevet i zebrafisk bog20. Det tager normalt omkring 4 måneder.
  2. Tage en enkelt voksen F0 fisk og krydse den med en enkelt modsatte køn vildtype fisk. Indsamle fisk embryoner efter avls senere på dagen. Holde de indsamlede fisk embryoner i 28,5 ° C inkubator i fisk vand med 0,1% methylenblåt.
  3. På den tredje dag, skal du kontrollere fisk embryoner under et mikroskop for fluorescerende dissektion med en normal god landbrugspraksis filter. Sortere ud grøn fisk embryoner, hvis der er nogen, og hæve dem til voksenalderen som F1 generation transgene fisk, Tg (ubi: ASAP1).
    Bemærk: Mendelske forholdet forventes ikke, da de fleste af forældrenes F0 fisk er kønsceller genetiske kimærer.
  4. Cross enkelt F1 voksne fisk med vildtype fisk og indsamle fisk embryoner. Sortere ud grøn fisk embryoner og hæve dem til voksenalderen som F2 generation fisk.
    Bemærk: Grøn og ikke-grøn fisk embryoner skal være tæt på 1:1 Hvis der er en enkelt transgenet.
  5. For at se electric potentielle ændringer i svulst som malign perifere nerve kappe tumorer (MPNST), krydse F2 generation Tg (ubi: ASAP1) fisk med rpl35hi258/wt fisk. Det er kendt, at synlige tumorer begynde at findes i 6-8 måneder gamle voksne21,22.

5. billedbehandling

  1. Billede zebrafisk embryoner, tage flere F2 generation grundlægger fisk og krydse dem med vildtype fisk i individuelle bogstavpar. Indsamle fisk embryoner på forskellige ønskede udviklingsstadier efter zebrafisk iscenesættelse guide23.
  2. I de tidlige faser af fisk embryoner, skræl og fjern chorions af embryoner ved hjælp af et par pincet omfattet en dissektion i en 10-cm diameter petriskål med fisk system vand.
  3. Overføre et par fisk embryoner på en concaved glas dias med 3% methylcellulose ved hjælp af en 3,4 mL engangs overførsel pipette. Justere embryoner til de ønskede positioner for at se den cellulære normal god landbrugspraksis aktivitet ved hjælp af en nål under en fluorescerende dissektion anvendelsesområde.
  4. For de bevægelige stadier af fisk embryoner (ældre end 12 somite fase), skal du bruge 0,05% tricaine mesylat til bedøver fisk embryoner før du overfører dem til dias. Kort, fisk embryoner var dukket op til 0,05% tricaine mesylat i fiskevand indtil de holdt op med svømning og tab kroppens balance. Også, tilføje en dråbe af 0,05% tricaine mesylat med methylcellulose på diaset.
  5. For mindre end 12 somite fase fisk embryoner, skal du bruge en epi-fluorescens sammensat mikroskop med et kompatibelt kamera og software til billedbehandling. For ældre end 12 somite fase fisk embryoner, skal du bruge et fluorescens dissektion mikroskop.
  6. Billede tumor celle spænding, først identificere fisk med MPNST tumorer. Derefter bedøver fisk med 0,05% tricaine mesylat. For hele mount sætte imaging, fisken i en 10-cm diameter petriskål. For at se den tumor celle elektriske aktivitet, kan fisk tumorer blive dissekeret ud efter hele mount billeddannelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I en vellykket injektion, mere end 50% injiceres fisk embryoner vil vise en vis grad af grønne fluorescens i somatiske celler, og de fleste af dem vil være positive af Tol2 transposon punktafgifter assay (figur 2). Efter 2-4 generationer af krydse ud med vildtype fisk (indtil de fluorescerende fisk nå 50%, den forventede mendelske ratio), blev de transgene fisk brugt til den billeddiagnostiske eksperiment for at spore celle membran potentialer under fosterudviklingen. Først, membran potentielle ændringer blev undersøgt hele cellecyklus under zebrafisk tidlige embryonale udviklingsstadier. Det blev observeret, at cellerne hyperpolarized før kavalergang fure dannelse (figur 3A-3C, og supplerende Video 1). Desuden viste forskellige væv en bred vifte af membran potentialer i 1-3 dages gamle fisk embryoner. (Figur 3D-3G). For eksempel, er somites og notochord generelt hyperpolarized, sammenlignet med de tilstødende væv/organer. Når zebrafisk embryoner var i stand til at flytte, var vi også i stand til at opdage de neuromuskulære elektrisk aktiviteter (figur 4, supplerende Video 2). Som bioelektrisk egenskaber af kræftceller kan blive ændret, vi benyttede sig af denne ASAP1 reporter fisk, og krydsede den med en rpL35 gen mutant, der er udsat for spontan maligne perifere nerve kappe tumorer21,24 ,25. Selv om kun et par fisk tumorer blev undersøgt, på grund af den lange potentielle vækstperiode for fisk tumor mutant, var det påfaldende, at der var spænding forskelle mellem tumorer og omkringliggende væv i live tumor-bærende zebrafisk (figur 5). Således, disse repræsentative resultater vist den succesfulde generation af en cellulær elektriske reporter fisk linje, og dens potentielle anvendelse på udviklingsmæssige og cellulær biologi.

Figure 1
Fig. 1: Illustration af Tol2 transposon-baserede plasmid konstruktion.
(A) BP rekombination blev brugt til ASAP1 sub kloning i pDONR221 midterste post vektor. attB sekvenser blev føjet til 5-udgangen af primere for ASAP1. (B) Diagram for Tol2 transposon-baserede konstruere montering baseret på LR rekombination. Lilla oval form viser Tol2 inverteret gentager. De stiplede linjer angiver homologe rekombination. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Typiske resultater af injicerede embryoner epifluorescensmikroskop og Tol2-punktafgifter assay.
(A) ikke-positive 1dpf fisk embryo. (B) injiceres med held 1dpf fisk embryo. Normal god landbrugspraksis steder er tydelig i stammen. (C) ikke-positive 2dpf fisk embryo. (D) injiceres med held 2dpf fisk embryo. Normal god landbrugspraksis steder er tydelig i stammen. (E) en repræsentant resultat af Tol2 punktafgifter assay. Lane 1-7 PCR blev forstærket fra 7 tilfældigt valgte fisk embryoner 8 timer efter injektion. Den sidste er en negativ kontrol (NC) uden nogen genomisk DNA. Skalalinjen = 250 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Dynamiske spændingsændringer under zebrafisk embryo udvikling.
(A-C) Differential cellulære spænding polaritet under mitosen i fisk embryoner. (A) 2-celle stadium zebrafisk embryo. (B) 4-celle stadium embryo. (C) 8-celle stadium embryo. De røde pilespidser angive positioner af kavalergang furer i paneler (A-C). Ændringerne er også tydelig i den tilsvarende film (supplerende Video 1). Området omkring kavalergang fure er mere polariseret sammenlignet med resten af cellen. (D-G) Dynamisk elektrisk spændingsændringer i de forskellige tidlige stadier af zebrafisk embryoner. (D) 12-somite fase. (E) 22-somite fase. (F) 48 timer sende befrugtning. (G) 72 timer sende befrugtning. e, øjet; ht, hjertet; NT, notochord; op, optik vesikel; ov, eksotiske vesikel; pf, brystfinnen; , somite; Gitte, æggeblomme. Skalalinjen = 250 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Elektrisk spændingsændringer af selve fisk under fisk embryo bevægelse.
2 - dages gammel fisk embryoner Vis neuro-muskulære elektriske aktiviteter under bevægelse. (A) - (F) sekventielle billeddannelse af samme fisk embryonet. Farve tæthed ændringer er svarer til den elektriske signal transduktion. Tidsinterval mellem to på hinanden følgende billeder er omkring 12,4 millisekunder. De røde pile angiver positioner, spænding ændret billedbehandling i perioden. Ændringerne er også tydelig i den tilsvarende film (supplerende Video 2). Alle paneler er i samme omfang. Skalalinjen = 250 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Tumorceller har tendens til at være mere polariseret.
Et 10 - måneder gamle fisk (rpL35hi258/wt; TG (ubi: ASAP1) udviklet en ondartet perifere nerve kappe svulst i underlivet. (A) & (C) Bright feltet billede. (B) & (D) billede med normal god landbrugspraksis kanal. (A) & (B) intakt fisk. (C) & (D) maven tumor var dissekeret ud. Tumorceller er mere polariseret (lysere grøn) i forhold til de omgivende væv (mørk grøn). Pilespidser Vis tumorer. Alle paneler er i samme omfang. Skalalinjen = 25 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende Video 1 . Epifluorescerende billeddannelse af elektrisk signalering kavalergang stadier i Tg (ubi: ASAP1) fisk embryo. Denne film blev indspillet fra visningen af dyr pole. ASAP1 Fluorescens er forbundet med dannelsen af celle kavalergang fure, en midlertidig struktur under celledeling. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende Video 2 . Epifluorescerende billeddannelse af elektrisk signalering i løbet af 2 - døgn gammel Tg (ubi: ASAP1) fisk embryo bevægelse. Flytningen blev indspillet fra den laterale visning af 2 - døgn gammel fisk fosteret efter anesthetization. The ASAP1 fluorescens ændringer er tydeligt i neuromuskulære væv under den bevægelige proces. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selv om de cellulære og væv niveau elektrisk aktiviteter under fosterudviklingen og menneskelig sygdom blev opdaget en lang tid siden, i vivo dynamiske elektriske ændringer og deres biologiske roller er stadig stort set ukendt. En af de største udfordringer er at visualisere og kvantificere de elektriske ændringer. Patch klemme teknologi er et gennembrud for sporing af enkelt celler, men dens anvendelse til hvirveldyr embryoner er begrænset, fordi de er sammensat af mange celler. De nuværende kemiske spænding farvestoffer er heller ikke ideelt på grund af deres følsomhed, særpræg og toksicitet. De seneste indsats på opfindelsen af GEVIs giver os en ny sti for at visualisere cellulære elektriske aktiviteter i vivo og i realtid. Her viste vi processen med at skabe en zebrafisk elektriske reporter linje, Tg (ubi:ASAP1).

Bruger denne reporter fisk linje, viser vi cellulære elektriske aktiviteter, der kan overvåges i zebrafisk embryoner. Den elektriske spænding ændring er stærkt relateret til celle cyklus i den tidlige embryonale udvikling. Vi har observeret, at hyperpolarisering sker før dannelsen af kavalergang fure/celledeling (figur 3). Dette er i modsætning til den nuværende viden at depolarisering sker før celledeling26. Således flere detaljer af cellemembranen spænding ændres i løbet af celle cyklus af andre dyre- og humane celler, og om dette er relateret til væv kontekst, kræver yderligere undersøgelser. Relaterede undersøgelser er i øjeblikket undervejs i vores laboratorium. Desuden har vi bekræftet, at ASAP1 er i stand til at spore fysiologiske spændingsændringer i den neurale-muskulære system (figur 4), hvori ændringen er relativt hurtigt i forhold til ændringerne i løbet af celle cykler.

Det blev også påvist, at denne reporter kan også bruges til at visualisere zebrafisk tumorer (figur 5). Det var interessant at finde tumor celler var generelt mere polariseret i forhold til det omgivende normale væv. Imidlertid, om dette er et generelt fænomen for alle maligne væv kræver yderligere undersøgelse, på grund af begrænsningen af tumor prøver og fisk tumortyper i denne undersøgelse. Fremtidige undersøgelser på cellemembranen polarisering og spænding kvantificering på andre typer af tumorer og menneskelige kræftceller vil være informativ for bedre at forstå dens roller under tumordannelse.

I denne protokol valgte vi en allestedsnærværende initiativtageren til at drive ASAP1 udtryk til at spore alle celler i fisk embryoner. Væv eller organ specifikke initiativtagere kunne være en anden mulighed, hvis blot en bestemt celle/vævstype foretrækkes. ASAP1 spænding sensor er et relativt godt karakteriseret biosensor, og det er sammensat af en spænding følsomme domæne af søpung spænding-følsomme fosfatase (S3-S4 loop) og en cirkulær permutation af normal god landbrugspraksis (standard er lav fluorescens). Det blev rapporteret til at være udtrykt på den uden for cellulære membran i menneskelige neuron celler og mus hjernen skiver4,27,28. Lysstyrken af sensoren bestemmes overvejende af S3 S4 loop og normal god landbrugspraksis konformationelle holdninger. Den hurtige grønne fluorescens ændring var usandsynligt forårsaget af proteinkoncentration, på grund af hastigheden af lysstyrke ændringer og proteinsyntese. Dog kan transgenet, ASAP1, har ændret udtryk i tumorceller, på grund af karakteren af genomisk ustabilitet. Ud over ASAP1, kan andre GEVIs, såsom archaerhodopsin-baserede spænding indikatorer (QuasAr1 og QuasAr2), også være en god supplerende mulighed, da de bruger en helt anden mekanisme og de også har en høj følsomhed og hastighed 29. Derudover er deres emissioner i rækken rød farve. Dette gør dem særligt gratis til den grønne ASAP1, hvis der allerede er en anden fluorescerende proteiner i samme celle. For eksempel, kan ASAP1 og QuasAr kombineres med Fucci zebrafisk30 for at studere forholdet mellem celle cyklus og elektriske potentielle ændringer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forskningsarbejdet rapporteret i denne publikation blev støttet af National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under Award nummer R35GM124913, Purdue University PI4D incitamentsaflønningsprogram og PVM interne konkurrencedygtige Grundforskning midler programmet. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af de finansiering agenter. Vi takker Koichi Kawakami for Tol2 konstruktionen, Michael Lin for ASAP1 konstruktion, og Leonard Zon for ubi promotor konstruere gennem Addgene.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
14mL cell culture tubes VWR 60818-725 E.Coli culture
Agarose electrophoresis tank Thermo Scientific Owl B2 DNA eletrophoresis
Agarose RA Amresco N605-500G For making the injection gels
Attb1-ASAP1-F primer IDT DNA GGGGACAAGTTTGTACAAAAAA
GCAGGCTTCACCATGGAGACGA
CTGTGAGGTATGAACA
ASAP1 coding region amplification for subcloning
Attb2-ASAP1-R primer IDT DNA GGGGACCACTTTGTACAAGAAA
GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC
AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA
ASAP1 coding region amplification for subcloning
Bright field dissection scope Nikon SMZ 745 Dechorionation, microinjection, mounting
Color camera Zeiss AxioCam MRc Fish embryo image recording
Concave slide VWR 48336-001 For holding fish embryos during imaging process
Disposable transfer pipette 3.4 ml Thermo Scientific 13-711-9AM Fish embryos and water transfer
Endonuclease enzyme, Not I NEB R0189L For linearizing plasmid DNA
Epifuorescent compound scope Zeiss Axio Imager.A2 Fish embryo imaging
Epifuorescent stereo dissection scope Zeiss Stereo Discovery.V12 Fish embryo imaging
Fluorescent light source Lumen dynamics X-cite seris 120 Light source for fluorescence microscopes
Forceps #5 WPI 500342 Dechorionation and needle breaking
Gateway BP Clonase II Enzyme mix Thermo Scientific 11789020 Gateway BP recombination cloning
Gateway LR Clonase II Plus enzyme Thermo Scientific 12538120 Gateway LR recombination cloning
Gel DNA Recovery Kit Zymo Research D4002 DNA gel purification
Loading tip Eppendorf 930001007 For loading injection solution into capilary needles
Methylcellulose (1600cPs) Alfa Aesar 43146 Fish embryo mounting
Methylene blue Sigma-Aldrich M9140 Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes
Microinjection mold Adaptive Science Tools TU-1 To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection
Microinjector WPI Pneumatic Picopump PV820 Microinjection injector
Micro-manipulator WPI Microinjector MM3301R Microinjection operation
Micropipette puller Sutter instrument P-1000 For preparing capillary needle
Mineral oil Amresco J217-500ml For calibrating injection volume
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Thermo Scientific AM1340 mRNA in vitro transcription
Monocolor camera Zeiss AxioCam MRm Fish embryo image recording
Plasmid Miniprep Kit Zymo Research D4020 Prepare small amount of plasmid DNA
Plastic Petri dishes VWR 25384-088 For holding fish or fish embryos during imaging process
RNA Clean & Concentrator-5 Zymo Research R1015 mRNA cleaning after in vitro transcription
Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 2000 For measuring DNA and RNA concentrations
Stage Micrometer Am Scope MR100 Microinjection volume calibration
Thermocycler Bio-Rad T100 DNA amplification for gene cloning
Thin wall glass capillaries WPI TW100F-4 Raw glass for making cappilary needle
Tol2-exL1 primer IDT DNA GCACAACACCAGAAATGCCCTC Tol2 excise assay
Tol2-exR primer IDT DNA ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG Tol2 excise assay
TOP10 Chemically Competent E. coli Thermo Scientific C404006 Used for transformation during gene cloning
Tricaine mesylate Sigma-Aldrich A5040 For anesthetizing fish or fish embryos
UV trans-illuminator 302nm UVP M-20V DNA visualization
Water bath Thermo Scientific 2853 For transformation process of gene cloning

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Levin, M. Molecular bioelectricity: how endogenous voltage potentials control cell behavior and instruct pattern regulation in vivo. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3835-3850 (2014).
  2. Storace, D., et al. Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential. Trends in Neuroscience. 39 (5), 277-289 (2016).
  3. Inagaki, S., Nagai, T. Current progress in genetically encoded voltage indicators for neural activity recording. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 95-100 (2016).
  4. St-Pierre, F., et al. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nature Neuroscience. 17 (6), 884-889 (2014).
  5. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
  6. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
  7. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. , (2013).
  8. Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (21), 11403-11408 (2000).
  9. Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science USA. 105 (50), 19827-19832 (2008).
  10. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  11. Mosimann, C., et al. Ubiquitous transgene expression and Cre-based recombination driven by the ubiquitin promoter in zebrafish. Development. 138 (1), 169-177 (2011).
  12. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
  13. Ordovas, J. M. Separation of small-size DNA fragments using agarose gel electrophoresis. Methods in Molecular Biology. 110, 35-42 (1998).
  14. Downey, N. Extraction of DNA from agarose gels. Methods Mol Biol. 235, 137-139 (2003).
  15. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. 45 (45), (2010).
  16. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  17. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
  18. Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610, 612, 614 (2007).
  19. Kawakami, K., Koga, A., Hori, H., Shima, A. Excision of the tol2 transposable element of the medaka fish, Oryzias latipes, in zebrafish, Danio rerio. Gene. 225 (1-2), 17-22 (1998).
  20. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, Univ. of Oregon Press. (2000).
  21. Amsterdam, A., et al. Many ribosomal protein genes are cancer genes in zebrafish. PLoS Biology. 2 (5), E139 (2004).
  22. Lai, K., et al. Many ribosomal protein mutations are associated with growth impairment and tumor predisposition in zebrafish. Developmental Dynamics. 238 (1), 76-85 (2009).
  23. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  24. Zhang, G., et al. Comparative oncogenomic analysis of copy number alterations in human and zebrafish tumors enables cancer driver discovery. PLoS Genetics. 9 (8), e1003734 (2013).
  25. Zhang, G., et al. Highly aneuploid zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors have genetic alterations similar to human cancers. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107 (39), 16940-16945 (2010).
  26. Urrego, D., Tomczak, A. P., Zahed, F., Stuhmer, W., Pardo, L. A. Potassium channels in cell cycle and cell proliferation. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B. 369 (1638), 20130094 (2014).
  27. Yang, H. H., et al. Subcellular Imaging of Voltage and Calcium Signals Reveals Neural Processing In Vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
  28. Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
  29. Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
  30. Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 106 (49), 20812-20817 (2009).

Tags

Denne måned i JoVE spørgsmål 134 bioelektromagnetisme cellens membran potentiale embryonale udvikling zebrafisk ASAP1 (Accelerated Sensor af handling potentialer 1) GEVIs (genetisk kodet spænding indikatorer)
Visualisering af cellulære elektriske aktivitet i zebrafisk tidlige embryoner og tumorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Silic, M. R., Zhang, G.More

Silic, M. R., Zhang, G. Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors. J. Vis. Exp. (134), e57330, doi:10.3791/57330 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter