Summary
Qui vi mostriamo il processo di creazione di una linea di zebrafish del reporter di tensione elettrica cellulare per visualizzare lo sviluppo embrionale, il movimento, e cellule di pesce del tumore in vivo.
Abstract
Bioelettricità, elettrico di segnalazione endogena mediata dai canali ionici e pompe situate sulla membrana cellulare, svolge i ruoli importanti nella segnalazione dei processi delle cellule neuronali e muscolari eccitabili e molti altri processi biologici, come embrionali patterning inerente allo sviluppo. Tuttavia, c'è una necessità per il monitoraggio di attività elettrica in vivo nell'embriogenesi dei vertebrati. I progressi degli indicatori di tensione fluorescenti geneticamente codificato (GEVIs) hanno reso possibile fornire una soluzione per questa sfida. Qui, descriviamo come creare una tensione transgenici indicatore zebrafish utilizzando l'indicatore di tensione stabilito, ASAP1 (accelerato di sensore di potenziali di azione 1), come esempio. Il kit Tol2 e un promotore di zebrafish onnipresente, ubi, sono stati scelti in questo studio. Spieghiamo anche i processi di clonazione site-specific di Gateway, Tol2 basati su trasposone zebrafish transgenesi e il processo di imaging per tumori di embrioni e pesce pesce di fase iniziale utilizzando microscopi normali epifluorescente. Usando questa linea di pesce, abbiamo trovato che ci sono variazioni di tensione elettrica cellulare durante l'embriogenesi zebrafish e pesce larvale movimento. Inoltre, è stato osservato che in alcuni tumori del fodero del nervo periferico maligno zebrafish, il tumore le cellule erano generalmente polarizzate rispetto ai tessuti normali circostanti.
Introduction
Bioelettricità si riferisce a segnali elettrici endogeno mediato da canali ionici e pompe situate sulla membrana cellulare1. Lo scambio ionico attraverso la membrana cellulare e le modifiche correnti e potenziali elettriche accoppiate, è essenziale per la segnalazione dei processi delle cellule neuronali e muscolari eccitabili. Inoltre, bioelettricità e gradienti ionici hanno una varietà di altre importanti funzioni biologiche, tra cui la conservazione dell'energia, biosintesi e trasporto del metabolita. Bioelettrica di segnalazione è stato scoperto anche come regolatore della formazione embrionale modello, come assi di corpo, il ciclo cellulare e di differenziazione delle cellule1. Pertanto, è fondamentale per la comprensione di molte malattie congenite umane che derivano da mis-regolamento di questo tipo di segnalazione. Anche se toppa morsetto è stato ampiamente utilizzato per la registrazione di singole cellule, è ancora lungi dall'essere ideale per il monitoraggio simultaneo di più celle durante lo sviluppo embrionale in vivo. Inoltre, tensione sensibili piccole molecole non sono anche ideali per applicazioni in vivo a causa della loro specificità, sensibilità e tossicità.
La creazione di una varietà di geneticamente codificato fluorescente tensione indicatori (GEVIs) offre un nuovo meccanismo per superare questo problema e permette per una facile applicazione studiare lo sviluppo embrionale, anche se essi sono stati originariamente inteso per monitoraggio neurale cellule di2,3. Uno della GEVIs attualmente disponibile è il sensore accelerato di potenziali di azione 1 (ASAP1)4. Si compone di un ciclo extracellulare di un dominio di rilevamento di tensione di tensione sensibile fosfatasi e una proteina fluorescente verde circolarmente permutata. Pertanto, ASAP1 permette la visualizzazione dei cambiamenti potenziali elettrici cellulari (polarizzazione: verde brillante; depolarizzazione: verde scuro). ASAP1 ha 2 ms on-e off cinetica e può tenere traccia di sottosoglia potenziale cambiamento4. Così, questo strumento genetico permette un nuovo livello di efficacia nel monitoraggio in tempo reale bioelettrica in cellule vive. Ulteriore comprensione dei ruoli di bioelettricità nello sviluppo embrionale e molte malattie umane, quali il cancro, sarà gettato nuova luce sui meccanismi sottostanti, che è fondamentale per la prevenzione e trattamento della malattia.
Zebrafish hanno dimostrato un potente modello animale per studiare biologia inerente allo sviluppo e malattie umane, compreso cancro5,6. Essi condividono geni ortologhi di 70% con gli esseri umani, e hanno simile vertebrati biologia7. Zebrafish fornire cura relativamente facile, una dimensione di grande frizione delle uova, trattabile genetica, transgenesi facile e trasparente esterno sviluppo embrionale, che li rendono un sistema superiore per in vivo imaging5,6. Una grande fonte di linee di pesci mutanti già presenti e un genoma completamente sequenziato, zebrafish fornirà una gamma relativamente illimitata della scoperta scientifica.
Per studiare in vivo in tempo reale attività elettrica delle cellule, approfittiamo del sistema modello zebrafish e ASAP1. In questo articolo, descriviamo come incorporare il biosensore fluorescente tensione ASAP1 il genoma di zebrafish utilizzando Tol2 trasposone transgenesi e visualizzare attività elettrica cellulare durante lo sviluppo embrionale, il pesce movimento larvale e nel tumore dal vivo .
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Protocol
Zebrafish sono alloggiati in una struttura animale AAALAC-approvato, e tutti gli esperimenti sono stati effettuati secondo i protocolli approvati dalla Purdue Animal Care and uso Comitato (PACUC).
1. Tol2 trasposone Miniprep costrutto
Nota: Tol2, un trasposone che è stato scoperto nei pesci medaka, ampiamente è stato utilizzato nello zebrafish ricerca comunità8,9. È stato adottato per il Gateway del sito ricombinazione clonazione sistema basato e conosciuto come il Tol2 kit10con successo. Il kit Tol2 permette per un modo più conveniente di creare costrutti di espressione personalizzata, ma anche di aumentare l'efficienza della transgenesi. Così, era una decisione facile da prendere vantaggio di questo sistema e creare un'onnipresente ASAP1 espressione zebrafish riga utilizzando un promotore convalidato ubiquitina guidare ASAP111.
- Creazione di una costruzione centrale voce ASAP1: pDONR221-ASAP1
- Acquisire il codificato geneticamente Tensione sensore ASAP1 costruire, pcDNA3.1/Puro-CAG-ASAP1 (plasmide #52519), da Addgene. Per amplificare la regione di codificazione di ASAP1, è possibile impostare una PCR utilizzando i primer su misura (attB1-ASAP1F e attB2-ASAP1R) fiancheggiati da sequenze di attB all'estremità 5' dei primer (Figura 1). Phusion DNA polimerasi è stato scelto per la sua elevata efficienza e condizioni di PCR sono state ottimizzate basati sul protocollo precedentemente pubblicato12.
- Caricare i prodotti di PCR 50 µ l in un 1% TAE gel utilizzando una pipetta regolare con punte di 200 µ l ed eseguire l'elettroforesi a 160 V in un serbatoio orizzontale gel per circa 30 min.
- Verifica il gel sotto un transilluminatore UV (353 nm), asportare fuori la banda desiderata utilizzando un bisturi a lama/sotto un transilluminatore UV come precedentemente pubblicati13,14e mettere il campione di DNA contenente gel in una microcentrifuga pulito 1,5 mL tubo.
- Eseguire purificazione del gel per i prodotti di PCR di ASAP1. Recuperare il DNA nel gel asportato utilizzando un kit di purificazione dei gel DNA commerciale seguendo le istruzioni del fabbricante ed eluire il DNA in 20 µ l di acqua. Prendere 1 µ l come un campione e misurare la concentrazione di DNA usando uno spettrofotometro. Le istruzioni del software utilizzando l'acqua come un controllo vuoto15del flusso.
- Prendere 100 ng di purificato prodotto di PCR e mescolarla con 150 ng di plasmide pDONR221 a 10 µ l di TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8.0)16. Aggiungere 2 µ l di BP Clonase II nella reazione e incubare la reazione a temperatura ambiente durante la notte.
- Il secondo giorno, aggiungere 1 µ l di proteinasi K nella reazione e incubare la reazione a 37 ° C per 30 min.
- Eseguire la trasformazione. La reazione di trasferimento e mescolare con 50 µ l di Top10 competenti Escherichia coli cellule e incubare le cellule in ghiaccio per 30 min. Poi, trasferire la provetta di reazione in bagnomaria a 42 ° C per 1 min. immediatamente rimuovere il tubo e incubare in ghiaccio per 2 min. Successivamente, mettere il tubo in uno shaker di 37 ° C ed incubare per 1 h.
- Estrarre il tubo e piastra le cellule su un piatto di kanamicina LB. Successivamente, incubare la piastra durante la notte (16-18 h) a 37 ° C.
- Scegli colonie singole e ben separate e inoculare loro in provette di coltura cellulare di 14 mL con 3 mL di terreno LB. Li della coltura durante la notte a 37 ° C in uno shaker con una velocità di rotazione di 250 giri/min (rotazione al minuto).
- Eseguire miniprep utilizzando un kit commerciale miniprep seguendo il manuale di istruzioni17.
- Sequenza 3-4 plasmidi con Sanger sequenziamento per identificare positivo pDONR221-ASAP1 cloni utilizzando primer di sequenziamento di M13F e M13R.
- Creando il costrutto Tol2 per il microinjection: pDestTol2 -ubi-ASAP1
- Scegliere che il sequenziamento verificato misura e pDONR221-ASAP1 clone sua concentrazione di DNA usando un seguito di spettrofotometro l'istruzione software usando l'acqua come un vuoto di controllo15.
- Prendere 100 µ g di pDONR221-ASAP1 e mescolare con 100 µ g del Tol2 kit 5-fine del plasmide (pENTR5'_ubi, Addgene n. 27320), 100 µ g di p3E-polyA (Tol2 kit #302) e 150 µ g di pDestTol2pA2 (Tol2 kit #394). Regolare volume totale a 8 µ l utilizzando il buffer di TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) in una microcentrifuga da 1,5 mL provetta e mescolare bene da un vortice breve di 2-5 s. Quindi, aggiungere 2 µ l di LR Clonase II plus e incubi la reazione a temperatura ambiente durante la notte.
- Il secondo giorno, aggiungere 1 µ l di proteinasi K nella reazione usando una pipetta a 10 µ l e incubare la reazione a 37 ° C per 30 min.
- Eseguire la trasformazione e identificare i cloni positivi come descritto sopra (punti 1.1.7-11).
- Misura la concentrazione di DNA di sequenziamento verificato pDestTol2-ubi-ASAP1 clone (Figura 1B) utilizzando un spettrofotometro15. La concentrazione è solitamente intorno 200ng / µ l.
2. preparare Tol2 Transposase mRNA e soluzione iniettabile
- Striscia e. coli glicerolo stock di pCS2FA-transposase plasmide (Tol2 kit #396) su una piastra di LB (con 100 ampicillina µ g/mL) utilizzando un ciclo di inoculazione sterilizzato. Incubare la piastra a 37 ° C in un incubatore per una notte. Il giorno successivo, prendere una singola Colonia e inoculare esso in 3 mL di LB (ampicillina 100 µ g/mL) usando una pipetta sterilizzata di 10 µ l. Della coltura durante la notte a 37 ° C in uno shaker con una velocità di rotazione di 250 giri/min.
- Eseguire miniprep sulla cultura di e. coli utilizzando un kit commerciale miniprep seguendo il manuale di istruzioni. Eluire il DNA del plasmide in 30-50 µ l di tampone di TE da 1 minuto Centrifugare a 14.000 giri/min e misurare la sua concentrazione di DNA con uno spettrofotometro.
- Linearizzare µ g di 1-2 del plasmide con non ho endonucleasi e purificare il DNA con un DNA pulizia kit seguendo il manuale di istruzioni dopo che non ho la digestione. Eluire il DNA in 5 µ l di acqua mediante centrifugazione a 14.000 rpm per 1 minuto. La concentrazione attesa è di circa 200-300 ng / µ l.
- Eseguire la trascrizione in vitro con non linearizzato pCS2FA-transposase come un modello di DNA utilizzando un kit di trascrizione SP6 commerciale.
- Una volta terminata la reazione, purificare Tol2 transposase mRNA usando una pulizia commerciale RNA kit seguendo le istruzioni del produttore. Infine, eluire mRNA in acqua RNAse-libera di 20 µ l e misurare la concentrazione di RNA in uno spettrofotometro. La concentrazione attesa è di circa 1-3 µ g / µ l. campioni possono essere conservati in un congelatore a-80 ° C, se necessario.
- Preparare la soluzione di microiniezione mescolando 20 ng / µ l pDestTol2 -ubi-transposase ASAP1 e Tol2 mRNA (100 ng / µ l) in un tubo del microcentrifuge pipettando. Per impedire la degradazione dell'acido nucleico causata da scongelamento ripetuti e ricongelare, aliquotare 6 µ l per provetta e memorizzarlo in un congelatore-80 ° C per un uso futuro.
3. microiniezione
- Impostare 4-6 vasche di allevamento con almeno 2 maschi e 2 femmine il pomeriggio prima dell'iniezione. Questi pesci non devono essere alimentati nel pomeriggio. Questo passaggio verrà ridurre la quantità di rifiuti di pesce e risparmiare tempo per pulire fuori la mattina successiva, aiutando anche per indurre una risposta di allevamento.
- La mattina seguente, rimuovere la soluzione preparata iniezione (pDestTol2 -ubi-ASAP1 costrutto e Tol2 mRNA) dal congelatore-80 ° C e posizionarlo sul ghiaccio.
- Tirare i divisori nel pesce di allevamento serbatoi e consentire il pesce ad accoppiarsi. In generale, pesci depongono le uova all'interno di 20-30 minuti dopo aver tirato fuori il divisore. Se non, attendere 1-2 ore in più. Alcuni pesci non possono affatto depongono le uova. In questo caso, è possibile ripetere questo esperimento per la raccolta di embrioni di pesce.
- Durante l'attesa, assicurarsi che non ci sono aghi preparati con la punta rotta in un angolo che crea un bordo smussato con forcipe o rompendo il tergicristallo un compito delicato.
- Tirare aghi da vetro capillare su un estrattore micropipetta utilizzando i seguenti parametri: calore 545; tirare 60; velocità 80; tempo 250; pressione 500. Rompere l'ago con una pinza sotto un ambito di dissezione (con oculare righello per la stima del diametro) tenendo il forcipe a un angolo di circa 45 °. Diametri degli aghi desiderata possono essere variabile a seconda delle impostazioni di microinjector, ma più piccolo diametro è comodo per fare diminuire la mortalità embrionale.
- Una volta che i pesci hanno deposto le uova, raccoglierli in un diametro di 10 cm di Petri e portarli all'ambito di dissezione. Rimuovere tutti gli embrioni anormali e rifiuti di pesce.
- Dispensare gli embrioni fecondati nell'iniezione di preparati agarosio al 3% della muffa. Rimuovere l'acqua in eccesso per aiutare a mantenere gli embrioni in luogo.
- Una volta che tutte le righe sono pieni di embrioni vitali, disporli in modo che le singole celle tutti rivolti nella stessa direzione verso l'ago, che è circa un angolo di 45° in orizzontale. Questo faciliterà iniezione molto più tardi.
- Anche con i guanti, utilizzare una pipetta di caricamento di 20 µ l punta e rimuovere 5 µ l del costrutto preparato dal tubo sul ghiaccio.
- Inserire delicatamente la punta nell'estremità posteriore del tubo capillare rotto fino a dove inizia a tapper, come per ottenere il reagente più vicino alla punta. Se ci sono ancora delle bolle d'aria, agitare l'ago, facendo attenzione a non rompere la punta.
- Inserire l'ago direttamente nel porta-aghi microiniezione e serrare con cautela fino a quando l'ago rimane al suo posto. Regolare l'angolo di circa 45°.
- Una volta che l'ago è preparato e collegato, accendere il microscopio e gas serbatoio a pressione. Delle imprese CO2 serbatoi sono generalmente buoni per questo scopo. Il volume di iniezione viene regolato dalla pressione di detenzione ed espulsione: approssimativa 0,5 psi per detenzione e a 30 psi per espulsione. Assicuratevi di controllare che la soluzione viene fuori quando si preme il pedale.
- Utilizzando un micrometro con una goccia di olio minerale, regolare il volume e il flusso della soluzione a ~ 150 µm di diametro (circa 2 nL). Assicurarsi che la pressione posteriore vi permetterà una piccola quantità di gocciolare fuori dell'ago. Se non c'è abbastanza pressione, azione capillare provoca liquido inserire l'ago e distruggere il mRNA.
- Una volta che l'ago è calibrato, cominciare a iniettare il costrutto la singola cella degli embrioni fecondati.
Nota: Questo richiede una grande quantità di pratica, pazienza e finezza, a causa della membrana delle cellule, essendo difficile da perforare. È importante iniettare la soluzione nella cellula, non il tuorlo, per la generazione di zebrafish transgenici. Questo è diverso dall'iniezione di morpholino. Non importa quale lato l'ago entra nella cellula fintanto che il costrutto va nella cella. La transgenesi avrà un tasso molto basso di successo se iniettato nel tuorlo invece della cella. Cella singola fase iniezione è anche importante, o pesce chimera somatico verrà creato. Questo ridurrà le possibilità del transgene andando alle cellule germinali. - Utilizzare il bordo della tacca gel per fornire un supporto che mantiene l'embrione in posizione e permette l'ago applicare pressione senza spostare l'embrione. Una volta che la punta dell'ago è nella cella singola, premere il pedale per rilasciare la quantità desiderata di soluzione. Ripetere questo processo per tutti gli embrioni.
- Al termine dell'operazione, è possibile trasferire gli embrioni iniettati in un piatto con etichettato risciacquandole fuori la tacca di agarosio con acqua sistema di pesci e delle pipette monouso 3,4 mL. Conservare gli embrioni in un incubatore di 28,5 ° C per far loro sviluppare. Controllare indietro per tutto il giorno di rimozione di embrioni di pesce morto e sostituire l'acqua con blu di metilene 0,1% in acqua pesci.
- Circa 6-8 ore dopo l'iniezione, individuo di prendere 10 iniettato embrioni di pesce e preparare il DNA genomico da loro usando il metodo di Hotshot18.
- La mattina seguente, utilizzare un microscopio di dissezione con una sorgente di luce di fluorescenza per ordinare fuori gli embrioni risultati GFP nei tessuti non-tuorlo. Questi embrioni di pesce dovrebbero contenere il costrutto iniettato.
- Eseguire analisi di accise Tol2 per controllare l'attività di trasposizione come descritto in precedenza19. Se asportato plasmide può essere rilevata, mantenere l'iniettato embrioni di pesce e farli crescere. Se nessun plasmide asportata può essere rilevato, ripetere il processo di sintesi e microiniezione di Tol2 mRNA fino a raggiungere i risultati positivi del test delle accise Tol2.
4. stabilire dei pesci transgenici ASAP1, Tg (ubi: ASAP1)
- Come descritto in precedenza nel libro zebrafish20, sollevare il pesce iniettato (generazione0 F) fino all'età adulta. Questo di solito dura circa 4 mesi.
- Prendere un singolo adulto F0 pesce e attraversarlo con un unico fronte genere wildtype pesce. Raccogliere pesci embrioni dopo la nidificazione nel corso della giornata. Tenere gli embrioni di pesci raccolti nell'incubatrice 28,5 ° C nei pesci di acqua con 0,1% di blu di metilene.
- Il terzo giorno, controllare gli embrioni di pesce sotto un microscopio fluorescente dissezione con un filtro GFP. Risolvere gli embrioni di pesce verde, se ne esistono e farli crescere fino all'età adulta come pesci transgenici di F1 generazione, Tg (ubi: ASAP1).
Nota: Rapporto mendeliana non dovrebbe dato che la maggior parte del pesce0 F parentale sono chimere genetica germinale. - Attraversare il singolo F1 adult pesce con pesce wildtype e raccogliere embrioni di pesce. Ordina fuori embrioni di pesce verde e farli crescere fino all'età adulta come pesce di generazione2 F.
Nota: Verde e gli embrioni non-verde pesce dovrebbero essere vicino a 1:1 se c'è un transgene singolo. - Per visualizzare le modifiche potenziali elettriche nel tumore come tumori del fodero del nervo periferico maligno (MPNST), attraversare la generazione F di2 Tg (ubi: ASAP1) pesce con pesce rpl35hi258/wt . È noto che i tumori visibili iniziano a essere trovato nel 6-8 mese vecchio adulti21,22.
5. imaging
- Immagine di embrioni di zebrafish, prendere più fondatore di generazione2 F pesce e li attraversano con wildtype pesce in singole coppie. Raccogliere pesci embrioni a diversi stadi di sviluppo desiderati secondo zebrafish Guida23di gestione temporanea.
- Per le fasi iniziali di embrioni di pesce, sbucciare e rimuovere chorions degli embrioni con attenzione usando un paio di pinze in un ambito di dissezione in un diametro di 10 cm di Petri con acqua sistema di pesci.
- Trasferire alcuni embrioni di pesce su un vetrino concavo con metilcellulosa 3% utilizzando una pipetta monouso 3,4 mL. Regolare gli embrioni nelle posizioni desiderate per visualizzare l'attività GFP cellulare utilizzando un ago sotto un ambito di dissezione fluorescente.
- Per le fasi di movimento di embrioni di pesce (più vecchi di 12 stadi somite), è possibile utilizzare mesylate tricaina 0.05% per anestetizzare gli embrioni di pesce prima di trasferirli a diapositive. Brevemente, embrioni di pesce erano emerse in 0.05% tricaina mesylate in pesci d'acqua fino a quando hanno smesso di nuotare ed equilibrio corpo perdita. Inoltre, aggiungere una goccia di 0.05% tricaina mesylate con la metilcellulosa sulla diapositiva.
- Per meno di 12 embrioni somite fase pesce, è necessario utilizzare un microscopio composto di epi-fluorescenza con una fotocamera compatibile e software per l'imaging. Per più di 12 embrioni di pesce fase somite, utilizzare un microscopio di dissezione di fluorescenza.
- A immagine di tensione delle cellule del tumore, in primo luogo identificare il pesce con i tumori MPNST. Quindi, anestetizzare il pesce con 0.05% tricaina mesylate. Per l'intero supporto imaging, mettere il pesce in un diametro di 10 cm di Petri. Per visualizzare l'attività elettrica delle cellule del tumore, i tumori pesce potrebbero essere dissecati fuori dopo formazione immagine intero supporto.
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Representative Results
In un'iniezione di successo, più di embrioni di pesce 50% iniettato visualizzerà un certo grado di fluorescenza verde nelle cellule somatiche, e la maggior parte di loro sarà positiva dall'analisi di Tol2 trasposone accise (Figura 2). Dopo 2-4 generazioni di fuori-croce con pesce wildtype (fino a quando il pesce fluorescente raggiungere il 50%, il rapporto previsto mendeliano), i pesci transgenici sono stati utilizzati per l'esperimento di formazione immagine per rilevare potenziali di membrana cellulare durante lo sviluppo embrionale. In primo luogo, variazioni di potenziale di membrana sono stati esaminati durante tutto il ciclo delle cellule durante i primi stadi di sviluppo embrionale zebrafish. È stato osservato che le cellule hyperpolarized prima della formazione del solco di clivaggio (Figura 3A-3Ce complementare Video 1). Inoltre, diversi tessuti ha mostrato una varietà di potenziali di membrana in 1-3 giorni vecchi embrioni di pesce. (Figura 3D-3G). Ad esempio, i somiti e notocorda sono generalmente hyperpolarized, rispetto ai tessuti/organi adiacenti. Una volta che gli embrioni di zebrafish sono stati in grado di muoversi, siamo stati anche in grado di rilevare l'attività elettrica neuromuscolare (Figura 4, complementare Video 2). Poichè la proprietà bioelettriche delle cellule tumorali potrebbe essere alterata, abbiamo approfittato di questo reporter ASAP1 pesce e ha attraversato con un mutante del gene rpL35 , che è incline al nervo periferico maligno spontaneo guaina tumori21,24 ,25. Anche se solo pochi tumori di pesce sono stati esaminati, dovuto il periodo lungo potenziale di crescita per il mutante di tumore di pesce, era evidente che c'erano differenze di tensione tra tumori e tessuti circostanti in diretta del tumore-cuscinetto zebrafish (Figura 5). Quindi, questi risultati rappresentativi dimostrata la generazione di successo di una linea di pesce elettrico cellulare reporter e la sua applicazione potenziale di biologia cellulare e dello sviluppo.
Figura 1: Illustrazione della costruzione basata su trasposone plasmide Tol2.
(A) ricombinazione di BP è stato utilizzato per ASAP1 Sub-clonazione nel vettore pDONR221 voce centrale. sequenze di attB sono stati aggiunti all'estremità 5 dei primer per ASAP1. (B) diagramma per Tol2 basati su trasposone costruire assemblaggio basato su ricombinazione LR. Forma ovale viola dimostra Tol2 invertito si ripete. Le linee tratteggiate indicano la ricombinazione omologa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: I risultati tipici di embrioni iniettati dall'analisi Tol2-accise ed epifluorescenza.
(A) embrione di pesce 1dpf Non-positivo. (B) iniettato con successo dell'embrione di pesce 1dpf. Macchie GFP sono evidenti nel bagagliaio. (C) embrione di pesce 2dpf Non-positivo. (D) iniettato con successo dell'embrione di pesce 2dpf. Macchie GFP sono evidenti nel bagagliaio. (E) un risultato rappresentativo del dosaggio delle accise Tol2. Lane 1-7 di PCR sono stati amplificati da 7 a caso selezionato embrioni di pesce 8 ore dopo l'iniezione. L'ultimo è un controllo negativo (NC) senza qualsiasi DNA genomic. Barra della scala = 250 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Tensione dinamica cambia durante lo sviluppo embrionale di Danio rerio.
(A-C) Polarità di tensione cellulare differenziale durante la mitosi negli embrioni di pesce. Embrione di pesce zebra di (A) fase 2-cell. (B) dell'embrione fase 4-cell. Embrione di stadio di 8 cellule (C) . Le teste di freccia rossa indicano le posizioni dei solchi clivaggio nei pannelli (A-C). Le modifiche sono evidenti anche del film corrispondente (complementare Video 1). La regione intorno al solco è più polarizzato rispetto al resto della cellula. (D-G) Variazioni di tensione elettrica dinamica nelle diverse fasi iniziali degli embrioni di zebrafish. (D) fase 12-somite. (E) stage 22-somite. (F) 48 ore dopo la fecondazione. (G) 72 ore dopo la fecondazione. e, occhio; ht, cuore; NT, notocorda; op, vescicola ottica; ov, vescicola otica; pf, pinne pettorali; così, somite; yk, tuorlo. Barra della scala = 250 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Cambiamenti di tensione elettrica del corpo durante il movimento di embrione di pesce pesce.
2 - giorno-vecchio pesce embrioni Visualizza neuro-muscolare elettrico attività durante il movimento. (A) - (F) sequenziale imaging dell'embrione stesso pesce. Cambiamenti di densità di colore sono corrispondenti alla trasduzione del segnale elettrica. L'intervallo di tempo tra due immagini consecutive è circa 12,4 millisecondi. Le frecce rosse indicano le posizioni che tensione cambiato durante il periodo di formazione immagine. Le modifiche sono evidenti anche del film corrispondente (complementare Video 2). Tutti i pannelli sono nella stessa scala. Barra della scala = 250 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Le cellule tumorali tendono ad essere più polarizzato.
Un pesce di 10 mesi di età (rpL35hi258/wt; TG (ubi: ASAP1) ha sviluppato un tumore del fodero del nervo periferico maligno nell'addome. Bright (C) & (A) immagine di campo. (B) e (D) immagine con canale GFP. (A) e (B) pesci intatto. (C) & (D) addome tumore è stato dissecato fuori. Le cellule del tumore sono più polarizzata (più luminoso verde) rispetto alle circostanti tessuti (verde scuro). Le frecce indicano i tumori. Tutti i pannelli sono nella stessa scala. Barra della scala = 25 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Complementare dei Video 1 . Epifluorescente imaging dei segnali elettrici durante le fasi di clivaggio a Tg (ubi: ASAP1) embrione di pesce. Questo film è stato registrato dalla vista del polo animale. La fluorescenza di ASAP1 è associata con la formazione del solco di cella, una struttura temporanea durante la divisione cellulare. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
Complementare dei Video 2 . Epifluorescente imaging dei segnali elettrici durante Tg 2 - giorno-vecchio (ubi: ASAP1) movimento di embrione di pesce. La mossa è stata registrata dalla vista laterale dell'embrione di pesce 2 - vecchio giorno dopo amputate. The ASAP1 alterazioni di fluorescenza sono evidenti in tessuto neuromuscolare durante il processo di spostamento. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Sebbene le attività di elettrico livello cellulare e tissutale durante lo sviluppo embrionale e malattia umana sono stati scoperti molto tempo fa, i cambiamenti dinamici elettrici in vivo e loro ruoli biologici ancora rimangono in gran parte sconosciuti. Una delle sfide principali è quello di visualizzare e quantificare i cambiamenti elettrici. Tecnologia di patch clamp è un'innovazione per tenere traccia delle singole cellule, ma la sua applicazione agli embrioni vertebrati è limitato perché sono composte di molte cellule. I coloranti chimici tensione corrente non sono anche l'ideali grazie alla loro sensibilità, la specificità e la tossicità. I recenti sforzi sull'invenzione del GEVIs ci forniscono un nuovo percorso per visualizzare attività elettrica cellulare in vivo e in tempo reale. Qui, abbiamo mostrato il processo di creazione di una linea elettrica reporter di zebrafish, Tg (ubi:ASAP1).
Utilizza questa linea di pesce reporter, mostriamo attività elettriche cellulari che possono essere monitorate in embrioni di zebrafish. La variazione di tensione elettrica è altamente relativo al ciclo cellulare durante lo sviluppo embrionale precoce. Abbiamo osservato che hyperpolarization accade prima della formazione della divisione clivaggio solco/cella (Figura 3). Questo è in contrasto con le attuali conoscenze che depolarizzazione accade prima divisione cellulare26. Così, più dettagli di tensione della membrana cellulare cambia durante il ciclo cellulare delle altre cellule animali ed umani e se questo è legato al contesto del tessuto, richiede ulteriori studi. Studi correlati sono attualmente in corso nel nostro laboratorio. Inoltre, abbiamo verificato che ASAP1 è in grado di tenere traccia delle modifiche fisiologiche tensione nel sistema neurale-muscolare (Figura 4), in cui l'alterazione è relativamente veloce rispetto ai cambiamenti durante cicli cellulari.
È stato anche dimostrato che questo giornalista utilizzabile anche per visualizzare i tumori zebrafish (Figura 5). E ' stato interessante trovare tumore le cellule erano generalmente più polarizzate rispetto ai tessuti normali circostanti. Tuttavia, se si tratta di un fenomeno generale per tutti i tessuti maligni richiede ulteriori indagini, a causa della limitazione di tutti i campioni del tumore e tumore pesce in questo studio. Le indagini future sulla quantificazione di polarizzazione e tensione di membrana cellulare su altri tipi di tumori e cellule tumorali umane sarà informative per comprendere meglio i suoi ruoli durante il tumorigenesis.
In questo protocollo, abbiamo scelto un promotore onnipresente per guidare l'espressione ASAP1 per tenere traccia di tutte le celle in embrioni di pesce. Tessuto o organo specifici promotori potrebbero essere un'altra opzione se solo un certo tipo di tessuto e delle cellule è preferito. Il sensore di tensione di ASAP1 è un biosensore relativamente ben caratterizzato, e si compone di un dominio sensibile di tensione della fosfatasi di tensione-sensibili e crostacei (ciclo S3-S4) e una permutazione circolare di GFP (di default è bassa fluorescenza). È stato segnalato per essere espresso sulla membrana cellulare esterna in cellule del neurone umano e del mouse cervello fette4,27,28. La luminosità del sensore è determinata prevalentemente dalle posizioni conformazionali del ciclo S3-S4 e GFP. Il cambiamento di fluorescenza verde rapida era improbabile causato dalla concentrazione di proteine, a causa della velocità dei cambiamenti di luminosità e della sintesi proteica. Tuttavia, il transgene, ASAP1, potrebbe essere alterati espressione nelle cellule tumorali, a causa della natura di instabilità genomica. Oltre ASAP1, altri GEVIs, ad esempio indicatori di tensione basato su archaerhodopsin (QuasAr1 e QuasAr2), può essere una buona opzione complementare, dato che usano un meccanismo completamente diverso e hanno anche un'elevata sensibilità e velocità 29. Inoltre, la loro emissione è nel campo di colore rosso. Questo li rende particolarmente gratuiti per il ASAP1 verde, se c'è già un'altra proteina fluorescente nella stessa cella. Ad esempio, ASAP1 e QuasAr può essere combinato con Fucci zebrafish30 per studiare la relazione tra ciclo cellulare e variazioni di potenziale elettrici.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Il lavoro di ricerca riportato in questa pubblicazione è stato sostenuto dal National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health, sotto il premio numero R35GM124913, Purdue University PI4D programma di incentivazione e PVM interno competitivo Programma di fondi di ricerca di base. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale degli agenti finanziamenti. Ringraziamo il costrutto Tol2, Michael Lin per il costrutto ASAP1, Koichi Kawakami e Leonard Zon per il promotore ubi costruire attraverso Addgene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14mL cell culture tubes | VWR | 60818-725 | E.Coli culture |
| Agarose electrophoresis tank | Thermo Scientific | Owl B2 | DNA eletrophoresis |
| Agarose RA | Amresco | N605-500G | For making the injection gels |
| Attb1-ASAP1-F primer | IDT DNA | GGGGACAAGTTTGTACAAAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA |
ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Attb2-ASAP1-R primer | IDT DNA | GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA |
ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Bright field dissection scope | Nikon | SMZ 745 | Dechorionation, microinjection, mounting |
| Color camera | Zeiss | AxioCam MRc | Fish embryo image recording |
| Concave slide | VWR | 48336-001 | For holding fish embryos during imaging process |
| Disposable transfer pipette 3.4 ml | Thermo Scientific | 13-711-9AM | Fish embryos and water transfer |
| Endonuclease enzyme, Not I | NEB | R0189L | For linearizing plasmid DNA |
| Epifuorescent compound scope | Zeiss | Axio Imager.A2 | Fish embryo imaging |
| Epifuorescent stereo dissection scope | Zeiss | Stereo Discovery.V12 | Fish embryo imaging |
| Fluorescent light source | Lumen dynamics | X-cite seris 120 | Light source for fluorescence microscopes |
| Forceps #5 | WPI | 500342 | Dechorionation and needle breaking |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Scientific | 11789020 | Gateway BP recombination cloning |
| Gateway LR Clonase II Plus enzyme | Thermo Scientific | 12538120 | Gateway LR recombination cloning |
| Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | DNA gel purification |
| Loading tip | Eppendorf | 930001007 | For loading injection solution into capilary needles |
| Methylcellulose (1600cPs) | Alfa Aesar | 43146 | Fish embryo mounting |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection |
| Microinjector | WPI | Pneumatic Picopump PV820 | Microinjection injector |
| Micro-manipulator | WPI | Microinjector MM3301R | Microinjection operation |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | For preparing capillary needle |
| Mineral oil | Amresco | J217-500ml | For calibrating injection volume |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Thermo Scientific | AM1340 | mRNA in vitro transcription |
| Monocolor camera | Zeiss | AxioCam MRm | Fish embryo image recording |
| Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4020 | Prepare small amount of plasmid DNA |
| Plastic Petri dishes | VWR | 25384-088 | For holding fish or fish embryos during imaging process |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | mRNA cleaning after in vitro transcription |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | For measuring DNA and RNA concentrations |
| Stage Micrometer | Am Scope | MR100 | Microinjection volume calibration |
| Thermocycler | Bio-Rad | T100 | DNA amplification for gene cloning |
| Thin wall glass capillaries | WPI | TW100F-4 | Raw glass for making cappilary needle |
| Tol2-exL1 primer | IDT DNA | GCACAACACCAGAAATGCCCTC | Tol2 excise assay |
| Tol2-exR primer | IDT DNA | ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG | Tol2 excise assay |
| TOP10 Chemically Competent E. coli | Thermo Scientific | C404006 | Used for transformation during gene cloning |
| Tricaine mesylate | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing fish or fish embryos |
| UV trans-illuminator 302nm | UVP | M-20V | DNA visualization |
| Water bath | Thermo Scientific | 2853 | For transformation process of gene cloning |
References
- Levin, M. Molecular bioelectricity: how endogenous voltage potentials control cell behavior and instruct pattern regulation in vivo. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3835-3850 (2014).
- Storace, D., et al. Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential. Trends in Neuroscience. 39 (5), 277-289 (2016).
- Inagaki, S., Nagai, T. Current progress in genetically encoded voltage indicators for neural activity recording. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 95-100 (2016).
- St-Pierre, F., et al. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nature Neuroscience. 17 (6), 884-889 (2014).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. , (2013).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science USA. 105 (50), 19827-19832 (2008).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Mosimann, C., et al. Ubiquitous transgene expression and Cre-based recombination driven by the ubiquitin promoter in zebrafish. Development. 138 (1), 169-177 (2011).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Ordovas, J. M. Separation of small-size DNA fragments using agarose gel electrophoresis. Methods in Molecular Biology. 110, 35-42 (1998).
- Downey, N. Extraction of DNA from agarose gels. Methods Mol Biol. 235, 137-139 (2003).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. 45 (45), (2010).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610, 612, 614 (2007).
- Kawakami, K., Koga, A., Hori, H., Shima, A. Excision of the tol2 transposable element of the medaka fish, Oryzias latipes, in zebrafish, Danio rerio. Gene. 225 (1-2), 17-22 (1998).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, Univ. of Oregon Press. (2000).
- Amsterdam, A., et al. Many ribosomal protein genes are cancer genes in zebrafish. PLoS Biology. 2 (5), E139 (2004).
- Lai, K., et al. Many ribosomal protein mutations are associated with growth impairment and tumor predisposition in zebrafish. Developmental Dynamics. 238 (1), 76-85 (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Zhang, G., et al. Comparative oncogenomic analysis of copy number alterations in human and zebrafish tumors enables cancer driver discovery. PLoS Genetics. 9 (8), e1003734 (2013).
- Zhang, G., et al. Highly aneuploid zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors have genetic alterations similar to human cancers. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107 (39), 16940-16945 (2010).
- Urrego, D., Tomczak, A. P., Zahed, F., Stuhmer, W., Pardo, L. A. Potassium channels in cell cycle and cell proliferation. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B. 369 (1638), 20130094 (2014).
- Yang, H. H., et al. Subcellular Imaging of Voltage and Calcium Signals Reveals Neural Processing In Vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
- Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 106 (49), 20812-20817 (2009).
