Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Zebra balığı erken embriyo ve tümör hücresel elektrik aktivitesinin görselleştirme

Published: April 25, 2018 doi: 10.3791/57330

Summary

Burada, bir hücresel elektrik voltaj muhabir Zebra balığı çizgi embriyonik gelişim, hareket, görselleştirmek için oluşturma sürecini göstermek ve in vivobalık tümör hücreleri.

Abstract

Bioelectricity, endojen elektrik iyon kanalları tarafından aracılı sinyalleşme ve hücre zarı üzerinde bulunan pompalar oynar gibi telaşlı nöronal ve kas hücrelerinin süreçleri ve birçok diğer biyolojik süreçler, sinyal önemli roller embriyonik gelişimsel desenlendirme. Ancak, in vivo omurgalı embriyogenez elektrik etkinliğini izleme için bir ihtiyaç vardır. Genetik olarak kodlanmış floresan voltaj göstergelerinin (GEVIs) gelişmeler bu sorun için bir çözüm sağlamak mümkün kılmıştır. Burada, nasıl bir transgenik voltaj göstergesi Zebra balığı kurulan voltaj göstergesi, ASAP1 kullanarak oluşturulacağını açıklar (hız sensörü, Aksiyon potansiyelleri 1), örnek olarak. Tol2 kit ve her yerde birden bulunan Zebra balığı organizatörü, ubi, bu çalışmada seçildi. Biz aynı zamanda ağ geçidi siteye özgü klonlama, Tol2 transposon tabanlı Zebra balığı transgenesis ve normal epifluorescent mikroskoplar kullanarak aşamasındaki balık embriyo ve balık tümörleri için görüntüleme işlemi işlemleri açıklar. Bu balık satırını kullanarak, Zebra balığı embriyo ve balık larva hareketi sırasında hücresel elektrik voltaj değişiklikleri vardır bulundu. Ayrıca, birkaç Zebra balığı Malign periferik sinir kılıf tümörleri içinde çevresindeki normal dokuların hücreleri genellikle polarize tümör karşılaştırıldığında gözlendi.

Introduction

Bioelectricity endojen elektrik iyon kanalları ve hücre zarının1üzerinde bulunan pompalar aracılı sinyalleşme için ifade eder. Hücresel membran ve eşleşmiş Elektrik potansiyeli ve geçerli değişiklikleri, iyonik değişim süreçleri telaşlı nöronal ve kas hücrelerinin sinyal için gereklidir. Buna ek olarak, bioelectricity ve iyon degradeler çeşitli enerji depolama, biyosentezi ve metaboliti ulaşım da dahil olmak üzere diğer önemli Biyolojik işlevleri var. Biyoelektrik sinyal Ayrıca embriyonik Desen oluşumu, vücut eksenleri, hücre döngüsü ve hücre farklılaşması1gibi bir düzenleyici olarak keşfedilmiştir. Böylece, bu tür sinyal yanlış düzenlenmesi neden pek çok insan Konjenital hastalıklar anlamak için önemlidir. Yama kelepçe yaygın tek hücreleri kaydetmek için kullanılmıştır, aynı anda birden fazla hücreleri embriyonik gelişim içinde vivosırasında izleme için ideal hala uzak olsa da. Ayrıca, voltaj duyarlı küçük moleküller de vivo içinde uygulamalar nedeniyle onların özelliklerine, hassasiyetleri ve toksisite için ideal değildir.

Çeşitli oluşturulması genetik olarak bu sorunu aşmak için yeni bir mekanizma floresan voltaj göstergelerinin (GEVIs) Teklifler kodlanmış ve düz-se bile onlar aslında sinir izlemek için istenmeyen embriyonik gelişim, eğitim kolay uygulama sağlar 2,3hücreleri. Şu anda mevcut GEVIs biri hız sensörü aksiyon potansiyelleri 1'in (ASAP1)4. Voltaj duyarlı fosfataz ve dairesel yayın derlenemiyor yeşil flüoresan protein bir gerilim algılamalı etki alanının hücre dışı bir döngü oluşur. Bu nedenle, ASAP1 hücresel elektrik potansiyel değişiklikleri görselleştirme sağlar (Polarizasyon: parlak yeşil; depolarizasyon: koyu yeşil). ASAP1 2 ms açık ve kapalı Kinetik vardır ve subthreshold olası değişiklik4izleyebilirsiniz. Böylece, bu genetik aracı gerçek zamanlı biyo-elektrik canlı hücrelerde izleme etkinliğinin yeni düzeyi sağlar. Daha fazla bioelectricity embriyonik geliştirme ve birçok insan hastalıkları, kanser gibi rollerini anlamak hastalık tedavi ve korunma için kritik olan temel mekanizmaları, yeni ışık tutacak.

Zebra balığı gelişim biyolojisi ve insan hastalıkları kanser5,6dahil olmak üzere çalışmaya güçlü bir hayvan modeli kanıtlanmıştır. Onlar % 70 orthologous genler insanlarla paylaşmak ve onlar-si olmak benzer omurgalı Biyoloji7. Zebra balığı nispeten kolay bakım, yumurta, uysal genetik, kolay transgenesis ve saydam dış embriyonik geliştirme, hangi yapmak onları vivo içinde görüntüleme5,6için üstün bir sistemi büyük debriyaj boyutunu sağlar. Bir büyük satırların kaynağı olan mutant balık zaten mevcut ve tam sıralı genom, Zebra balığı bilimsel keşif nispeten sınırsız bir dizi sağlayacaktır.

Hücreleri vivo içinde gerçek zamanlı elektriksel aktivitesinin araştırmak için Zebra balığı modeli sistemi ve ASAP1 avantajlarından yararlanın. Bu yazıda nasıl flüoresan gerilim Biyoalgılayıcı ASAP1 Tol2 transposon transgenesis kullanarak Zebra balığı genom dahil tarif ve hücresel elektriksel aktivite sırasında embriyonik gelişim, Balık larva hareketi ve canlı tümör görselleştirmek .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Zebra balığı AAALAC onaylı bir hayvan tesiste yer alan ve tüm deneylerin Purdue hayvan bakım ve kullanım Komitesi (PACUC) tarafından onaylanmış protokolleri göre yapılmıştır.

1. Tol2 Transposon plazmid yapı hazırlık

Not: Tol2, medaka balıkta keşfedilmiştir bir transposon içinde Zebra balığı araştırma topluluk8,9yaygın olarak kullanılmıştır. Başarılı bir şekilde ağ geçidi siteye özgü rekombinasyon tabanlı klonlama sisteme kabul ve Tol2 seti10olarak da bilinir. Tol2 seti oluşturma özelleştirilmiş ifade yapıları da transgenesis verimliliğini artırırken, daha uygun bir yol sağlar. Böylece, bu sistem yararlanmak ve doğrulanmış Ubikuitin organizatörü ASAP111sürücü kullanarak her yerde ASAP1 ifade Zebra balığı çizgi oluşturmak için kolay bir karar oldu.

  1. Orta giriş ASAP1 yapı oluştururken: pDONR221-ASAP1
    1. Genetik olarak kodlanmış voltaj sensör ASAP1 yapı, pcDNA3.1/Puro-CAG-ASAP1 (plazmid #52519), Addgene elde etmek. ASAP1 kodlayıcı bölge yükseltmek için sonunda 5' astar (şekil 1) attB serileri ile çevrili (attB1-ASAP1F ve attB2-ASAP1R) özelleştirilmiş primerler kullanılarak bir PCR ayarlayın. Phusion DNA polimeraz yüksek verimlilik için seçildi ve PCR koşulları daha önce yayımlanmış protokolü12tarihinde göre optimize.
    2. TAE jel düzenli bir pipet ile 200 µL ipuçlarını kullanarak bir %1 50 µL PCR ürünleri yüklemek ve Elektroforez 160 V adlı bir yatay jel tankı yaklaşık 30 dk için gerçekleştirin.
    3. Jel UV transilluminator altında kontrol (353 nm), tüketim bıçak/neşter UV transilluminator altında daha önce yayımlanmış13,14olarak kullanarak istenen bant dışarı ve DNA içeren jel örneği temiz 1.5 mL microcentrifuge koymak tüp.
    4. Jel arıtma ASAP1 PCR ürünleri için gerçekleştirin. Ticari DNA jel arıtma seti üreticisinin öğretim takip uygulayarak çıkarılan jel DNA'da yeniden elde etmek ve su 20 µL DNA elute. Bir örnek olarak 1 µL al ve bir Spektrofotometre kullanarak DNA toplama ölçmek. Boş denetim15su kullanarak yazılım yönergeleri akışı.
    5. Almak 100 ng, saf PCR ürünü ve 150 ile karıştırmak pDONR221 plazmid TE 10 µL içinde ng tampon (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8.0)16. BP Clonase II 2 µL tepki içine ekleyin ve reaksiyon oda sıcaklığında gecede kuluçkaya.
    6. İkinci gününde, İndinavir K 1 µL tepki ekleyin ve tepki için 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
    7. Dönüştürme gerçekleştirmek. Reaksiyon aktarmak ve yetkili E. coli hücreleri ve hücreleri 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya Top10 50 µL ile karıştırın. O zaman, 1 dk. 42 ° C su banyosu tepki tüpüne hemen tüpü çıkarması ve 2 min için buz üzerinde kuluçkaya transfer. Daha sonra tüp 37 ° C shaker koyun ve 1 h için kuluçkaya.
    8. Tüp çıkar ve hücreleri sefaloridin LB plaka üzerine plaka. Daha sonra plaka gecede (16-18 h) 37 ° C'de kuluçkaya
    9. Tek ve iyi ayrı kolonileri alın ve onları 14 mL hücre kültür tüpleri ile 3 mL LB orta içine aşılamak. Onları gecede bir shaker (dönüş / dakika) 250 rpm'lik dönüş hızı ile 37 ° C'de kültür.
    10. Onun öğretim el ile17takip bir ticari miniprep kit kullanarak miniprep gerçekleştirin.
    11. 3-4 Plazmid dizi Sanger ile M13F ve M13R sıralama primerler kullanılarak olumlu pDONR221-ASAP1 tanımlamak için sıralama klonlar.
  2. Mikroenjeksiyon Tol2 yapı oluştururken: pDestTol2 -ubi-ASAP1
    1. Nasıl yapılacağını pDONR221-ASAP1 klon ve ölçü onun DNA toplama bir Spektrofotometre aşağıdaki boş bir kontrol gibi15su kullanarak yazılım yönergesi kullanarak doğrulanmadı seçin.
    2. PDONR221-ASAP1 100 µg alıp Tol2 kit 5 uçlu plazmid 100 µg ile karıştırın (pENTR5'_ubi, Addgene #27320), 100 µg p3E-polyA (Tol2 kit #302) ve pDestTol2pA2 150 µg (Tol2 kit #394). 8 µL için toplam ses seviyesini ayarlamak bir 1.5 mL microcentrifuge TE tampon (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) kullanarak tüp ve mix de bir 2-5 s kısa girdap tarafından. O zaman, LR Clonase II plus 2 µL ekleyin ve reaksiyon oda sıcaklığında gecede kuluçkaya.
    3. İkinci gün, İndinavir K 1 µL 10 µL pipet kullanarak tepki ekleyin ve tepki için 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
    4. Dönüştürme gerçekleştirmek ve olumlu klonlar (adımları 1.1.7-11) açıklandığı gibi tanımlar.
    5. Ölçü sıralama DNA konsantrasyon pDestTol2-ubi-ASAP1 klon (şekil 1B) Spektrofotometre15kullanarak doğrulanmadı. Genellikle 200ng/µL bölgedir.

2. Tol2 Transposase mRNA ve enjeksiyon çözüm hazırlamak

  1. Steril aşılama döngü kullanarak çizgi E. coli gliserol stokunun pCS2FA-transposase plazmid (Tol2 kit #396) (ile 100 µg/mL Ampisilin) LB plaka üzerine. Plaka bir kuluçka 37 ° C'de gecede kuluçkaya. Ertesi gün, bir koloni almak ve bunu LB (100 µg/mL Ampisilin) 3 mL steril 10 µL pipet ucu kullanarak aşılamak. Bir shaker 250 rpm'lik dönüş hızı ile 37 ° C'de gecede kültür.
  2. Miniprep onun kullanım kılavuzu takip bir ticari miniprep kit kullanarak E. coli kültür gerçekleştirin. Plazmid DNA TE arabellek 30-50 µL 1 dakika santrifüj 14.000 RPM tarafından elute ve onun DNA toplama bir Spektrofotometre ile ölçmek.
  3. Plazmid ile değil ben 1-2 µg endonükleaz linearize ve temizleme seti değil ben sonra onun kullanım kılavuzu aşağıdaki DNA ile DNA sindirim arındırmak. DNA su 5 µL 1 dakikadır 14.000 rpm centrifuging tarafından elute. Beklenen konsantrasyon ilgili 200-300 ng/µL.
  4. Vitro transkripsiyon gerçekleştirmek ile değil ben pCS2FA-transposase bir ticari SP6 transkripsiyon kit kullanarak DNA şablon olarak doğrusallaştırılmış.
  5. Reaksiyon tamamlandıktan sonra üreticinin yönergelerini izleyerek bir ticari RNA temizlik kullanarak mRNA kit Tol2 transposase arındırmak. Son olarak, mRNA RNAase ücretsiz 20 µL suya elute ve bir Spektrofotometre RNA konsantrasyon ölçmek. Beklenen konsantrasyon ilgili 1-3 µg / µL. örnekleri gerekirse-80 ° C dondurucuda saklanabilir.
  6. 20 ng/µL pDestTol2 -ubikarıştırılarak mikroenjeksiyon çözüm hazırlamak-ASAP1 ve Tol2 transposase mRNA (100 ng/µL) pipetting tarafından microcentrifuge tüp içinde. Nükleik asit önlemek için bozulması tekrarlanan çözdürme ve tüp başına refreezing, aliquot 6 µL neden olduğu ve-80 ° C dondurucu ileride kullanmak üzere saklayın.

3. mikroenjeksiyon

  1. 4-6 üreme tankları en az 2 kadın ve 2 erkek ile öğleden sonra enjeksiyon önce ayarlayın. Bu balık öğleden sonra beslenmelidir değil. Bu adımı balık atık miktarını azaltmak ve ertesi sabah da ikna etmek üreme yanıt için yardımcı olurken, onları temizlemek için zaman kazandırır.
  2. Ertesi sabah, hazırlanan enjeksiyon çözümü kaldırmak (pDestTol2 -ubi-ASAP1 yapı ve Tol2 mRNA)-80 ° C dondurucu gelen ve buz üzerinde yerleştirin.
  3. Bölücüler tankları ıslah balık çekin ve çiftleşmek balık sağlar. Genel olarak, Balık bölücü çekerek sonra 20-30 dakika içinde yumurta yatıyordu. Aksi takdirde, 1-2 saat daha bekle. Biraz balık hiç yumurtalarını değil. Bu durumda, bu deney balık embriyo koleksiyonu için yineleyin.
  4. Beklerken, iğneler Forseps ile veya bir hassas görev silecek kırarak eğimli kenarı oluşturmak bir açıyla kırık ucu hazırlanmış olduğundan emin olun.
    1. Aşağıdaki parametreleri kullanarak bir micropipette çektirmenin kapiller camdan Needles çekin: 545; ısı Çekme 60; hızı 80; zaman 250; basınç 500. Forseps tutarak bir açı yaklaşık 45 ° bir diseksiyon kapsamla (çapı tahmini için göz-adet cetvel) altında Forseps ile iğne kır. İstenen iğne çapları microinjector ayarlarına bağlı olarak değişken olabilir, ama daha küçük çaplı embriyo ölümleri azaltmak için tercih edilir.
  5. Bir kez balık yumurta atılmıştır var, onları bir 10-cm çapında Petri kabına toplamak ve diseksiyon kapsama getir. Tüm anormal embriyo kaldırmak ve atık balık.
  6. Damlalıklı döllenmiş embriyo içine hazırlanan % 3 özel enjeksiyon kalıp. Embriyo tutmak yardımcı olmak için fazla suyu kaldırın.
  7. Bir kez tüm satırları uygun embriyo ile dolu, aynı yöne doğru yatay olarak yaklaşık 45 ° açı bu iğne tek hücreleri tüm yüz onları yeniden düzenleyin. Bu enjeksiyon daha sonra çok daha kolay yapacaktır.
  8. Eldiven giyerken, 20 µL yükleme damlalıklı kullanın İpucu ve buz üzerinde tüp hazır yapı 5 µL kaldırın.
  9. Dikkatle ta uzantılar gibi ipucu yakın reaktif elde olarak için başladığı için kırık kılcal tüp arka uç ucunu takın. Hala hava kabarcıkları Eğer ucunu kırmak emin iğne sallamak.
  10. İğne mikroenjeksiyon iğne bağı düz yerleştirin ve iğne yerinde kalır kadar dikkatlice sıkın. Yaklaşık 45 ° açıyla ayarlayın.
  11. Bir kez iğne hazırlanan ve bağlı, mikroskop ve gaz basınç tankı açın. Ticari CO2 Tanklar bu amaç için genel olarak iyi. Enjeksiyon hacmi holding ve ejeksiyon basınç ayarlanır: yaklaşık 0,5 psi tutmak için ve fırlatma için 30 psi. Çözüm, zaman pedal basarak çıkar ki kontrol ettiğinizden emin olun.
  12. Mineral yağ, bir damla ile bir sahne mikrometre kullanarak ayarlayın birim ve çözüm için ~ 150 µm çapında akışını (yaklaşık 2 nL). Arka basınç iğne damla küçük bir miktar izin verir emin olun. Yeterince geri dönüş basıncı varsa, kılcal eylem iğne girin ve mRNA yok etmek için sıvı neden olur.
  13. İğne kalibre edilmiş bir kez inşa döllenmiş embriyolar tek hücre enjekte başlar.
    Not: Bu uygulama, sabır ve incelik, hücre zarının delmek sabit varlık nedeniyle büyük bir miktar alır. Bu çözüm değil sarısı transgenik Zebra balığı üretmek için hücre içine enjekte etmek önemlidir. Bu morpholino enjeksiyon farklıdır. Hangi tarafta iğne hücrenin yapı hücreye gider sürece girer önemli değil. Transgenesis hücre yerine sarısı içine enjekte başarı oranı çok düşük olacaktır. Tek hücreli sahne enjeksiyon da önemlidir veya somatik chimera balık-ecek var olmak mahluk. Bu germ hücreleri girmeden transgene olasılığını azaltacaktır.
  14. Jel çentik kenarına embriyo yerine tutar ve iğne embriyo hareket ettirmeden basınç uygulamak izin veren bir destek sağlamak için kullanın. İğne ucu tek hücrede olduğunda, çözüm istenilen miktarda serbest bırakmak için pedal basın. Tüm embriyoların için bu adımları tekrarlayın.
  15. Rapor tamamlandığında, enjekte embriyo onları balık sistem su ve bir tek kullanımlık 3.4 mL transfer pipet ile özel çentik dışarı durulama etiketli bir tabak içine aktarın. Embriyo geliştirmek izin bir 28.5 ° C kuluçka makinesi içinde saklayın. Kontrol sırt ölü balık embriyo kaldırma gün ve % 0.1 Metilen mavisi balık suda su yerine.
  16. Yaklaşık 6-8 saat sonra enjeksiyon, enjekte almak 10 tek embriyo balık ve sert çocuk yöntemi18kullanarak onlardan genomik DNA hazırlamak.
  17. Ertesi sabah, diseksiyon mikroskop GFP ve sigara sarısı dokularda gösterilen embriyo dışarı sıralamak için bir Floresan ışık kaynağı ile kullanın. Bu balık embriyoların enjekte yapı içermelidir.
  18. Tol2 tüketim tahlil19daha önce açıklandığı gibi transposon etkinliği denetlemek için gerçekleştirin. Eksize plazmid tespit edilebilir, enjekte tutmak balık embriyo ve onları yetiştirmek. Eğer hiçbir eksize plazmid bulmak, Tol2 mRNA sentezi ve mikroenjeksiyon işlemi Tol2 tüketim testin pozitif sonuçlar elde kadar yineleyin.

4. transgenik ASAP1 balık, Tg kurun (UBI: ASAP1)

  1. Yetişkinliğe enjekte balık (F0 üretimi) Zebra balığı kitap20daha önce açıklandığı gibi kaldırın. Bu genellikle yaklaşık 4 ay sürer.
  2. Bir tek yetişkin F0 balık almak ve cinsiyet wildtype balık karşısında tek bir çapraz. Islah daha sonra gün sonra balık embriyo toplamak. Toplanan balık embriyo 28.5 ° C kuluçka balık su % 0,1 Metilen mavisi ile tutun.
  3. Üçüncü günde, floresan diseksiyon mikroskop altında balık embriyo GFP filtre ile kontrol edin. Eğer var birisi yeşil balık embriyo sıralamak ve onları yetişkinliğe F1 nesil transgenik balık, Tg olarak yetiştirmek (UBI: ASAP1).
    Not: mikrop-line genetik chimeras ebeveyn F0 balık çoğu bu yana Mendel oranı beklenmez.
  4. Tek F1 yetişkin balık wildtype balık ile çapraz ve balık embriyo toplamak. Yeşil balık embriyo sıralamak ve onları yetişkinliğe F2 nesil balık olarak yetiştirmek.
    Not: Yeşil ve yeşil balık embriyo 1:1 yakın olup olmadığını tek bir transgene olmalıdır.
  5. Tümör kötü huylu periferik sinir kılıfı Tümörü (MPNST) gibi elektrik potansiyel değişiklikleri görüntülemek için F2 nesil Tg çapraz (UBI: ASAP1) rpl35hi258/wt balık ile balık. Bu görünür tümör içinde 6-8 ay yaşlı yetişkin21,22bulunmak başlatmak bilinmektedir.

5. görüntüleme

  1. Zebra balığı embriyo resim, birden çok F2 nesil kurucusu balık almak ve onları wildtype balık bireysel çiftleri ile çapraz için. Kılavuzu23evreleme Zebra balığı göre farklı istenen gelişim aşamalarında balık embriyo toplamak.
  2. Balık embriyo erken dönemlerinde için soyma ve chorions dikkatlice 10 cm çapında Petri kabına balık sistem su ile bir diseksiyon kapsamı altında bir çift forseps kullanarak embriyoların kaldırma.
  3. Concaved cam slayt üzerine birkaç balık embriyo 3.4 mL tek kullanımlık transfer pipet kullanarak % 3 methylcellulose ile aktarın. Bir floresan diseksiyon kapsamı altında bir iğne kullanarak hücresel GFP etkinliğini görüntülemek için istenen konumlara embriyo ayarlayın.
  4. Balık embriyo (12 somite sahne büyük) hareketli aşamaları için % 0.05 tricaine mesylate balık embriyo slaytlara aktarmadan önce anestezi için kullanın. Kısaca, yüzme ve beden denge kaybı durdurulana kadar balık embriyo %0,05 tricaine mesylate balık su içine ortaya. Ayrıca, slayt üzerinde %0,05 tricaine mesylate methylcellulose ile bir damla ekleyin.
  5. Az 12 somite sahne balık için embriyo, epi-floresan mikroskop bileşik bir uyumlu kamera ve yazılım ile görüntüleme için kullanın. 12 somite sahne balık embriyolar daha eski için Floresans diseksiyon mikroskop kullanın.
  6. Tümör hücre voltajı resim, ilk balık MPNST tümörler ile tanımlamak için. O zaman, %0.05 tricaine mesylate balıkla anestezi. Bütün Dağı görüntüleme için balık 10 cm çapında Petri kabına koymak. Tümör hücre elektrik etkinliğini görüntülemek için balık tümörler dışarı bütün Dağı görüntüleme sonra disseke.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bir başarılı yerleştirmeye, fazla enjekte % 50 balık embriyo yeşil floresan bir dereceye somatik hücreler görüntüler ve bunların çoğu Tol2 transposon tüketim tahlil (Şekil 2) tarafından olumlu olacaktır. 2-4 nesil (floresan balık % 50, beklenen Mendel oranı gelinceye) wildtype balıkla dışı geçtikten sonra transgenik balık hücre membran potansiyeli embriyonik gelişim sırasında izlemek için görüntüleme deneme için kullanılmıştır. İlk olarak, membran olası değişiklikler Zebra balığı erken embriyonik gelişim dönemleri sırasında hücre döngüsü boyunca incelendi. Hücrelerin bölünme karık oluşumu daha önce (şekil 3A-3Cve tamamlayıcı Video 1) hyperpolarized gözlendi. Ayrıca, farklı dokuların membran potansiyeli çeşitli 1-3 gün içinde eski balık embriyo gösterdi. (Şekil 3D-3G). Örneğin, somites ve notochord genellikle, bitişik doku/organ karşılaştırıldığında hyperpolarized. Zebra balığı embriyo taşımak mümkün çıkınca, ayrıca nöromüsküler elektrik faaliyetleri (şekil 4, ek Video 2) algılamak başardık. Kanser hücrelerinin biyo-elektrik özellikleri değişmiş gibi biz bu ASAP1 muhabir faydalandı balığı ve spontan Malign periferik sinir kılıfı tümörü21için,24 eğilimli bir rpL35 gen mutant ile çapraz ,25. Her ne kadar sadece birkaç balık tümör nedeniyle balık tümör mutant için uzun potansiyel büyüme döneminde incelenmiş canlı tümör taşıyan Zebra balığı (şekil 5) tümörler ve çevre dokular arasındaki gerilim farkları olduğunu fark edildi. Böylece, bir hücresel elektrik muhabir balık çizgi ve gelişimsel ve hücre biyolojisi için potansiyel uygulama başarılı nesil temsilcisi bu sonuçlar gösterdi.

Figure 1
Resim 1: Tol2 transposon tabanlı plazmid inşaat Illustration.
(A) BP rekombinasyon ASAP1 pDONR221 orta giriş vektör alt klonlama için kullanıldı. attB dizileri astar 5-son ASAP1 için eklenmiştir. (B) Tol2 transposon tabanlı için diyagramı oluşturmak LR rekombinasyon üzerinde temel montaj. Mor oval şekil ters Tol2 tekrarlar gösterir. Homolog rekombinasyon kesik çizgilerle gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Epifluorescence ve Tol2-tüketim tahlil enjekte embriyo tipik sonuçları.
(A) sigara-pozitif 1dpf balık embriyo. (B) başarıyla 1dpf balık embriyo enjekte. GFP noktalar bagaja belirgindir. (C) sigara-pozitif 2dpf balık embriyo. (D) başarıyla 2dpf balık embriyo enjekte. GFP noktalar bagaja belirgindir. (E) Tol2 özel tüketim testin temsil edici bir sonuç. 1-7 PCR rasgele--dan 7 güçlendirilmiş Lane balık embriyo 8 saat sonra enjeksiyon seçili. Bir negatif kontrol (NC) genomik DNA olmadan sonuncusuydu. Ölçek çubuğu 250 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Zebra balığı embriyo gelişimi sırasında dinamik gerilim değiştirir.
(A-C) Balık embriyo mitoz sırasında fark hücresel gerilim polarite. (A) 2-hücre sahne Zebra balığı embriyo. (B) 4 hücreli sahne embriyo. (C) 8-hücre sahne embriyo. Kırmızı ok uçları bölünme gozlerime pozisyonlarda panelleri (A-C) gösterir. Değişiklikleri de karşılık gelen Film (ek Video 1) açık durumdadır. Bölünme karık çevresindeki daha polarize hücre geri kalanını karşılaştırılır. (D-G) Zebra balığı embriyo farklı erken aşamalarında dinamik elektrik voltaj değişiklikleri. (D) 12-somite sahne. (E) 22-somite sahne. (F) döllenme 48 saat sonrası. (G) 72 saat Döllenme sonrası. e, göz; ht, kalp; NT, notochord; op, optik vezikül; ov, ve vezikül; pf, göğüs fin; Bu yüzden, somite; yk, sarısı. Ölçek çubuğu 250 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: Elektrik voltaj değişiklikleri balık embriyo hareket sırasında balık vücudun.
2 - gün eski balık embriyo Haritayı sinir-kas elektrik faaliyetleri sırasında hareket. (F) (a) - aynı balık embriyo sıralı görüntüleme. Renk yoğunluğu değişiklikleri elektrik sinyal iletimi için karşılık gelen. Aralığı zaman iki ardışık görüntüler arasında yaklaşık 12,4 milisaniyedir. Kırmızı oklar, gerilim görüntüleme döneminde değişti pozisyonları gösterir. Değişiklikleri de karşılık gelen Film (ek Video 2) belirgindir. Tüm panelleri aynı ölçek vardır. Ölçek çubuğu 250 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: Tümör hücreleri daha polarize eğilimindedir.
10 - ay eski bir balık (rpL35hi258/wt; TG (UBI: ASAP1) bir malign periferik sinir kılıfı tümörü karın geliştirdi. (A) ve (C) parlak alan görüntü. (B) ve (D) görüntü GFP kanalı ile. (A) ve (B) olduğu gibi balık. (C) ve (D) karın tümör dışarı disseke. Tümör hücreleri vardır daha polarize (daha parlak yeşil) doku (koyu yeşil) çevreleyen için karşılaştırıldığında. Ok uçları tümörler göster. Tüm panelleri aynı ölçek vardır. Ölçek çubuğu = 25 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Takıma giren Video 1 . Elektrik Tg aşamalarında bölünme sırasında sinyal, Epifluorescent görüntüleme (ubi: ASAP1) Balık embriyo. Bu film hayvan pole görünümünden kaydedildi. ASAP1 floresan hücre bölünme karık, hücre bölünmesi sırasında geçici bir yapı oluşumu ile ilişkilidir. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Takıma giren Video 2 . 2 - eski gün Tg sırasında elektrik sinyal, Epifluorescent görüntüleme (ubi: ASAP1) Balık embriyo hareketi. Hareket 2 - gün eski balık embriyo yan görünümden sonra anesthetization kaydedildi. ASAP1 floresan değişiklikler hareketli işlemi sırasında nöromüsküler dokusunda belirgin. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her ne kadar cep ve doku düzeyinde elektrik faaliyetleri sırasında embriyonik geliştirme ve insan hastalık uzun zaman önce keşfedildi, vivo içinde dinamik elektrik değişiklikleri ve biyolojik rolleri hala büyük ölçüde bilinmeyen kalır. Büyük zorluklardan biri görselleştirmek ve elektrik değişiklikleri ölçmek etmektir. Yama kelepçe teknoloji bir mola-tek hücre izlemek için geçer ancak birçok hücrelerinin oluşan oldukları için uygulama omurgalı embriyolar için sınırlıdır. Geçerli kimyasal gerilim boyalar da onların hassasiyetleri, özelliklerine ve toksisite nedeniyle ideal değildir. GEVIs buluş üzerinde son çabaları bizi hücresel elektrik faaliyetleri içinde vivo görselleştirmek için yeni bir yol sağlar ve gerçek zamanlı olarak. Burada, bir Zebra balığı elektrik muhabir çizgi, Tg oluşturma işlemi göstermiştir (ubi:ASAP1).

Bu muhabir balık satırını kullanarak, biz Zebra balığı embriyo izlenebilir hücresel elektrik etkinlikleri göster. Elektrik voltaj değişikliği hücre döngüsünün erken embriyonik gelişim sırasında son derece ilgilidir. Biz bölünme karık/hücre bölünmesi (şekil 3) oluşumu daha önce o hyperpolarization olur gözlemledim. Geçerli bilgi aksine bu o depolarizasyon hücre bölünmesi26önce olur. Böylece, daha tafsilât-in hücre zarı gerilim diğer hayvan ve insan hücreleri hücre döngüsü sırasında değiştirir ve bu doku içerik, ilgili olup olmadığını daha fazla çalışmaları gerektirir. İlgili çalışmalar şu anda bizim laboratuvar olarak devam etmektedir. Ayrıca, ASAP1 sinir-kas sisteminde değişiklik hücre döngüsü sırasında değişikliklere göre nispeten hızlı olduğu (şekil 4), fizyolojik voltaj değişiklikleri izlemek yapabiliyor doğruladıktan.

Ayrıca bu muhabir de Zebra balığı Tümörleri (şekil 5) görselleştirmek için kullanılabilir gösterilmiştir. Çevre normal dokular için karşılaştırıldığında tümör hücreleri genellikle daha polarize bulmak ilginç. Ancak, bu tüm Malign dokular için genel bir olgu olup daha fazla araştırma, tümör örnekleri ve balık tümör türleri bu çalışmada sınırlandırılması nedeniyle gerektirir. Diğer tür tümörleri ve insan kanser hücrelerinin hücre zarı polarizasyon ve gerilim miktar üzerine gelecekteki araştırmalar-ecek var olmak daha iyi rolleri tumorigenesis sırasında anlamak için bilgilendirici.

Bu protokol için balık embriyo hücrelerinde izlemek için ASAP1 ifade götürmek için her yerde bir organizatörü seçtik. Eğer sadece belirli bir hücre/doku türü tercih edilir doku veya organ belirli rehberleri başka bir seçenek olabilir. ASAP1 gerilim sensörü nispeten iyi karakterize bir Biyoalgılayıcı ve deniz squirt voltaj duyarlı fosfataz (S3-S4 loop) bir voltaj duyarlı etki ve dairesel permütasyon GFP oluşur (varsayılan olarak düşük floresan). Bu insan nöron hücreleri ve fare beyin dilimleri4,27,28dış hücre membran ifade edilecek bildirildi. Sensör parlaklığını baskın S3-S4 döngü ve GFP konformasyon pozisyonları belirlenir. Hızlı yeşil floresan değiştirme parlaklık değişiklikleri ve protein sentez hızı nedeniyle protein konsantrasyonu nedeniyle olasılığının düşük olduğunu. Ancak, transgene, ASAP1, tümör hücreleri, genomik istikrarsızlık doğası gereği ifadede üzerinde değişiklik olabilir. ASAP1 ek olarak, archaerhodopsin tabanlı gerilim göstergeleri (QuasAr1 ve QuasAr2), gibi diğer GEVIs da tamamen farklı bir mekanizma kullandıkları ve onlar da yüksek bir hassasiyet ve 29hız beri tamamlayıcı iyi bir seçenek olabilir. Buna ek olarak, kendi emisyon içinde kırmızı renk aralığıdır. Eğer zaten başka bir floresan protein aynı hücrede bu onları özellikle ücretsiz yeşil ASAP1 için yapar. Örneğin, ASAP1 ve QuasAr Fucci Zebra balığı30 hücre döngüsü ve elektrik olası değişiklikler arasındaki ilişki eğitim için birleştirilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu yayında bildirilen araştırma çalışmaları tarafından Ulusal Genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası R35GM124913, Purdue Üniversitesi PI4D teşvik programı ve PVM iç rekabet altında desteklenen Temel araştırma fonları programı. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka finansman ajanları resmi görüşlerini temsil etmiyor. Biz Koichi Kawakami Tol2 yapı, Michael Lin ASAP1 inşa etmek için teşekkür ederiz ve Leonard Zon ubi organizatörü için inşa Addgene.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
14mL cell culture tubes VWR 60818-725 E.Coli culture
Agarose electrophoresis tank Thermo Scientific Owl B2 DNA eletrophoresis
Agarose RA Amresco N605-500G For making the injection gels
Attb1-ASAP1-F primer IDT DNA GGGGACAAGTTTGTACAAAAAA
GCAGGCTTCACCATGGAGACGA
CTGTGAGGTATGAACA
ASAP1 coding region amplification for subcloning
Attb2-ASAP1-R primer IDT DNA GGGGACCACTTTGTACAAGAAA
GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC
AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA
ASAP1 coding region amplification for subcloning
Bright field dissection scope Nikon SMZ 745 Dechorionation, microinjection, mounting
Color camera Zeiss AxioCam MRc Fish embryo image recording
Concave slide VWR 48336-001 For holding fish embryos during imaging process
Disposable transfer pipette 3.4 ml Thermo Scientific 13-711-9AM Fish embryos and water transfer
Endonuclease enzyme, Not I NEB R0189L For linearizing plasmid DNA
Epifuorescent compound scope Zeiss Axio Imager.A2 Fish embryo imaging
Epifuorescent stereo dissection scope Zeiss Stereo Discovery.V12 Fish embryo imaging
Fluorescent light source Lumen dynamics X-cite seris 120 Light source for fluorescence microscopes
Forceps #5 WPI 500342 Dechorionation and needle breaking
Gateway BP Clonase II Enzyme mix Thermo Scientific 11789020 Gateway BP recombination cloning
Gateway LR Clonase II Plus enzyme Thermo Scientific 12538120 Gateway LR recombination cloning
Gel DNA Recovery Kit Zymo Research D4002 DNA gel purification
Loading tip Eppendorf 930001007 For loading injection solution into capilary needles
Methylcellulose (1600cPs) Alfa Aesar 43146 Fish embryo mounting
Methylene blue Sigma-Aldrich M9140 Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes
Microinjection mold Adaptive Science Tools TU-1 To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection
Microinjector WPI Pneumatic Picopump PV820 Microinjection injector
Micro-manipulator WPI Microinjector MM3301R Microinjection operation
Micropipette puller Sutter instrument P-1000 For preparing capillary needle
Mineral oil Amresco J217-500ml For calibrating injection volume
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Thermo Scientific AM1340 mRNA in vitro transcription
Monocolor camera Zeiss AxioCam MRm Fish embryo image recording
Plasmid Miniprep Kit Zymo Research D4020 Prepare small amount of plasmid DNA
Plastic Petri dishes VWR 25384-088 For holding fish or fish embryos during imaging process
RNA Clean & Concentrator-5 Zymo Research R1015 mRNA cleaning after in vitro transcription
Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 2000 For measuring DNA and RNA concentrations
Stage Micrometer Am Scope MR100 Microinjection volume calibration
Thermocycler Bio-Rad T100 DNA amplification for gene cloning
Thin wall glass capillaries WPI TW100F-4 Raw glass for making cappilary needle
Tol2-exL1 primer IDT DNA GCACAACACCAGAAATGCCCTC Tol2 excise assay
Tol2-exR primer IDT DNA ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG Tol2 excise assay
TOP10 Chemically Competent E. coli Thermo Scientific C404006 Used for transformation during gene cloning
Tricaine mesylate Sigma-Aldrich A5040 For anesthetizing fish or fish embryos
UV trans-illuminator 302nm UVP M-20V DNA visualization
Water bath Thermo Scientific 2853 For transformation process of gene cloning

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Levin, M. Molecular bioelectricity: how endogenous voltage potentials control cell behavior and instruct pattern regulation in vivo. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3835-3850 (2014).
  2. Storace, D., et al. Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential. Trends in Neuroscience. 39 (5), 277-289 (2016).
  3. Inagaki, S., Nagai, T. Current progress in genetically encoded voltage indicators for neural activity recording. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 95-100 (2016).
  4. St-Pierre, F., et al. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nature Neuroscience. 17 (6), 884-889 (2014).
  5. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
  6. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
  7. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. , (2013).
  8. Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (21), 11403-11408 (2000).
  9. Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science USA. 105 (50), 19827-19832 (2008).
  10. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  11. Mosimann, C., et al. Ubiquitous transgene expression and Cre-based recombination driven by the ubiquitin promoter in zebrafish. Development. 138 (1), 169-177 (2011).
  12. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
  13. Ordovas, J. M. Separation of small-size DNA fragments using agarose gel electrophoresis. Methods in Molecular Biology. 110, 35-42 (1998).
  14. Downey, N. Extraction of DNA from agarose gels. Methods Mol Biol. 235, 137-139 (2003).
  15. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. 45 (45), (2010).
  16. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  17. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
  18. Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610, 612, 614 (2007).
  19. Kawakami, K., Koga, A., Hori, H., Shima, A. Excision of the tol2 transposable element of the medaka fish, Oryzias latipes, in zebrafish, Danio rerio. Gene. 225 (1-2), 17-22 (1998).
  20. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, Univ. of Oregon Press. (2000).
  21. Amsterdam, A., et al. Many ribosomal protein genes are cancer genes in zebrafish. PLoS Biology. 2 (5), E139 (2004).
  22. Lai, K., et al. Many ribosomal protein mutations are associated with growth impairment and tumor predisposition in zebrafish. Developmental Dynamics. 238 (1), 76-85 (2009).
  23. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  24. Zhang, G., et al. Comparative oncogenomic analysis of copy number alterations in human and zebrafish tumors enables cancer driver discovery. PLoS Genetics. 9 (8), e1003734 (2013).
  25. Zhang, G., et al. Highly aneuploid zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors have genetic alterations similar to human cancers. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107 (39), 16940-16945 (2010).
  26. Urrego, D., Tomczak, A. P., Zahed, F., Stuhmer, W., Pardo, L. A. Potassium channels in cell cycle and cell proliferation. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B. 369 (1638), 20130094 (2014).
  27. Yang, H. H., et al. Subcellular Imaging of Voltage and Calcium Signals Reveals Neural Processing In Vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
  28. Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
  29. Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
  30. Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 106 (49), 20812-20817 (2009).

Tags

Aman Tanrım sayı: 134 Bioelectricity hücre membran potansiyeli embriyonik gelişim Zebra balığı bu ayda ASAP1 (Aksiyon potansiyelleri 1 hızlandırılmış sensörünün) GEVIs (genetik olarak kodlanmış voltaj göstergelerinin)
Zebra balığı erken embriyo ve tümör hücresel elektrik aktivitesinin görselleştirme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Silic, M. R., Zhang, G.More

Silic, M. R., Zhang, G. Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors. J. Vis. Exp. (134), e57330, doi:10.3791/57330 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter