Summary
여기, 우리가 배아 개발, 운동, 시각화 세포 전기 전압 기자 제 브라 라인을 만드는 과정을 보여 그리고 물고기 종양 vivo에서세포.
Abstract
전기, 내 생 전기적 신호 이온 채널에 의해 중재 및 세포 막에 있는 펌프 고르기 신경 및 근육 세포의 프로세스와 같은 다른 많은 생물 학적 과정, 신호에 중요 한 역할 배아 개발 패턴입니다. 그러나, vivo에서 전기 활동 모니터링 척추 embryogenesis에 대 한 필요가 있다. 인코딩된 유전자 형광 전압 표시기 (GEVIs)의 진보는이 전에 대 한 솔루션을 제공할 수 만들었습니다. 여기, 우리 유전자 변형 전압 표시기 zebrafish 설립된 전압 표시기, ASAP1를 사용 하 여 만드는 방법에 설명 (가속 센서의 활동 전위 1), 예를 들어. Tol2 키트와 유비 쿼터 스 zebrafish 발기인, ubi, 이 연구에서 선정 됐다. 우리는 또한 게이트웨이 사이트 복제, Tol2 transposon 기반 zebrafish transgenesis, 그리고 일반 epifluorescent 현미경을 사용 하 여 초기 단계 물고기 배아와 물고기 종양에 대 한 이미징 프로세스의 프로세스를 설명 합니다. 이 물고기 라인을 사용 하 여, 우리는 제 브라 embryogenesis, 그리고 물고기 애벌레 운동 하는 동안 세포 전기 전압 변화는 발견. 또한, 몇 가지 zebrafish 악성 말 초 신경 칼 집 종양, 셀은 일반적으로 편광 종양 주변 정상 조직에 비해 관찰 되었다.
Introduction
전기 이온 채널과1세포 막 있는 펌프에 의해 중재 생 전기 신호를 말합니다. 세포 막과 결합 된 전기 잠재력과 현재 변화, 이온 교환 프로세스 고르기 신경 및 근육 세포의 신호에 대 한 필수적입니다. 또한, 전기 및 이온 기온 변화도 다른 중요 한 생물 학적 기능 에너지 저장, 생 합성, 대사 산물 수송 등의 다양 한이 있다. 생체 전기 신호도 몸 축, 세포 주기, 세포 감 별 법1등 미 발달 패턴 형성의 레 귤 레이 터로 발견 되었다. 따라서, 그것은 이러한 유형의 신호의 미 규제에 기인 하 많은 인간의 선 천 성 질병을 이해 중요 합니다. 패치 클램프 널리 사용 되었습니다 단일 셀 기록, 배아 발달 비보중 여러 셀의 동시 모니터링에 이상적에서 멀리 아직도 이다. 또한, 전압 민감한 작은 분자는 또한 그들의 특이성, 감도, 및 독성 vivo에서 애플리케이션에 적합 하지.
창조의 다양 한 유전자 형광 전압 표시기 (GEVIs) 제공이이 문제를 극복 하기 위해 새로운 메커니즘이 인코딩되고 그들은 원래 신경 모니터링 위한 했다 비록 배아 개발 공부를 쉽게 응용 프로그램에 대 한 허용 2,3세포. 현재 사용할 수 있는 GEVIs 중 하나는 가속 센서의 활동 전위 1 (ASAP1)4입니다. 그것은 전압 과민 한 인산 가수분해 효소와 원형으로 배치 된 녹색 형광 단백질의 전압 감지 도메인의 extracellular 루프의 구성 됩니다. 따라서, ASAP1 세포 전기 잠재적인 변화의 시각화 수 (분극: 밝은 녹색; 도발은: 진한 녹색). ASAP1 속도 론 온 오프 2 ms, 있으며 subthreshold 잠재적인 변경4를 추적할 수 있습니다. 따라서,이 유전 도구 라이브 셀에 실시간 생체 모니터링에 효능의 새로운 수준에 대 한 수 있습니다. 배아 발달에 많은 인간 질병, 암, 등 전기의 역할의 더 이해 것입니다 창 고 기본 메커니즘에 새로운 빛이는 질병 치료 및 예방에 매우 중요.
Zebrafish 강력한 동물 모델 개발 생물학과 암5,6을 포함 하 여 인간의 질병을 입증 되었습니다. 인간, 70 %orthologous 유전자를 공유 하는 그들은 그리고 그들은 유사한 척 추가 있는 생물학7. Zebrafish는 비교적 쉽게 치료, 계란, 온순한 유전학, 쉬운 transgenesis, 그리고 투명 한 외부 배아 발달, 그들에 게 비보에 이미징5,6우수한 시스템의 큰 클러치 크기를 제공 합니다. 이미 존재 하는 돌연변이 물고기 선의 큰 소스와 완전히 시퀀스 게놈, zebrafish는 과학적 발견의 상대적으로 무제한 범위를 제공 합니다.
Vivo에서 실시간 전기 세포의 활동을 조사, 우리 활용 zebrafish 모델 시스템 및 ASAP1. 이 문서에서 우리는 형광 전압 바이오 센서 ASAP1 Tol2 transposon transgenesis를 사용 하 여 zebrafish 게놈으로 통합 하는 방법을 설명 하 고 배아 개발, 물고기 애벌레 움직임, 그리고 라이브 종양에서 세포 전기 활동을 시각화 .
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Protocol
Zebrafish는 AAALAC 승인 동물 시설에 보관 되어있습니다 그리고 모든 실험 프로토콜 퍼듀 동물 관리 및 사용 위원회 (PACUC)에 의해 승인에 따라 실시 했다.
1. Tol2 Transposon 플라스 미드 구조 준비
참고: Tol2, 메 다카 물고기에서 발견 되었다 transposon zebrafish 연구 커뮤니티8,9사용 널리 있다. 그것은 되었습니다 성공적으로 게이트웨이 사이트 재결합 기반 복제 시스템에 채택 및 Tol2 키트10로 알려진. Tol2 키트는 또한 transgenesis의 효율성을 증가 하는 동안 사용자 지정된 식 구문을 만드는의 더 편리한 방법에 대 한 수 있습니다. 따라서,이 시스템을 활용 하 고 검증된 유비퀴틴 발기인 ASAP111를 사용 하 여 유비 쿼터 스 ASAP1 식 제 브라 라인 만들기 쉬운 결정 이었다.
- 중간 항목 ASAP1 구조를 만들기: pDONR221 ASAP1
- Addgene에서 pcDNA3.1/순수 하지 않아-CAG-ASAP1 (플라스 미드 #52519), 유전으로 인코딩된 전압 센서 ASAP1 구조를 취득 합니다. ASAP1 코딩 영역 증폭 PCR 뇌관 (그림 1)의 5' 끝에 attB 시퀀스 형벌 사용자 지정된 뇌관 (attB1-ASAP1F와 attB2-ASAP1R)를 사용 하 여 설정 합니다. Phusion DNA 중 합 효소의 높은 효율을 위해 선택 되었다 그리고 PCR 조건12이전 게시 된 프로토콜 따라 최적화 된 했다.
- 태 젤 200 µ L 팁, 일반 피 펫을 사용 하 여 1%로 50 µ L PCR 제품을 로드 하 고 약 30 분 동안 가로 젤 탱크에 160 V에서 전기 영동을 수행.
- UV transilluminator에서 젤 확인 (353 nm), UV transilluminator 아래 블레이드/메스를 사용 하 여 이전에 게시13,14, 원하는 밴드 소비 세 그리고 깨끗 한 1.5 mL microcentrifuge로 DNA 포함 하 젤 샘플을 넣어 튜브입니다.
- ASAP1 PCR 제품 젤 정화를 수행 합니다. 제조업체의 지시에 따라 상업 DNA 젤 정화 키트를 사용 하 여 삭제 젤에서 DNA를 복구 하 고 물 20 µ L로 DNA을 elute. 샘플으로 1 µ L를가지고 고는 분 광 광도 계를 사용 하 여 DNA 농도 측정. 빈 컨트롤15로 물을 사용 하 여 소프트웨어 지침 흐름.
- 받아 100 ng의 PCR 제품을 정화 하 고 150 믹스 테의 10 µ L 플라스 미드 pDONR221의 ng 버퍼 (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8.0)16. 반응으로 혈압 Clonase II의 2 µ L을 추가 하 고 품 어 하룻밤 실 온에서 반응.
- 둘째 날에는 반응으로 가수분해 K의 1 µ L을 추가 하 고 품 어 30 분 동안 37 ° C에서 반응.
- 변환을 수행 합니다. 반응 전송 및 Top10 유능한 대장균 세포 및 품 어 30 분 동안 얼음에 셀의 50 µ L 함께 섞는다. 다음 전송 1 분에 42 ° C 물 목욕으로 반응 관은 즉시 튜브를 제거 하 고 2 분 동안 얼음에 품 어. 다음, 튜브 37 ° C 통에 넣고 1 시간을 위해 그것을 품 어.
- 튜브를 꺼내와 대 파운드 플레이트에 셀 접시. 다음, 접시 하룻밤 (16-18 h) 37 ° c.에 품 어
- 단일과 잘 분리 된 식민지를 선택 하 고 14 mL 셀 문화 튜브 파운드 매체의 3 mL에 접종. 하룻밤 250 rpm (분당 회전)의 회전 속도 함께 통에 37 ° C에서 문화 그들.
- Miniprep의 명령 수동17다음 상업 miniprep 키트를 사용 하 여 수행 합니다.
- 3-4 플라스 미드를 시퀀스 생어 시퀀싱 식별 긍정적인 pDONR221-ASAP1 M13F 및 M13R 시퀀싱 뇌관을 사용 하 여 복제.
- Microinjection에 대 한 Tol2 구조를 만들기: pDestTol2-유비-ASAP1
- 시퀀싱 확인 pDONR221 ASAP1 복제 및 측정의 DNA 농도 분 광 광도 계 다음 빈 제어15물을 사용 하 여 소프트웨어 명령을 사용 하 여 선택 합니다.
- PDONR221-ASAP1의 100 µ g을 100 µ g Tol2 키트 5-엔드 플라스 미드의 혼합 (pENTR5'_ubi, Addgene #27320), 100 µ g (Tol2 키트 #302) p3E-polyA의 및 pDestTol2pA2의 150 µ g (Tol2 키트 #394). 8 µ L 총 볼륨 조정 튜브 1.5 mL microcentrifuge TE 버퍼 (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0)를 사용 하 고 2-5 s 간단한 소용돌이 의해 잘 혼합. 그런 다음 LR Clonase 2 플러스, 2 µ L을 추가 하 고 품 어 하룻밤 실 온에서 반응.
- 두 번째 날, 10 µ L 피 펫을 사용 하 여 반응에 가수분해 K의 1 µ L을 추가 하 고 품 어 30 분 동안 37 ° C에서 반응.
- 변환을 수행 하 고 (단계 1.1.7-11) 위에서 설명한 대로 긍정적인 클론을 식별 합니다.
- 시퀀싱의 DNA 농도 측정 pDestTol2-유비-ASAP1 복제 (그림 1B)15분 광 광도 계 사용 하 여 확인 합니다. 일반적으로 농도 200ng / µ L입니다.
2. Tol2 Transposase mRNA와 주입 솔루션 준비
- 행진 대장균 글리세롤 주식에 있는 파운드 판 (100 µ g/mL 암 피 실린) pCS2FA transposase 플라스 미드 (Tol2 키트 #396)의 멸 균된 접종 루프를 사용 하 여. 인큐베이터에서 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어. 다음 날, 단일 식민지를 선택 하 고 멸 균된 10 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 그것의 파운드 (100 µ g/mL 암 피 실린) 3 mL에 접종. 하룻밤 250 rpm의 회전 속도 함께 통에 37 ° C에서 문화.
- 그것의 사용 설명서에 따라 상업 miniprep 키트를 사용 하 여 대장균 문화에 miniprep를 수행 합니다. 1 분 14000 rpm에서 원심 분리기로 TE 버퍼의 30-50 µ L에 플라스 미드 DNA elute 그리고 DNA 농도 분 광 광도 측정.
- 내가 가진 플라스 미드의 1-2 µ g endonuclease 선형화 하 고 정화 청소 키트 후 하지의 사용 설명서를 다음 DNA와 DNA 소화. 14000 rpm에서 1 분간 centrifuging 여 물 5 µ L로 DNA를 elute. 에 대 한 예상된 농도 200-300 ng / µ L.
- 녹음 방송 생체 외에서 수행 하지 나 상업 SP6 전송 키트를 사용 하 여 DNA 템플렛으로 pCS2FA transposase를 선형화.
- 반응이 완료 되 면 Tol2 transposase mRNA 상업적인 RNA 청소를 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 장비를 정화. 마지막으로, 20 µ L RNAase 무료 물으로 mRNA elute 고는 분 광 광도 계에 RNA 농도 측정 한다. 에 대 한 예상된 농도 1-3 µ g / µ L. 견본-80 ° C 냉동 실에 저장할 수 있습니다 필요한 경우.
- 20 ng / µ L pDestTol2-유비를 혼합 하 여 microinjection 솔루션 준비-ASAP1 및 Tol2 transposase mRNA (100 ng / µ L) pipetting으로 microcentrifuge 관에서. 반복 해빙과 튜브 당 거, aliquot 6 µ L로 인 한 핵 산 저하를 방지 하려면 나중에 사용-80 ° C 냉동 고에 보관.
3입니다. microinjection
- 주입 하기 전에 오후 4-6 번 식 탱크 2 남성 및 2 명의 여성을 설정 합니다. 이 물고기는 오후에 먹여야 하지 해야 합니다. 이 단계 물고기 낭비의 양을 줄일 하 고 다음날 아침 또한 번 식 응답을 유도 하는 동시에 밖으로 그들을 청소 하는 시간을 절약할 것 이다.
- 다음 아침, 제거 준비 주입 솔루션 (pDestTol2-유비-ASAP1 구문 및 Tol2 mRNA)-80 ° C 냉동 고에서 얼음에 놓습니다.
- 물고기 사육 탱크에에서 디바이 더를 당겨 하 고 물고기 친구를 허용 합니다. 일반적으로, 생선 알을 꺼내 구분선 후 20-30 분 이내. 그렇지 않은 경우 1-2 시간 이상 기다립니다. 일부 물고기 계란을 전혀 놓지 않을 수 있습니다. 이 경우에, 물고기 배아 컬렉션에 대 한이 실험을 반복 합니다.
- 기다리는 동안, 거기에 바늘 팁 겸 자, 또는 섬세 한 작업와이 퍼에 침입 하 여 3d 가장자리를 만드는 각도에 깨진 준비 있는지 확인 합니다.
- 다음 매개 변수를 사용 하 여 micropipette 끌어당기는 사람에 유리 모 세관에서 바늘을 당겨: 545;가 열 풀 60; 속도 80; 시간 250; 압력 500입니다. 각도 약 45 °에는 집게를 잡고 집게 (직경 추정에 대 한 눈 조각 통치자)와 절 개 범위 아래와 바늘을 휴식. 원하는 바늘 직경 microinjector 설정에 따라 변수가 될 수 있습니다 하지만 작은 직경은 태아 사망률 감소에 대 한 선호.
- 일단 물고기는 계란, 10 cm 직경 페 트리 접시에에서 그들을 수집 하 고 절 개 범위에 그들을. 모든 비정상적인 배아를 제거 하 고 폐기물을 물고기.
- 피펫으로 준비 3 %agarose 주입으로 수정 된 배아 금형. 장소에 배아를 유지할 수 있도록 초과 물을 제거 합니다.
- 일단 모든 행 가능한 배아 가득 정렬 있도록 모든 단일 셀 약 45 ° 각도 수평으로 바늘을 향해 같은 방향으로 얼굴. 이것을 쉽게 주입 훨씬 나중.
- 장갑을 끼고, 동안 20 µ L 로드 피펫으로 사용 팁과 얼음에 튜브에서 준비 된 구문 5 µ L를 제거.
- 신중 하 게 그것은 팁에 가까운 시를 얻을로 꼭지를 시작 하는 위치에 있는 모든 방법이 깨진된 모 세관 튜브의 백 엔드에 팁을 삽입 합니다. 경우 여전히 공기 방울, 바늘, 팁을 아프게 하지를 흔들.
- Microinjection 바늘 홀더 연속으로 바늘을 삽입 하 고 바늘 자리에 유지 될 때까지 신중 하 게 강화. 약 45 ° 각도 조정 합니다.
- 일단 바늘 준비 하 고 연결, 현미경 및 가스 압력 탱크를 켭니다. 상업 CO2 탱크는이 목적을 위해 일반적으로 좋다. 지주 및 방출 압력에 의해 분사 볼륨 조정: 대략 0.5 psi 지주 및 방출에 대 한 30 psi. 솔루션 때 페달을 누르면 밖으로 나오는 것을 확인 해야 합니다.
- ~ 150 µ m 직경에서 솔루션의 흐름과 볼륨 조정 미네랄 오일의 방울으로 무대 마이크로미터를 사용 하 여 (약 2 nL). 백 프레셔 바늘의 똑 작은 금액을 드릴 것입니다 확인 하십시오. 충분히 다시 압력 없는 경우 모 세관 작용 액체 바늘을 입력 하는 mRNA를 파괴 하면 됩니다.
- 일단 바늘 보정, 수정 된 배아의 단일 셀에는 구조 주입 시작.
참고:이 연습, 인 내, 그리고 기교, 피어스 하드 되 세포 막 때문에 많은 양의 걸립니다. 그것은 셀, 아니라 노 른 자, 유전자 변형 zebrafish를 생성 하기 위한 솔루션을 주입 하는 것이 중요입니다. 이 morpholino 주입에 다릅니다. 그것은 어느 쪽 바늘 입력 셀 구성 셀에가 하는 만큼 중요 하지 않습니다. 노 른 자는 셀에 주입 하는 경우는 transgenesis 성공의 매우 낮은 속도 할 것 이다. 단일 셀 단계 주입은 또한 중요 하다, 또는 체세포 키메라 물고기를 만들 것입니다. 이 세균 세포에 들어가는 transgene의 가능성을 줄일 것 이다. - 젤 노치의 가장자리를 사용 하 여 제공 하는 장소에서 태아를 유지 및 태아를 이동 하지 않고 압력을 적용 하 니 백업. 일단 바늘의 팁 단일 셀에 원하는 양의 솔루션 출시 페달을 누릅니다. 배아의 모든에 대해이 프로세스를 반복 합니다.
- 완료 되 면, 물고기 시스템 물과 일회용 3.4 mL 전송 피 펫 agarose 노치에서 그들을 rinsing 하 여 레이블이 지정 된 그릇에 주입 된 배아를 전송. 그들이 개발 하는 28.5 ° C 인큐베이터에 배아를 저장 합니다. 죽은 물고기 배아를 제거 하는 하루 동안 다시 확인 하 고 0.1% 메 틸 렌 블루 물고기 물에서 물을 바꿉니다.
- 주입 후 약 6-8 시간 걸릴 10 개인 주입 배아 물고기 고18인가요 메서드 사용 하 여 그들에서 게놈 DNA를 준비 합니다.
- 다음 아침, 비 노 른 자 조직에 GFP를 보여주는 배아 밖으로 정렬 하려면 형광 광원으로 해 부 현미경을 사용 합니다. 이러한 물고기 배아 삽입 된 구문을 포함 해야 합니다.
- Tol2 소비 분석 결과 확인 앞에서 설명한19transposon 활동을 수행 합니다. 삭제 플라스 미드를 감지할 수 있습니다, 유지는 삽입 된 배아를 물고기와 그들을 인상. 아니 삭제 플라스 미드는 검출 될 수 있다, Tol2 소비 분석 결과의 긍정적인 결과 얻을 때까지 Tol2 mRNA 합성 및 microinjection 프로세스를 반복 합니다.
4. 유전자 변형 ASAP1 물고기, 안내 설정 (ubi: ASAP1)
- 앞에서 설명한 zebrafish 책20에서 성인 기에 주입 된 물고기를 (F0 세대)를 올립니다. 이 일반적으로 약 4 개월 걸립니다.
- 단일 성인 F0 물고기 고 성별 wildtype 물고기 반대 한 번으로 교차. 나중에 번 식 후 물고기 배아를 수집 합니다. 물고기에서 28.5 ° C 배양 기에서 수집한 물고기 배아 0.1% 메 틸 렌 블루 물 유지.
- 제 3의 날에 GFP 필터 형광 해 부 현미경 아래 물고기 배아를 확인 합니다. 있을 경우, 초록 물고기 배아 밖으로 정렬 하 고 F1 세대 유전자 변형 물고기, Tg 성인이 그들을 인상 (ubi: ASAP1).
참고: 이후 부모의 F0 물고기의 대부분은 세균 선 유전자 키메라 Mendelian 비율 예상 하지는. - 크로스 wildtype 물고기와 단일 F1 성인 물고기 고 물고기 배아를 수집 합니다. 초록 물고기 배아 밖으로 정렬 하 고 F2 세대 생선으로 성인 기에 발생.
참고: 녹색과 비 그린 물고기 배아 가까이 있어야 한다 1:1 단일 transgene 인지. - 악성 말 초 신경 칼 집 종양 (MPNST) 같은 종양에서 전기 잠재적인 변화를 보려면 F2 세대 Tg 크로스 (ubi: ASAP1) rpl35hi258/wt 물고기와 물고기. 보이는 종양 6-8 달 오래 된 성인21,22에서 찾을 수 시작을 알려졌다.
5입니다. 영상
- Zebrafish 태아 이미지, 여러 F2 세대 설립자 물고기 고 개별 쌍에서 wildtype 물고기와 그들을 교차 하는 것 하. 준비 가이드23zebrafish에 따르면 다른 원하는 발달 단계에서 물고기 배아를 수집 합니다.
- 물고기 배아의 초기 단계에 대 한 껍질 하 고 신중 하 게 집게의 쌍을 사용 하 여 10 cm 직경 물고기 시스템 물으로 페 트리 접시에에서 절 개 범위에서 배아의 chorions를 제거 합니다.
- 3.4 mL 처분할 수 있는 이동 피 펫을 사용 하 여 3% 스와 concaved 유리 슬라이드에 몇 가지 물고기 배아를 전송 합니다. 배아는 형광 절 개 범위 아래 바늘을 사용 하 여 셀룰러 GFP 활동을 볼 수 원하는 위치를 조정 합니다.
- 물고기의 이동 단계 배아 (12 somite 단계 보다 더 오래 된), 0.05% tricaine mesylate 물고기 배아 슬라이드에 그들을 전송 하기 전에 anesthetize를 사용 합니다. 간단히, 그들은 수영, 손실 신체 균형을 멈출 때까지 물고기 배아 물고기 물에서 0.05% tricaine mesylate에 등장 했다. 또한, 슬라이드에는 스와 0.05% tricaine mesylate 방울을 추가 합니다.
- 미만 12 somite 무대 물고기 배아에 대 한 호환 카메라와 소프트웨어 피 형광 화합물 현미경을 사용 하 여 이미징. 12 somite 무대 물고기 배아 보다 오래 된에 대 한 형광 해 부 현미경을 사용 합니다.
- 종양 세포 전압 이미지, 먼저 MPNST 종양 물고기를 식별. 그런 다음 anesthetize 0.05% tricaine mesylate와 물고기. 전체 산에 대 한 이미징, 10 cm 직경 페 트리 접시에 생선을 넣어. 종양 세포 전기 활동을 보려면 물고기 종양 수 수 해 부 밖으로 전체 마운트 영상 후.
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Representative Results
성공적인 주입, 주입 50% 물고기 배아는 체세포에 녹색 형광의 어느 정도 표시 됩니다 그리고 그들의 대부분은 Tol2 transposon 소비 분석 결과 (그림 2)에 의해 긍정적인 것 보다 더 많은. 후 2-4 세대-wildtype 물고기 (까지 형광 물고기 도달 예상된 Mendelian 비율 50%)와 교차, 유전자 변형 물고기 배아 개발 하는 동안 세포 막 잠재력을 추적 하기 위해 이미징 실험을 위해 사용 되었다. 첫째, 막 잠재적인 변경 zebrafish 초기 배아 발달 단계 동안 세포 주기 동안 시험 되었다. 세포 분열 밭 고 랑 형성 (-3C,그림 3A와 보조 비디오 1) 전에 hyperpolarized 관찰 되었다. 또한, 다른 조직 했다 막 잠재력의 다양 한 1 ~ 3 일에 오래 된 물고기 배아. (그림 3D-3G). 예를 들어 notochord 그리고 somites는 일반적으로 hyperpolarized, 인접 조직/장기에 비해. Zebrafish 태아 이동 수 있었다, 일단 우리는 또한 (그림 4, 보조 비디오 2) 신경 근육 학 전기 활동을 감지할 수 있습니다. 암 세포의 생체 속성을 변경할 수 있습니다, 우리 물고기,이 ASAP1 기자를 이용 했다 그리고 자발적인 악성 말 초 신경 칼 집 종양21,24 경향이 있는 rpL35 유전자 돌연변이로 넘어 ,25. 비록 물고기 종양 돌연변이 대 한 잠재적인 긴 성장 기간 때문만 몇 물고기 종양 검사 했다 라이브 종양 베어링 zebrafish (그림 5)에 종양과 주변 조직 사이의 전압 차이 했다 두 드러 졌다. 따라서, 이러한 대표적인 결과 세포 전기 기자 물고기 선 및 그것의 잠재적인 응용 프로그램 개발 및 세포 생물학을의 성공적인 세대를 설명 했다.
그림 1: Tol2 플라스 미드 transposon 기반 건설의 그림.
(A) 혈압 재결합 ASAP1 하위 pDONR221 중간 항목 벡터에 클로닝을 위해 사용 되었다. attB 시퀀스는 ASAP1에 대 한 5-뇌관의 끝에 추가 되었습니다. (B) Tol2 transposon-기반에 대 한 다이어그램 생성 LR 재결합에 따라 조립 합니다. 보라색 타원형 모양 거꾸로 Tol2 반복을 보여 줍니다. 점선된 라인 동종 재결합을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: epifluorescence와 Tol2-소비 분석 결과 의해 주입 된 배아의 전형적인 결과.
(A) 비-긍정적인 1dpf 물고기 태아 (B)는 성공적으로 1dpf 물고기 태아 주입. GFP 명소 트렁크에 분명 하다입니다. (C) 비-긍정적인 2dpf 물고기 태아 (D)는 성공적으로 2dpf 물고기 태아 주입. GFP 명소 트렁크에 분명 하다입니다. (E) Tol2 소비 분석 결과의 대표적인 결과. 레인 1-7 PCR 7에서 무작위로 증폭 했다 물고기 배아 주입 후 8 시간 선택. 마지막 하나는 어떤 genomic DNA 없이 부정적인 제어 (NC). 눈금 막대 250 μ m =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 동적 전압 zebrafish 태아 개발 중 변경합니다.
(A-C) 물고기 배아에서 유사 분열 동안 차동 세포 전압 극성. (A) 2-셀 단계 zebrafish 태아 (B) 4 세포 단계 태아. (C) 8 세포 단계 태아. 빨간색 화살표 머리 (A-C) 패널에서 분열 밭 고 랑의 위치를 나타냅니다. 변경 내용을 해당 영화 (보충 비디오 1)에서 분명 있습니다. 분열 밭 고 랑 주위 지역 편광 더 셀의 나머지 부분에 비해입니다. (D-G) Zebrafish 태아의 다른 초기 단계에서 동적 전기 전압 변화. (D) 12 somite 무대. (E) 22-somite 무대. (F) 48 시간 게시물 수정. (G) 72 시간 수정 게시. e, 눈; ht, 심장; nt, notochord; op, 광학 기; ov, otic 소포; pf, 가슴 지 느 러 미; 그래서, somite; 공용 구, 노 른 자입니다. 눈금 막대 250 μ m =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 물고기 태아 움직임 동안 물고기 시체의 전기 전압 변화.
2 일 오래 된 물고기 배아 쇼 신경 근육 전기 활동은 운동 하는 동안. (A)-(F) 순차 이미지 같은 물고기 태아의입니다. 색상 밀도 변화는 전기 신호 변환에 대응 합니다. 두 개의 연속 이미지 사이의 간격 시간 약 12.4 밀리초입니다. 빨간색 화살표는 전압 이미징 기간 동안 변경 하는 위치를 나타냅니다. 변경 내용을 해당 영화 (보충 비디오 2)에서 분명 있습니다. 모든 패널은 동일한 규모에 있습니다. 눈금 막대 250 μ m =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 종양 세포 편광 더 있을 경향이 있다.
10 달 오래 된 생선 (rpL35hi258/wt. Tg (ubi: ASAP1)는 복 부에 악성 말 초 신경 칼 집 종양 개발. (A) 및 (C) 브라이트 필드 이미지. (B) & GFP 채널 (D) 이미지. (A) 및 (B) 그대로 물고기. (C) 및 (D) 복 부 종양을 해 부 했다. 종양 세포는 더 편광된 (밝은 녹색) 조직 (진한 녹색) 주변에 비해. 화살표 머리 종양을 보여줍니다. 모든 패널은 동일한 규모에 있습니다. 눈금 막대 = 25 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보조 비디오 1 . Tg에 분열 단계 동안 전기 신호 Epifluorescent 이미징 (유비: ASAP1) 물고기 태아. 이 영화는 동물 극의 보기에서 기록 되었다. ASAP1 형광 세포 분열 밭 고 랑, 세포 분열 동안 임시 구조 형성으로 연결 됩니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보조 비디오 2 . 2 일 오래 된 안내 하는 동안 전기 신호 Epifluorescent 이미징 (유비: ASAP1) 태아 이동 물고기. 이동 후 anesthetization 2 일 오래 된 물고기 태아의 측면 보기에서 기록 되었다. 는 ASAP1 형광 변경 이동 과정에서 신경 근육 조직에 분명 하다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
있지만 세포와 조직 수준의 전기 활동 배아 개발 및 인간 질병 동안 오래 전에 발견 되었다, vivo에서 동적 전기 변화 및 그들의 생물학 역할 여전히 남아 크게 알 수 없는. 주요 과제 중 하나는 시각화 하 고 계량 전기 변화입니다. 단일 셀을 추적 하기 위한 휴식 통해 패치 클램프 기술 이다 하지만 그들은 많은 세포의 구성 되어 있기 때문에 척추 동물 배아의 응용 제한 됩니다. 현재 화학 전압 염료는도 그들의 감도, 특이성, 및 독성 이상적 없습니다. GEVIs의 발명품에 최근 노력 vivo에서 세포 전기 활동을 시각화 하는 새로운 경로 제공 하 고 실시간으로. 여기, 우리가 zebrafish 전기 기자 선, Tg를 만드는 과정을 보여주었다 (ubi:ASAP1).
이 기자 물고기 라인을 사용 하 여, 우리 zebrafish 태아에 있는 세포 전기 활동을 모니터링할 수 있습니다을 보여줍니다. 높은 전기 전압 변화는 초기 미 발달 발달 동안에 세포 주기 관련. 우리는 그 hyperpolarization 분열 밭 고 랑/세포 분열 (그림 3)의 형성 전에 발생을 관찰 했습니다. 이 현재 정보 대조 그 도발은 세포 분열26전에 일어난다. 따라서, 세포 막 전압의 자세한 내용은 다른 인간과 동물 세포의 세포 주기 동안 변경 하 고이 조직 컨텍스트 관련 여부 추가 연구 필요. 관련된 연구는 현재 우리의 실험실에서 진행. 또한, 우리 ASAP1를 변경은 상대적으로 빠른 세포 주기 동안 변화에 비해 신경 근육 시스템 (그림 4), 생리 적인 전압 변화를 추적할 수는 확인.
그것은 또한이 기자 또한 zebrafish 종양 (그림 5) 시각화를 사용할 수 있습니다 시연 했다. 종양 주변 정상 조직에 비해 셀은 일반적으로 더 편광 찾을 재미 있었다. 그러나,이 모든 악성 조직에 대 한 일반적인 현상 인지 종양 샘플 및 물고기 종양 유형이 연구에서의 제한으로 인해 조사 더 필요 합니다. 다른 종류의 종양과 인간 암 세포에 세포 막 분극 및 전압 정량화에 미래 조사는 tumorigenesis 중 더 나은 이해의 역할에 대 한 유익한 것입니다.
이 프로토콜, 우리 물고기 태아의 모든 셀을 추적 하기 위해 ASAP1 식 드라이브를 유비 쿼터 스 발기인을 선택 했다. 조직 또는 기관 특정 발기인 특정 세포/조직 종류는 선호 하는 경우에 다른 옵션 수 있습니다. ASAP1 전압 센서는 비교적 잘 특징이 바이오 센서, 그리고 그것은 바다 물 총 전압에 민감한 인산 가수분해 효소 (S3 S4 루프)의 전압 민감한 도메인와 원형 순열 GFP의의 구성 된다 (기본값은 낮은 형광). 그것은 인간의 신경 세포와 마우스 뇌 조각4,,2728외부 세포 막에 표현 될 알려졌다. 센서의 밝기 지배적 S3 S4 루프 GFP의 구조적 위치에 의해 결정 됩니다. 급속 한 녹색 형광 변화가 했다 단백질 농도, 밝기 변화 및 단백질 합성의 속도 때문에 의해 발생 가능성이 높습니다. 그러나, transgene, ASAP1, 종양 세포, genomic 불안정성의 본질 때문에 식을 변경 수 있습니다. ASAP1, 뿐만 아니라 archaerhodopsin 기반 전압 표시기 (QuasAr1 및 QuasAr2) 같은 다른 GEVIs 수도 있습니다 좋은 보완 옵션 때문에 그들은 완전히 다른 메커니즘을 사용 하 여 그리고 그들은 또한 높은 감도 29속도. 또한, 그들의 방출은 붉은 색 범위에서입니다. 이 게 그들 특히 무료 녹색 ASAP1 경우 이미 동일한 셀에서 다른 형광 단백질 이다. 예를 들어 ASAP1 및 준 성 Fucci zebrafish30 세포 주기 및 전기 잠재적인 변화 사이의 관계를 공부와 결합할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 간행물에 보고 된 연구 작업에 의해 국립 연구소의 일반 의료 과학 수상 번호 R35GM124913, 퍼듀 대학 PI4D 인센티브 프로그램, 그리고 PVM 내부 경쟁에서 국립 보건원의 지원 기초 연구 자금 프로그램입니다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 자금 에이전트의 공식 의견을 대표 하지 않는다. 우리 Tol2 구문, ASAP1 구문에 대 한 마이클 린 고이치 가와카미를 감사 하 고 레너드 Zon ubi 발기인에 대 한 Addgene를 통해 생성.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14mL cell culture tubes | VWR | 60818-725 | E.Coli culture |
| Agarose electrophoresis tank | Thermo Scientific | Owl B2 | DNA eletrophoresis |
| Agarose RA | Amresco | N605-500G | For making the injection gels |
| Attb1-ASAP1-F primer | IDT DNA | GGGGACAAGTTTGTACAAAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA |
ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Attb2-ASAP1-R primer | IDT DNA | GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA |
ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Bright field dissection scope | Nikon | SMZ 745 | Dechorionation, microinjection, mounting |
| Color camera | Zeiss | AxioCam MRc | Fish embryo image recording |
| Concave slide | VWR | 48336-001 | For holding fish embryos during imaging process |
| Disposable transfer pipette 3.4 ml | Thermo Scientific | 13-711-9AM | Fish embryos and water transfer |
| Endonuclease enzyme, Not I | NEB | R0189L | For linearizing plasmid DNA |
| Epifuorescent compound scope | Zeiss | Axio Imager.A2 | Fish embryo imaging |
| Epifuorescent stereo dissection scope | Zeiss | Stereo Discovery.V12 | Fish embryo imaging |
| Fluorescent light source | Lumen dynamics | X-cite seris 120 | Light source for fluorescence microscopes |
| Forceps #5 | WPI | 500342 | Dechorionation and needle breaking |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Scientific | 11789020 | Gateway BP recombination cloning |
| Gateway LR Clonase II Plus enzyme | Thermo Scientific | 12538120 | Gateway LR recombination cloning |
| Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | DNA gel purification |
| Loading tip | Eppendorf | 930001007 | For loading injection solution into capilary needles |
| Methylcellulose (1600cPs) | Alfa Aesar | 43146 | Fish embryo mounting |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection |
| Microinjector | WPI | Pneumatic Picopump PV820 | Microinjection injector |
| Micro-manipulator | WPI | Microinjector MM3301R | Microinjection operation |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | For preparing capillary needle |
| Mineral oil | Amresco | J217-500ml | For calibrating injection volume |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Thermo Scientific | AM1340 | mRNA in vitro transcription |
| Monocolor camera | Zeiss | AxioCam MRm | Fish embryo image recording |
| Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4020 | Prepare small amount of plasmid DNA |
| Plastic Petri dishes | VWR | 25384-088 | For holding fish or fish embryos during imaging process |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | mRNA cleaning after in vitro transcription |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | For measuring DNA and RNA concentrations |
| Stage Micrometer | Am Scope | MR100 | Microinjection volume calibration |
| Thermocycler | Bio-Rad | T100 | DNA amplification for gene cloning |
| Thin wall glass capillaries | WPI | TW100F-4 | Raw glass for making cappilary needle |
| Tol2-exL1 primer | IDT DNA | GCACAACACCAGAAATGCCCTC | Tol2 excise assay |
| Tol2-exR primer | IDT DNA | ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG | Tol2 excise assay |
| TOP10 Chemically Competent E. coli | Thermo Scientific | C404006 | Used for transformation during gene cloning |
| Tricaine mesylate | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing fish or fish embryos |
| UV trans-illuminator 302nm | UVP | M-20V | DNA visualization |
| Water bath | Thermo Scientific | 2853 | For transformation process of gene cloning |
References
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