Summary
هنا، نحن إظهار عملية إنشاء خط جهد كهربائي خلوية الزرد مراسل لتصور التنمية الجنينية، والحركة، والأسماك ورم الخلايا في الجسم الحي.
Abstract
تنوعها والإشارات الكهربائية الذاتية بوساطة قنوات أيون والمضخات الموجودة على غشاء الخلية، تلعب أدواراً هامة في إشارات العمليات منفعل من الخلايا العصبية والعضلات والعديد من العمليات البيولوجية الأخرى، مثل الجنينية الزخرفة التنموية. ومع ذلك، هناك حاجة لرصد النشاط الكهربائي في فيفو في embryogenesis الفقاريات. التقدم المحرز مؤشرات الجهد الفلورسنت المشفرة جينياً (جيفيس) مكنت لتوفير حل لمواجهة هذا التحدي. هنا، نحن تصف كيفية إنشاء الزرد مؤشر جهد المحورة وراثيا استخدام مؤشر الجهد المعمول، ASAP1 (تسارع جهاز استشعار لإمكانات العمل 1)، على سبيل مثال. يو بي أي، اختيرت كيت Tol2 ومروج الزرد في كل مكان، في هذه الدراسة. ونحن أيضا شرح عمليات استنساخ بوابة الموقع، Tol2 الزرد المستندة إلى ينقول ترانسجينيسيس، وعملية التصوير للأورام الأجنة والأسماك الأسماك في مرحلة مبكرة باستخدام المجاهر العادية ابيفلوريسسينت. استخدام هذا الخط الأسماك، وجدنا أن هناك تغيرات الجهد الكهربائي الخلوية أثناء embryogenesis الزرد، وحركة الأسماك اليرقات. وعلاوة على ذلك، فقد لوحظ أن ورم الخلايا كانت عموما الاستقطاب في أورام غمد الأعصاب الطرفية الخبيثة الزرد قليلة، مقارنة بالانسجة الطبيعية المحيطة بها.
Introduction
ويشير تستخرجها للإشارات الكهربائية الذاتية بوساطة قنوات أيون والمضخات الموجودة على غشاء الخلية1. تبادل أيونى عبر الغشاء الخلوي، وإلى جانب التغييرات الحالية والمحتملة الكهربائية، ضرورية لإشارات عمليات خلايا العصبية والعضلات منفعل. وباﻹضافة إلى ذلك، تستخرجها والتدرجات وأيون لها مجموعة متنوعة من الوظائف البيولوجية الهامة الأخرى بما في ذلك تخزين الطاقة والنقل المستقلب والحيوي،. إشارات bioelectrical اكتشفت أيضا كمنظم لتشكيل نمط الجنينية، مثل هيئة المحاور، ودورة الخلية، والخلية التمايز1. وبالتالي، من الأهمية بمكان لفهم العديد من الأمراض الخلقية البشرية التي تنجم عن سوء تنظيم هذا النوع من الإشارات. على الرغم من أن المشبك التصحيح قد استخدمت على نطاق واسع لتسجيل الخلايا المفردة، أنها لا تزال بعيدة عن المثالية للرصد المتزامن لخلايا متعددة أثناء التطور الجنيني في فيفو. وعلاوة على ذلك، الجهد جزيئات صغيرة حساسة أيضا ليست مثالية للتطبيقات في فيفو نظراً لخصائصها، والحساسيات، والسمية.
إنشاء مجموعة متنوعة من وراثيا ترميز الجهد الفلورسنت المؤشرات (جيفيس) يوفر إليه جديدة للتغلب على هذه المشكلة، ويسمح للتطبيقات سهلة لدراسة التطور الجنيني، على الرغم من أنها كانت مخصصة أصلاً لرصد العصبية الخلايا2،3. واحد جيفيس المتاحة حاليا هو تسارع جهاز استشعار لإمكانات العمل 1 (ASAP1)4. وهو يتألف من حلقة خارج الخلية في مجال الاستشعار عن بعد الجهد الجهد الفوسفاتيز الحساسة وبروتين فلوري أخضر دائري مبدل. ولذلك، يسمح ASAP1 التصور للتغيرات المحتملة الكهربائية الخلوية (الاستقطاب: أخضر ساطع؛ depolarization: أخضر داكن). ASAP1 2 مللي ثانية وإيقاف حركية، ويمكن تعقب التغيير المحتمل سوبثريشولد4. وبالتالي، تتيح هذه الأداة الوراثية لمستوى جديد من الكفاءة في رصد الاحتمالات في الوقت الحقيقي في الخلايا الحية. زيادة فهم أدوار تستخرجها في التطور الجنيني وكثير من الأمراض البشرية، مثل السرطان، سوف ضوءا جديداً على الآليات الكامنة، التي حاسمة بالنسبة للوقاية والعلاج من الأمراض.
ثبت الزرد نموذج حيوان قوية لدراسة علم الأحياء التنموي والأمراض البشرية بما في ذلك السرطان5،6. تتبادل الجينات أورثولوجوس 70% مع البشر، ولديهم بيولوجيا الفقاريات مماثلة7. الزرد توفير الرعاية سهلة نسبيا، وحجم مخلب كبير من البيض وتتبعها الوراثة، ترانسجينيسيس سهلة وشفافة من التنمية الجنينية الخارجية، مما يجعلها نظام متفوقة في فيفو التصوير5،6. مصدر كبير للأسماك متحولة خطوط موجودة بالفعل وجينوم الكامل متتابع، ستوفر الزرد نطاق محدود نسبيا من الاكتشافات العلمية.
للتحقيق في فيفو في الوقت الحقيقي النشاط الكهربائي للخلايا، علينا الاستفادة من النظام النموذجي الزرد و ASAP1. في هذه الورقة، تصف كيفية إدماج biosensor الجهد نيون ASAP1 في الجينوم الزرد استخدام Tol2 ينقول ترانسجينيسيس، وتصور النشاط الكهربائي الخلوية أثناء التطور الجنيني، حركة الأسماك اليرقات، وفي ورم لايف .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الزرد يسكن في منشأة حيوان الموافقة على آآلاك، وجميع التجارب التي أجريت وفقا للبروتوكولات المعتمدة "رعاية الحيوان بوردو" واستخدام اللجنة (باكوك).
1-Tol2 ينقول بلازميد بناء إعداد
ملاحظة: Tol2، ينقول التي تم اكتشافها في أسماك الميداكا، على نطاق واسع استخدمت في البحوث الزرد المجتمع8،9. أنه تم بنجاح اعتمدت على بوابة الموقع جزئ استنساخ النظام القائم والمعروفة باسم مجموعة Tol210. كيت Tol2 يسمح بطريقة أكثر ملائمة لإنشاء بنيات التعبير مخصصة، بينما أيضا زيادة كفاءة ترانسجينيسيس. وهكذا، كان قرارا سهلاً الاستفادة من هذا النظام، وإنشاء خط الزرد تعبير ASAP1 في كل مكان باستخدام أحد المروجين المصادق عليه ubiquitin إلى محرك الأقراص ASAP111.
- إنشاء بنية دخول متوسطة ASAP1: pDONR221-ASAP1
- اكتساب الجهد المشفرة جينياً بناء استشعار ASAP1، pcDNA3.1/بورو-كاج-ASAP1 (بلازميد #52519)، من أدجيني. لتضخيم منطقة الترميز ASAP1، إعداد PCR استخدام كبسولة تفجير مخصصة (attB1-ASAP1F و attB2-ASAP1R) الذي كان واقفاً مع تسلسل أتتب في 5 ' نهاية الإشعال (الشكل 1). بوليميراز "الدنا فوسيون" اختير لكفاءته العالية، وظروف PCR كانت الأمثل استناداً إلى بروتوكول تم نشرها في السابق12.
- تحميل منتجات PCR ميليلتر 50 إلى 1 ٪ هلام تاي باستخدام ماصة انتظام مع 200 ميليلتر نصائح، وإجراء التفريد في 160 الخامس في خزان جل أفقي لمدة حوالي 30 دقيقة.
- تحقق من الجل تحت ترانسيلوميناتور الأشعة فوق البنفسجية (353 nm) والمكوس خارج النطاق المطلوب باستخدام شفرة/مشرط تحت ترانسيلوميناتور الأشعة فوق البنفسجية كما نشرت سابقا13،14، وموضع العينة هلام التي تحتوي على الحمض النووي ميكروسينتريفوجي نظيفة 1.5 مل أنبوب.
- إجراء تنقية جل لمنتجات ASAP1 PCR. استرداد الحمض النووي في جل قصت استخدام الحمض النووي تجاري جل عدة تنقية اتباع إرشادات الشركة المصنعة، والوت الحمض النووي إلى 20 ميليلتر من الماء. 1 ميليلتر كعينة، وقياس تركيز الحمض النووي باستخدام جهاز المطياف الضوئي. تدفق البرامج تعليمات باستخدام المياه ك عنصر تحكم فارغة15.
- خذ 100 نانوغرام من تنقية المنتج بكر ومزجها مع 150 نانوغرام بلازميد pDONR221 في 10 ميليلتر من الشركة المصرية للاتصالات المخزن المؤقت (10 ملم تريس، 1 مم يدتا pH 8.0)16. إضافة 2 ميليلتر من شركة بريتيش بتروليوم كلناز الثاني في رد فعل واحتضان التفاعل في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
- اليوم الثاني، إضافة 1 ميليلتر من البروتيناز ك إلى رد فعل واحتضان رد فعل في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- القيام بالتحويل. نقل رد فعل ومزجها مع 50 ميليلتر من Top10 المختصة كولاي الخلايا واحتضان الخلايا على الجليد لمدة 30 دقيقة. ثم نقل رد فعل الأنبوبة في حمام مائي 42 درجة مئوية للحد الأدنى 1 فورا إزالة الأنبوب واحتضان على الجليد لمدة 2 دقيقة. بعد ذلك، وضعت الأنبوب شاكر 37 درجة مئوية واحتضانها من أجل ح 1.
- إخراج الأنبوب ولوحة الخلايا على صفيحة كاناميسين رطل. وبعد ذلك، احتضان لوحة بين عشية وضحاها (16-18 ح) عند 37 درجة مئوية.
- اختيار المستعمرات واحدة والمنفصلين عن ذويهم جيدا وتطعيم منهم إلى 14 مل خلية ثقافة أنابيب مع 3 مل متوسطة رطل. الثقافة لها بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في شاكر مع سرعة دوران 250 لفة في الدقيقة (دوران في الدقيقة الواحدة).
- أداء مينيبريب باستخدام مجموعة مينيبريب تجارية التالية في تعليمات دليل17.
- تسلسل والبلازميدات 3-4 مع سانجر استنساخ تسلسل تحديد إيجابي pDONR221-ASAP1 استخدام كبسولة تفجير تسلسل M13F و M13R.
- إنشاء بنية Tol2 ل microinjection: pDestTol2-يو بي أي-ASAP1
- اختر التسلسل التحقق من استنساخ pDONR221-ASAP1 وقياس تركيز الحمض النووي استخدام التالية جهاز المطياف الضوئي تعليمة برمجية استخدام المياه كما التحكم فارغة15.
- تأخذ 100 ميكروغرام من pDONR221-ASAP1 ومزجها مع 100 ميكروغرام من Tol2 طقم 5-نهاية بلازميد (pENTR5 ' _ubi، أدجيني #27320)، 100 ميكروغرام من p3E-بوليا (كيت Tol2 #302) و 150 ميكروغرام من pDestTol2pA2 (كيت Tol2 #394). ضبط الحجم الإجمالي ميليلتر 8 استخدام المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات (10 ملم تريس، 1 مم يدتا، pH 8.0) في ميكروسينتريفوجي 1.5 مل أنبوب وخلط جيدا بدوامة قصيرة s 2-5. ثم أضف 2 ميليلتر LR كلناز الثاني زائد، واحتضان التفاعل في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
- اليوم الثاني، إضافة 1 ميليلتر من البروتيناز ك إلى رد فعل استخدام 10 ميليلتر ماصة، واحتضان رد فعل في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- القيام بالتحويل وتحديد استنساخ إيجابية كما هو موضح أعلاه (الخطوات 1.1.7-11).
- قياس تركيز الحمض النووي لتسلسل التحقق من pDestTol2-يو بي أي-ASAP1 استنساخ (الشكل 1B) باستخدام جهاز المطياف الضوئي15. عادة ما يتم التركيز حول 200ng/ميليلتر.
2-إعداد Tol2 ترانسبوساسي مرناً والحل الحقن
- الانتصارات كولاي والغليسيرول الأسهم من بلازميد pCS2FA-ترانسبوساسي (كيت Tol2 #396) على صفيحة رطل (مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين) استخدام حلقة تلقيح معقمة. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة بين عشية وضحاها. اختيار مستعمرة واحدة في اليوم التالي، وتطعيم ذلك إلى 3 مل رطل (الأمبيسلّين 100 ميكروغرام/مل) باستخدام تلميح ماصة 10 ميكروليتر معقمة. الثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في شاكر مع سرعة دوران 250 لفة في الدقيقة.
- أداء مينيبريب في ثقافة كولاي استخدام مجموعة مينيبريب تجارية التالية في دليل التعليمات. الوت بلازميد الحمض النووي إلى 30-50 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات بدقيقة واحدة للطرد المركزي 14,000 لفة في الدقيقة، وقياس تركيز الحمض النووي مع جهاز المطياف الضوئي.
- لينيريزي 1-2 ميكروغرام من بلازميد مع عدم اندونوكلياسي وتنقية الحمض النووي مع الحمض النووي تنظيف كيت بعد دليل التعليمات لا الهضم. الوت الحمض النووي إلى 5 ميليلتر من الماء قبل سينتريفوجينج 14,000 لفة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة. تركيز المتوقعة عن 200-300 نانوغرام/ميليلتر.
- إجراء النسخ في المختبر مع عدم خطيا pCS2FA-ترانسبوساسي كقالب الحمض النووي باستخدام مجموعة نسخ تجارية SP6.
- بمجرد الانتهاء من رد فعل تنقية ترانسبوساسي Tol2 كيت مرناً باستخدام الحمض النووي الريبي التنظيف التجارية اتباع إرشادات الشركة المصنعة. وأخيراً، الوت مرناً في المياه خالية من رناسي ميليلتر 20 وقياس تركيز الحمض النووي الريبي في جهاز المطياف الضوئي. تركيز المتوقعة حول 1-3 ميكروغرام/ميليلتر. عينات يمكن تخزينها في ثلاجة-80 درجة مئوية إذا لزم الأمر.
- إعداد الحل microinjection بخلط 20 نانوغرام/ميليلتر pDestTol2-يو بي أي-ترانسبوساسي ASAP1 و Tol2 مرناً (100 نانوغرام/ميليلتر) في أنبوب ميكروسينتريفوجي من بيبيتينج. لمنع تدهور الأحماض النووية الناجمة عن ذوبان الجليد المتكررة وإعادة تجميد، الكوة ميليلتر 6 كل أنبوب وتخزينها في ثلاجة-80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
3-microinjection
- قم بإعداد الدبابات تربية 4-6 مع 2 على الأقل من الذكور والإناث 2 بعد الظهر قبل الحقن. يجب عدم تغذية هذه الأسماك في فترة ما بعد الظهر. هذه الخطوة سوف تقلل من كمية النفايات السمكية وتوفيرا للوقت لتنظيف لهم صباح اليوم التالي، بينما تساعد أيضا للحث على رد تربية.
- في صباح اليوم التالي، إزالة الحل الحقن المعدة (pDestTol2-يو بي أي-ASAP1 بناء ومرناً Tol2) من الثلاجة-80 درجة مئوية، ووضعه على الجليد.
- سحب رموز التقسيم في خزانات تربية الأسماك وتسمح الأسماك رفيقه. وبصفة عامة، الأسماك تضع البيض داخل 20-30 دقيقة بعد سحب الفاصل. إذا لم يكن كذلك، الانتظار 1-2 ساعات أطول. بعض الأسماك قد لا تضع بيضها على الإطلاق. وفي هذه الحالة، كرر هذه التجربة لجمع الأسماك الجنين.
- بينما كان ينتظر، تأكد من هناك أعد مع تلميح كسر في زاوية خلق على حافة مشطوفة بالملقط، أو عن طريق كسر على ممسحة مهمة حساسة الإبر.
- سحب الإبر من الزجاج الشعرية على ساحبة ميكروبيبيتي استخدام المعلمات التالية: الحرارة 545؛ سحب 60؛ السرعة 80؛ الوقت 250؛ ضغط 500. كسر الإبرة مع الملقط تحت نطاق تشريح (مع قطعة العين المسطرة لتقدير قطر) بعقد الملقط في زاوية حوالي 45 درجة. أقطار إبرة المطلوب يمكن أن يكون متغير استناداً إلى إعدادات ميكروينجيكتور، ولكن القطر الأصغر المفضل لتقليل معدل وفيات الأجنة.
- مرة واحدة وقد وضعت السمك البيض، جمع لهم في قطرها 10 سم طبق بيتري وتقديمهم إلى نطاق التشريح. إزالة جميع أجنة غير طبيعية والأسماك النفايات.
- بيبيت العفن أجنة مخصبة إلى حقن استعداد 3% [اغروس]. إزالة الماء الزائد للمساعدة في الحفاظ الأجنة في المكان.
- بمجرد كافة الصفوف تمتلئ أجنة قابلة للاستمرار، ترتيبها حيث أن كافة الخلايا وحيدة تواجه نفس الاتجاه نحو الإبرة، وتقريبا بزاوية 45 درجة أفقياً. وهذا سيجعل الحقن أسهل بكثير في وقت لاحق.
- حين ارتداء القفازات، واستخدام بيبيت 20 ميليلتر تحميل تلميح وإزالة 5 ميليلتر بناء إعداد من الأنبوب على الجليد.
- عناية إدراج التلميح في نهاية الجزء الخلفي من كسر الأنبوب الشعرية وصولاً إلى حيث يبدأ في تابر، وفيما يتعلق بالحصول على الكاشف أقرب إلى الحافة. إذا كان لا يزال هناك فقاعات الهواء، اهتز الإبرة، مع التأكد من عدم كسر التلميح.
- إدراج الإبرة مباشرة إلى صاحب إبرة microinjection وتشديد بعناية حتى يبقى الإبرة في المكان. ضبط الزاوية لحوالي 45°.
- حالما يتم إعداد الإبرة وتعلق، قم بتشغيل خزان الضغط مجهر والغاز. الدبابات2 شركة تجارية جيدة عموما لهذا الغرض. يتم ضبط حجم الحقن بالضغط القابضة وقذف: تقريب 0.5 رطل/بوصة مربعة لعقد و 30 رطل/بوصة مربعة للإخراج. تأكد من التحقق من أن الحل الذي يخرج عند الضغط على دواسة.
- استخدام ميكرومتر مرحلة مع قطره الزيوت المعدنية، ضبط حجم وتدفق من الحل ~ 150 ميكرومتر في القطر (حوالي 2 nL). التأكد من أن الضغط مرة أخرى سوف تتيح كمية صغيرة بالتنقيط بالإبرة. إذا لم يكن هناك ضغط الظهر ما يكفي، سوف يسبب عمل شعري السائل لإدخال الإبرة وتدمير مرناً.
- حالما يتم معايرة الإبرة، تبدأ بالحقن في البناء داخل خلية مفردة من أجنة مخصبة.
ملاحظة: هذا يأخذ كمية كبيرة من الممارسة والصبر والجودة، بسبب غشاء الخلية التي يصعب على بيرس. من المهم أن حقن الحل في الخلية، وليس الصفار، لتوليد الزرد المحورة وراثيا. وهذا يختلف عن حقن morpholino. ولا يهم الجانب الذي يدخل الإبرة الخلية طالما البناء يذهب في الخلية. سوف يكون ترانسجينيسيس نسبة منخفضة جداً من النجاح إذا حقن الصفار بدلاً من الخلية. حقن المرحلة خلية واحدة من المهم أيضا، أو سيتم إنشاء الأسماك الوهم جسدية. وهذا سوف يقلل من فرصة للتحوير الدخول إلى الخلايا الجرثومية. - استخدام حافة الشق جل لتوفير مساندة يبقى الجنين في المكان، ويسمح بالإبرة لتطبيق الضغط دون نقل الجنين. مجرد غيض الإبرة في خلية واحدة، اضغط على دواسة للإفراج عن المبلغ المطلوب للحل. كرر هذه العملية لكل من الأجنة.
- عند الانتهاء، نقل الأجنة حقن في طبق مسمى بدهن منهم الخروج من الشق [اغروس] مع الأسماك نظام المياه وماصة نقل المتاح 3.4 مل. تخزين الأجنة في حاضنة 28.5 درجة مئوية للسماح لهم بتطوير. تحقق مرة أخرى طوال اليوم إزالة السمك الميت الأجنة واستبدال الماء الأزرق الميثيلين 0.1% في أسماك المياه.
- حوالي 6-8 ساعات بعد الحقن، الفرد تأخذ 10 حقن أجنة الأسماك وإعداد الحمض النووي من عليها باستخدام أسلوب العامل البارع18.
- في صباح اليوم التالي، استخدام مجهر تشريح مع مصدر ضوء فلورية لفرز الأجنة عرض التجارة والنقل في الأنسجة غير صفار. ينبغي أن تتضمن هذه الأجنة الأسماك في بناء حقن.
- إجراء المقايسة المكوس Tol2 للتحقق من نشاط ينقول كما هو موضح سابقا19. إذا كان يمكن الكشف عن قصت بلازميد، الاحتفاظ حقن أجنة الأسماك ورفع لهم. إذا كان يمكن الكشف عن لا بلازميد قصت، كرر عملية التوليف و microinjection Tol2 مرناً حتى تحقيق النتائج الإيجابية للمقايسة المكوس Tol2.
4-إنشاء ASAP1 المعدلة وراثيا الأسماك، تيراغرام (يو بي أي: ASAP1)
- رفع الأسماك حقن (الجيل0 و) إلى سن الرشد كما هو موضح سابقا في كتاب الزرد20. وهذا عادة ما يستغرق حوالي 4 أشهر.
- و الكبار واحد0 الأسماك وعبوره مع واحد مقابل الجنس wildtype الأسماك. جمع أجنة الأسماك بعد تكاثر في الوقت لاحق. تبقى أجنة الأسماك التي تم جمعها في الحاضنة 28.5 درجة مئوية في أسماك المياه مع 0.1% الميثيلين الأزرق.
- اليوم الثالث، فحص أجنة الأسماك تحت مجهر تشريح فلورسنت مع عامل تصفية التجارة والنقل. فرز الأجنة السمك الأخضر، إذا كان هناك أي، وتربيتهم إلى سن البلوغ كالأسماك المحورة وراثيا و1 جيل، تيراغرام (يو بي أي: ASAP1).
ملاحظة: لا يتوقع نسبة مندلية منذ أكثر من الأسماك0 و الأبوية هي التركيبات الجينية الجرثومية-خط. - عبور واحد و1 الأسماك الكبار مع الأسماك wildtype وجمع أجنة الأسماك. فرز الأجنة أسماك خضراء وتربيتهم إلى سن البلوغ كأسماك الجيل2 و.
ملاحظة: الأخضر واجنة الأسماك غير الأخضر يجب أن تكون قريبة من 1:1 إذا كان هناك التحوير واحد. - لعرض التغييرات المحتملة الكهربائية في الأورام مثل أورام غمد الأعصاب الطرفية الخبيثة (مبنست)، عبر الجيل2 و تيراغرام (يو بي أي: ASAP1) السمك مع rpl35hi258/وزن الأسماك. ومن المعروف أن أورام مرئية ابدأ يمكن العثور عليها في21،الكبار شهر 6-8 من العمر22.
5-التصوير
- أن صورة الأجنة الزرد، واتخاذ متعددة و2 جيل مؤسس الأسماك وعبور لهم مع الأسماك wildtype في أزواج الفردية. جمع أجنة الأسماك في مختلف مراحل النمو المطلوب حسب الزرد التدريج دليل23.
- للمراحل المبكرة من أجنة الأسماك، التقشير وإزالة تشوريونس الأجنة بعناية باستخدام زوج من الملقط تحت نطاق تشريح في قطرها 10 سم طبق بيتري مع الأسماك نظام المياه.
- نقل أجنة الأسماك قليلة إلى شريحة زجاج concaved مع ميثيلسيلولوسي 3% باستخدام ماصة نقل المتاح 3.4 مل. ضبط الأجنة للمواقف المطلوبة لعرض النشاط بروتينات فلورية خضراء الخلوية باستخدام إبرة تحت نطاق تشريح فلورسنت.
- لمراحل الانتقال من الأسماك استخدام الأجنة (أقدم من 12 مرحلة سميط)، mesylate تريكيني 0.05% لتخدير الأسماك الأجنة قبل نقلها إلى الشرائح. بإيجاز، وقد ظهرت أجنة الأسماك إلى 0.05% تريكيني mesylate في أسماك المياه حتى أنها توقفت عن السباحة وفقدان توازن الجسم. أيضا، إضافة بانخفاض 0.05% تريكيني mesylate مع ميثيلسيلولوسي على الشريحة.
- لاجنة الأسماك المرحلة سميط أقل من 12، استخدام مجهر مجمع برنامج التحصين الموسع-الأسفار مع كاميرا متوافقة والبرامج للتصوير. لأقدم من 12 أجنة الأسماك في مرحلة سوميتي، استخدام مجهر تشريح الأسفار.
- صورة ورم الخلايا الجهد، أولاً تحديد السمك مع الأورام مبنست. ثم تخدير السمك مع mesylate تريكيني 0.05%. لتصوير جبل كله، وضعت الأسماك في قطرها 10 سم طبق بيتري. لعرض النشاط الكهربائي خلية الورم، قد يكون تشريح الأورام الأسماك بها بعد تصوير جبل كله.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في حقن ناجحة، أكثر من أجنة الأسماك 50% حقن سيتم عرض بعض درجة الفلورية الخضراء في الخلايا الجسمية، ومعظمها سيكون إيجابيا بمقايسة المكوس ينقول Tol2 (الشكل 2). بعد خارج عبر الأجيال 2-4 مع الأسماك wildtype (حتى الأسماك الفلورية تصل إلى 50 في المائة ونسبة مندلية المتوقعة)، والأسماك المحورة وراثيا استخدمت لتجربة التصوير لتعقب إمكانات غشاء الخلية أثناء التطور الجنيني. أولاً، تم فحص التغيرات المحتملة غشاء طوال دورة الخلية أثناء مراحل النمو الجنيني المبكر الزرد. ولوحظ أن الخلايا هايبربولاريزيد قبل تشكيل ثلم الانقسام (الشكل 3A-3C، و التكميلية الفيديو 1). وعلاوة على ذلك، أظهرت أنسجة مختلفة مجموعة متنوعة من إمكانات غشاء في يوم 1-3 أجنة الأسماك القديمة. (3D الشكل-3G). على سبيل المثال، سميتس و notochord هي عموما هايبربولاريزيد، مقارنة بالأجهزة/الأنسجة المجاورة. كانت قادرة على نقل الأجنة الزرد، تمكنا أيضا من كشف الأنشطة الكهربائية العضلية (الشكل 4، التكميلي فيديو 2). كما يمكن تغيير خصائص الاحتمالات للخلايا السرطانية، استغل هذا المراسل ASAP1 الأسماك، وعبرت عليه مع متحولة جينات rpL35 ، وعرضه للأعصاب المحيطية الخبيثة عفوية غمد الأورام21،24 ،25. وبحثت إلا عدد قليل من الأورام الأسماك، بسبب فترة النمو الطويلة المحتملة للمسخ الورم الأسماك، كانت ملاحظته أن كانت هناك فروق الجهد بين الأورام والأنسجة المحيطة بها في العيش الحاملة للورم الزرد (الشكل 5). وهكذا، أثبتت هذه نتائج الممثل توليد ناجحة خط أسماك مراسل كهربائية خلوية، وتطبيقاتها المحتملة للبيولوجيا الخلوية والتنموية.
الشكل 1: رسم توضيحي للبناء على أساس ينقول بلازميد Tol2.
(أ) استخدمت BP جزئ ASAP1 الاستنساخ الفرعي إلى ناقل الإدخال الأوسط pDONR221. تسلسل أتتب أضيفت إلى 5-نهاية كبسولة تفجير ل ASAP1. (ب) بناء الرسم التخطيطي ل Tol2 على أساس ينقول تجميع استناداً إلى جزئ LR. ويبين الشكل البيضاوي الأرجواني يكرر Tol2 مقلوب. تشير الخطوط المتقطعة إلى جزئ مثلى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: النتائج النموذجية حقن الأجنة ابيفلوريسسينسي و Tol2-المكوس المقايسة.
(أ) عدم إيجابية 1dpf الأسماك الجنين. (ب) بنجاح حقن الأجنة الأسماك 1dpf. بروتينات فلورية خضراء البقع جلية في الجذع. (ج) عدم إيجابية 2dpf الأسماك الجنين. (د) بنجاح حقن الأجنة الأسماك 2dpf. بروتينات فلورية خضراء البقع جلية في الجذع. (ه) ممثل نتيجة الفحص المكوس Tol2. لين تم تضخيمه PCR 1-7 من 7 عشوائياً اختيار أجنة الأسماك 8 ساعات بعد الحقن. آخر واحد عنصر تحكم سلبية (NC) دون أي الحمض النووي. شريط المقياس = 250 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تغيرات الجهد الحيوي أثناء تطوير الأجنة الزرد.
(أ-ج) قطبية فرق الجهد الخلوية أثناء الانقسام في أجنة الأسماك. (أ) المرحلة 2-خلية الزرد الجنين. (ب) المرحلة 4 خلايا الأجنة. (ج) مرحلة 8 خلايا الأجنة. رؤوس الأسهم الحمراء تشير إلى مواقف الشقوق الانقسام في اللوحات (أ-ج). التغييرات واضحة أيضا في الفيلم المطابق (تكميلية الفيديو 1). المنطقة المحيطة ثلم الانقسام أكثر استقطابا مقارنة مع بقية الخلية. (د-ز) الجهد الكهربائي ديناميكية التغيرات في مختلف المراحل المبكرة للأجنة الزرد. (د) مرحلة 12-سميط. (ه) 22-سوميتي المرحلة. (و) بعد 48 ساعة من الإخصاب. (ز) بعد 72 ساعة من الإخصاب. ه، والعين؛ ht، القلب؛ الإقليم الشمالي، نوتوتشورد؛ البروتوكول الاختياري، حويصلة البصرية؛ ov، حويصلة أوتيك؛ الجبهة الوطنية، الزعنفة الصدرية؛ لذا، سميط؛ يك، صفار البيض. شريط المقياس = 250 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: تغيرات الجهد الكهربائي من جسم الأسماك أثناء حركة الجنين الأسماك.
2-يوم العمر الأسماك الأجنة تظهر العصبية العضلية الكهربائية الأنشطة أثناء الحركة. (أ)-(و) متسلسلة تصوير الجنين السمك نفسه. تغيرات كثافة اللون هي المطابقة لتوصيل الإشارات الكهربائية. الوقت الفاصل بين صورتين متتاليتين حوالي 12.4 ميلي ثانية. الأسهم الحمراء تشير إلى مواقف أن الجهد يتغير خلال فترة التصوير. التغييرات واضحة أيضا في الفيلم المطابق (التكميلي فيديو 2). جميع الألواح في نفس النطاق. شريط المقياس = 250 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5: الخلايا السرطانية تميل إلى أن تكون أكثر استقطابا.
سمكة 10 أشهر-- (rpL35hi258/wt؛ تيراغرام (يو بي أي: ASAP1) وضعت ورم غمد الأعصاب طرفية خبيثة في البطن. (أ) و (ج) برايت حقل الصورة. (ب) و (د) صورة مع قناة التجارة والنقل. (أ) و (ب) الأسماك سليمة. وكان تشريح الورم (ج) و (د) البطن خارجاً. الخلايا السرطانية هي أكثر استقطابا (أكثر إشراقا الأخضر) بالمقارنة مع المحيطة بالانسجة (أخضر داكن). إظهار السهم رؤساء الأورام. جميع الألواح في نفس النطاق. شريط مقياس = 25 مم- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الفيديو التكميلي 1 . تصوير ابيفلوريسسينت من الإشارات الكهربائية أثناء مراحل الانقسام في تيراغرام (يو بي أي: ASAP1) الجنين الأسماك. تم تسجيل هذا الفيلم من وجهة نظر القطب الحيواني. الأسفار ASAP1 يرتبط بتشكيل الخلية الانقسام ثلم، هيكل مؤقت أثناء انقسام الخلية. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
فيديو تكميلي 2 . تصوير ابيفلوريسسينت من الإشارات الكهربائية أثناء تيراغرام 2-يوم القديمة (يو بي أي: ASAP1) الأسماك حركة الجنين. وسجلت هذه الخطوة من العرض الجانبي الجنين الأسماك 2-القديمة يوم بعد أنيسثيتيزيشن. ASAP1 الأسفار التعديلات جلية في الأنسجة العضلية أثناء عملية الانتقال. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من أن تم اكتشاف الخلايا والأنسجة ومستوى الأنشطة الكهربائية أثناء التطور الجنيني والأمراض البشرية منذ زمن طويل، في فيفو الكهربائية التغيرات الدينامية ودورها البيولوجي لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. أحد التحديات الرئيسية هو تصور وتحديد التغييرات الكهربائية. التكنولوجيا المشبك التصحيح كسر عبر لتتبع الخلايا المفردة، ولكن يقتصر تطبيقه على أجنة الفقاريات لأنها تتكون من العديد من الخلايا. الأصباغ الكيميائية الجهد الحالي أيضا ليست مثالية بسبب الحساسيات، وخصائصها، والسمية. الجهود التي بذلت مؤخرا في اختراع جيفيس توفر لنا طريقا جديداً لتصور الأنشطة الكهربائية الخلوية في فيفو وفي الوقت الحقيقي. نحن هنا، وأظهرت عملية إنشاء خط كهربائي مراسل الزرد، تيراغرام (يو بي أي:ASAP1).
استخدام هذا الخط الأسماك مراسل، نعرض الأنشطة الكهربائية الخلوية التي يمكن رصدها في الأجنة الزرد. عالية تتصل بتغيير الجهد الكهربائي دورة الخلية أثناء النمو الجنيني المبكر. وقد لاحظنا أن فرط الاستقطاب يحدث قبل تشكيل الشعبة ثلم/الخلية الانقسام (الشكل 3). وهذا على النقيض من المعارف الراهنة depolarization أن يحدث قبل انقسام الخلية26. وهكذا، مزيدا من التفاصيل عن الجهد غشاء الخلية التغييرات أثناء دورة الخلية من الخلايا الحيوانية والبشرية الأخرى، وما إذا كان هذا هو المتصلة بالسياق الأنسجة، تتطلب مزيدا من الدراسات. تجري حاليا دراسات ذات صلة في المختبر. وعلاوة على ذلك، نحن لديك التحقق من أن ASAP1 قادرة على تعقب التغييرات الفسيولوجية الجهد في المنظومة العصبية العضلية (الشكل 4)، الذي التغيير سريع نسبيا مقارنة بالتغيرات خلال دورات الخلية.
كما اتضح أن هذا المراسل يمكن استخدامها أيضا لتصور الزرد الأورام (الشكل 5). كان مثيرا للاهتمام للبحث عن ورم الخلايا كانت عموما أكثر استقطابا بالمقارنة مع الأنسجة الطبيعية المحيطة بها. ومع ذلك، إذا كان هذا ظاهرة عامة لجميع الأنسجة الخبيثة تتطلب مزيدا التحقيق، بسبب الحد من عينات الورم وأنواع الأسماك الورم في هذه الدراسة. إجراء تحقيقات في المستقبل على غشاء الخلية الاستقطاب والجهد التقدير الكمي في أنواع أخرى من الأورام والخلايا السرطانية البشرية ستكون مفيدة لتحسين فهم الأدوار التي تقوم بها أثناء توموريجينيسيس.
في هذا البروتوكول، اخترنا أحد المروجين في كل مكان محرك التعبير ASAP1 لتعقب كافة الخلايا في أجنة الأسماك. نسيج أو عضو من المروجين محددة يمكن أن يكون خيار آخر إلا إذا كان نوع خلية/نسيج معين المفضل. استشعار الجهد ASAP1 بيوسينسور جيدا نسبيا تتسم، ويتألف من مجال جهد حساسة لبخ البحر المراعية للجهد الفوسفاتيز (حلقة S3 S4) والتقليب دائرية من التجارة والنقل (القيمة الافتراضية هي الفلورية منخفضة). وذكر أن يتم التعبير عنها في خارج الغشاء الخلوي في الخلايا العصبية البشرية والماوس الدماغ شرائح4،،من2728. سطوع الاستشعار يتحدد المهيمن بمواقف conformational S3 S4 الحلقة والتجارة والنقل. التغيير السريع الفلورية الخضراء كان من المحتمل الناجم عن تركيز البروتين، نظراً لسرعة التغيرات السطوع وتخليق البروتين. ومع ذلك، التحوير، ASAP1، قد غيرت التعبير في الخلايا السرطانية، نظراً لطبيعة عدم الاستقرار المجيني. جيفيس الأخرى، مثل مؤشرات الجهد القائم على أرتشايرهودوبسين (QuasAr1 و QuasAr2)، بالإضافة إلى ASAP1، كما يمكن خيار تكميلية جيدة، نظراً لأنها تستخدم إليه مختلفة تماما، ولديهم أيضا حساسية عالية وسرعة 29. وبالإضافة إلى ذلك، تلك الانبعاثات في نطاق اللون الأحمر. وهذا يجعلها مجانية خاصة ل ASAP1 الخضراء، إذا كان هناك بالفعل البروتين الفلورسنت آخر في نفس الخلية. على سبيل المثال، يمكن أن يقترن ASAP1 وكوازار فوكسي الزرد30 لدراسة العلاقة بين دورة الخلية والتغييرات المحتملة الكهربائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد أعمال البحث التي ذكرت في هذا المنشور بالمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة "معاهد الصحة الوطنية في" إطار جائزة رقم R35GM124913 وبرنامج الحوافز PI4D جامعة بوردو، والتنافسية الداخلية PVM برنامج صناديق الأبحاث الأساسية. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية لعملاء التمويل. ونحن نشكر كويشي كاواكامي لبناء Tol2، مايكل لين لبناء ASAP1، وتشييد زون ليونارد للمروج يو بي أي عن طريق أدجيني.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14mL cell culture tubes | VWR | 60818-725 | E.Coli culture |
| Agarose electrophoresis tank | Thermo Scientific | Owl B2 | DNA eletrophoresis |
| Agarose RA | Amresco | N605-500G | For making the injection gels |
| Attb1-ASAP1-F primer | IDT DNA | GGGGACAAGTTTGTACAAAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA |
ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Attb2-ASAP1-R primer | IDT DNA | GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA |
ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Bright field dissection scope | Nikon | SMZ 745 | Dechorionation, microinjection, mounting |
| Color camera | Zeiss | AxioCam MRc | Fish embryo image recording |
| Concave slide | VWR | 48336-001 | For holding fish embryos during imaging process |
| Disposable transfer pipette 3.4 ml | Thermo Scientific | 13-711-9AM | Fish embryos and water transfer |
| Endonuclease enzyme, Not I | NEB | R0189L | For linearizing plasmid DNA |
| Epifuorescent compound scope | Zeiss | Axio Imager.A2 | Fish embryo imaging |
| Epifuorescent stereo dissection scope | Zeiss | Stereo Discovery.V12 | Fish embryo imaging |
| Fluorescent light source | Lumen dynamics | X-cite seris 120 | Light source for fluorescence microscopes |
| Forceps #5 | WPI | 500342 | Dechorionation and needle breaking |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Scientific | 11789020 | Gateway BP recombination cloning |
| Gateway LR Clonase II Plus enzyme | Thermo Scientific | 12538120 | Gateway LR recombination cloning |
| Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | DNA gel purification |
| Loading tip | Eppendorf | 930001007 | For loading injection solution into capilary needles |
| Methylcellulose (1600cPs) | Alfa Aesar | 43146 | Fish embryo mounting |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection |
| Microinjector | WPI | Pneumatic Picopump PV820 | Microinjection injector |
| Micro-manipulator | WPI | Microinjector MM3301R | Microinjection operation |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | For preparing capillary needle |
| Mineral oil | Amresco | J217-500ml | For calibrating injection volume |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Thermo Scientific | AM1340 | mRNA in vitro transcription |
| Monocolor camera | Zeiss | AxioCam MRm | Fish embryo image recording |
| Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4020 | Prepare small amount of plasmid DNA |
| Plastic Petri dishes | VWR | 25384-088 | For holding fish or fish embryos during imaging process |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | mRNA cleaning after in vitro transcription |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | For measuring DNA and RNA concentrations |
| Stage Micrometer | Am Scope | MR100 | Microinjection volume calibration |
| Thermocycler | Bio-Rad | T100 | DNA amplification for gene cloning |
| Thin wall glass capillaries | WPI | TW100F-4 | Raw glass for making cappilary needle |
| Tol2-exL1 primer | IDT DNA | GCACAACACCAGAAATGCCCTC | Tol2 excise assay |
| Tol2-exR primer | IDT DNA | ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG | Tol2 excise assay |
| TOP10 Chemically Competent E. coli | Thermo Scientific | C404006 | Used for transformation during gene cloning |
| Tricaine mesylate | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing fish or fish embryos |
| UV trans-illuminator 302nm | UVP | M-20V | DNA visualization |
| Water bath | Thermo Scientific | 2853 | For transformation process of gene cloning |
References
- Levin, M. Molecular bioelectricity: how endogenous voltage potentials control cell behavior and instruct pattern regulation in vivo. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3835-3850 (2014).
- Storace, D., et al. Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential. Trends in Neuroscience. 39 (5), 277-289 (2016).
- Inagaki, S., Nagai, T. Current progress in genetically encoded voltage indicators for neural activity recording. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 95-100 (2016).
- St-Pierre, F., et al. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nature Neuroscience. 17 (6), 884-889 (2014).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. , (2013).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science USA. 105 (50), 19827-19832 (2008).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Mosimann, C., et al. Ubiquitous transgene expression and Cre-based recombination driven by the ubiquitin promoter in zebrafish. Development. 138 (1), 169-177 (2011).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Ordovas, J. M. Separation of small-size DNA fragments using agarose gel electrophoresis. Methods in Molecular Biology. 110, 35-42 (1998).
- Downey, N. Extraction of DNA from agarose gels. Methods Mol Biol. 235, 137-139 (2003).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. 45 (45), (2010).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610, 612, 614 (2007).
- Kawakami, K., Koga, A., Hori, H., Shima, A. Excision of the tol2 transposable element of the medaka fish, Oryzias latipes, in zebrafish, Danio rerio. Gene. 225 (1-2), 17-22 (1998).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, Univ. of Oregon Press. (2000).
- Amsterdam, A., et al. Many ribosomal protein genes are cancer genes in zebrafish. PLoS Biology. 2 (5), E139 (2004).
- Lai, K., et al. Many ribosomal protein mutations are associated with growth impairment and tumor predisposition in zebrafish. Developmental Dynamics. 238 (1), 76-85 (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Zhang, G., et al. Comparative oncogenomic analysis of copy number alterations in human and zebrafish tumors enables cancer driver discovery. PLoS Genetics. 9 (8), e1003734 (2013).
- Zhang, G., et al. Highly aneuploid zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors have genetic alterations similar to human cancers. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107 (39), 16940-16945 (2010).
- Urrego, D., Tomczak, A. P., Zahed, F., Stuhmer, W., Pardo, L. A. Potassium channels in cell cycle and cell proliferation. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B. 369 (1638), 20130094 (2014).
- Yang, H. H., et al. Subcellular Imaging of Voltage and Calcium Signals Reveals Neural Processing In Vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
- Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 106 (49), 20812-20817 (2009).
