Summary
Her viser vi å lage en mobilnettet strømstyrken reporter sebrafisk linje for å visualisere embryonale utviklingen, bevegelse, og fisk tumor celler i vivo.
Abstract
Bioelectricity, endogen elektrisk signalering formidlet av ionekanaler og pumper på cellemembranen, spiller viktige roller i signalering prosesser av nervøs neuronal og muskel celler og mange andre biologiske prosesser, som embryonale utviklingsmessige mønstre. Men er det behov for i vivo elektrisk aktivitet overvåking i virveldyr embryogenesis. Fremskritt i genetisk kodet fluorescerende spenning indikatorer (GEVIs) har gjort det mulig å gi en løsning på denne utfordringen. Her beskriver vi hvordan du oppretter en transgene spenning indikator sebrafisk bruker indikatoren etablerte spenning, ASAP1 (akselerert Sensor av handlingen potensialer 1), som et eksempel. Tol2 kit og en allestedsnærværende sebrafisk promoter, ubi, ble valgt i denne studien. Vi har også forklare prosessene av Gateway områdespesifikke kloning, Tol2 transposon-baserte sebrafisk transgenesis og avbildingsprosessen for tidlig stadium fisk embryoer og fisk svulster bruk av vanlig epifluorescent mikroskop. Bruker denne fisken linjen, fant vi at det er mobilnettet strømstyrken endringer under sebrafisk embryogenesis og fisk larver bevegelse. Videre ble det observert at i noen sebrafisk ondartet perifere nerve skjede svulster, svulst cellene var generelt polarisert forhold til de omliggende normalt vev.
Introduction
Bioelectricity refererer til endogene elektrisk signalering formidlet av ionekanaler og pumper ligger på cellemembranen1. Ioniske utveksling mobilnettet membranen og kombinert elektrisk potensielle og nåværende endringene, er avgjørende for signalering prosesser av nervøs neuronal og muskel celler. I tillegg har bioelectricity og ion graderinger en rekke andre viktige biologiske funksjoner inkludert energilagring, biosyntesen og metabolitten transport. Bioelektrisk signalering ble også oppdaget en regulerende embryonale mønster formasjonen, som kroppen akser, cellen syklus og celle differensiering1. Derfor er det avgjørende for å forstå mange menneskelige medfødte sykdommer som følge av mis regulering av denne typen signalering. Selv om oppdateringen klemme har vært mye brukt for opptak enkeltceller, er det fortsatt langt fra ideell for samtidig overvåking av flere celler under embryonale utviklingen i vivo. Videre er spenning følsom små molekyler heller ikke perfekt for programmer i vivo sine særegenheter, følsomhet og toksisitet.
Etableringen av en rekke genetisk kodet fluorescerende spenning indikatorer (GEVIs) tilbyr en ny mekanisme for å overkomme dette problemet, og muliggjør enkel bruk å studere embryonale utvikling, selv om de var opprinnelig ment for overvåking nevrale 2,3i cellene. En av de tilgjengelige GEVIs er akselerert Sensor av handlingen potensialer 1 (ASAP1)4. Det består av en ekstracellulære løkke av et spenning-sensing domene spenning følsom fosfatase og et sirkulært permuted grønne fluorescerende protein. Derfor ASAP1 lar visualisering av mobilnettet elektrisk mulige endringer (polarisering: lys grønn; depolarization: mørk grønn). ASAP1 har 2 ms-og-på kinetics og kan spore subthreshold potensielle endre4. Dermed gir genetisk verktøyet et nytt nivå av effekt i real-time bioelectric overvåking i levende celler. Videre forståelse av rollene til bioelectricity i embryonale utvikling og mange menneskelige sykdommer som kreft, vil kaste nytt lys over de underliggende mekanismene som er avgjørende for behandling og forebygging.
Sebrafisk har vist en kraftig dyremodell utviklingsbiologi og menneskelige sykdommer, inkludert kreft5,6. De deler 70% orthologous gener med mennesker, og de har lignende virveldyr biologi7. Sebrafisk gir relativt enkel pleie, en stor clutch størrelse på egg, medgjørlig genetikk, lett transgenesis og gjennomsiktig eksterne embryonale utvikling, som gjør dem et bedre system for i vivo tenkelig5,6. Med en stor kilde til mutant fisk linjene allerede finnes og et fullt sekvensert genom, vil sebrafisk gi en relativt ubegrenset rekke vitenskapelige funn.
Undersøke i vivo sanntid elektriske aktiviteten til cellene, tar vi nytte av sebrafisk modell systemet og ASAP1. I dette papiret, vi beskriver hvordan å innlemme fluorescerende spenning biosensor ASAP1 i sebrafisk genomet bruker Tol2 transposon transgenesis, og visualisere mobilnettet elektrisk aktivitet under embryonale utviklingen, fisk larver bevegelse, og i live svulst .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sebrafisk ligger i en AAALAC-godkjent dyr anlegget, og alle eksperimentene ble utført i henhold til protokoller godkjent av Purdue Animal Care og bruk Committee (PACUC).
1. Tol2 Transposon plasmider konstruere forberedelse
Merk: Tol2, en transposon som ble oppdaget i medaka fisk, er mye brukt i sebrafisk forskning samfunnet8,9. Det har vært vellykket vedtatt Gateway områdespesifikke rekombinasjon-basert kloning systemet og kjent som de Tol2 kit10. Tol2 kit gir en enklere måte å lage egendefinerte uttrykk konstruerer, samtidig øke effektiviteten av transgenesis. Dermed var det en lett avgjørelse å dra nytte av dette systemet, og opprette en allestedsnærværende ASAP1 uttrykk sebrafisk linje ved hjelp av en godkjent ubiquitin promoter for å kjøre ASAP111.
- Opprette en midtre oppføringen ASAP1 konstruksjon: pDONR221-ASAP1
- Hente den genetisk kodet spenning sensoren ASAP1 konstruksjonen, pcDNA3.1/Puro-CAG-ASAP1 (plasmider #52519), fra Addgene. For å forsterke ASAP1 koding regionen, sette opp en PCR bruke tilpassede primerne (attB1-ASAP1F og attB2-ASAP1R) flankert med attB sekvenser på 5' slutten primerne (figur 1). Phusion DNA polymerase ble valgt for sin høye effektivitet og PCR forhold var optimalisert basert på tidligere publiserte protokoll12.
- Laste inn 50 µL PCR produktene i en 1% TAE gel med en vanlig pipette med 200 µL tips, og utfør geleelektroforese på 160 V i en horisontal gel tank i ca 30 min.
- Sjekk gel under et UV transilluminator (353 nm), avgiftsdirektoratet ut det ønskede båndet med blad/skalpell under et UV transilluminator som tidligere publisert13,14og DNA som inneholder gel prøven inn en ren 1,5 mL microcentrifuge rør.
- Utføre gel rensing for ASAP1 PCR-produktene. Gjenopprette DNA i forbrukeravgift gel med en kommersiell DNA gel rensing kit følger produsentens instruksjoner, og elute DNA i 20 µL av vann. Ta 1 µL som et eksempel, og måle DNA konsentrasjonen bruker et spektrofotometer. Flyt programvare instruksjonene bruker vann som en tom kontroll15.
- Ta 100 ng av renset PCR produkt og bland det med 150 ng av pDONR221 plasmider i 10 µL av TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8.0)16. Legg 2 µL av BP Clonase II i reaksjonen og ruge reaksjonen i romtemperatur over natten.
- På den andre dagen, sammenlegge 1 µL av proteinasen K i reaksjonen og ruge reaksjonen på 37 ° C i 30 min.
- Utføre transformasjonen. Overføre reaksjonen og bland det med 50 µL av Top10 kompetent E. coli celler og ruge cellene på is 30 min. Deretter overføre reaksjon røret i et vannbad 42 ° C i 1 umiddelbart fjerne røret og ruge på is 2 min. Deretter legge røret i en 37 ° C shaker og ruge det 1t.
- Ta av røret og plate cellene på en kanamycin LB tallerken. Deretter ruge platen over natten (16-18 h) på 37 ° C.
- Velg enkelt og godt atskilt koloniene og vaksinere dem inn i 14 mL celle kultur rør med 3 mL LB medium. Kultur dem over natten på 37 ° C i en shaker med en rotasjonshastighet på 250 rpm (rotasjon per minutt).
- Utføre miniprep ved hjelp av en kommersiell miniprep kit etter sin instruksjon manuell17.
- Rekkefølge 3-4 plasmider med Sanger kloner sekvensering å identifisere positive pDONR221-ASAP1 med M13F og M13R sekvensering primere.
- Opprette Tol2 Konstruer for microinjection: pDestTol2 -ubi-ASAP1
- Velg sekvensering av bekreftet pDONR221-ASAP1 klone og måle DNA konsentrasjonen bruker et spektrofotometer følgende programvare instruksjon med vann som en tom kontroll15.
- Ta 100 µg av pDONR221-ASAP1 og bland det med 100 µg av Tol2 kit 5-end plasmider (pENTR5'_ubi, Addgene #27320), 100 µg av p3E-polyA (Tol2 kit #302) og 150 µg av pDestTol2pA2 (Tol2 kit #394). Justere totale volumet til 8 µL bruker TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) i en 1,5 mL microcentrifuge rør og bland godt en 2-5 s kort vortex. Deretter legger 2 µL av LR Clonase II pluss og ruge reaksjonen i romtemperatur over natten.
- På den andre dagen, sammenlegge 1 µL av proteinasen K i reaksjonen bruker en 10 µL pipette og ruge reaksjonen på 37 ° C i 30 min.
- Utføre transformasjon og identifisere positive kloner som beskrevet ovenfor (trinn 1.1.7-11).
- Mål DNA konsentrasjonen av sekvensering bekreftet pDestTol2-ubi-ASAP1 klone (figur 1B) med et spektrofotometer15. Konsentrasjonen er vanligvis rundt 200ng/µL.
2. Forbered Tol2 Transposase mRNA og injeksjon løsning
- Strek E. coli glyserol lager av pCS2FA-transposase plasmider (Tol2 kit #396) på en LB plate (med 100 µg/mL ampicillin) bruker en sterilisert inokuleringen sløyfe. Inkuber platen på 37 ° C i en inkubator over natten. Neste dag, plukke en enkelt koloni og vaksinere den i 3 mL LB (100 µg/mL ampicillin) med en sterilisert 10 µL pipette tips. Kultur det overnatting på 37 ° C i en shaker med en rotasjonshastighet på 250 rpm.
- Utføre miniprep på E. coli kultur med en kommersiell miniprep kit etter sin bruksanvisningen. Elute plasmider DNA i 30-50 µL av TE buffer av 1 minutt sentrifuge på 14 000 rpm og måle DNA konsentrasjonen med et spektrofotometer.
- Linearize 1-2 µg av plasmider med jeg ikke endonuclease og rense den med en DNA rengjøringssett etter sin bruksanvisningen etter jeg ikke fordøyelsen. Elute DNA i 5 µL vann av sentrifugering på 14 000 rpm i 1 minutt. Forventet konsentrasjonen er om 200-300 ng/µL.
- Utføre i vitro transkripsjon med ikke jeg linearized pCS2FA-transposase som DNA mal ved hjelp av en kommersiell SP6 transkripsjon kit.
- Når reaksjonen er fullført, rense Tol2 transposase mRNA bruker en kommersiell RNA rengjøring utstyr følger produsentens instruksjoner. Endelig elute mRNA i 20 µL RNAase-fritt vann og måle RNA konsentrasjonen i et spektrofotometer. Forventet konsentrasjonen er om 1-3 µg / µL. prøver kan lagres i en-80 ° C fryser hvis nødvendig.
- Forberede microinjection løsningen ved å blande 20 ng/µL pDestTol2 -ubi-ASAP1 og Tol2 transposase mRNA (100 ng/µL) i et microcentrifuge rør av pipettering. Hindre nukleinsyre nedbrytning skyldes gjentatt tining og refreezing, aliquot 6 µL per rør og lagre det i en-80 ° C fryser for fremtidig bruk.
3. microinjection
- Definere 4-6 avl tanker med minst 2 menn og 2 kvinner ettermiddagen før injeksjon. Disse fisken må ikke være matet i ettermiddag. Dette trinnet vil redusere fiskeavfall og spare tid å rense dem ut neste morgen, mens det samtidig hjelper å indusere avl svar.
- Neste morgen, fjerne forberedt injeksjon løsningen (pDestTol2 -ubi-ASAP1 konstruksjon og Tol2 mRNA) fra-80 ° C fryseren, og plassere den på isen.
- Trekk skillelinjene i fisk avl tanker og tillate fisk til make. Generelt, legger fisk egg i 20-30 minutter etter trekke ut skillet. Hvis ikke, vent 1-2 timer lenger. Noen fisk kan ikke legge egg hele. I dette tilfellet Gjenta dette eksperimentet for fisk embryoet samling.
- Mens du venter, kontroller at det er nåler tilberedt med spissen brutt skrått oppretter en skråkant med tang eller ved å bryte på en delikate oppgaven vindusvisker.
- Trekke nåler fra kapillær glass på en brønnene avtrekker med følgende parametere: varme 545; trekke 60; hastighet 80; tid 250; Trykk 500. Bryte nålen med tang under en disseksjon omfang (med øye-stykke hersker for diameter estimering) ved å holde tang på en vinkel ca 45 °. Ønsket nål diametere kan være variabel avhengig av microinjector, men mindre diameter foretrekkes for å redusere embryoet dødelighet.
- Når fisken har lagt egg, samle dem i en 10 cm diameter Petriskål og bringe dem til disseksjon omfanget. Fjern alle unormale embryoer og fisk avfall.
- Pipetter de befruktede embryoene til forberedt 3% agarose injeksjon mold. Fjern overflødig vann for å holde embryoene på plass.
- Når alle radene er fylt med levedyktig embryo, ordne dem slik at enkeltceller alle ansikt samme retning mot nålen, som er ca en 45° vinkel vannrett. Dette vil gjøre injeksjon enklere senere.
- Med hansker, bruke en Pipetter 20 µL lasting tips og fjerne 5 µL av forberedt Konstruer fra røret på is.
- Nøye inn spissen bakenden av ødelagte kapillær røret helt til hvor det begynner å tapper, å få reagensen så nær spissen. Hvis det fremdeles luftbobler, riste nålen, og pass på å ikke bryte spissen.
- Sette inn nålen rett inn microinjection nål holder og nøye stram til nålen holder seg på plass. Justere vinkelen til ca 45°.
- Når nålen er forberedt og festet, slå på mikroskopet og gass trykket tank. Kommersielle CO2 tankene er generelt bra for dette formålet. Injeksjon lydvolumet er endret av holder og utstøting presset: omtrentlig 0,5 psi for å holde og 30 psi utstøting. Husk å sjekke at løsningen kommer ut ved å trykke på pedalen.
- Bruke en scenen mikrometer med en dråpe mineralolje, justere volum og flyt av løsningen ~ 150 µm i diameter (ca 2 nL). Kontroller at mottrykk vil la litt dryppe ut av nålen. Hvis det ikke er nok mottrykk, vil kapillære handlingen føre til væske inn nålen og ødelegge mRNA.
- Når nålen er kalibrert, kan du begynne å injisere Konstruer i enkeltcelle av befruktet embryo.
Merk: Dette tar mye praksis, tålmodighet og finesse, på grunn av cellemembranen er hard å pierce. Det er viktig å injisere løsningen i cellen, ikke eggeplomme, for generering av transgene sebrafisk. Dette er forskjellig fra morpholino injeksjon. Det spiller ingen rolle hvilken side nålen kommer inn i cellen så lenge Konstruer går i cellen. Transgenesis vil ha en svært lav hastighet på suksess hvis injiseres eggeplomme i stedet for cellen. Encellede scenen injeksjon er også viktig, eller somatiske chimera fisk opprettes. Dette reduserer sjansen av transgene skal i bakterie celler. - Bruke kanten av gel hakket for å tilby en bakside som holder embryoet på plass og nålen gjelder press uten å flytte fosteret. Når spissen av nålen er i en celle, Trykk pedalen for å løslate den ønskede mengden av løsning. Gjenta denne prosessen for alle embryoene.
- Når fullført, overføre de injiserte embryoene til en merket rett ved skylle dem ut av agarose hakket med fisk system vann og en engangs 3,4 mL overføring pipette. Lagre embryoene i en 28,5 ° C inkubator for å la dem utvikle. Sjekk tilbake hele dagen fjerne død fisk embryoer og erstatte vann med 0,1% methylene blåfarge i fisken vann.
- Rundt 6-8 timer etter injeksjonen, ta 10 individ injisert fisk embryoer og forberede genomisk DNA fra dem Hotshot metoden18.
- Neste morgen, bruke disseksjon mikroskop med fluorescens lyskilde for å sortere ut embryoene viser GFP i ikke-eggeplomme vev. Disse fisken Foster bør inneholde den injiserte konstruere.
- Utføre Tol2 avgiftsdirektoratet analysen for å kontrollere transposon aktiviteten som beskrevet tidligere19. Hvis forbrukeravgift plasmider kan oppdages, holde den injiserte fisk embryoer og heve seg. Hvis ingen forbrukeravgift plasmider kan oppdages, kan du gjenta Tol2 mRNA syntese og microinjection prosessen til å oppnå de positive resultatene av Tol2 avgiftsdirektoratet analysen.
4. etablere transgene ASAP1 fisk, vs (ubi: ASAP1)
- Øke injisert fisken (F0 generasjon) til voksen som beskrevet tidligere i sebrafisk bok20. Dette tar vanligvis ca 4 måneder.
- Ta en enkelt voksen F0 fisk og krysser den med en motsatt kjønn wildtype fisk. Samle fisk embryo etter avl senere på dagen. Hold samlet fisk embryo i 28,5 ° C inkubator i fisken vann med 0,1% methylene blåfarge.
- På den tredje dagen, sjekk fisk embryo under fluorescerende disseksjon mikroskop med et GFP-filter. Sortere ut grønne fisk embryoer, hvis det er noen, og heve dem til voksen som F1 generasjon transgene fisk, vs (ubi: ASAP1).
Merk: Mendelian forholdet er ikke forventet siden de fleste foreldre F0 fisken er bakterie-line genetisk chimeras. - Krysse enkelt F1 voksen fisk med wildtype fisk og samle fisk embryoer. Sortere ut grønne fisk embryoer og heve dem til voksen som F2 generasjon fisk.
Merk: Green og ikke-grønne fisk embryo bør være nær 1:1 Hvis det er en enkelt transgene. - Vil vise elektrisk mulige endringer i svulst som ondartet perifere nerve skjede svulster (MPNST), krysser den F2 generasjonen vs (ubi: ASAP1) fisk med rpl35hi258/wt fisk. Det er kjent at synlige svulster starter i 6-8 måned gammel voksne21,22.
5. imaging
- Bilde sebrafisk embryo, ta flere F2 generasjon grunnlegger fisk og krysse dem med wildtype fisk i individuelle par. Samle fisk embryoer på ulike ønsket utviklingsstadier ifølge sebrafisk staging guide23.
- De tidlige stadiene av fisk embryo, skrelle og fjerne chorions av embryo nøye med en tang under en disseksjon omfang i 10 cm diameter Petriskål med fisk system vann.
- Overfør noen fisk embryoer på en hul glass lysbilde 3% methylcellulose bruker en 3.4 mL disponibel overføring pipette. Juster embryoene til den ønskede plasseringen vise mobilnettet GFP aktiviteten bruker en nål, under et fluorescerende disseksjon omfang.
- Den bevegelige stadier av fisk embryo (eldre enn 12 somite scenen), bruke 0,05% tricaine mesylate for å bedøve fisk embryo før du overfører dem til lysbilder. Kort, fisk embryo var fram til 0,05% tricaine mesylate i fisken vann før de stoppet svømming og tap kroppens balanse. Også legge til en dråpe 0,05% tricaine mesylate med methylcellulose på lysbildet.
- For mindre enn 12 somite scenen fisk embryo, kan du bruke en epi-fluorescens satt mikroskop med et kompatibelt kamera og programvare for bildebehandling. Eldre enn 12 somite scenen fisk embryo, bruke fluorescens disseksjon mikroskop.
- Bilde svulst celle spenning, først identifisere fisken med MPNST svulster. Deretter bedøve fisken med 0,05% tricaine mesylate. For hele mount sette bildebehandling, fisken i 10 cm diameter Petriskål. For å vise den svulst celle elektriske aktiviteten, kan fisk svulster være dissekert ut etter hele mount bildebehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I en vellykket injeksjon, mer enn 50% injisert fisk embryo vises noen grad av grønne fluorescens i somatiske celler, og de fleste av dem vil være positiv ved Tol2 transposon avgiftsdirektoratet analysen (figur 2). Etter 2-4 generasjoner av krysse ut med wildtype fisk (inntil fluorescerende fisken nå 50%, forventet Mendelian forholdet), ble transgene fisken brukt for bildebehandling eksperimentet spore cellemembranen potensialer under embryonale utviklingen. Først ble membran mulige endringer undersøkt i cellen syklus under sebrafisk tidlig embryonale utviklingsstadier. Det ble observert at cellene hyperpolarized før cleavage fure dannelsen (figur 3A-3Cog supplerende Video 1). Videre viste ulike vev en rekke membran potensial i 1-3 dager gammel fisk embryoer. (Figur 3D-3G). For eksempel er somites og notochord vanligvis hyperpolarized, sammenlignet med tilstøtende vev/organer. Når sebrafisk embryoer kunne flytte, var vi også kunne oppdage nevromuskulær elektriske aktiviteter (Figur 4, utfyllende Video 2). Som bioelectric egenskaper av kreftceller kan endres, vi tok nytte av denne ASAP1 reporter fisk, og krysset den med en rpL35 gene mutant, som er utsatt for spontane ondartet perifere nerve skjede svulster21,24 ,25. Selv bare noen fisk svulster ble undersøkt, på grunn av lang potensielle vekstperioden for fisk svulst mutant, var merkbar at det var spenning forskjeller mellom svulster og omkringliggende vev i live svulst rentebærende sebrafisk (figur 5). Dermed viste disse representant resultatene generasjon vellykket en mobilnettet elektrisk reporter fisk linje og potensielle programmet til utviklingsmessige og cellulær biologi.
Figur 1: Illustrasjon av Tol2 transposon-baserte plasmider byggingen.
(A) BP rekombinasjon ble brukt ASAP1 sub kloning i pDONR221 midten oppføring vektor. attB sekvenser ble lagt til 5-end primerne for ASAP1. (B) Diagram for Tol2 transposon-baserte konstruere montering basert på LR rekombinasjon. Lilla oval figur viser Tol2 invertert gjentar. De stiplede linjene angir homologe rekombinasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Typiske resultater av injisert embryo av epifluorescence og Tol2-avgiftsdirektoratet analysen.
(A) ikke-positive 1dpf fisk fosteret. (B) har injisert 1dpf fisk fosteret. GFP flekker er tydelig i bagasjerommet. (C) ikke-positive 2dpf fisk fosteret. (D) har injisert 2dpf fisk fosteret. GFP flekker er tydelig i bagasjerommet. (E) et representativt resultat Tol2 avgiftsdirektoratet analysen. Lane 1-7 PCR ble forsterket 7 tilfeldig valgt fisk embryo 8 timer etter injeksjonen. Den siste er en negativ kontroll (NC) uten noen genomisk DNA. Skala bar = 250 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Dynamiske spenningen endringene under sebrafisk embryo utvikling.
(A-C) Differensial mobilnettet spenning polaritet under mitose i fisk embryoer. (A) 2-celle scenen sebrafisk fosteret. (B) 4-cellers scenen fosteret. (C) 8-cellers scenen fosteret. Rød pil hodene angir plasseringen av cleavage furer i panelene (A-C). Endringene er også tydelig i tilsvarende filmen (supplerende Video 1). Området rundt cleavage fure er mer polarisert forhold resten av cellen. (D-G) Dynamisk strømstyrken endringer i de ulike tidlige stadiene av sebrafisk embryoer. (D) 12-somite scenen. (E) 22-somite scenen. (F) 48 timer innlegg befruktning. (G) 72 timer innlegg befruktning. e, øyet; ht, hjerte. NT, notochord; op, optikk vesicle; ov, otic vesicle; pf, pectoral fin; så, somite; Novotel, eggeplomme. Skala bar = 250 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Elektrisk spenning endringer av fisk kroppen under fisk embryoet bevegelse.
2 - dagers gammel fisk embryo Vis Nevro-muskulære elektriske aktiviteter under bevegelse. (A) - (F) sekvensiell avbilding av samme fisk fosteret. Tetthet endringer er tilsvarer den elektriske signalnettverk signaltransduksjon. Intervalltiden mellom to påfølgende bilder er ca 12,4 millisekunder. Røde piler indikerer plasseringen at spenning endret seg for tenkelig perioden. Endringene er også tydelig i tilsvarende filmen (supplerende Video 2). Alle paneler er i samme skala. Skala bar = 250 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Kreftceller pleier å være mer polarisert.
En 10 - måned gamle fisk (rpL35hi258/wt; VS (ubi: ASAP1) utviklet en ondartet perifere nerve skjede svulst i magen. (A) og (C) Bright feltet bilde. (B) og (D) bilde med GFP kanal. (A) og (B) intakt fisk. (C) og (D) magen svulst ble dissekert ut. Kreftceller er mer polarisert (lysere grønn) sammenlignet med omkringliggende vev (mørk grønn). Pilespisser viser tumorer. Alle paneler er i samme skala. Skala bar = 25 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende Video 1 . Epifluorescent imaging elektrisk signalnettverk under spalting stadier i vs (ubi: ASAP1) fisk fosteret. Denne filmen ble spilt inn fra visningen av dyr pole. ASAP1 fluorescens er forbundet med dannelsen av cellen cleavage fure, en midlertidig struktur under celledeling. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende Video 2 . Epifluorescent imaging elektrisk signalnettverk under 2 - dagers gammel Tg (ubi: ASAP1) fisk embryoet bevegelse. Flyttingen ble innspilt fra laterale visningen av 2 - dagers gammel fisk embryoet etter anesthetization. The ASAP1 fluorescens endringer er tydelig i nevromuskulær vev under flytteprosessen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om de cellular og vev nivå elektriske aktivitetene under embryonale utvikling og menneskelig sykdom ble oppdaget for lenge siden, fortsatt i vivo dynamisk elektrisk endringene og deres biologiske roller hovedsakelig ubekjent. En av de store utfordringene er å visualisere og kvantifisere elektrisk endringene. Oppdateringen klemme teknologi er et gjennombrudd for sporing enkeltceller, men sin søknad til virveldyr embryoer er begrenset fordi består av mange celler. De gjeldende kjemiske spenning fargestoffer er heller ikke ideelt deres følsomhet, særegenheter og toksisitet. Den siste innsatsen på oppfinnelsen av GEVIs gi oss en ny vei å visualisere mobilnettet elektriske aktiviteter i vivo og i sanntid. Her vi viste å lage en sebrafisk elektrisk reporter linje, vs (ubi:ASAP1).
Bruker denne reporteren fisk linjen, viser vi mobilnettet elektriske aktiviteter som kan måles i sebrafisk embryoer. Strømstyrken endringen er svært knyttet til celle syklus under embryonale utviklingen. Vi har observert at hyperpolarization skjer før dannelsen av cleavage fure/celledeling (Figur 3). Dette er gjeldende kunnskap som depolarization skjer før celledeling26. Dermed mer cellemembranen spenning endres under cellen syklus av andre dyr og menneskelige celler, og om dette er relatert til vev sammenheng, krever videre studier. Relaterte studier er underveis i vårt laboratorium. Videre har vi bekreftet at ASAP1 er i stand til å spore fysiologiske spenningen endringene i nevrale-muskulære systemet (Figur 4), der endring er relativt rask sammenlignet med endringene i cellen sykluser.
Det ble også demonstrert at denne reporteren kan også brukes til å visualisere sebrafisk svulster (figur 5). Det var interessant å finne tumor celler var generelt mer polarisert i forhold til de omliggende normalt vev. Men om dette er et generelt fenomen for alle ondartet vev krever videre etterforskning, på grunn av begrensning av svulst prøver og fisk svulst typer i denne studien. Fremtidige undersøkelser på cellemembranen polarisering og spenning kvantifisering på andre typer svulster og menneskelige celler vil være informative for å bedre forstå sine roller under tumorigenesis.
I denne protokollen valgte vi en allestedsnærværende promoter å kjøre ASAP1 uttrykk til å spore alle cellene i fisk embryoer. Vev eller organ bestemte arrangørene kan være et annet alternativ hvis bare en bestemt celle/vev type foretrekkes. ASAP1 spenningssensoren er en relativt godt preget biosensor, og det består av en spenning følsom domenet Sjøpungen spenning-sensitive fosfatase (S3-S4 loop) og en sirkulær Permutasjon av GFP (standard er lav fluorescens). Det ble rapportert til uttrykk på utenfor mobilnettet membranen i menneskelig Nevron celler og musen, hjernen, skiver,4,,27,,28. Lysstyrken på sensoren bestemmes nesten kun conformational plasseringen av S3-S4 loop og GFP. Rask grønne fluorescens endringen var usannsynlig forårsaket av protein konsentrasjon, grunnet hastigheten i lysstyrke endringene og proteinsyntese. Imidlertid kan transgene, ASAP1, ha endret uttrykk i kreftceller, på grunn av genomisk ustabilitet. I tillegg til ASAP1, kan andre GEVIs, for eksempel archaerhodopsin-baserte spenning indikatorer (QuasAr1 og QuasAr2), også være et godt gratis alternativ, siden de bruker en helt annen mekanisme og de har en høy følsomhet og hastighet 29. I tillegg er utslipp i området rød farge. Dette gjør dem spesielt gratis til den grønne ASAP1, hvis det finnes allerede en annen fluorescerende protein i samme celle. For eksempel kan ASAP1 og QuasAr kombineres med Fucci sebrafisk30 for å studere forholdet mellom cellen syklus og elektrisk mulige endringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forskningsarbeid i denne publikasjonen ble støttet av National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health under prisen tall R35GM124913, Purdue University PI4D insentivprogram og PVM interne konkurransedyktig Grunnforskning midler programmet. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet av finansiering agenter. Vi takker Koichi Kawakami for den Tol2 konstruksjonen, Michael Lin for den ASAP1 konstruksjonen, og Leonard Zon for ubi arrangøren konstruere gjennom Addgene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14mL cell culture tubes | VWR | 60818-725 | E.Coli culture |
| Agarose electrophoresis tank | Thermo Scientific | Owl B2 | DNA eletrophoresis |
| Agarose RA | Amresco | N605-500G | For making the injection gels |
| Attb1-ASAP1-F primer | IDT DNA | GGGGACAAGTTTGTACAAAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA |
ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Attb2-ASAP1-R primer | IDT DNA | GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA |
ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Bright field dissection scope | Nikon | SMZ 745 | Dechorionation, microinjection, mounting |
| Color camera | Zeiss | AxioCam MRc | Fish embryo image recording |
| Concave slide | VWR | 48336-001 | For holding fish embryos during imaging process |
| Disposable transfer pipette 3.4 ml | Thermo Scientific | 13-711-9AM | Fish embryos and water transfer |
| Endonuclease enzyme, Not I | NEB | R0189L | For linearizing plasmid DNA |
| Epifuorescent compound scope | Zeiss | Axio Imager.A2 | Fish embryo imaging |
| Epifuorescent stereo dissection scope | Zeiss | Stereo Discovery.V12 | Fish embryo imaging |
| Fluorescent light source | Lumen dynamics | X-cite seris 120 | Light source for fluorescence microscopes |
| Forceps #5 | WPI | 500342 | Dechorionation and needle breaking |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Scientific | 11789020 | Gateway BP recombination cloning |
| Gateway LR Clonase II Plus enzyme | Thermo Scientific | 12538120 | Gateway LR recombination cloning |
| Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | DNA gel purification |
| Loading tip | Eppendorf | 930001007 | For loading injection solution into capilary needles |
| Methylcellulose (1600cPs) | Alfa Aesar | 43146 | Fish embryo mounting |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection |
| Microinjector | WPI | Pneumatic Picopump PV820 | Microinjection injector |
| Micro-manipulator | WPI | Microinjector MM3301R | Microinjection operation |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | For preparing capillary needle |
| Mineral oil | Amresco | J217-500ml | For calibrating injection volume |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Thermo Scientific | AM1340 | mRNA in vitro transcription |
| Monocolor camera | Zeiss | AxioCam MRm | Fish embryo image recording |
| Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4020 | Prepare small amount of plasmid DNA |
| Plastic Petri dishes | VWR | 25384-088 | For holding fish or fish embryos during imaging process |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | mRNA cleaning after in vitro transcription |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | For measuring DNA and RNA concentrations |
| Stage Micrometer | Am Scope | MR100 | Microinjection volume calibration |
| Thermocycler | Bio-Rad | T100 | DNA amplification for gene cloning |
| Thin wall glass capillaries | WPI | TW100F-4 | Raw glass for making cappilary needle |
| Tol2-exL1 primer | IDT DNA | GCACAACACCAGAAATGCCCTC | Tol2 excise assay |
| Tol2-exR primer | IDT DNA | ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG | Tol2 excise assay |
| TOP10 Chemically Competent E. coli | Thermo Scientific | C404006 | Used for transformation during gene cloning |
| Tricaine mesylate | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing fish or fish embryos |
| UV trans-illuminator 302nm | UVP | M-20V | DNA visualization |
| Water bath | Thermo Scientific | 2853 | For transformation process of gene cloning |
References
- Levin, M. Molecular bioelectricity: how endogenous voltage potentials control cell behavior and instruct pattern regulation in vivo. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3835-3850 (2014).
- Storace, D., et al. Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential. Trends in Neuroscience. 39 (5), 277-289 (2016).
- Inagaki, S., Nagai, T. Current progress in genetically encoded voltage indicators for neural activity recording. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 95-100 (2016).
- St-Pierre, F., et al. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nature Neuroscience. 17 (6), 884-889 (2014).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. , (2013).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science USA. 105 (50), 19827-19832 (2008).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Mosimann, C., et al. Ubiquitous transgene expression and Cre-based recombination driven by the ubiquitin promoter in zebrafish. Development. 138 (1), 169-177 (2011).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Ordovas, J. M. Separation of small-size DNA fragments using agarose gel electrophoresis. Methods in Molecular Biology. 110, 35-42 (1998).
- Downey, N. Extraction of DNA from agarose gels. Methods Mol Biol. 235, 137-139 (2003).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. 45 (45), (2010).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610, 612, 614 (2007).
- Kawakami, K., Koga, A., Hori, H., Shima, A. Excision of the tol2 transposable element of the medaka fish, Oryzias latipes, in zebrafish, Danio rerio. Gene. 225 (1-2), 17-22 (1998).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, Univ. of Oregon Press. (2000).
- Amsterdam, A., et al. Many ribosomal protein genes are cancer genes in zebrafish. PLoS Biology. 2 (5), E139 (2004).
- Lai, K., et al. Many ribosomal protein mutations are associated with growth impairment and tumor predisposition in zebrafish. Developmental Dynamics. 238 (1), 76-85 (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Zhang, G., et al. Comparative oncogenomic analysis of copy number alterations in human and zebrafish tumors enables cancer driver discovery. PLoS Genetics. 9 (8), e1003734 (2013).
- Zhang, G., et al. Highly aneuploid zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors have genetic alterations similar to human cancers. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107 (39), 16940-16945 (2010).
- Urrego, D., Tomczak, A. P., Zahed, F., Stuhmer, W., Pardo, L. A. Potassium channels in cell cycle and cell proliferation. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B. 369 (1638), 20130094 (2014).
- Yang, H. H., et al. Subcellular Imaging of Voltage and Calcium Signals Reveals Neural Processing In Vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
- Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 106 (49), 20812-20817 (2009).
