Summary
Здесь мы покажем процесс создания строки данио рерио репортер сотовой электрического напряжения для визуализации эмбриональное развитие, движение, и рыбы опухолевых клеток в естественных условиях.
Abstract
Шапкой, эндогенного электрической сигнализации при посредничестве ионных каналов и насосы расположены на клеточной мембраны, играет важную роль в сигнализации процессов возбудимых нейронов и мышечных клеток и многие другие биологические процессы, такие как эмбриональные развития кучность. Однако существует необходимость в естественных условиях мониторинг электрической активности в позвоночных эмбриогенеза. Достижения генетически закодированный напряжение люминесцентных индикаторов (Гевиш) сделали возможным предоставить решение для этой проблемы. Здесь мы опишем, как для создания трансгенных напряжения Индикатор данио рерио, используя установленные напряжения Индикатор, ASAP1 (ускорения датчик потенциалы действия 1), в качестве примера. Комплект Tol2 и вездесущие данио рерио промоутер, ubi, были выбраны в этом исследовании. Мы также объяснить процессы шлюза сайта клонирования, Tol2 на основе transposon данио рерио трансгенез и процесс обработки изображений для ранней стадии рыбы эмбрионов и рыбы опухоли с помощью регулярных epifluorescent микроскопы. С помощью этой линии рыб, мы обнаружили, что есть изменения клеточного электрического напряжения во время эмбриогенеза у рыбок данио и движение личинок рыб. Кроме того было отмечено, что в несколько данио рерио злокачественные периферических нервов оболочки опухоли, опухоль, которую клетки были обычно поляризованных по сравнению с окружающих нормальных тканей.
Introduction
Шапкой относится к эндогенной электрической сигнализации при посредничестве ионных каналов и насосы расположены на клеточной мембраны1. Ионный обмен через клеточную мембрану и спаренных электрические потенциальных и текущих изменений, необходимы для сигнализации процессов возбудимых нейронов и мышечных клеток. Кроме того шапкой и градиентов ионов имеют целый ряд других важных биологических функций, включая хранение энергии, биосинтез и метаболит транспорт. Биоэлектрических сигналов был также обнаружен как регулятор формирования эмбриональных шаблон, например осей тела, клеточного цикла и дифференциации клеток1. Таким образом крайне важно для понимания многих врожденных заболеваний человека, которые в результате неправильного регулирования этого типа сигнализации. Хотя фиксации широко используется для записи одной клетки, это еще далеко не идеально подходит для одновременного контроля за несколько ячеек во время эмбрионального развития в естественных условиях. Кроме того чувствительных малые молекулы напряжения также не идеально подходит для приложений в естественных условиях из-за их особенностей, чувствительности и токсичность.
Создание целого ряда генетически кодировке напряжение люминесцентных индикаторов (Гевиш) предлагает новый механизм для преодоления этой проблемы и позволяет легко приложения для изучения эмбрионального развития, даже несмотря на то, что они были первоначально предназначены для мониторинга нейронных клетки2,3. Один из имеющихся в настоящее время Гевиш является ускоренное датчик потенциалы действия 1 (ASAP1)4. Он состоит из внеклеточная петля напряжения зондирования домена напряжения чувствительные фосфатазы и циркулярно перестановкой Зеленый флуоресцирующий белок. Таким образом, ASAP1 позволяет визуализировать сотовых электрическая потенциальных изменений (поляризации: ярко-зеленый цвет; деполяризации: темно-зеленый). ASAP1 имеет 2 мс вкл и Выкл кинетики и можно отслеживать подпорогового потенциальных изменений4. Таким образом этот генетический инструмент позволяет на новый уровень эффективности в биоэлектрические мониторинг в реальном времени в живых клетках. Углублению понимания роли шапкой в эмбриональном развитии и многих заболеваний человека, таких как рак, будет проливают новый свет на основных механизмов, который имеет решающее значение для профилактики и лечения заболеваний.
Данио рерио доказали мощный животных модель для изучения биологии развития и человеческих заболеваний, включая рак5,6. Они разделяют 70% orthologous генов с людьми, и они имеют аналогичные позвоночных биологии7. Данио рерио обеспечивают сравнительно легко ухаживать, большой сцепление размера яйца, шансов справиться с возникающими генетики, легко трансгенез и прозрачные внешние эмбрионального развития, которые делают их улучшенные системы в vivo изображений5,6. С большим источником мутант рыбы линии уже присутствует и полностью виртуализированного генома данио рерио обеспечит относительно неограниченный спектр научных открытий.
Расследовать в естественных условиях в реальном времени электрической активности клеток, мы воспользоваться zebrafish модель системы и ASAP1. В этом документе мы описывают как включить биосенсор флуоресцентные напряжения ASAP1 в геноме данио рерио, с помощью Tol2 transposon трансгенез и визуализировать сотовой электрической активности во время эмбрионального развития, Движение личинок рыбы и в живых опухолевых .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Данио рерио размещаются в объекте животных АААЛЖ одобрил, и все эксперименты были проведены согласно протоколов, одобренных Purdue животное уход и использование Комитета (PACUC).
1. Tol2 Transposon плазмидные конструкции подготовка
Примечание: Tol2, transposon, которая была обнаружена в оризии рыбы, широко использовался в данио рерио исследований сообщества8,9. Он успешно принят к участкам на основе рекомбинации клонирования системы шлюза и известен как Tol2 комплект10. Tol2 комплект обеспечивает более удобный способ создания конструкции пользовательское выражение, а также повышения эффективности трансгенез. Таким образом это было непростое решение воспользоваться этой системы, и создания вездесущие ASAP1 выражение данио рерио линии с использованием проверенных убиквитин промоутер водить ASAP111.
- Создание конструкцию среднего запись ASAP1: pDONR221-ASAP1
- Приобрести генетически закодированный напряжения датчика ASAP1 конструкции, pcDNA3.1/Puro-CAG-ASAP1 (плазмида #52519), от Addgene. Для того чтобы усилить кодирования региона ASAP1, создан ПЦР с помощью заказной грунтовки (attB1-ASAP1F и attB2-ASAP1R) с attB последовательностей в конце 5' праймеров (рис. 1). Phusion ДНК-полимеразы был выбран для его высокой эффективности, и условия PCR были оптимизированы, основанный на ранее опубликованные протокол12.
- Загрузить продукты PCR 50 мкл в 1%, TAE гель с помощью регулярных пипетки с 200 мкл советы и провести электрофорез на 160 V в бак горизонтального гель для около 30 мин.
- Проверить под transilluminator УФ гель (353 Нм), акцизы, нужный диапазон с помощью лезвия/скальпеля под УФ transilluminator как ранее опубликованные13,14и положил содержащие гель образца ДНК в microcentrifuge чистой 1,5 мл трубка.
- Выполните очищение геля для продуктов ПЦР ASAP1. Восстановить ДНК в подакцизным гель с использованием коммерческих ДНК гель очистки комплект инструкций производителя, а элюировать ДНК в 20 мкл воды. Возьмите 1 мкл пример и измерения концентрации ДНК с помощью спектрофотометра. Поток с использованием воды как пустой элемент управления15инструкции программного обеспечения.
- Взять 100 нг очищенный продукт PCR и смешать с 150 нг pDONR221 плазмид в 10 мкл TE буфера (10 мм трис, 1 мм ЭДТА рН 8,0)16. 2 мкл BP Clonase II в реакцию и инкубировать и реакции на ночь при комнатной температуре.
- На второй день 1 мкл протеиназы K в реакцию и инкубировать реакции при 37 ° C за 30 мин.
- Выполните преобразование. Передача реакции и смешайте его с 50 мкл Top10 сведущее Escherichia coli клетки и инкубации клеток на льду за 30 мин. Затем, передачи реакции трубку в ванну воды 42 ° C за 1 мин немедленно снять трубку и инкубировать на льду на 2 мин. Затем положите трубку в шейкере 37 ° C и проинкубируйте 1 ч.
- Вынуть трубку и плиты клетки на тарелку канамицин фунтов. Далее Инкубируйте пластину на ночь (16-18 ч) при температуре 37 ° C.
- Выбрать один и хорошо разделенных колоний и прививать им в 14 мл клетки культуры пробирки с 3 мл среды фунтов. Культура их на ночь при 37 ° C в шейкере со скоростью вращения 250/мин (вращения в минуту).
- Выполняйте с использованием коммерческих алкалический комплекта после его инструкция ручной17алкалический.
- Последовательность 3-4 плазмид с Сэнгер последовательности для выявления положительных pDONR221-ASAP1 клонов, используя M13F и M13R грунты последовательности.
- Создание Tol2 конструкции для микроинъекции: pDestTol2 -ubi-ASAP1
- Выберите последовательность проверки клон pDONR221-ASAP1 и меру его концентрации ДНК с помощью спектрофотометра следующее программное обеспечение инструкции с использованием воды как пустой управления15.
- Взять 100 мкг pDONR221-ASAP1 и смешайте его с 100 мкг Tol2 комплект 5-конец плазмида (pENTR5'_ubi, Addgene #27320), 100 мкг p3E-поля (Tol2 комплект #302) и 150 мкг pDestTol2pA2 (Tol2 комплект #394). Настроить общий объем до 8 мкл с использованием TE буфера (10 мм трис, 1 мм ЭДТА, рН 8.0) в 1,5 мл microcentrifuge трубки и смешайте хорошо краткое вихрь 2-5 s. Затем 2 мкл LR Clonase II плюс, и инкубировать и реакции на ночь при комнатной температуре.
- На второй день 1 мкл протеиназы K в реакцию с помощью пипетки 10 мкл и инкубировать реакции при 37 ° C за 30 мин.
- Выполнить преобразование и выявить позитивные клоны, как описано выше (1.1.7-11 меры).
- Измерение концентрации ДНК последовательности проверки pDestTol2-ubi-ASAP1 клон (рис. 1B) с помощью спектрофотометра15. Обычно концентрация составляет около 200ng/мкл.
2. Подготовка Tol2 Транспозаза мРНК и инъекционного раствора
- Полоска E. coli глицерин запас плазмида pCS2FA-Транспозаза (комплект #396 Tol2) на плиту LB (с 100 мкг/мл ампициллин) с помощью цикла стерилизации прививка. Инкубируйте пластины при 37 ° C в инкубаторе на ночь. На следующий день, выбрать один колонии и прививать его в 3 мл фунтов (ампициллин 100 мкг/мл) с помощью кончика пипетки стерилизовать 10 мкл. Культура на ночь при 37 ° C в шейкере со скоростью вращения 250 об/мин.
- Выполните алкалический культуры E. coli , с использованием коммерческих алкалический комплекта после его Инструкция по эксплуатации. Элюировать ДНК плазмиды в 30-50 мкл буфера TE на 1-ой минуте центрифуги на 14 000 об/мин и измерение его концентрации ДНК с спектрофотометром.
- Линеаризации 1-2 мкг плазмида с я не эндонуклеазы и очистить ДНК с ДНК, после я не его Инструкция по эксплуатации комплекта для чистки пищеварение. Элюировать ДНК в 5 мкл воды центрифугированием на 14 000 об/мин за 1 минуту. Ожидаемые концентрации — о 200-300 нг/мкл.
- Выполнять в vitro транскрипция с не я линеаризованных pCS2FA-Транспозаза как шаблон ДНК с помощью коммерческого SP6 транскрипции Кит.
- По окончании реакции очищайте Tol2 Транспозаза мРНК, с использованием коммерческих Очистка РНК комплект следуя инструкциям производителя. Наконец элюировать мРНК в 20 мкл RNAase свободной воды и измерить РНК концентрации в спектрофотометре. Ожидаемые концентрации идет о 1-3 мкг / мкл. образцы можно хранить в морозильной камере-80 ° C при необходимости.
- Подготовить микроинъекции решение путем смешивания 20 нг/мкл pDestTol2 -ubi-ASAP1 и Tol2 Транспозаза мРНК (100 нг/мкл) в пробки microcentrifuge, закупорить. Для предотвращения деградации нуклеиновых кислот, вызванные неоднократные оттаивания и снега, аликвота 6 мкл в трубку и хранить его в холодильнике-80 ° C для использования в будущем.
3. микроинъекции
- Настройка 4-6 разведения танки с по крайней мере 2 кобеля и 2 суки днем перед инъекцией. Эти рыбы не должны подаваться в послеобеденное время. Этот шаг будет уменьшить количество рыбных отходов и сэкономить время, чтобы очистить их на следующее утро, а также помогает стимулировать разведение ответ.
- Следующим утром, удалить подготовленные инъекционного раствора (pDestTol2 -ubi-ASAP1 конструкцию и Tol2 мРНК) из морозильной камеры-80 ° C и поместите его на льду.
- Вытяните разделителей в рыбоводстве танков и позволяют рыбы к спариванию. В общем рыбы откладывают яйца в течение 20-30 минут после потянув делителя. Если нет, подождите 1-2 часа дольше. Некоторые рыбы могут вообще не откладывают свои яйца. В этом случае повторите этот эксперимент для рыбы эмбриона коллекции.
- Во время ожидания, убедитесь, что есть иглы, подготовленных с наконечником, сломанной углом, создавая скошенный край с щипцами или нарушая на деликатную задачу стеклоочистителя.
- Тяните иглы от капиллярной стекла микропипеткой съемник, используя следующие параметры: тепло 545; Вытяните 60; скорость 80; время 250; давление 500. Сломать иглу с щипцами под областью диссекции (с правителем глаз кусок для оценки диаметра), удерживая щипцы под углом примерно 45 °. Желаемый иглы диаметром может быть переменной, в зависимости от параметра microinjector, но меньшего диаметра является предпочтительным для снижения смертности эмбрионов.
- Как только рыба положили яйца, собрать их в 10 см в диаметре Петри и довести их до области рассечение. Удалите все ненормальные эмбрионов и рыбных отходов.
- Накапайте оплодотворенных эмбрионов в подготовленный 3% агарозном инъекции плесень. Удалите излишки воды, чтобы помочь сохранить эмбрионы на месте.
- После того, как все строки будут заполнены с жизнеспособных эмбрионов, организовать их так, что отдельные ячейки все сталкиваются же сторону иглу, которая находится под углом около 45° по горизонтали. Это облегчит инъекции гораздо позже.
- Надев перчатки, используйте пипетки 20 мкл загрузки отзыв и удаление 5 мкл подготовленные конструкции из трубки на льду.
- Осторожно введите наконечник в задней части сломанной капиллярной трубки вплоть до где он начинает Таппер, чтобы получить как можно ближе к оконечности реагент. Если есть еще пузырьков воздуха, встряхните иглы, убедившись в том, чтобы не нарушать кончик.
- Вставьте иглу прямо в микроинъекции иглодержатель и тщательно затяните до тех пор, пока игла остается на месте. Отрегулируйте угол около 45 °.
- После того, как иглы подготовлен и придает, включите микроскоп и газа давление бака. Коммерческие CO2 танков вообще хороши для этой цели. Объем впрыска регулируется проведение и выброса давление: приблизительно 0.5 psi для проведения и 30 psi для отстрела. Будьте уверены проверить, что решение выходит при нажатии на педаль.
- С помощью микрометра стадии с капелькой минерального масла, регулировать громкость и потока раствора до ~ 150 мкм в диаметре (около 2 nL). Убедитесь, что обратное давление будет пусть небольшое количество капать из иглы. Если не достаточно противодавление, капиллярных действий приведет к жидкости для ввода иглы и уничтожить мРНК.
- После того, как иглы откалиброван, Начните впрыскивать конструкцию в одну ячейку оплодотворенных эмбрионов.
Примечание: Это занимает большой объем практики, терпение и утонченность, благодаря клеточной мембраны, будучи жестких проткнуть. Важно придать решение в клетку, не желток, для создания трансгенных данио рерио. Это отличается от Морфолино инъекций. Не имеет значения, какой стороне игла попадает в камеру, пока конструкция идет в ячейке. Трансгенез будет иметь очень низкий уровень успеха, если вводится в желтке вместо ячейки. Стадии одноклеточных инъекции также имеет важное значение, или соматические Химера рыбы будут создаваться. Это уменьшит вероятность трансген, вдаваясь в зародышевых клеток. - Используйте край гель вырез для обеспечения поддержки, который держит эмбриона на месте и позволяет иглой, чтобы применить давление без перемещения эмбриона. После того, как кончик иглы находится в одной ячейке, нажмите на педаль, чтобы освободить нужное количество раствора. Повторите этот процесс для всех эмбрионов.
- После завершения передачи эмбрионы вводят в обозначенные блюдо, промыв их из агарозы паз рыбы системы водой с одноразовой 3,4 мл передачи пипетки. Хранение эмбрионов в 28,5 ° C инкубатор, чтобы позволить им развивать. Проверить обратно на протяжении дня, удаляя мертвые рыбы эмбрионов и заменить воду с метиленовым синим 0.1% в воде рыбы.
- Около 6-8 часов после инъекции, принять 10 индивидуальные вводят рыба эмбрионов и подготовить геномной ДНК от них с помощью метода отчаянный18.
- Следующим утром, используйте рассечение микроскоп с источником света флуоресцирования разобраться эмбрионов, показаны GFP в тканях не желток. Эти рыбы эмбрионов должна содержать вводят конструкции.
- Выполните Tol2 акцизных пробирного проверить действие transposon, как описано ранее,19. Если подакцизным плазмиды могут быть обнаружены, держать вводят рыбы эмбрионов и поднять их. Если не подакцизным плазмиды могут быть обнаружены, повторите процесс синтеза и микроинъекции мРНК Tol2 до достижения позитивных результатов анализа акцизных Tol2.
4. Создание трансгенных ASAP1 рыбы, Tg (ubi: ASAP1)
- Поднимите вводят рыбы (поколения0 F) к взрослой жизни, как описано ранее в данио рерио книга20. Обычно это занимает около 4 месяцев.
- Возьмите один взрослый F0 рыба и крест с одиночным напротив пола wildtype рыбы. Соберите рыбу эмбрионов после разведения позже в тот же день. Держите собраны рыбы эмбрионов в инкубаторе 28,5 ° C в рыбе воды с 0,1% метиленовым синим.
- На третий день проверьте эмбрионов рыб под микроскопом флуоресцентные диссекции с фильтром GFP. Разобраться рыбу зеленый эмбрионов, если таковые имеются и поднять их до совершеннолетия как F1 поколения трансгенной рыбы, Tg (ubi: ASAP1).
Примечание: Менделевское соотношение не ожидается, так как большинство родителей рыбы0 F зародышевой линии генетических химер. - Крест один1 F взрослых рыб с wildtype рыбой и собирать рыбу эмбрионов. Сортировать рыбу зеленый эмбрионов и поднять их до совершеннолетия как F2 поколения рыб.
Примечание: Зеленый и эмбрионов-зеленый рыбы должно быть близко к 1:1 Если существует один трансген. - Для просмотра электрические потенциальные изменения в опухоли как злокачественные периферических нервов оболочки опухоли (MPNST), крест2 поколения F Tg (ubi: ASAP1) рыба с рыбой rpl35hi258/Вт . Известно, что видимые опухоли начинают быть найдены в 6-8 месяцев старых взрослых21,22.
5. Визуализация
- Для изображения zebrafish эмбриона, взять несколько F2 поколения основателя рыбы и пересекать их с wildtype рыбой в отдельных пар. Соберите рыбу эмбрионов на разных стадиях желаемого развития согласно данио рерио, постановка руководство23.
- На ранних стадиях эмбрионов рыб очистить и удалить chorions эмбрионы, тщательно используя пару щипцы под областью рассечение диаметром 10 см Петри блюдо с рыбой воды системы.
- Передача нескольких эмбрионов рыб на слайд кривыми стекла с 3% метилцеллюлоза, с помощью пипетки одноразовой передачи 3,4 мл. Отрегулируйте эмбрионов в желаемой позиции для просмотра клеточной активности GFP с помощью иглы под областью флуоресцентные рассечение.
- Для движущихся этапов рыбы эмбрионов (старше 12 Сомит стадии), используйте tricaine мезилата 0,05% чтобы анестезировать рыбы эмбрионов до их перевода в слайды. Вкратце рыба эмбрионы были объединены в tricaine мезилата 0,05% в воде рыбы до тех пор, пока они остановились, плавание и потери равновесия тела. Кроме того добавьте каплю tricaine мезилата 0,05% с метилцеллюлоза на слайде.
- Для менее чем 12 Сомит стадии рыбы эмбрионов используйте epi флуоресценции составной микроскоп с совместимые камеры и программное обеспечение для обработки изображений. Для старше 12 Сомит стадии рыбы эмбрионов используйте микроскопом рассечение флуоресценции.
- Для изображения опухолевых клеток напряжения, сначала определить рыба с MPNST опухолями. Затем анестезировать рыба с tricaine мезилата 0,05%. Для отображения всей горе, Положите рыбу в Петри диаметром 10 см. Чтобы просмотреть электрической активности клеток опухоли, рыб опухолей может расчлененный после всей горе изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В успешных инъекции, больше, чем эмбрионы вводят 50% рыбы будет отображать определенную степень зеленый флуоресценции в соматических клетках, и большинство из них будет положительным, Tol2 transposon акцизных пробирного (рис. 2). После 2-4 поколения исходящей крест с wildtype рыбы (до 50%, коэффициент ожидаемой Менделевское) флуоресцентных рыб, трансгенной рыбы были использованы для визуализации эксперимента для отслеживания клеточной мембраны потенциалов во время эмбрионального развития. Во-первых данио рерио ранних эмбриональных стадиях развития на протяжении клеточного цикла были рассмотрены потенциальные изменения мембраны. Было отмечено, что клетки hyperpolarized до формирования борозды расщеплении (Рисунок 3А-3Cи дополнительного видео 1). Кроме того различные ткани показал разнообразные мембранных потенциалов в 1-3 день старые рыбы эмбрионов. (Рис. 3D-3G). К примеру сегменты и хорда обычно hyperpolarized, по сравнению с прилегающих тканей/органов. После данио рерио эмбрионы были в состоянии двигаться, мы также смогли обнаружить нервно электрической деятельности (Рисунок 4, Дополнительные видео 2). Как биоэлектрические свойства раковых клеток могут быть изменены, мы воспользовались этой ASAP1 репортер рыбы и пересекается с rpL35 гена мутант, который подвержен спонтанное злокачественные периферических нервов оболочки опухоли21,24 ,25. Хотя только несколько рыб опухолей были рассмотрены, благодаря давно потенциальных период роста для рыбы опухоли Мутанты, было заметно, что напряжение между существуют различия опухоли и окружающих тканей в прямом опухоли подшипник данио рерио (рис. 5). Таким образом эти представитель результаты продемонстрировали успешные поколение сотовых электрическая репортер рыбы линии, и его возможное применение в области развития и клеточной биологии.
Рисунок 1: Иллюстрация строительства Tol2 на основе transposon плазмиды.
(A) BP рекомбинации был использован для ASAP1 югу клонирования в середине вступления вектор pDONR221. attB последовательности были добавлены к концу 5 Праймеры для ASAP1. (B) схемы для Tol2 на основе transposon построить сборку на основании LR рекомбинации. Фиолетовый овальной формы показывает, что Tol2 Перевернутый повторяется. Пунктирные линии указывают гомологичная рекомбинация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Типичные результаты вводят эмбрионов эпифлуоресцентного и Tol2-акцизов assay.
(A) Non позитивных 1dpf рыбы эмбриона. (B) успешно вводят 1dpf рыбы эмбриона. GFP пятна проявляются в багажнике. (C) Non позитивных 2dpf рыбы эмбриона. (D) успешно вводят 2dpf рыбы эмбриона. GFP пятна проявляются в багажнике. (E) представитель результат пробирного акцизных Tol2. Переулок, 1-7 PCR были усилены от 7 случайно выбранных эмбрионов рыб 8 часов после инъекции. Последний является отрицательный контроль (НК) без каких-либо геномной ДНК. Шкалы бар = 250 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Изменения динамического напряжения во время разработки zebrafish эмбриона.
(A-C) Полярности дифференциальные сотовой напряжения во время митоза в эмбрионов рыб. (A) 2-клеточной стадии zebrafish эмбриона. (B) этап 4-клеток эмбриона. (C) 8-секционная стадии эмбриона. Красная стрелка глав указывают положение борозды расщеплении в панели (A-C). Изменения проявляются также в соответствующих кино (Дополнительные видео 1). Регион вокруг борозды расщеплении является более поляризованной сравнению остальные ячейки. (D-G) Изменения динамического напряжения на различных ранних стадиях zebrafish эмбриона. (D) 12-Сомит этап. (E) 22-Сомит этап. (F) 48 часов пост оплодотворения. (G) 72 часа пост оплодотворения. e, глаз; ht, сердце; NT, Хорда; ОП, везикул оптика; ov, слуховой пузырек; pf, грудной плавник; таким образом, Сомит; yk, желток. Шкалы бар = 250 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Электрическое напряжение изменения тела рыбы во время движения рыбы эмбриона.
2 - день старые рыбы эмбрионов шоу нейро мышечной электрические деятельность во время движения. (A) - (F) последовательных изображений же рыбы эмбриона. Цвет изменения плотности соответствуют электрические сигнальной трансдукции. Интервал времени между двумя последовательными изображения составляет около 12,4 миллисекунд. Красные стрелки указывают на позиции, что напряжения изменилась в период обработки изображений. Изменения проявляются также в соответствующих кино (Дополнительные видео 2). Все панели находятся в тех же масштабах. Шкалы бар = 250 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Опухолевые клетки, как правило, быть более поляризованным.
10 - месячного рыбы (rpL35hi258/Вт; TG (ubi: ASAP1) разработал злокачественные периферических нервов оболочка опухоль в брюшной полости. (A) и (C) яркий поле изображение. (B) и (D) изображение с каналом GFP. (A) и (B) нетронутыми рыбы. (C) и (D) живот опухоли был расчлененный вне. Опухолевые клетки являются более поляризованной (ярче зеленый) по сравнению с окружающих тканей (тёмно-зеленый). Стрел показать опухоли. Все панели находятся в тех же масштабах. Шкалы бар = 25 mm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительные видео 1 . Epifluorescent томография электрической сигнализации этапе расщепления в Tg (ubi: ASAP1) рыба эмбриона. Этот фильм был записан с зрения животных полюса. Флуоресценции ASAP1 связан с образованием клеток расщепления борозды, временная структура во время деления клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительные видео 2 . Epifluorescent томография электрической сигнализации во время 2 - дневных тг (ubi: ASAP1) рыба эмбриона движения. Этот шаг был записан с бокового зрения 2 - дневных эмбрионов рыб после анестезии. ASAP1 флуоресценции изменения очевидны в нервно-мышечной ткани во время процесса перемещения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя клеточные и тканевые деятельности на уровне электрические во время эмбрионального развития и болезней человека были обнаружены долгое время назад, в естественных условиях динамические электрические изменения и их биологической роли по-прежнему во многом неизвестным. Одна из основных задач является для визуализации и количественно электрические изменения. Технология зажима патч прорыв для отслеживания единичных клеток, но его применение к позвоночных эмбрионы ограничено, потому что они состоят из многих клеток. Текущий химических напряжения красители также не являются идеальными из-за их особенностей, специфику и токсичность. Недавние усилия на изобретение Гевиш дают нам новый путь для визуализации клеточных Электрический мероприятий в естественных условиях и в режиме реального времени. Здесь, мы показали процесс создания линии электрических репортер данио рерио, Tg (ubi:ASAP1).
С помощью этой линии репортер рыбы, мы показываем сотовой электрической деятельности, которые могут контролироваться в zebrafish эмбриона. Изменение электрического напряжения очень связано с клеточного цикла во время раннего эмбрионального развития. Мы заметили, что гиперполяризации происходит до формирования расщепления борозду/клеточного деления (рис. 3). Это в отличие от нынешних знаний, деполяризации происходит до деления клеток26. Таким образом более подробно напряжения клеточной мембраны изменяется во время клеточного цикла других клеток животных и человека и ли это связано с ткани контексте, требуют дальнейшего исследования. В настоящее время проводятся соответствующие исследования в нашей лаборатории. Кроме того мы убедились, что ASAP1 способна отслеживать изменения физиологических напряжения в нейронных мышечной системы (Рисунок 4), в котором изменения относительно быстрым по сравнению с изменениями во время циклов клеток.
Было также продемонстрировано, что этот репортер может также использоваться для визуализации данио рерио опухоли (рис. 5). Это было интересно найти опухоль, которую клетки были в целом более поляризованных по сравнению с окружающих нормальных тканей. Однако является ли это общее явление для всех злокачественных тканей требует дальнейшего расследования, из-за ограничения образцы опухоли и опухоли видов рыб в этом исследовании. Будущие исследования по количественной оценке поляризации и напряжения клеточной мембраны на других типах опухолей и человеческих раковых клеток будет информативным для лучшего понимания ее роли во время tumorigenesis.
В этом протоколе мы выбрали повсеместно промоутер водить ASAP1 выражение, чтобы отслеживать все клетки эмбрионов рыб. Ткань или орган конкретных промоутеров может быть другой вариант, если только определенного типа клеток/тканей является предпочтительным. Датчик напряжения ASAP1 является относительно хорошо характеризуется биосенсор, и он состоит из чувствительных домен напряжения море шприц напряжения чувствительные фосфатазы (S3-S4 цикла) и круговой пермутирование GFP (значение по умолчанию — низкая флуоресценции). Было сообщено быть выражено на внешней клеточной мембраны в клетках человека нейрон и мыши мозга ломтиками4,27,28. Яркости датчика определяется преимущественно конформационные позиции S3-S4 цикла и GFP. Быстрое зеленый флуоресценции изменения вряд ли вызванной концентрацией белка, из-за скорости изменения яркости и синтеза белка. Однако трансген, ASAP1, возможно изменили выражение в опухолевых клетках, ввиду характера геномной нестабильности. В дополнение к ASAP1 другие Гевиш, таких как индикаторы напряжения на основе archaerhodopsin (QuasAr1 и QuasAr2), также могут быть хороший дополнительный вариант, так как они используют совершенно другой механизм, и они также имеют высокую чувствительность и скорость 29. Кроме того их выбросов находится в красной цветовой гамме. Это делает их особенно бесплатный зеленый ASAP1, если уже существует другой флуоресцентных белков в той же ячейке. К примеру ASAP1 и Квазар может сочетаться с Fucci данио рерио30 для изучения взаимосвязи между клеточного цикла и электрические потенциальных изменений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Научно-исследовательская работа в этой публикации было поддержано, Национальный институт Генеральной медицинских наук национальных институтов здоровья под награду номер R35GM124913, PI4D университет Purdue программы стимулирования и PVM внутренней конкуренции Программа фондов фундаментальных исследований. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения финансирования агентов. Мы благодарим Коити Kawakami для Tol2 конструкции, Майкл Лин для ASAP1 конструкции, и Леонард Zon для ubi промоутер построить через Addgene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14mL cell culture tubes | VWR | 60818-725 | E.Coli culture |
| Agarose electrophoresis tank | Thermo Scientific | Owl B2 | DNA eletrophoresis |
| Agarose RA | Amresco | N605-500G | For making the injection gels |
| Attb1-ASAP1-F primer | IDT DNA | GGGGACAAGTTTGTACAAAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA |
ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Attb2-ASAP1-R primer | IDT DNA | GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA |
ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Bright field dissection scope | Nikon | SMZ 745 | Dechorionation, microinjection, mounting |
| Color camera | Zeiss | AxioCam MRc | Fish embryo image recording |
| Concave slide | VWR | 48336-001 | For holding fish embryos during imaging process |
| Disposable transfer pipette 3.4 ml | Thermo Scientific | 13-711-9AM | Fish embryos and water transfer |
| Endonuclease enzyme, Not I | NEB | R0189L | For linearizing plasmid DNA |
| Epifuorescent compound scope | Zeiss | Axio Imager.A2 | Fish embryo imaging |
| Epifuorescent stereo dissection scope | Zeiss | Stereo Discovery.V12 | Fish embryo imaging |
| Fluorescent light source | Lumen dynamics | X-cite seris 120 | Light source for fluorescence microscopes |
| Forceps #5 | WPI | 500342 | Dechorionation and needle breaking |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Scientific | 11789020 | Gateway BP recombination cloning |
| Gateway LR Clonase II Plus enzyme | Thermo Scientific | 12538120 | Gateway LR recombination cloning |
| Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | DNA gel purification |
| Loading tip | Eppendorf | 930001007 | For loading injection solution into capilary needles |
| Methylcellulose (1600cPs) | Alfa Aesar | 43146 | Fish embryo mounting |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection |
| Microinjector | WPI | Pneumatic Picopump PV820 | Microinjection injector |
| Micro-manipulator | WPI | Microinjector MM3301R | Microinjection operation |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | For preparing capillary needle |
| Mineral oil | Amresco | J217-500ml | For calibrating injection volume |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Thermo Scientific | AM1340 | mRNA in vitro transcription |
| Monocolor camera | Zeiss | AxioCam MRm | Fish embryo image recording |
| Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4020 | Prepare small amount of plasmid DNA |
| Plastic Petri dishes | VWR | 25384-088 | For holding fish or fish embryos during imaging process |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | mRNA cleaning after in vitro transcription |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | For measuring DNA and RNA concentrations |
| Stage Micrometer | Am Scope | MR100 | Microinjection volume calibration |
| Thermocycler | Bio-Rad | T100 | DNA amplification for gene cloning |
| Thin wall glass capillaries | WPI | TW100F-4 | Raw glass for making cappilary needle |
| Tol2-exL1 primer | IDT DNA | GCACAACACCAGAAATGCCCTC | Tol2 excise assay |
| Tol2-exR primer | IDT DNA | ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG | Tol2 excise assay |
| TOP10 Chemically Competent E. coli | Thermo Scientific | C404006 | Used for transformation during gene cloning |
| Tricaine mesylate | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing fish or fish embryos |
| UV trans-illuminator 302nm | UVP | M-20V | DNA visualization |
| Water bath | Thermo Scientific | 2853 | For transformation process of gene cloning |
References
- Levin, M. Molecular bioelectricity: how endogenous voltage potentials control cell behavior and instruct pattern regulation in vivo. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3835-3850 (2014).
- Storace, D., et al. Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential. Trends in Neuroscience. 39 (5), 277-289 (2016).
- Inagaki, S., Nagai, T. Current progress in genetically encoded voltage indicators for neural activity recording. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 95-100 (2016).
- St-Pierre, F., et al. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nature Neuroscience. 17 (6), 884-889 (2014).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. , (2013).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science USA. 105 (50), 19827-19832 (2008).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Mosimann, C., et al. Ubiquitous transgene expression and Cre-based recombination driven by the ubiquitin promoter in zebrafish. Development. 138 (1), 169-177 (2011).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Ordovas, J. M. Separation of small-size DNA fragments using agarose gel electrophoresis. Methods in Molecular Biology. 110, 35-42 (1998).
- Downey, N. Extraction of DNA from agarose gels. Methods Mol Biol. 235, 137-139 (2003).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. 45 (45), (2010).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610, 612, 614 (2007).
- Kawakami, K., Koga, A., Hori, H., Shima, A. Excision of the tol2 transposable element of the medaka fish, Oryzias latipes, in zebrafish, Danio rerio. Gene. 225 (1-2), 17-22 (1998).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, Univ. of Oregon Press. (2000).
- Amsterdam, A., et al. Many ribosomal protein genes are cancer genes in zebrafish. PLoS Biology. 2 (5), E139 (2004).
- Lai, K., et al. Many ribosomal protein mutations are associated with growth impairment and tumor predisposition in zebrafish. Developmental Dynamics. 238 (1), 76-85 (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Zhang, G., et al. Comparative oncogenomic analysis of copy number alterations in human and zebrafish tumors enables cancer driver discovery. PLoS Genetics. 9 (8), e1003734 (2013).
- Zhang, G., et al. Highly aneuploid zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors have genetic alterations similar to human cancers. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107 (39), 16940-16945 (2010).
- Urrego, D., Tomczak, A. P., Zahed, F., Stuhmer, W., Pardo, L. A. Potassium channels in cell cycle and cell proliferation. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B. 369 (1638), 20130094 (2014).
- Yang, H. H., et al. Subcellular Imaging of Voltage and Calcium Signals Reveals Neural Processing In Vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
- Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 106 (49), 20812-20817 (2009).
