Summary
Aquí, mostramos el proceso de crear una línea de pez cebra de reportero de tensión eléctrica celular para visualizar el desarrollo embrionario, movimiento, y las células de tumor de peces en vivo.
Abstract
Bioelectricidad, señalización eléctrica endógena mediada por canales iónicos y bombas situadas en la membrana celular, juega un papel importante en la señalización de los procesos de las células neuronales y musculares excitables y muchos otros procesos biológicos, tales como embrionarias patrones del desarrollo. Sin embargo, es necesario para en vivo monitoreo de la actividad eléctrica en la embriogénesis vertebrados. Los avances de los indicadores de voltaje fluorescente genéticamente codificados (GEVIs) han hecho posible dar una solución para este desafío. Aquí, describimos cómo crear un indicador de voltaje transgénicos pez cebra utilizando el indicador de tensión establecido, ASAP1 (acelerado Sensor de potenciales de acción 1), por ejemplo. El kit de Tol2 y un promotor de pez cebra ubicuo, ubi, fueron escogidos en este estudio. También explicamos los procesos de clonación de puerta de enlace específica, Tol2 pez cebra basada en transposon transgénesis y el proceso de proyección de imagen de incipiente peces peces y embriones los tumores utilizando microscopios regulares epifluorescente. Usando esta línea de peces, encontramos que hay cambios de voltaje eléctrico celular durante la embriogénesis de pez cebra y movimiento de larvas de peces. Además, se observó que en unos tumores de la vaina del nervio periférico maligno de pez cebra, el tumor de células generalmente fueron polarizadas en comparación con los tejidos normales circundantes.
Introduction
Bioelectricidad se refiere a señalización eléctrica endógena mediada por canales iónicos y bombas situadas en la membrana de la célula1. Intercambio iónico a través de la membrana celular y el acoplado cambios actuales y potenciales eléctricos, es esencial para la señalización de los procesos de las células neuronales y musculares excitables. Además, la bioelectricidad y los gradientes de iones tienen una variedad de otras funciones biológicas importantes como almacenamiento de energía, biosíntesis y transporte de metabolitos. Señalización bioeléctrica también fue descubierto como un regulador de la formación embrionaria, como ejes del cuerpo, el ciclo celular y diferenciación de células1. Por lo tanto, es fundamental para la comprensión de muchas enfermedades congénitas humanas que resultan de la mala regulación de este tipo de señalización. Aunque abrazadera del remiendo ha sido ampliamente utilizada para la grabación de las células, está todavía lejos de ser ideal para el control simultáneo de múltiples células durante el desarrollo embrionario en vivo. Además, moléculas pequeñas sensibles de tensión no son también ideales para aplicaciones en vivo debido a su toxicidad, especificidades y sensibilidades.
La creación de una variedad de genéticamente codificado voltaje fluorescente indicadores (GEVIs) ofrece un nuevo mecanismo para resolver este problema y permite la fácil aplicación para el estudio de desarrollo embrionario, a pesar de que originalmente estaban destinados para el control neural células de2,3. Uno de los GEVIs actualmente disponibles es el Sensor acelerado de potenciales de acción 1 (ASAP1)4. Se compone de un lazo extracelular de un dominio de detección de tensión de voltaje sensibles fosfatasa y una proteína fluorescente verde permutada circularmente. Por lo tanto, ASAP1 permite la visualización de los cambios de potencial eléctricos celulares (polarización: verde brillante, despolarización: verde oscuro). ASAP1 tiene 2 ms on y off cinética y puede realizar un seguimiento de cambio potencial subliminal4. Así, esta herramienta genética permite un nuevo nivel de eficacia en bioeléctrica de la supervisión en tiempo real en células vivas. Mayor comprensión de los roles de la bioelectricidad en muchas enfermedades humanas, como el cáncer y el desarrollo embrionario se arroja nueva luz sobre los mecanismos subyacentes, que es fundamental para la prevención y tratamiento de la enfermedad.
Pez cebra se ha demostrado un potente modelo animal para estudiar la biología del desarrollo y enfermedades humanas incluyendo cáncer5,6. Comparten el 70% orthologous genes con los seres humanos, y tienen Biología vertebrado similar7. Pez cebra proporcionan cuidado relativamente fácil, un tamaño grande de huevos, manejable genética, transgénesis fácil y desarrollo embrionario externo transparente, que las hacen un sistema superior en vivo imagen5,6. Con una fuente grande de líneas de peces mutantes ya presentes y un genoma completamente secuenciado, pez cebra ofrecerá una gama relativamente ilimitada de los descubrimientos científicos.
Para investigar la en vivo en tiempo real actividad eléctrica de las células, aprovechamos el sistema de modelo de pez cebra y ASAP1. En este papel, describimos cómo incorporar el biosensor fluorescente tensión ASAP1 en el genoma del pez cebra con Tol2 transposon transgénesis y visualizar actividad eléctrica celular durante el desarrollo embrionario, larval de peces movimiento y el tumor vivo .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
El pez cebra se encuentran en un centro de animales aprobados por AAALAC, y todos los experimentos se llevaron a cabo según los protocolos aprobados por el cuidado de animales de Purdue y uso Comité (PACUC).
1. Tol2 Transposon plásmido construcción preparación
Nota: Tol2, un transposón que fue descubierto en los peces medaka, ha sido ampliamente utilizado en el pez cebra investigación comunidad8,9. Ha sido con éxito adoptado al puerta de enlace específica basada en la recombinación sistema de clonación y conocido como el kit de Tol210. El kit de Tol2 permite de una manera más conveniente de crear construcciones modificadas para requisitos particulares de expresión, aumentando también la eficiencia de la transgénesis. Así, fue una decisión fácil de tomar ventaja de este sistema y crear una línea de pez cebra de expresión de ASAP1 ubicua utilizando un promotor ubiquitina de validado a ASAP111.
- Crear una entrada medio ASAP1 construcción: pDONR221-ASAP1
- Adquirir el concepto de sensor ASAP1 voltaje genéticamente codificado, pcDNA3.1/Puro-CAG-ASAP1 (plásmido #52519), de Addgene. Para amplificar la región de la codificación de ASAP1, configurar una PCR utilizando los cebadores modificado para requisitos particulares (attB1-ASAP1F y attB2-ASAP1R) flanqueados por secuencias attB en el extremo 5' de los cebadores (figura 1). Polimerasa de la DNA de Phusion fue elegida por su alta eficiencia y las condiciones PCR fueron optimizadas basados en el protocolo previamente publicados12.
- Cargar los productos de PCR de 50 μL en un 1% TAE de gel utilizando una pipeta regular con puntas μl 200 y realizar la electroforesis a 160 V en un tanque horizontal gel durante unos 30 minutos.
- Compruebe el gel en un transiluminador UV (353 nm), impuesto especial a la banda deseada con un cuchilla/bisturí bajo un transiluminador UV previamente publicados13,14y puso la muestra de ADN que contienen gel en una microcentrífuga de 1.5 mL limpia tubo.
- Realizar la purificación del gel para los productos de PCR ASAP1. Recuperar el ADN en el gel suprimido usando un kit de purificación de gel de ADN comercial siguiendo las instrucciones del fabricante y eluir el ADN en 20 μl de agua. Toma 1 μl como una muestra y medir la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro. Flujo de las instrucciones de software usando agua como blanco control15.
- Tome 100 ng de purificado producto de PCR y se mezcla con 150 ng de plásmido pDONR221 en 10 μl de TE (10 mM Tris, pH de EDTA 1 mM 8.0)16del almacenador intermediario. Añadir 2 μl de BP Clonase II en la reacción e incubar la reacción a temperatura ambiente durante la noche.
- En el segundo día, añadir 1 μl de proteinasa K en la reacción e incubar la reacción a 37 ° C durante 30 minutos.
- Realizar la transformación. Transferencia de la reacción y mezclar con 50 μl de Top10 competentes de e. coli las células e incubar las células en hielo durante 30 minutos. Luego, cambiar el tubo de reacción en un baño de agua de 42 ° C durante 1 minuto, inmediatamente retire el tubo e incubar en hielo durante 2 minutos. A continuación, poner el tubo en una coctelera de 37 ° C e incubar durante 1 h.
- Sacar el tubo y la placa de las células en una placa de LB de la kanamicina. A continuación, incubar la placa durante la noche (16-18 h) a 37 ° C.
- Seleccionar colonias individuales y bien separadas y sembrar en tubos de cultivo celular de 14 mL con 3 mL de medio LB. Cultura les durante la noche a 37 ° C en un agitador con una velocidad de rotación de 250 rpm (rotación por minuto).
- Realizar utilizando un kit comercial miniprep siguiendo su manual de instrucción17de miniprep.
- Secuencia 3-4 plásmidos con Sanger secuenciación para identificar positiva pDONR221-ASAP1 reproduce con primers de secuencia M13F y M13R.
- Creación de la construcción de Tol2 para microinyección: pDestTol2 -ubi-ASAP1
- Elegir que la secuencia medida verificada pDONR221 ASAP1 clon su concentración de ADN utilizando un siguiente espectrofotómetro la instrucción de software usando el agua como un espacio en blanco de control15.
- Tomar 100 μg de pDONR221-ASAP1 y se mezcla con 100 μg de plásmido de Tol2 kit 5-final (pENTR5'_ubi, Addgene #27320), 100 μg de p3E-polyA (Tol2 kit #302) y 150 μg de pDestTol2pA2 (Tol2 kit #394). Ajustar el volumen total a 8 μl utilizando tampón TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) en una microcentrífuga de 1.5 mL tubo y mezcle bien por un vórtice breve de 2-5 s. Luego, añadir 2 μl de LR Clonase II plus e incubar la reacción a temperatura ambiente durante la noche.
- En el segundo día, añadir 1 μl de proteinasa K en la reacción con una pipeta μl 10 e incubar la reacción a 37 ° C durante 30 minutos.
- Realizar transformación e identificar clones positivos como se describió anteriormente (medidas 1.1.7-11).
- Medida de la concentración de DNA de secuencia había verificada clon pDestTol2-ubi-ASAP1 (figura 1B) utilizando un espectrofotómetro15. La concentración es generalmente alrededor de 200ng/μl.
2. preparar Tol2 transposasa mRNA y solución inyectable
- Raya e. coli glicerol stock de plásmido pCS2FA transposasa (Tol2 kit #396) sobre una placa de LB (con ampicilina 100 en μg/mL) usando un asa de inoculación esterilizada. Incubar la placa a 37 ° C en una incubadora durante una noche. Al día siguiente, elige una sola Colonia e inocular él en 3 mL de LB (ampicilina 100 μg/mL) utilizando una pipeta esterilizada de 10 μl. Cultura de la noche a 37 ° C en un agitador con una velocidad de rotación de 250 rpm.
- Realizar miniprep en la cultura de e. coli utilizando un kit comercial miniprep siguiendo su manual de instrucciones. Eluir el ADN plásmido en 30-50 μl de tampón TE por 1 minuto centrifugar a 14.000 rpm y medir su concentración de ADN con un espectrofotómetro.
- Alinear 1-2 μg de plásmido no i endonucleasa y purificar el ADN con ADN kit no me después con su manual de instrucciones de limpieza la digestión. Eluir el ADN en 5 μl de agua por centrifugación a 14.000 rpm durante 1 minuto. La concentración esperada es de 200-300 ng/μl.
- Realizar la transcripción en vitro con no linealizado transposasa pCS2FA como una plantilla de ADN utilizando un kit comercial de transcripción SP6.
- Una vez terminada la reacción, purificar Tol2 transposasa mRNA usando una limpieza de RNA comercial kit siguiendo las instrucciones del fabricante. Finalmente, procederá a la elución mRNA en 20 μl de agua libre de ARNasa y medir la concentración de RNA en un espectrofotómetro. La concentración esperada es de 1-3 μg / μl. las muestras se pueden almacenar en un congelador de-80 ° C si es necesario.
- Preparar la solución de microinyección mezclando 20 ng/μl pDestTol2 -ubi-ASAP1 y Tol2 transposasa mRNA (100 ng/μL) en un tubo de microcentrífuga mediante pipeteo. Para evitar la degradación de ácidos nucleicos por descongelación repetida y recongelamiento, alícuotas 6 μl por tubo y guardarlo en un congelador de-80 ° C para su uso futuro.
3. microinyección
- Set 4-6 tanques de cría con al menos 2 machos y 2 hembras la tarde antes de la inyección. Estos peces no deben ser alimentados por la tarde. Este paso será reducir la cantidad de residuos de pescado y ahorrar tiempo a limpiar por la mañana, mientras que también ayuda a inducir una respuesta de mejoramiento.
- A la mañana siguiente, retire la solución de la inyección preparada (pDestTol2 -ubi-ASAP1 construir y mRNA de Tol2) del congelador de-80 ° C y coloque en hielo.
- Tire los divisores en el pescado tanques de cría y permitir a los peces para aparearse. En general, peces ponen huevos a 20-30 minutos después de sacar el divisor. Si no, espere 1-2 horas más. Algunos peces en absoluto no pueden poner huevos. En este caso, repite este experimento para colección de embriones de peces.
- Mientras espera, asegúrese de que hay agujas con la punta rota en un ángulo que crea un borde biselado con fórceps, o rompiendo en un limpiador de tarea delicada.
- Tire las agujas de vidrio capilar en un extractor de micropipeta utilizando los siguientes parámetros: calor 545; Tire de 60; velocidad 80; tiempo 250; presión de 500. Romper la aguja con pinzas por debajo de un alcance de disección (con ocular de regla para la estimación del diámetro) manteniendo el fórceps en un ángulo de aproximadamente 45 °. Diámetros de deseada de la aguja pueden ser variable dependiendo de la configuración microinyector, pero menor diámetro es preferible para reducir la mortalidad del embrión.
- Una vez que los peces han puesto huevos, recoger en un diámetro de 10 cm plato de Petri y llevarlos al alcance de la disección. Quitar todos los embriones anormales y desechos de pescado.
- Pipeta de molde los embriones fertilizados en la inyección de preparados de agarosa al 3%. Eliminar el exceso de agua para ayudar a mantener los embriones en el lugar.
- Una vez que todas las filas están llenas de embriones viables, disponerlos de modo que las células todas hacia la misma dirección hacia la aguja, que es aproximadamente un ángulo de 45° horizontal. Esto facilitará la inyección mucho más tarde.
- Usando guantes, utilizar una pipeta de carga μl 20 punta y 5 μl de la construcción dispuesta retirar el tubo en hielo.
- Inserte cuidadosamente la punta en el extremo posterior del tubo capilar roto hasta donde comienza a tapper, para obtener el reactivo tan cerca de la punta. Si quedan burbujas de aire, agitar la aguja, asegurándose de no romper la punta.
- Inserte la aguja en el portaagujas de microinyección y apriete con cuidado hasta que la aguja permanece en su lugar. Ajuste el ángulo de 45 °.
- Una vez que la aguja está preparada y conectada, encienda el microscopio y gas tanque de presión. Comercial CO2 tanques son generalmente buenos para este propósito. El volumen de inyección se ajusta por la presión de sujeción y eyección: aproximadamente 0,5 psi para la tenencia y 30 psi para expulsión. Asegúrese de comprobar que la solución se sale cuando se presiona el pedal.
- Usando un micrómetro con una gota de aceite mineral, ajustar el volumen y el flujo de la solución de ~ 150 μm de diámetro (aprox. 2 nL). Asegúrese de que la contrapresión dejó una pequeña cantidad gotear de la aguja. Si no hay suficiente presión, acción capilar produce un líquido entrar en la aguja y destruir el mRNA.
- Una vez que se calibra la aguja, comenzar a inyectar la construcción dentro de la célula de los embriones fecundados.
Nota: Esto tiene una gran cantidad de práctica, paciencia y delicadeza, debido a la membrana de la célula es difícil de perforar. Es importante inyectar la solución en la celda, no la yema, para la generación de pez cebra transgénico. Esto es diferente de la inyección de morfolino. No importa qué lado la aguja entra en la célula, siempre y cuando la construcción va en la celda. La transgénesis tendrá una muy baja tasa de éxito si se inyecta en la yema de huevo en lugar de la célula. Inyección fase unicelular también es importante, o pez quimera somática se creará. Esto reducirá la posibilidad de que el transgén entrar a las células de germen. - Utilice el borde de la ranura de gel para proporcionar un soporte que mantiene al embrión en su lugar y permite que la aguja aplicando presión sin mover el embrión. Una vez que la punta de la aguja está en la célula, presione el pedal para liberar la cantidad deseada de solución. Repita este proceso para todos los embriones.
- Terminada, transferir los embriones inyectados en una placa etiqueta de enjuague de la muesca de la agarosa con agua de sistema de pescado y una pipeta de transferencia desechable mL 3,4. Almacenar los embriones en una incubadora de 28,5 ° C, que les permita desarrollar. Compruebe detrás durante todo el día eliminando embriones de peces muertos y reemplazar agua con azul de metileno 0.1% en agua de pescado.
- Alrededor de 6-8 horas después de la inyección, tome 10 inyectado embriones de peces y preparar la DNA de genomic de ellos usando el método de Hotshot18.
- A la mañana siguiente, usar un microscopio de disección con una fuente de luz de fluorescencia para clasificar los embriones que GFP en los tejidos de la yema no. Estos embriones de peces deben contener la construcción inyectada.
- Realizar el ensayo de Tol2 impuestos especiales para comprobar la actividad del transposon como se describió anteriormente19. Si suprimido plásmido puede ser detectada, mantener la inyección embriones de peces y criarlos. Si no suprimido plásmido puede ser detectada, repita el proceso de síntesis y microinyección de Tol2 mRNA hasta lograr los resultados positivos del ensayo Tol2 impuestos especiales.
4. establecer peces transgénicos ASAP1, Tg (ubi: ASAP1)
- Levantar los peces inyectados (generación de F0 ) a la edad adulta como se describió anteriormente en el pez cebra libro20. Esto generalmente toma alrededor de 4 meses.
- Tomar un solo adultos F0 peces y cruzarlo con un sencillo frente a peces de tipo salvaje del género. Recolectar embriones de peces después de criar durante el día. Mantener los embriones de peces recogidos en la incubadora de 28,5 ° C en los peces del agua con azul de metileno 0,1%.
- En el tercer día, revise los embriones de peces por debajo de un microscopio de disección fluorescente con un filtro GFP. Clasificar embriones de peces verdes, si hay alguna y elevarlas a la edad adulta como peces transgénicos generación de F1 , Tg (ubi: ASAP1).
Nota: Proporción mendeliana no se espera ya que la mayoría de los padres F0 peces es quimeras genética de línea germinal. - Cruz sola F1 adultos peces con peces tipo salvaje y recolectar embriones de peces. Clasificar los embriones verde peces y criarlos hasta la edad adulta como de los pescados generación F2 .
Nota: Verde y no verde peces embriones debe cerca de 1:1 si hay un solo transgen. - Para ver los cambios de potencial eléctricos en tumor como tumores de la vaina del maligno del nervio periférico (MPNST), cruzar la generación de2 F Tg (ubi: ASAP1) pescado con pescado rpl35hi258/wt . Es conocido que los tumores visibles comienzan a encontrarse en el 6-8 meses adultos21,22.
5. la proyección de imagen
- Imagen de embriones de pez cebra, tomar a múltiples fundador de generación de2 F pescados y cruzarlos con los pescados de tipo salvaje en pares individuales. Recoger peces embriones en diferentes etapas de desarrollo deseadas según el pez cebra escenificando guía23.
- Para las primeras etapas de embriones de peces, pelar y quitar chorions de los embriones cuidadosamente con un par de fórceps bajo una disección en un diámetro de 10 cm placa de Petri con agua de sistema de pescado.
- Transferencia de unos embriones de peces en un portaobjetos de vidrio cóncava con 3% de metilcelulosa con una pipeta de transferencia desechable 3,4 mL. Ajustar los embriones a la posición deseada para ver la actividad celular de la GFP utilizando una aguja por debajo de un alcance de disección fluorescente.
- Para las etapas móviles de embriones de peces (más de la 12 etapa del somite), uso de mesilato de metanosulfonato de 0.05% para anestesiar los embriones de peces antes de transferirlas a las diapositivas. Brevemente, embriones de peces fueron emergió en mesilato de metanosulfonato de 0.05% en agua de pescado hasta que dejaron de natación y equilibrio del cuerpo de la pérdida. También, agregar una gota de mesilato de metanosulfonato de 0,05% con la metilcelulosa en la diapositiva.
- Menos de 12 embriones del pescado de la etapa del somite, usar un microscopio de epi-fluorescencia compuesto con una cámara compatible y un software para la proyección de imagen. Para mayores de 12 embriones en fase de somite pescado, usar un microscopio de disección de fluorescencia.
- Voltaje de la célula de tumor de la imagen, primero identificar los peces con tumores MPNST. Entonces, anestesiar el pez con mesilato de metanosulfonato de 0.05%. Para el montaje de toda la proyección de imagen, poner el pescado en un diámetro de 10 cm plato de Petri. Para ver la actividad eléctrica de la célula tumoral, tumores de pescado pueden diseca después Monte toda la proyección de imagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En una inyección exitosa, más que embriones de pescado 50% inyectado mostrará cierta fluorescencia verde en las células somáticas, y la mayoría de ellos será positiva por análisis de impuestos sobre el consumo de transposon de Tol2 (figura 2). Después de 2-4 generaciones de hacia fuera-Cruz con peces de tipo salvaje (hasta que los peces fluorescentes alcanzan 50%, la proporción mendeliana esperada), los peces transgénicos se utilizaron para el experimento de la proyección de imagen para realizar un seguimiento de los potenciales de membrana de la célula durante el desarrollo embrionario. En primer lugar, examinaron a cambios potenciales de la membrana a lo largo del ciclo celular durante las primeras etapas del desarrollo embrionario pez cebra. Se observó que las células hyperpolarized antes de la formación de surco de la hendidura (Figura 3A-3Cy complementario 1 de Video). Por otra parte, diferentes tejidos demostraron una variedad de potenciales de membrana en 1-3 días viejos embriones de peces. (Figura 3D-3G). Por ejemplo, los somitas y la notocorda son generalmente hyperpolarized, en comparación con los tejidos/órganos adyacentes. Una vez que los embriones de pez cebra son capaces de moverse, también fuimos capaces de detectar las actividades eléctricas neuromusculares (figura 4, 2 de Video suplementaria). Como propiedades bioeléctricas de las células cancerosas podrían verse alterados, aprovechó este reportero ASAP1 peces y cruzado con un mutante de gen rpL35 , que es propenso a la espontánea nervio periférico maligno de vaina tumores21,24 ,25. Aunque sólo unos pocos tumores de pescado fueron examinados, debido al período largo potencial de crecimiento para el mutante de tumor de pescado, era notorio que había diferencias de voltaje entre tumores y tejidos circundantes en el pez cebra vivo con tumores (figura 5). Así, estos resultados representativos demostraron la exitosa generación de una línea de peces celular reportero eléctrico y su potencial aplicación a la biología celular y del desarrollo.
Figura 1: Ilustración de la construcción de la base de transposon plásmido de Tol2.
(A) recombinación de BP fue utilizado para el ASAP1 el clonado en el vector de entrada medio pDONR221. secuencias attB agregaron a 5-final de los iniciadores para ASAP1. (B) diagrama de Tol2 transposon-basado construcción de montaje basados en la recombinación de LR. Forma oval color púrpura muestra Tol2 invertido repite. Las líneas discontinuas indican recombinación homóloga. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados típicos de los embriones inyectados por epifluorescencia y ensayo de Tol2-impuestos.
Embrión de pez (A) no-positivo 1dpf. (B) inyectar con éxito embriones de peces 1dpf. GFP son evidentes en el tronco. Embrión de pez (C) no-positivo 2dpf. (D) inyectado con éxito embriones de peces 2dpf. GFP son evidentes en el tronco. (E) un resultado representativo de Tol2 ensayo de impuestos especiales. Carril 1-7 PCR fueron amplificados al azar de 7 selecciona embriones de peces 8 horas después de la inyección. El último es un control negativo (NC) sin cualquier DNA genomic. Barra de escala = 250 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Tensión dinámica cambia durante el desarrollo del embrión de pez cebra.
(A-C) Polaridad de diferencial de voltaje celular durante la mitosis en los embriones de peces. (A) embrión de pez cebra de etapa 2-células. (B) embrión de 4 células etapa. (C) embriones de etapa de 8 células. Las cabezas de la flecha roja indican la posición de los surcos de escote en los paneles (A-C). Los cambios también son evidentes en la película correspondiente (1 vídeo complementario). La región alrededor del surco de la hendidura es más polarizada en comparación con el resto de la célula. (D-G) Cambios de tensión eléctrica dinámica en las diferentes etapas tempranas de los embriones de pez cebra. (D) etapa de 12-somite. (E) etapa de 22 somite. (F) 48 horas post fecundación. (G) 72 horas post fecundación. e, ojo; ht, corazón; NT, notocordio; op, vesícula óptica; ov, vesícula ótica; pf, la aleta pectoral; así, el somite; yk, yema de huevo. Barra de escala = 250 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cambios de tensión eléctrica del cuerpo de los pescados durante el movimiento de embriones de peces.
2 - viejo pescado embriones Mostrar neuro-muscular eléctrica las actividades durante el movimiento. (A) - (F) imagen secuencial del mismo embrión de pez. Cambios de densidad del color se corresponden a la transducción señal eléctrica. El intervalo de tiempo entre dos imágenes consecutivas es de aproximadamente 12,4 milisegundos. Las flechas rojas indican las posiciones que el voltaje cambió durante el período de proyección de imagen. Los cambios también son evidentes en la película correspondiente (2 Video complementario). Todos los paneles están en la misma escala. Barra de escala = 250 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Las células tumorales tienden a estar más polarizadas.
Un pez 10 - meses de edad (rpL35hi258/wt; TG (ubi: ASAP1) desarrolló un tumor de vaina de nervio periférico maligno en el abdomen. Imagen de campo (A) y (C) brillante. (B) y (D) imagen con canal GFP. (A) y (B) peces intactos. (C) y (D) Abdomen tumor se diseca. Las células tumorales son más polarizada (más verde) en comparación con los tejidos (verde oscuro) circundantes. Cabezas de flecha indican los tumores. Todos los paneles están en la misma escala. Barra de escala = 25 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video complementario 1 . Proyección de imagen de epifluorescente de señalización eléctrica durante etapas de escote en Tg (ubi: ASAP1) embrión de pez. Esta pelicula fue grabada desde la vista del polo animal. La fluorescencia de ASAP1 se asocia con la formación del surco de división celular, una estructura temporal durante la división celular. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Video complementario 2 . Proyección de imagen de epifluorescente de señalización eléctrica durante 2 días de edad Tg (ubi: ASAP1) movimiento de embriones de peces. El movimiento se registró desde la vista lateral del embrión de pez 2 días de edad después de la anestesia. ASAP1 la fluorescencia alteraciones son evidentes en el tejido neuromuscular durante el proceso de movimiento. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aunque las actividades eléctricas nivel celular y tejidos durante el desarrollo embrionario y la enfermedad humana fueron descubiertas hace mucho tiempo, los en vivo eléctrica cambios dinámicos y sus papeles biológicos siguen siendo en gran parte desconocidos. Uno de los mayores retos es visualizar y cuantificar los cambios eléctricos. Tecnología de abrazadera del remiendo es una brecha para el seguimiento de las células, pero su aplicación en embriones vertebrados es limitada porque se componen de muchas células. Los tintes químicos voltaje actual también no son ideales debido a sus sensibilidades, especificidades y toxicidades. Los recientes esfuerzos en la invención de los GEVIs nos proporcionan un nuevo camino para visualizar las actividades eléctrica celular en vivo y en tiempo real. Aquí, mostramos el proceso de creación de una línea eléctrica reportero de pez cebra, Tg (ubi:ASAP1).
Con esta línea de peces de reportero, mostramos actividades eléctricas celulares que pueden ser monitoreadas en embriones de pez cebra. El cambio de voltaje eléctrico está altamente relacionado con el ciclo celular durante el desarrollo embrionario temprano. Hemos observado que hiperpolarización ocurre antes de la formación de la división de surco/célula de escote (figura 3). Esto está en contraste con el conocimiento actual que despolarización ocurre antes de la división celular26. Así, más detalles del voltaje de la membrana de la célula cambia durante el ciclo celular de otras células animales y humanas y si esto se relaciona con contexto de tejido, requieren más estudios. Estudios relacionados están actualmente en marcha en nuestro laboratorio. Por otra parte, hemos verificado que ASAP1 es capaz de seguir los cambios fisiológicos de la tensión en el sistema neural muscular (figura 4), en el que la alteración es relativamente rápida en comparación con los cambios durante los ciclos de la célula.
También se demostró que este reportero también puede utilizarse para visualizar tumores de pez cebra (figura 5). Fue interesante encontrar tumor células generalmente eran más polarizadas respecto a los tejidos normales circundantes. Sin embargo, si se trata de un fenómeno general para todos los tejidos malignos requiere más investigación, debido a la limitación de muestras tumorales y el tumor de especies en este estudio. Las investigaciones futuras sobre cuantificación de polarización y la tensión de membrana de la célula en otros tipos de tumores y células cancerosas humanas será para la mejor comprensión de sus papeles durante tumorigenesis.
En este protocolo, optamos por un promotor omnipresente para conducir ASAP1 expresión a todas las células de embriones de peces. Promotores específicos de tejido u órgano podrían ser otra opción si sólo un cierto tipo de células y tejidos es preferido. El sensor de voltaje de ASAP1 es un biosensor relativamente bien caracterizado, y se compone de un dominio sensible del voltaje de la fosfatasa de voltaje-sensible mar squirt (circuito S3-S4) y una permutación circular de GFP (valor por defecto es leve fluorescencia). Se informó a expresarse en la membrana exterior celular en las células de la neurona humana y ratón cerebro rebanadas4,27,28. El brillo del sensor dominante está determinado por las posiciones conformacionales de la S3-S4 de bucle y GFP. El cambio de fluorescencia verde rápida era poco probable causado por la concentración de proteína, debido a la velocidad de los cambios de brillo y la síntesis de proteínas. Sin embargo, puede haber modificado el transgén, ASAP1, expresión en las células del tumor, debido a la naturaleza de la inestabilidad genómica. Además de ASAP1, otros GEVIs, como indicadores de tensión basados en archaerhodopsin (QuasAr1 y QuasAr2), también pueden ser una buena opción complementaria, ya que utilizan un mecanismo completamente diferente y también tienen una alta sensibilidad y velocidad de 29. Además, su emisión es en la gama de color rojo. Esto los hace particularmente gratuito a la ASAP1 verde, si ya existe otra proteína fluorescente en la misma célula. Por ejemplo, ASAP1 y QuasAr pueden combinarse con Fucci pez cebra30 para estudiar la relación entre el ciclo celular y los cambios de potencial eléctricos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El trabajo de investigación en esta publicación fue apoyado por el Instituto Nacional de General médica Ciencias de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número R35GM124913, programa de incentivos de la Universidad de Purdue PI4D y PVM interno competitivo Programa de fondos de investigación básica. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los agentes de financiación. Agradecemos a Koichi Kawakami para la construcción de Tol2, Michael Lin para la construcción de ASAP1, y Leonard Zon para el promotor ubi construir a través de Addgene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14mL cell culture tubes | VWR | 60818-725 | E.Coli culture |
| Agarose electrophoresis tank | Thermo Scientific | Owl B2 | DNA eletrophoresis |
| Agarose RA | Amresco | N605-500G | For making the injection gels |
| Attb1-ASAP1-F primer | IDT DNA | GGGGACAAGTTTGTACAAAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA |
ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Attb2-ASAP1-R primer | IDT DNA | GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA |
ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Bright field dissection scope | Nikon | SMZ 745 | Dechorionation, microinjection, mounting |
| Color camera | Zeiss | AxioCam MRc | Fish embryo image recording |
| Concave slide | VWR | 48336-001 | For holding fish embryos during imaging process |
| Disposable transfer pipette 3.4 ml | Thermo Scientific | 13-711-9AM | Fish embryos and water transfer |
| Endonuclease enzyme, Not I | NEB | R0189L | For linearizing plasmid DNA |
| Epifuorescent compound scope | Zeiss | Axio Imager.A2 | Fish embryo imaging |
| Epifuorescent stereo dissection scope | Zeiss | Stereo Discovery.V12 | Fish embryo imaging |
| Fluorescent light source | Lumen dynamics | X-cite seris 120 | Light source for fluorescence microscopes |
| Forceps #5 | WPI | 500342 | Dechorionation and needle breaking |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Scientific | 11789020 | Gateway BP recombination cloning |
| Gateway LR Clonase II Plus enzyme | Thermo Scientific | 12538120 | Gateway LR recombination cloning |
| Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | DNA gel purification |
| Loading tip | Eppendorf | 930001007 | For loading injection solution into capilary needles |
| Methylcellulose (1600cPs) | Alfa Aesar | 43146 | Fish embryo mounting |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection |
| Microinjector | WPI | Pneumatic Picopump PV820 | Microinjection injector |
| Micro-manipulator | WPI | Microinjector MM3301R | Microinjection operation |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | For preparing capillary needle |
| Mineral oil | Amresco | J217-500ml | For calibrating injection volume |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Thermo Scientific | AM1340 | mRNA in vitro transcription |
| Monocolor camera | Zeiss | AxioCam MRm | Fish embryo image recording |
| Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4020 | Prepare small amount of plasmid DNA |
| Plastic Petri dishes | VWR | 25384-088 | For holding fish or fish embryos during imaging process |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | mRNA cleaning after in vitro transcription |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | For measuring DNA and RNA concentrations |
| Stage Micrometer | Am Scope | MR100 | Microinjection volume calibration |
| Thermocycler | Bio-Rad | T100 | DNA amplification for gene cloning |
| Thin wall glass capillaries | WPI | TW100F-4 | Raw glass for making cappilary needle |
| Tol2-exL1 primer | IDT DNA | GCACAACACCAGAAATGCCCTC | Tol2 excise assay |
| Tol2-exR primer | IDT DNA | ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG | Tol2 excise assay |
| TOP10 Chemically Competent E. coli | Thermo Scientific | C404006 | Used for transformation during gene cloning |
| Tricaine mesylate | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing fish or fish embryos |
| UV trans-illuminator 302nm | UVP | M-20V | DNA visualization |
| Water bath | Thermo Scientific | 2853 | For transformation process of gene cloning |
References
- Levin, M. Molecular bioelectricity: how endogenous voltage potentials control cell behavior and instruct pattern regulation in vivo. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3835-3850 (2014).
- Storace, D., et al. Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential. Trends in Neuroscience. 39 (5), 277-289 (2016).
- Inagaki, S., Nagai, T. Current progress in genetically encoded voltage indicators for neural activity recording. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 95-100 (2016).
- St-Pierre, F., et al. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nature Neuroscience. 17 (6), 884-889 (2014).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. , (2013).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science USA. 105 (50), 19827-19832 (2008).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Mosimann, C., et al. Ubiquitous transgene expression and Cre-based recombination driven by the ubiquitin promoter in zebrafish. Development. 138 (1), 169-177 (2011).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Ordovas, J. M. Separation of small-size DNA fragments using agarose gel electrophoresis. Methods in Molecular Biology. 110, 35-42 (1998).
- Downey, N. Extraction of DNA from agarose gels. Methods Mol Biol. 235, 137-139 (2003).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. 45 (45), (2010).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610, 612, 614 (2007).
- Kawakami, K., Koga, A., Hori, H., Shima, A. Excision of the tol2 transposable element of the medaka fish, Oryzias latipes, in zebrafish, Danio rerio. Gene. 225 (1-2), 17-22 (1998).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, Univ. of Oregon Press. (2000).
- Amsterdam, A., et al. Many ribosomal protein genes are cancer genes in zebrafish. PLoS Biology. 2 (5), E139 (2004).
- Lai, K., et al. Many ribosomal protein mutations are associated with growth impairment and tumor predisposition in zebrafish. Developmental Dynamics. 238 (1), 76-85 (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Zhang, G., et al. Comparative oncogenomic analysis of copy number alterations in human and zebrafish tumors enables cancer driver discovery. PLoS Genetics. 9 (8), e1003734 (2013).
- Zhang, G., et al. Highly aneuploid zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors have genetic alterations similar to human cancers. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107 (39), 16940-16945 (2010).
- Urrego, D., Tomczak, A. P., Zahed, F., Stuhmer, W., Pardo, L. A. Potassium channels in cell cycle and cell proliferation. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B. 369 (1638), 20130094 (2014).
- Yang, H. H., et al. Subcellular Imaging of Voltage and Calcium Signals Reveals Neural Processing In Vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
- Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 106 (49), 20812-20817 (2009).
