Summary
描述了执行滴定 ELISA 的详细协议。此外, 提出了一种新的评价滴定 ELISAs 的方法, 并获得了可溶性配体对微量滴定板固定化受体的离解常数。
Abstract
离解常数描述二个伙伴之间的相互作用在束缚平衡并且是衡量他们的亲和力。它是比较不同配体的关键参数,例如, 竞争性抑制剂, 蛋白质亚型和突变体, 其结合强度的结合的合作伙伴。离解常数通过绘制绑定vs自由配体的浓度作为绑定曲线来确定。相反, 滴定曲线, 其中一个比例的浓度的绑定配体被绘制反对总浓度的附加配体, 更容易记录。该信号可以 spectroscopically 和酶联免疫吸附试验 (ELISA) 检测。这在一项滴定 ELISA 的协议中得到了证明, 它测量了蛇毒衍生 rhodocetin 对其固定化目标域α2β1整合素的约束力。滴定 ELISAs 是多才多艺和广泛使用。任何一对相互作用的蛋白质可以作为固定受体和可溶性配体, 只要两种蛋白质是纯的, 他们的浓度是已知的。到目前为止的困难是确定从滴定曲线的离解常数。本文介绍了滴定曲线的数学函数。在没有任何容易出错的饱和率图形估计的情况下, 该算法可以通过非线性回归的数学评价直接处理原始数据 (不同浓度的附加配体的信号强度)。这样, 可以同时记录几种滴定曲线, 转化为一组特征参数, 其中包括解离常数和结合主动受体的浓度, 并对其进行统计学评价。结合该算法, 滴定 ELISAs 获得直接呈现离解常数的优点。因此, 将来可能会更有效地使用这些方法。
Introduction
离解常数 K 是描述受体 (R) 对配体 (L) 亲和性的关键参数。以质量作用定律为基础, 定义了受体配体复合 RL 离解受体 R 和配体 L 的平衡:
等式1
索引f指示受体和配体的自由/未绑定状态。受体配体复合物的浓度, RL, 是相同的受体绑定配体 Lb的浓度。当受体 rt的总浓度是自由受体 rf和配体绑定受体 rb = Lb的总和时, 离解常数也可以写成:
等式2
因此, 饱和屈服 Y, 定义为绑定配体 Lb的分数与受体 Rt的总浓度的关系,
等式3
取决于游离配体 Lf的浓度:
等式4
这种双曲关系描述了受体配体相互作用的结合曲线, 其图形显示了束缚配体 lb作为游离配体 lf浓度的函数的浓度。从结合曲线上可以导出游离配体在半最大饱和屈服下的浓度。此外, 还建立了进行线性化绑定曲线的不同算法, 如Klotz1、2或根据斯卡查德或哈内斯进行的转换 (由Bisswanger3 检查) 的双对等图。然而, 所有的算法都存在一个问题, 即饱和屈服的最大值在结合曲线上的自由配体的高浓度下渐近逼近, 必须在图形预评价中得到估计, 因此容易出错。
另外, 结合曲线的确定要求在束缚平衡期间定量的自由和束缚配体。为此, 游离配体必须与受体结合的配体分离并量化。因此, 配体和受体必须在其性质上有所不同, 如非蛋白配体, 而不是蛋白质受体。如果两个具有约束力的合作伙伴都是蛋白质, 它们就必须在大小、电荷或其他分子特征上区分开来。然而, 小尺度结合方法中配体浓度的量化是一项艰巨的任务。对配体进行放射性标记往往是检测束缚配体低浓度的必要条件, 尤其是在大量的受体无法获得或负担得起的情况下。此外, 受体结合的配体可以在隔离期间和之后, 以不可忽略的方式分离。因此, 复杂的方法, 如平衡凝胶过滤4, 毛细管电泳5和脉冲蛋白质分解6, 需要量化受体绑定配体, 并将其与游离配体分离。
与这些结合化验相比, 滴定实验不需要定量分离的束缚和游离配体。为此, 在恒定浓度的受体滴定不同浓度的添加配体。通过绑定到受体, 绑定配体有一个生物物理性质, 它区别于游离配体, 是可测量的,例如, 光度, 荧光, 或抗体检测。因此, 信号 S, 与饱和率 Y 和因而也到受体束缚配体 (lb) 的浓度成正比, 被检测为添加配体 (lt) 总浓度的函数。两个参数, 信号 S 和添加配体的总浓度比束缚和游离配体的浓度直接和容易的方式量化。特别是通过酶联免疫吸附试验 (ELISA) 检测受体结合配体, 使试样体积减少到100µL 以下, 以及多井微量滴定板中几种配体浓度的平行测量。在滴定 ELISA 中, 受体被物理吸附到微量滴定板上, 在同一浓度和滴定与可溶性配体。该受体主要通过疏水性吸附固定于塑料表面。固定化受体的表面浓度与受体在非线性关系中的涂层浓度相关, 可能根据 Langmuir´s 吸附等温线7。除了吸附受体分子的总数量外, 它们的活性状态也是滴定测定的另一个重要参数。只有固定的受体保留配体结合活动, 是相关的滴定分析和最终贡献的总浓度的活性受体 Rt滴定法, 不能直接确定。
非固定化受体覆盖的塑料表面上的部位容易吸附其他蛋白质, 如配体。对这种塑料表面的配体进行物理吸附会导致类似的信号作为受体束缚配体, 但以非特异性的方式。为了减少这种非特异性信号, 尚未涂上蛋白质的微量滴定板的塑料表面部位会被牛血清白蛋白 (BSA) 阻断。然而, 对于某些受体配体滴定法, 可以观察非特异性的背景信号。然后, 建议使用其他阻挡剂, 如0.2% 明胶或0.04% 吐温20的溶液。
与受体结合后, 游离配体被两个洗涤步骤除去。束缚配体仍然与受体, 这是固定在塑料表面的微量滴定井, 并选择性加强化学固定。对于随以戊二醛的束缚配体与固定化受体的共价键交联, HEPES 中的缓冲物质三被取代, 而不改变配体结合。HEPES, 与三个不同, 不灭活戊二醛。戊二醛共价交联固定与受体的束缚配体, 防止其离解在随后的洗涤和孵化步骤。因此, 受体配体相互作用是化学冻结, 并保证一个滴定曲线, 不受随后的洗涤和孵化步骤的影响。然而, 戊二醛固定可能化学修饰的配体和受体, 这样的方式, 他们的相互作用减少或废除。此外, 修饰配体内的表位可能改变检测抗体的结合亲和性, 特别是当单克隆抗体用于量化绑定配体。尽管这两种戊二醛固定的不良影响都发生在这种滴定法中, 但对戊二醛的检测灵敏度必须在滴定实验之前对每种受体配体相互作用进行测试。固定后, 过量戊二醛被去除三洗涤步骤与三含缓冲。三钝化剩余醛类, 这可能 nonspecifically 反应与检测抗体在随后的步骤。
结合酶联抗体定量分析了束缚配体的数量, 提供了光度 ELISA 信号。这是绘制的与总配体浓度 Lt添加到每个井。尽管它更容易获得, 滴定曲线不是一个双曲函数与结合曲线的对比。此外, 如何从滴定曲线计算离解常数 K 也不清楚。虽然 Stockell8和海恩和 Weischet9独立地报告了进行线性化 spectroscopically 获得滴定曲线的算法, 但由于它们估计的最大信号值的不确定性, 它们的数量很短。高浓度添加配体的饱和屈服方法。
本文介绍了一种滴定法和非线性回归算法, 从滴定曲线上推导出受体配体相互作用的离解常数 K。这一协议的例子, 以相互作用的胶原结合 a 域的整合素α2β1与蛇毒衍生抑制剂。整合是细胞黏附分子, 它调解细胞的锚地到周围细胞外基质或底层基底膜10,11。此外, 整合在细胞和细胞外基质之间传递重要信号, 通过招募额外的信号分子和形成新的细胞器, adhesomes, 在细胞基质相互作用12,13,14. 胶原蛋白是α2β1整合素的配体, 是人体最丰富的蛋白质, 是结缔组织15的关键支架组件。α2β1整合素与胶原蛋白之间的相互作用是由α2亚单位的 A 域介导的。整合素α2A 域含有价阳离子, 它是胶原结合所必需的, 它的结构稳定。野生型的形式以及α2A 领域的突变体, 如 Y216 被取代为甘氨酸的表面暴露的残留物, 可以很容易地在细菌表达系统中产生 recombinantly, 并通过其寡核苷酸与 NiNTA 分离。superflow 柱与随后透析对三缓冲盐水 (tb; 50 毫米三/HCl, pH 值 7.4, 150 毫米氯化钠) 包含2毫米氯化镁216。它们的浓度是用二辛可宁酸测定法 (纯度) 测定的, 它们的含量由常规的 SDS 页进行测试, 并沾上了考马斯--灿烂的蓝色 R250。
α2β1整合素与胶原蛋白的相互作用是由 rhodocetin 的蛇毒成分 (Calloselasma rhodostoma)16,17) 的结合所阻断的。作为可溶性配体在这个滴定酶联免疫吸附, rhodocetin 是从粗毒液纯化, 如前所述16。它被溶化在 HEPES 缓冲的盐水 (哈佛商学院; 10 毫米 HEPES/氢氧化钠, pH 值 7.4, 150 毫米氯化钠) 并且被存放被冻结在-20 °c。它的浓度是由鉴定者决定的, 其纯度由 SDS 页面证明。作为拮抗剂, rhodocetin 不仅阻断了整合素α2β1 A 域的胶原蛋白结合, 而且稳定了整合体的非活性构象, 从而防止胶原蛋白进入细胞或血小板18。rhodocetin 与受体靶的分离常数的测定具有重要的生物医学意义, 从而解开其分子机制和药用电位如, 作为抗血栓剂。为此, 介绍了一种滴定 ELISA 法, 包括其评价, 适用于几乎任何受体配体相互作用的1:1 相互作用化学计量。
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Protocol
1. 库存解决方案
- 要准备100毫升的 10x tb pH 7.4 溶液, 溶解6.06 克的氯化钠在90毫升的去离子水, 调整 pH 值7.4 与 37% HCl 溶液, 填补体积到100毫升与去离子水, 并过滤解决方案。
- 要准备100毫升的1米 HEPES/氢氧化钠, pH 7.4 溶液, 溶解23.83 克的 HEPES 在90毫升的去离子水, 调整 pH 值7.4 与1.5 米氢氧化钠, 填补体积到100毫升与去离子水, 并过滤解决方案。
- 要准备100毫升的5米氯化钠溶液, 在90毫升的去离子水中溶解29.2 克氯化钠。用去离子水填充体积到100毫升, 过滤溶液。
- 要准备100毫升的1米氯化镁2解决方案, 溶解20.33 克氯化镁2 ·6H2O 在90毫升的去离子水中。用去离子水填充体积到100毫升, 过滤溶液。
- 在水中制备5% 热灭活 bsa, 在50毫升管中重2.5 克 bsa (分数 V, pH 7.0), 并将其溶解在45毫升的去离子水中。用去离子水将溶液填入50毫升, 在68摄氏度的水浴中加热溶液45分钟. 在冰浴冷却它并且存放它在-20 °c。
- 制备含水25% 戊二醛溶液。
注意: 戊二醛是有害的, 如果吞咽, 有毒的吸入, 并导致烧伤。穿戴防护服、手套和眼睛/脸部防护。 - 提高兔抗血清的前述19。根据标准协议20确定抗血清的效价。
- 从山羊共轭碱性磷酸酶中制备抗兔免疫球蛋白抗体。
- 制备100毫升0.1 米甘氨酸溶液, 在90毫升的去离子水中溶解0.75 克甘氨酸。用1.5 米氢氧化钠溶液将 pH 值调整为 10.4, 用去离子水填充体积到100毫升, 并过滤溶液。
- 制备100毫升0.5 米锌 (ii)-醋酸盐溶液, 溶解10.98 克锌 (ii)-醋酸盐·2H2O 在90毫升的去离子水中。用去离子水填充体积到100毫升, 过滤溶液。
- 制备100毫升1.5 米氢氧化钠溶液, 在90毫升的去离子水中溶解6.0 克氢氧化钠。用去离子水填充体积到100毫升, 过滤溶液。
2. 准备缓冲器和工作解决方案
- 稀释5毫升 10x tb 的 pH 值 7.4, 45 毫升去离子水, 并添加100µL 1 米氯化镁2库存解决方案。保持室温。tb, pH 值 7.4, 2 毫米氯化镁2解决方案是为固定的受体和洗涤微量滴定板。
- 稀释10毫升5% 的热灭活 BSA 在水和5毫升 10x tb, pH 7.4 与去离子水到50毫升。添加100µL 1 M 氯化镁2库存解决方案, 并将解决方案进行良好的混合。保持在冰上, 并保存在-20 摄氏度的进一步实验。请注意, 每个滴定曲线都需要2.5 毫升的 tb, 1% BSA, pH 值 7.4, 2 毫米氯化镁2 。
- 稀释2.5 毫升的1米 HEPES/氢氧化钠, pH 7.4 和1.5 毫升5米氯化钠溶液到50毫升与去离子水, 添加100µL 1 M 氯化镁2解决方案, 并彻底混合解决方案, 准备50毫升的哈佛商学院, pH 7.4:50 毫米 HEPES/氢氧化钠, 150 毫米氯化钠。
- 添加5µL 1M 氯化镁2库存解决方案和2µL 0.5 米锌 (II)-醋酸盐库存溶液5毫升0.1 米甘氨酸溶液, ph 10.4 制备碱性磷酸酶 (AP) 缓冲液 (0.1 米甘氨酸溶液, ph 10.4, 1 毫米氯化镁2, 0.2 毫米锌 (II)-醋酸盐)。
3. 将受体 (整合素α2A 域) 固定在微量滴定板上
- 稀释整合素α2A 域的库存解决方案, 在 tb, pH 值 7.4, 2 毫米氯化镁2中, 最终浓度为5µg/毫升。
注: 涂层溶液的体积为一滴定曲线的650µL, 其中包括12井的半面积微量滴定板。 - 在一个半区域微量滴定板上填满每一个井, 其中50µL 的5µg/毫升涂层溶液的整合素α2A 域 (野生型或突变体)。至少以重复的方式执行每个滴定行 (在本例中为胎; 请参见图 1中的微量滴定板的布局)。
- 用铝箔封住盘子, 或用盖子把它关上。把盘子放在4摄氏度的晚上。
4. 用 tb、pH 值7.4、2 mM 氯化镁2冲洗两次板材的涂层井
- 要去除未通过物理吸附固定于塑料表面的可溶性受体分子, 请去除涂层溶液, 并用50µL, pH 7.4, 2 毫米氯化镁2填充每个井。
- 卸下清洗液。确保井不变干。因此, 不要把微量滴定板放到纸巾上, 以除去残留的液体。使用多级吸管或多通道吸管快速填满水井。
- 重复这个洗涤步骤一次。
5. 阻止非特异性绑定站点
- 在 tb、pH 值7.4、2 mM 氯化镁2中, 向每个井中添加50µL 1% BSA 溶液。
- 用箔封好井, 或用盖子盖紧。
- 在室温下孵化出1小时的水井。
注意: 此协议的任何孵化步骤都可以在摇摆或震动平台上执行。然而, 这不是必需的, 也不会改变实验的结果。
6. 配体 Rhodocetin 系列稀释排的制备
- 改变 rhodocetin 的开始浓度和稀释因子的串联稀释, 以获得适当范围的配体浓度和记录一个完整的滴定曲线的最小和最大的信号。在本实验中, 采用 243 nM rhodocetin 的起始浓度和稀释因子2.3。稀释 rhodocetin 的溶液, 达到串联稀释排的最高配体浓度。对于每个滴定曲线的稀释系数为 2.3, 准备115µL 243 nM (即, 152 µg/毫升) rhodocetin 溶液在 1% BSA/tb, pH 7.4, 2 毫米氯化镁2在试管 #1。
- 65µL 1% BSA 溶液在 tb, pH 7.4, 2 毫米氯化镁2在10试管, 标记 #2 通过 #11。
- 转移50µL 的 rhodocetin 稀释从试管 #1 到试管 #2, 混合两种溶液 (总容积: 115 µL; 稀释系数: 1:2. 3) 由研磨, 然后将50µL 从此混合物转移到试管 #3,等
- 继续此系列稀释, 直到试管 #11。
注: 在步骤 6.1-6.4 中给出的体积足以用于一个滴定曲线。将这些卷乘以复制数。在这种情况下, 执行八滴定曲线 (胎两个α2A 域形式), 并准备以下卷: 920 µL 的 rhodocetin 溶液在最高浓度的试管 #1;520µL 1% BSA 在 TBS, pH 7.4, 2 毫米氯化镁2填写每个试管 #2 #11;和400µL 的传输量从一个管到下一个。
7. 配体 (Rhodocetin) 在不同浓度下对固定化受体的结合 (整合素α2A 域)
- 用真空线从微量滴定板井中取出堵塞液。
- 立即添加50µL 的 rhodocetin 溶液在 1% bsa/tb, pH 7.4/氯化镁2的试验管 #1 到1列的水井, #2 的试验管的解决方案 2,等添加50µL 1% BSA 在 tb, pH 7。4, 2 毫米氯化镁2 (阻塞和稀释缓冲器) 作为对12列的井的无配体控制 (参见微量滴定板的布局,图1)。
- 用箔封好井, 或用盖子盖紧。
- 在室温下孵化水井1.5 小时 (约 20-22 摄氏度)。
8. 用哈佛商学院两次洗井, pH 7.4, 2 毫米氯化镁2
- 要移除非束缚配体分子, 请移除结合溶液, 并用50µL, pH 7.4, 2 毫米氯化镁2填充每个井。然后, 取出洗涤液。
- 当心水井不会变干。因此, 不要把微量滴定板放到纸巾上, 以除去残留的液体。使用多级吸管或多通道吸管快速填满水井。
- 重复这个洗涤步骤一次。
9. 将受体束缚配体与2.5% 戊二醛固定在哈佛商学院, pH 7.4, 2 毫米氯化镁2
- 通过混合1部分25% 戊二醛溶液和哈佛商学院9部分, pH 7.4, 2 毫米氯化镁2, 准备一个新的2.5% 戊二醛溶液。
- 用2.5% 戊二醛溶液的50µL 在哈佛商学院, pH 7.4, 2 毫米氯化镁2中填充微量滴定板的每一个井。室温下孵化微量滴定板10分钟。
10. 三次洗井, 50 µL/井, pH 7.4, 2 mM 氯化镁2
- 要去除和停用过量戊二醛, 请取出固定液, 用50µL, pH 7.4, 2 毫米氯化镁2填充每个井。然后取出洗涤液。
注: 将含有戊二醛的固定液从微量滴定板倒入盘中, 并在其被同等容积的 tb、pH 值7.4 后丢弃固定液。 - 当心水井不会变干。因此, 不要把微量滴定板放到纸巾上, 以除去残留的液体。使用多级吸管或多通道吸管快速填满水井。
- 重复这洗涤步骤两次。
11. ELISA 法定量检测受体结合配体
- 增加50µL/井的主要抗体溶液在 1% BSA 在 TBS, pH 7.4, 2 毫米氯化镁2。主要抗体解决方案是对 rhodocetin19, 稀释 1:2, 000 在 1% BSA, pH 7.4, 2 毫米氯化镁2提出的兔抗血清。
- 在室温下孵育 75-90 分钟的板材。用50µL (tb)、7.4、2 mM 氯化镁2将板的所有井冲洗三次。在三洗涤步骤中, 不需要将微量滴定板攻到纸巾上。
- 增加50µL/井的二次抗体溶液在 1% BSA 在 TBS, pH 7.4, 2 毫米氯化镁2。为此, 稀释二次抗体, 兔免疫球蛋白靶向山羊抗体共轭碱性磷酸酶, 到 1:2, 000 在 1% BSA 在 tb, pH 7.4, 2 毫米氯化镁2。在室温下孵育 75-90 分钟的板材。
- 在5毫升的 ap 缓冲器 (0.1 米甘氨酸溶液, pH 10.4, 含1毫米氯化镁2和0.2 毫米锌 (II)-醋酸盐) 中溶解5毫克片剂, 将含有 4-硝基苯基磷酸盐钠的六水合物 (磷酸酶基质) 溶出, 制备 ap 检测溶液。
- 在执行下一步之前, 先用50µL/井、7.4、2 mM 氯化镁2冲洗三次板的所有井。在最后一个洗涤步骤后, 把微量滴定板上的纸巾移除所有的液体痕迹。
- 添加50µL/井的 AP 检测解决方案的水井的微量滴定板。及时向所有油井添加 AP 检测解决方案, 尽可能同时启动酶转化。因此, 使用多通道吸管。
- 在室温下孵化出钢板, 直到溶液中的最高配体浓度变黄。
注: 根据信号强度的不同, 潜伏期可能在5分钟和1小时之间变化。 - 加入50µL/井1.5 米氢氧化钠溶液, 停止磷酸酶基质的转化。让盘子站立几分钟, 确保两种溶液无条纹混合。为了保证所有井中相同的潜伏期, 使用多通道吸管, 并添加1.5 米氢氧化钠, 与在步骤11.8 中的 AP 检测基板相同的顺序加入油井。
- 用 ELISA 读取器测量每个井405毫微米的光密度 (OD)。
12. 滴定信号的评估
- 使用 Excel 打开原始数据表 (OD405nm值)。由于滴定曲线的这些信号值是以行读取的, 因此将这些值转置为一列, 并在另一列中添加配体的浓度作为标签。
- 打开 Graphpad 棱镜 5 (版本 5.0)。在主菜单中打开一个新项目文件。在新建数据 & 图形下选择XY格式。为 Y 轴选择输入和绘制每个值的单个点选项。
- 将两列、添加配体的浓度和信号值 (OD405nm值) 复制到 excel 文件中, 并将它们分别粘贴到 GraphPad 棱镜的数据表中作为 X 和 Y 值。
- 打开 GraphPad 棱镜5的分析子程序, 然后选择XY 分析下的选项非线性回归。选择用户定义的公式, 然后按新建按钮以创建新的公式。
- 在表单中键入滴定曲线方程: Y = (Smax Smin) * (x + r + k)-sqrt ((x + r + k) ^ 2-4 * r X))/(2 * r) + Smin + B * X 进入新打开的模板表中, 以 Y 为信号值 S, X 为加配体 L 的浓度, R 为固定化受体的浓度, K 为离解常数, B 为背景斜率。定义适当的约束, 如 K > 0 和 R > 0。
注意: 这个等式是一个不同形式的等式 9的等式。 - 通过选择新创建的用户定义的公式来分析数据表的值。用计算得出的近似值 (K、Rt、smax、smin和 B) 打开表, 这些数值显示在软件屏幕左侧的结果部分下。
注: 只有在滴定曲线至少包含5个数据点的情况下, 该软件才通过非线性回归的迭代拟合确定5参数。 - 对每组滴定曲线的参数 K、Rt、smax、s最小和 B 进行统计计算, 并将参数与组的特定特征 (突变或化学修饰的配体或受体) 关联。
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Representative Results
在 ELISA 被开发以后, 被转换的碱性磷酸酶基体的黄色颜色, 对位-复硝酚表明, 束缚的 rhodocetin 配体的数量减少以增加的 rhodocetin 的浓度从列1到 11 (图 1)。12栏无 rhodocetin 井中的无色井显示了低背景信号。
光度量化在405毫微米提供数据, 可以直接地被哺养入分析软件, 并且通过使用一个非线性回归和等式 9, 接近每个滴定行的原始的数据和计算信号 S (等于 OD405nm) 作为添加的 rhodocetin 配体 Lt (图 2) 的总浓度的函数。四滴定曲线为每个受体形式 (野生型和突变体) 是高度重现性和几乎叠加。与这种低群内方差相比, 两组滴定曲线之间有明显的分离。更高浓度的 rhodocetin 配体需要绑定到突变α2A 域, 以获得类似的价值信号的野生类型的形式。这种右移位的滴定曲线表明, 突变配体具有降低亲和性的配体。因此, 引入α2A 域的突变会损害 rhodocetin 绑定, 因为它是整合素域18的 rhodocetin 绑定站点的一部分。
滴定曲线可由5特征参数描述: (i.) 离解常数 K, (ii) 固定化的浓度, 生物活性受体 Rt, (iii) 最大值和 (iv) 最小信号 (smax和 Smin), 以及 (v) 背景信号 B 的斜率。在这些参数中, 离解常数 K 对于滴定曲线的生物解释是必不可少的, 也是最相关的。每个滴定曲线为 K 提供一个值。因此, 单, 也分组滴定曲线可以统计比较。这种统计分析的四滴定曲线的野生类型和突变α2A 域显示在图 3中。rhodocetin 与野型α2A 域结合的亲和常数为 5.80 0.15 nm, 而 rhodocetin 与变异受体结合, 其亲和性明显低于 9.68 @ 0.18 nM (p < 0.0001)。
因此, 滴定法与这种数学评价结合, 可以快速和统计地评估配体结合到受体及其突变或化学修饰的衍生物。因此, 滴定法和评价算法是分析结构函数关系的重要工具。
图 1: 用于滴定 ELISA 的微量滴定板的代表性布局。每行提供一个滴定曲线的数据。为了比较 rhodocetin (RC) 配体的结合性, α2A 域的野生类型 (行 A D) 或突变形式 (列 E H) 被固定在四排的水井中 (皮带测定)。水平点线将两组滴定曲线隔开。rhodocetin 配体的浓度从1栏减少到 11, 而柱12的井, 在垂直点线的右侧表示, 不包含任何 rhodocetin, 代表背景控制。该板块是在绑定配体被定量的 ELISA, 其中碱性磷酸酶基质转化为黄色的对-复硝酚. 数据显示从三重复实验中的一个。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 代表性滴定曲线.以 rhodocetin 为可溶性配体 (符号), 以及近似滴定曲线 (线), 在半对数图中显示了整合素α2A 域滴定固定化野生型和突变形式的原始数据。皮带决心的原始的数据 (圈子, 三角向上和向下, 正方形为每四滴定列) 显示为固定化狂放的类型 (开放标志) 和变异 (被填装的符号) α2A 受体。计算出的滴定曲线显示为野生型 (黑线) 和受体突变体 (灰线) 的线 (实心, 短虚线, 点状, 链点)。四滴定曲线在两组 (野生类型和突变受体) 叠加, 而滴定曲线明显不同的两组。突变体α2A 域的滴定曲线转移到较高的 rhodocetin 浓度, 表明 rhodocetin 与突变受体的亲和性较低。数据显示从三重复实验中的一个。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 从滴定曲线推导出的离解常数 K 的统计比较。
绘制了图 2中的八滴定曲线的 dissociations 常数, 并对α2A 域的野类型和突变形式进行了分组。分别用点、虚线黑线和灰色误差线表示单个值、组方法和标准偏差。每个组内的小方差和组之间的显著差异表明, 在配体与野生类型的亲和性和突变受体之间有显著差异 (p < 0.0001)。使用双尾 Student´s t测试进行比较。数据显示从三重复实验中的一个。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
滴定 ELISA 是一种多功能的测试系统, 用于测定受体配体相互作用的离解。由于滴定 ELISA 绕过了有效分离游离和束缚配体的必要性, 并定量分析了它们的浓度, 大量的研究和出版物使用滴定 ELISAs 而不是记录绑定曲线.此外, 滴定 ELISAs 是容易执行和要求相当低数量的受体和配体。为了准确分析离解常数, 必须使用纯制剂和受体和配体。在受体制剂中污染蛋白质与微量滴定板塑料表面吸附部位的受体竞争。由于它们不束缚配体, 但减少配体结合受体的数量, 受体溶液的杂质减少了滴定 ELISA 的信号。如果受体制剂的纯度不能进一步提高, 针对受体的抗体可以固定在微量滴定板上, 并且在堵塞油井后, 将从含有杂质的制剂中捕获受体。然而, 必须注意, 以使捕获抗体不干扰检测绑定配体与主要和二级抗体, 因为物种干扰的抗体, 或它阻碍配体结合。
为了获得一组完整的数据, 我们赞赏以互惠的方式执行滴定 ELISA, 即在其他实验中使用可溶性配体作为受体, 将其固定在微量滴定板上, 并滴定前受体, 将作为可溶性配体伙伴应用。这通常很管用, 除非固定化钝化一个合作伙伴的结合活动, 或除非工具, 如检测滴定的抗体, 不存在或难以获得。在 rhodocetin-α2A 域绑定系统中, 当谷胱甘肽 s-转移酶 (GST) 基团被融合到α2A 域以促进其检测与 GST 抗体16后, 这一效果很好。
滴定 ELISA 的另一个好处是, 只有添加配体 (lt) 的浓度, 而不是自由和束缚配体 (lf和 lb分别), 需要知道。因此, 配体制剂应尽可能清洁。如果这是不可能的或可行的, 只有在有限的范围内, 滴定 elisa 仍然可以使用, 在配体的摩尔比率已独立确定后,例如, 由 SDS 页, 免疫印迹法, 或三明治 elisa。
如果受体与配体之间的亲和性过低, 或者戊二醛固定取消了结合作用, 则可能发生滴定 ELISA 的问题。在后一种情况下, 需要建立一个无固定的滴定酶联免疫协议。实际上, 只有当绑定伙伴与合理的高亲和性进行交互时, 才能检测出离解常数, 这是在大约200毫微米以下的范围内。
滴定提供信号强度 S 作为补充配体的总浓度的作用, Lt。作为自由和未绑定配体的浓度, lf和 lb, 求和为 lt, 当 Lb等于 Y·的乘积时Rt根据等式 3,等式 4被转换为:
等式5
产生二次方程,
等式6
其实际解决方案是,
等式7
另外, 在添加配体 Lt的特定浓度下的信号强度 S (lt) 表示饱和屈服 Y, 在它通过最小信号值的减法、Smin和规范化到动态范围后进行了修正。, 作为最大和最小信号值之间的区别, smax和 smin:
等式8
等式 7和等式 8的组合产生的数学函数将信号强度 S (lt) 与添加配体 Lt的浓度关联起来。一个术语 B·可以添加 lt来描述与 Lt线性升高的非特定背景信号。B 是背景的比例常数。因此, 描述滴定曲线的一般函数是:
等式9
滴定曲线的这个函数对应于一个平方根项和一个线性项组成的函数, 分别描述了受体和配体之间的具体相互作用和配体的非特异性相互作用。此函数与绑定曲线的双曲函数不同 (Lbvs.Lf)。
与结合曲线相比, 在 y 轴上绘制束缚配体的浓度, 滴定曲线更灵活, 允许任何与束缚配体浓度相关的信号在 y 轴上绘制。这一信号可能是测光地检测到的结合酶链抗体 (如在这种情况下的 ELISA), 但它也可能是其他光谱信号, 如吸光度变化, 循环二色谱 9, 荧光极化 21和核磁共振信号22。此外, 还可以对等温滴定量热仪23的热力信号进行评估。其他研究通过表面等离子体共振测量消失场的实时变化, 确定受体-配体复合体的形成和分离的动力学上和离率的结合亲和性24,25, 在大量沉积由石英晶体天平26, 或在荧光由微型 thermophoresis26,27。这些实时测量已成为强大的工具, 因为其复杂的评估软件。滴定 ELISA 和 SPR 法通常是在蛋白质-化学分析中检查结合伙伴的选择方法。而滴定酶联免疫测定的亲和常数热力学上通过量化的束缚配体的数量在不同的平衡状态, SPR 利用动力学方法和接近的动能率常数,k off 和k 在, 该比率提供了动力学确定的离解常数2425。根据两种不同的方法, K 值可能不同。在 rhodocetin-α2A 域绑定实验中, SPR 数据显示 koff和 kon速率常数, 因此动力学确定 rhodocetin-α2A 复杂19的亲和常数 k, 它们非常类似于用滴定法测定了本研究中的 K 值。细微的差异可以通过不同批次或不同条件的活动变化和蛋白质样品贮存的持续时间来解释。在这以后尊敬, 在滴定法 ELISA 所有样品同时测量和不顺序地象在 SPR 机器。现在, 在数学上容易接近和易于管理的滴定曲线方程 (等式 9), 这种终点测量的滴定 ELISA 可能会变得像动力学评估实时测量一样强大, 这需要一个成本密集型的 SPR 机器。
该方程考虑了配体浓度的降低, 特别是在低配体浓度下, 配合物的总浓度。这使得滴定曲线在整个配体浓度范围内得到更好的近似值。与结合曲线相比, 滴定 ELISA 的一个缺点是, 到目前为止, 对滴定曲线的数学评价是困难的。而在结合曲线中, 游离配体 Lf在半最大饱和度上的浓度等于离解常数, 对于滴定曲线来说, 这不是真的。两种算法已独立开发成图形化进行线性化滴定曲线和确定离解常数。然而, 这两种算法都为光谱滴定实验 Stockell et 等。8和海恩 & Weischet9的缺点是, 必须以图形方式确定饱和率 Y 的最大信号。随着这个值的渐近, 饱和屈服, 因此计算出的离解常数是固有的误差容易。与此相反, 基于等式 9的算法使用来自滴定实验的原始数据, 并在非线性回归中计算离解常数 K 以及其他参数, 以找到最佳拟合解 (图 2和图3).此外, 由于该算法不需要以图形方式估计配体饱和度可能达到的最大信号, 所以评价过程变得更快、更准确, 且比图形化评估的偏差小。可以并行计算几种滴定曲线。这样, 可以同时测量几组滴定曲线, 并对其参数进行统计分析和比较。此外, 每一个滴定曲线给出一组值, 其中的离解常数 K, 固定化和结合主动受体 Rt, 动态范围作为最大和最小信号值的差异max和 smin, 以及与实验背景信号相对应的线性因子 B, 利用这些值, 可以计算和绘制饱和率 Y 的依赖于添加配体 Lt。在这种饱和屈服图中, 加配体在半最大饱和信号中的浓度 (50%) 等于离解常数 K 加一半固定化活性受体 Rt的总和。
等式10
这可以用等式 7派生给 Y = 0.5。因此, 固定化活性受体 Rt的浓度可以通过执行滴定酶联免疫吸附剂的不同涂层浓度的受体来确定。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该协议和算法是在德意志 Forschungsgemeinschaft (DFG 赠款 SFB1009 A09 和 EB177/13-1) 资助的一个项目内开发的。作者感谢芭芭拉 Schedding 和费利克斯 Schmalbein 的技术支持和赖能博士批判地阅读手稿。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIS | neoFrox | 1125KG001 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| NaCl | Applichem | 1,316,591,214 | |
| MgCl2 | Merck | 172571 | |
| integrin a2A, wild-type and mutant, recombinant | isolated in author's lab | ||
| NiNTA superflow column | Qiagen, Germany | 30821 | |
| Coomassie-Brilliant Blue R250 | Serva | 35050 | |
| bicinchoninic acid assay (BCA), protein concentration determination kit | Fisher Scientific | 23225 | |
| bovine serum albumine (BSA), fraction V | Applichem | A1391 | |
| 25 % solution of glutaraldehyde | Merck | 354400 | |
| anti-rabbit immunglobulin-antibodies from goat, conjugated with alkaline phosphatase | Sigma-Aldrich | A9919 | |
| Glycine | Applichem | A1377 | |
| Zn(II)-acetate | Applichem | A4324 | |
| NaOH | Applichem | A1551 | |
| Alkaline phosphatase substrate tablet (5 mg) | Sigma-Aldrich | S0942 | |
| Costar half-area microtiter plate | Thermo Scientific | Corning 3690 | |
| micro reaction tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| Microplate ELISA reader | BioTek | Synergy HT |
References
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