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Biochemistry

एक विधि के रूप में अनुमापन एलिसा रिसेप्टर Ligand बातचीत के पृथक्करण स्थिरांक निर्धारित करने के लिए

Published: February 15, 2018 doi: 10.3791/57334
Automatic Translation
1
1Institute of Physiological Chemistry and Pathobiochemistry, University of Münster

Summary

एक विस्तृत प्रोटोकॉल एक अनुमापन एलिसा प्रदर्शन करने के लिए वर्णित है । इसके अलावा, एक उपंयास एल्गोरिथ्म अनुमापन एलिसा का मूल्यांकन करने के लिए और एक microtiter प्लेट-मैटीरियल रिसेप्टर के लिए एक घुलनशील ligand के बंधन के एक पृथक्करण निरंतर प्राप्त करने के लिए प्रस्तुत किया है ।

Abstract

पृथक्करण लगातार बाध्यकारी संतुलन में दो भागीदारों के बीच बातचीत का वर्णन है और उनके संबंध का एक उपाय है । यह एक महत्वपूर्ण पैरामीटर के लिए विभिंन लाइगैंडों, जैसे, प्रतिस्पर्धी अवरोधकों, प्रोटीन isoforms और म्यूटेंट, एक बाध्यकारी भागीदार के लिए अपनी बाध्यकारी ताकत के लिए तुलना है । पृथक्करण स्थिरांक बाध्यकारी curves के रूप में मुक्त ligand बाउंड बनाम की सांद्रता की साजिश रचने से निर्धारित होते हैं । इसके विपरीत, अनुमापन घटता है, जिसमें एक संकेत है कि बाध्य ligand की एकाग्रता के लिए आनुपातिक है जोड़ा ligand की कुल एकाग्रता के खिलाफ साजिश रची है, बहुत रिकॉर्ड करने के लिए आसान कर रहे हैं । संकेत spectroscopically और एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) द्वारा पता लगाया जा सकता है । यह एक अनुमापन एलिसा के लिए एक प्रोटोकॉल में उदाहरण है कि सांप विष की बाध्यकारी-व्युत्पंन rhodocetin α2β1 integrin के अपने मैटीरियल लक्ष्य डोमेन के लिए उपाय । अनुमापन एलिसा बहुमुखी और व्यापक रूप से इस्तेमाल कर रहे हैं । बातचीत प्रोटीन के किसी भी जोड़ी के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है मैटीरियल रिसेप्टर और घुलनशील ligand, बशर्ते कि दोनों प्रोटीन शुद्ध कर रहे हैं, और उनकी सांद्रता जाना जाता है । कठिनाई अब तक एक अनुमापन वक्र से पृथक्करण लगातार निर्धारित किया गया है । इस अध्ययन में, एक गणितीय अनुमापन curves अंतर्निहित समारोह शुरू की है । किसी भी त्रुटि प्रवण एक संतृप्ति उपज की चित्रमय अनुमान के बिना, इस एल्गोरिथ्म कच्चे डेटा के प्रसंस्करण की अनुमति देता है (जोड़ा ligand के विभिंन सांद्रता पर संकेत तीव्रता) गैर रेखीय प्रतिगमन के माध्यम से गणितीय मूल्यांकन द्वारा सीधे । इस प्रकार, कई अनुमापन घटता एक साथ दर्ज किया जा सकता है और विशिष्ट मापदंडों का एक सेट में तब्दील, उनमें से पृथक्करण निरंतर और बाध्यकारी सक्रिय रिसेप्टर की एकाग्रता, और वे सांख्यिकीय मूल्यांकन किया जा सकता है. जब इस एल्गोरिथ्म के साथ संयुक्त, अनुमापन एलिसा सीधे पृथक्करण निरंतर पेश करने का लाभ प्राप्त करते हैं । इसलिए, वे भविष्य में और अधिक कुशलता से इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

पृथक्करण स्थिरांक K अपने ligand (L) के लिए एक रिसेप्टर (R) के संबध का वर्णन करने के लिए एक कुंजी पैरामीटर है. जन कार्रवाई के कानून के आधार पर, कश्मीर संतुलन के लिए परिभाषित किया गया है, जिसमें रिसेप्टर में ligand परिसर आरएल dissociates आर और ligand एल में:

Equation 1             समीकरण 1

के साथ सूचकांक एफ रिसेप्टर और ligand के मुक्त/असीम राज्य का संकेत है । रिसेप्टर की एकाग्रता-ligand जटिल, आर एल, रिसेप्टर की एकाग्रता के समान है-ligand एलबीबाध्य. रिसेप्टर आरटी की कुल एकाग्रता के रूप में मुक्त रिसेप्टर आरएफ और ligand-बाउंड रिसेप्टर आरबी = एलबीकी राशि है, पृथक्करण स्थिरांक भी के रूप में लिखा जा सकता है:

Equation 2         समीकरण 2

इसलिए, संतृप्ति की उपज Y, रिसेप्टर आरटीकी कुल एकाग्रता के संबंध में बाध्य ligand एलबी के अंश के रूप में परिभाषित,

Equation 3         समीकरण 3

मुक्त ligand एल की एकाग्रता पर निर्भर करता हैच:

Equation 4         समीकरण 4

इस अतिशयोक्तिपूर्ण संबंध एक रिसेप्टर ligand बातचीत के बंधन वक्र का वर्णन करता है और इसके भूखंड मुक्त ligand एलएफकी एकाग्रता के एक समारोह के रूप में बंधे ligand एलबी की एकाग्रता से पता चलता है. बंधन वक्र से, पृथक्करण लगातार कश्मीर आधा-अधिक से अधिक अधिकतम संतृप्ति उपज में मुक्त ligand की एकाग्रता के रूप में प्राप्त किया जा सकता है । इसके अलावा, विभिंन एल्गोरिदम linearize curves करने के लिए स्थापित किया गया है, जैसे Klotz द्वारा डबल पारस्परिक साजिश के रूप में1,2, या परिवर्तनों के अनुसार Scatchard या Hanes (Bisswanger3द्वारा की समीक्षा की) । हालांकि, सभी एल्गोरिदम समस्या यह है कि संतृप्ति उपज है, जो asymptotically बंधन वक्र में मुक्त ligand के उच्च सांद्रता पर संपर्क किया है की अधिकतम मूल्य से ग्रस्त है, एक चित्रमय पूर्व मूल्यांकन में अनुमान लगाया जा सकता है और इसलिए है त्रुटि-प्रवण ।

इसके अलावा, एक बाध्यकारी वक्र के निर्धारण के बंधन संतुलन के दौरान स्वतंत्र और समयबद्ध ligand के ठहराव की आवश्यकता है । इस अंत करने के लिए, मुक्त ligand रिसेप्टर बाध्य ligand और quantified से अलग हो गया है । इसलिए, ligand और रिसेप्टर के लिए एक प्रोटीन रिसेप्टर के विरोध के रूप में एक गैर प्रोटीन ligand के रूप में उनकी संपत्तियों, में अलग करने के लिए है. यदि दोनों बाध्यकारी भागीदारों प्रोटीन हैं, वे अपने आकार, शुल्क, या अंय आणविक सुविधाओं में भेद किया जाना है । फिर भी, छोटे पैमाने पर बाध्यकारी दृष्टिकोण में ligand सांद्रता के ठहराव एक कठिन काम है । ligand के रेडियोधर्मी लेबल अक्सर बाध्य ligand की कम एकाग्रता का पता लगाने के लिए आवश्यक हो गया है, विशेष रूप से अगर रिसेप्टर्स की पर्याप्त मात्रा में उपलब्ध है या सस्ती नहीं थे. इसके अलावा, रिसेप्टर बाउंड ligand अलग कर देना के दौरान और अलगाव के बाद एक गैर नगण्य तरीके से हो सकता है । इसलिए, ऐसे संतुलन जेल निस्पंदन4, केशिका ट्रो5, और पल्स प्रोटियोलिसिस6, के रूप में जटिल तरीके, रिसेप्टर से बंधे ligand यों की आवश्यकता होती है और यह मुफ्त ligand से अलग ।

इन बाध्यकारी परख के विपरीत, अनुमापन प्रयोगों बाध्य और मुक्त ligand के मात्रात्मक जुदाई की आवश्यकता नहीं है । इस अंत करने के लिए, एक निरंतर एकाग्रता में एक रिसेप्टर जोड़ा ligand के विभिन्न सांद्रता के साथ titrated है. रिसेप्टर के लिए बाध्यकारी द्वारा, बाध्य ligand एक भौतिक संपत्ति है जो इसे मुक्त ligand से अलग है और से मध्यम श्रेणी का है, जैसे, photometry, fluorometry, या एंटीबॉडी का पता लगाने । इस प्रकार, एक संकेत एस, जो संतृप्ति के लिए आनुपातिक है और फलस्वरूप भी रिसेप्टर की एकाग्रता के लिए बाध्य ligand (एलबी), जोड़ा ligand की कुल एकाग्रता के एक समारोह के रूप में पता चला है (एलटी). दोनों मापदंडों, संकेत एस और जोड़ा ligand की कुल एकाग्रता बाध्य और मुक्त ligand की सांद्रता की तुलना में एक प्रत्यक्ष और आसान तरीके से quantified हैं. विशेष रूप से, रिसेप्टर का पता लगाने-ligand एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) के लिए नमूना मात्रा की कमी से नीचे १०० µ एल के रूप में अच्छी तरह से बहु में कई ligand सांद्रता के समानांतर माप अच्छी तरह से microtiter प्लेट की अनुमति दी । एक अनुमापन एलिसा में, एक रिसेप्टर शारीरिक रूप से एक ही एकाग्रता और घुलनशील ligand के साथ titrated में एक microtiter प्लेट को adsorbed है । रिसेप्टर hydrophobic सोखना द्वारा अनिवार्य रूप से प्लास्टिक की सतह के लिए मैटीरियल है । स्थिर रिसेप्टर की सतह एकाग्रता एक रैखिक संबंध में रिसेप्टर की कोटिंग एकाग्रता के साथ संबद्ध, Langmuir ´ एस सोखना isotherm के अनुसार होने की संभावना7. adsorbed रिसेप्टर अणुओं की कुल संख्या के अलावा, उनकी गतिविधि राज्य अनुमापन परख के लिए एक और महत्वपूर्ण पैरामीटर है । केवल स्थिर रिसेप्टर्स जो ligand बाध्यकारी गतिविधि को बनाए रखा है, अनुमापन परख के लिए प्रासंगिक है और अंततः सक्रिय रिसेप्टर्स के कुल एकाग्रता के लिए योगदान आरटी अनुमापन परख, जो सीधे निर्धारित नहीं किया जा सकता है ।

प्लास्टिक की सतह पर साइटों, जो मैटीरियल रिसेप्टर द्वारा कवर नहीं कर रहे हैं adsorb अन्य प्रोटीन, जैसे ligand के लिए प्रवण हैं । इस तरह के प्लास्टिक की सतह साइटों को ligand के भौतिक सोखना रिसेप्टर बाध्य ligand के रूप में एक समान संकेत में परिणाम, अभी तक एक गैर विशिष्ट तरीके से होगा । इस विशिष्ट संकेत को कम करने के लिए, प्लास्टिक की सतह साइटों microtiter प्लेटों जो प्रोटीन के साथ लेपित नहीं किया गया है अभी तक गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) के साथ अवरुद्ध हो जाएगा । हालांकि, कुछ रिसेप्टर-ligand अनुमापन परख के लिए, गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि संकेतों मनाया जा सकता है । फिर, अंय ब्लॉकिंग एजेंटों, जैसे ०.२% जिलेटिन या ०.०४% 20 के बीच की एक समाधान की सिफारिश की है ।

रिसेप्टर के लिए बाध्यकारी के बाद, मुक्त ligand दो धोने कदम से हटा दिया है. बाउंड ligand रिसेप्टर, जो अच्छी तरह से microtiter की प्लास्टिक की सतह के लिए मैटीरियल है, और वैकल्पिक रूप से रासायनिक निर्धारण द्वारा प्रबलित के साथ रहता है । बाद के आबंध पार के लिए बाध्य ligand और glutaraldehyde के साथ मैटीरियल रिसेप्टर का संबंध, बफर पदार्थ TRIS HEPES के लिए जगह है, ligand बंधन में किसी भी परिवर्तन के बिना । HEPES, TRIS के विपरीत, glutaraldehyde को निष्क्रिय नहीं करता है । आबंध पार glutaraldehyde के साथ संपर्क अपने रिसेप्टर के साथ बंधे ligand को ठीक करता है और बाद में कपड़े धोने और गर्मी कदम के दौरान अपनी पृथक्करण रोकता है । इस प्रकार, रिसेप्टर ligand बातचीत रासायनिक जम जाता है और एक अनुमापन वक्र जो धोने और गर्मी के बाद के कदम से अप्रभावित है वारंट । हालांकि, glutaraldehyde निर्धारण रासायनिक ligand और रिसेप्टर इस तरह से संशोधित कर सकते हैं कि उनकी बातचीत कम या समाप्त हो गया है. इसके अलावा, ligand के भीतर epitopes के संशोधन का पता लगाने एंटीबॉडी के बंधन संबध बदल सकते हैं, खासकर अगर एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के लिए बाध्य ligand यों तो इस्तेमाल किया जाता है । हालांकि glutaraldehyde निर्धारण के इन प्रतिकूल प्रभाव का न तो इस अनुमापन एलिसा में होता है, glutaraldehyde की ओर परीक्षण की संवेदनशीलता हर रिसेप्टर ligand बातचीत के लिए अनुमापन प्रयोग करने से पहले परीक्षण किया जाना चाहिए । निर्धारण के बाद, अतिरिक्त glutaraldehyde TRIS-युक्त बफर के साथ तीन धुलाई चरणों में हटा दिया जाता है । TRIS शेष एल्डिहाइड समूहों, जो विशेष रूप से बाद में कदम में एंटीबॉडी का पता लगाने के साथ प्रतिक्रिया हो सकती है निष्क्रिय करता है ।

बंधे ligand की मात्रा एंजाइम से जुड़े एंटीबॉडी के साथ quantified है, जो एक भामिति एलिसा संकेत एस प्रदान करते हैं । इस बनाम कुल ligand एकाग्रता एलटी एक अच्छी तरह से जोड़ा साजिश रची है । इसके आसान अधिग्रहण के बावजूद, अनुमापन वक्र बाध्यकारी वक्र के विपरीत में एक अतिशयोक्तिपूर्ण समारोह नहीं है । इसके अलावा, यह कैसे एक अनुमापन वक्र से पृथक्करण लगातार कश्मीर की गणना करने के लिए स्पष्ट नहीं किया गया है । हालांकि linearize spectroscopically अनुमापन curves करने के लिए एल्गोरिदम स्वतंत्र रूप से Stockell8 और Heyn और Weischet9द्वारा सूचित किया गया है, वे कम अधिकतम संकेत मूल्य का आकलन करने के अपने अनिश्चितता के कारण गिर गया है कि जोड़ा ligand के उच्च सांद्रता पर संतृप्ति उपज दृष्टिकोण ।

यहां, एक अनुमापन एलिसा और एक गैर रेखीय प्रतिगमन एल्गोरिथ्म एक अनुमापन वक्र से एक रिसेप्टर ligand बातचीत के लिए पृथक्करण निरंतर कश्मीर प्राप्त करने के लिए वर्णित हैं । इस प्रोटोकॉल कोलेजन की बातचीत के लिए उदाहरण है एक सर्प विष के साथ एक integrin α2β1 के डोमेन बाध्यकारी--अवरोध करनेवाला । Integrins कोशिका आसंजन अणु हैं, जो आसपास के extracellular मैट्रिक्स या अंतर्निहित तहखाने झिल्ली के लिए कोशिकाओं के anchorage मध्यस्थता10,11. इसके अलावा, integrins कोशिकाओं और extracellular मैट्रिक्स के बीच अतिरिक्त संकेतन अणुओं की भर्ती और नए सेल organelles, adhesomes, सेल-मैट्रिक्स बातचीत पर12,13के गठन से महत्वपूर्ण संकेतों को व्यक्त करते हैं, 14. कोलेजन, α2β1 integrin के ligand, मानव शरीर के सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन है और संयोजी ऊतक के एक महत्वपूर्ण मचान घटक15है । α2β1 integrin और कोलेजन के बीच बातचीत integrin α2 उपइकाई के एक डोमेन द्वारा मध्यस्थता है । integrin α2A-डोमेन एक divalent कटियन, जो कोलेजन बाध्यकारी के लिए आवश्यक है और अपनी संरचना स्थिर होता है । जंगली प्रकार के रूप में अच्छी तरह के रूप में α2A डोमेन के म्यूटेंट, जैसे एक जिसमें सतह उजागर अवशेषों Y216 एक glycine के लिए प्रतिस्थापित किया गया था, आसानी से एक बैक्टीरियल अभिव्यक्ति प्रणाली में recombinantly का उत्पादन किया जा सकता है और उनके oligo के माध्यम से अलग-एक नि्ता के साथ टैग- TRIS-बफर खारा के खिलाफ बाद डायलिसिस के साथ superflow कॉलम (टीबीएस; ५० mm TRIS/एचसीएल, पीएच ७.४, १५० mm NaCl) जिसमें 2 mM MgCl216है । उनकी सांद्रता bicinchoninic एसिड परख (बीसीए) के साथ निर्धारित की गई थी और उनके purities पारंपरिक एसडीएस-पृष्ठ और Coomassie-प्रतिभाशाली नीले R250 के साथ दाग द्वारा परीक्षण कर रहे हैं ।

α2β1 integrin और कोलेजन के बीच बातचीत सर्प विष घटक, rhodocetin से, मलयन पिट सांप (Calloselasma rhodostoma)16,17से बाध्यकारी द्वारा अवरुद्ध है । इस अनुमापन एलिसा में एक घुलनशील ligand के रूप में प्रयुक्त, rhodocetin कच्चे जहर से शुद्ध के रूप में पहले16वर्णित है । यह HEPES-बफर खारा में भंग कर रहा है (एचबीएस; 10 मिमी HEPES/NaOH, पीएच ७.४, १५० मिमी NaCl) और पर जमे हुए संग्रहीत है-20 ° c. इसकी एकाग्रता बीसीए द्वारा निर्धारित की गई थी और इसकी शुद्धता एसडीएस-पृष्ठ द्वारा सिद्ध की गई थी. एक विरोधी के रूप में, rhodocetin न केवल ब्लॉक कोलेजन integrin α2β1 ए-डोमेन के लिए, लेकिन यह भी integrin के निष्क्रिय अनुरूप स्थिर जिससे या कोशिकाओं या प्लेटलेट्स में कोलेजन से किसी भी संकेतन को रोकने18। यह महान जैव चिकित्सा महत्व का है अपने रिसेप्टर लक्ष्य के साथ rhodocetin के पृथक्करण निरंतर निर्धारित है और इस तरह अपने आणविक तंत्र और दवा की क्षमता को सुलझाना उदा, एक antithrombotic एजेंट के रूप में. यह अंत करने के लिए, एक अनुमापन एलिसा अपने मूल्यांकन, जो लगभग किसी भी रिसेप्टर एक 1:1 बातचीत stoichiometry के साथ ligand बातचीत के लिए लागू है सहित वर्णित है ।

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Protocol

1. स्टॉक समाधान

  1. १०० मिलीलीटर की 10x टीबीएस पीएच ७.४ समाधान तैयार करने के लिए, TRIS के ६.०६ जी भंग और NaCl के ८.७७ ग्राम में पानी की ९० मिलीलीटर, ७.४% एचसीएल समाधान के साथ पीएच को समायोजित करने के लिए, मात्रा को भरने के पानी के साथ ३७ मिलीलीटर, और समाधान फिल्टर ।
  2. 1 एम HEPES/NaOH, पीएच ७.४ समाधान के १०० मिलीलीटर तैयार करने के लिए, पानी के ९० मिलीलीटर में HEPES के २३.८३ ग्राम भंग, ७.४ एम NaOH के साथ १.५ के लिए पीएच समायोजित, पानी के साथ १०० मिलीलीटर के लिए मात्रा को भरने, और समाधान फिल्टर ।
  3. 5 मीटर NaCl समाधान की १०० मिलीलीटर तैयार करने के लिए, NaCl के २९.२ ग्राम को भंग पानी के ९० मिलीलीटर में । पानी के साथ १०० मिलीलीटर के लिए मात्रा भरें और समाधान फिल्टर ।
  4. तैयार करने के लिए १०० मिलीलीटर की 1 M MgCl2 समाधान, भंग २०.३३ g के MgCl2 · 6H में ९० मिलीलीटर पानी में2हे. पानी के साथ १०० मिलीलीटर के लिए मात्रा भरें और समाधान फिल्टर ।
  5. पानी में 5% गर्मी-निष्क्रिय BSA तैयार करने के लिए, एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में BSA (अंश वी, पीएच ७.०) के २.५ ग्राम वजन और जल के ४५ मिलीलीटर में इसे भंग । ५० मिलीलीटर पानी के साथ समाधान भरें, और ४५ मिनट के लिए ६८ डिग्री सेल्सियस पर एक पानी स्नान में समाधान गर्मी । यह एक बर्फ स्नान में ठंडा और यह दुकान पर-20 ° c ।
  6. जलीय 25% glutaraldehyde समाधान तैयार करें ।
    चेतावनी: Glutaraldehyde हानिकारक है अगर निगल लिया, साँस लेना द्वारा विषाक्त, और कारण जलता है । सुरक्षात्मक कपड़े, दस्ताने पहनते हैं, और आंख/
  7. खरगोश आनटिसम के रूप में पहले वर्णित19उठाएं । आनटिसम का titer मानक चलत20के अनुसार निर्धारित किया गया था ।
  8. क्षारीय फॉस्फेट के साथ बकरी संयुग्मित से एंटी-खरगोश immunoglobulin-एंटीबॉडी तैयार करें ।
  9. ०.१ मीटर glycine समाधान के १०० मिलीलीटर तैयार करने के लिए, glycine के ९० मिलीलीटर में ०.७५ ग्राम भंग पानी की । १.५ मीटर NaOH समाधान के साथ १०.४ करने के लिए पीएच समायोजित करें, पानी के साथ १०० मिलीलीटर के लिए मात्रा को भरने, और समाधान फिल्टर ।
  10. तैयार करने के लिए १०० मिलीलीटर की ०.५ मीटर Zn (ii)-एसीटेट हल, भंग १०.९८ g के Zn (ii)-एसीटेट · 2H में ९० मिलीलीटर पानी में2हे. पानी के साथ १०० मिलीलीटर के लिए मात्रा भरें और समाधान फिल्टर ।
  11. १.५ मीटर NaOH समाधान के १०० मिलीलीटर तैयार करने के लिए, NaOH के ९० मिलीलीटर में ६.० ग्राम भंग पानी की । पानी के साथ १०० मिलीलीटर के लिए मात्रा भरें और समाधान फिल्टर ।

2. तैयार बफ़र्स और कार्य समाधान

  1. पतला 10x टीबीएस पीएच ७.४ के 5 मिलीलीटर, ४५ मिलीलीटर जल के साथ और एक 1 मीटर MgCl के १०० µ एल जोड़ने के2 स्टॉक समाधान । इसे कमरे के तापमान पर रखें । टीबीएस, पीएच ७.४, 2 मिमी MgCl2 समाधान रिसेप्टर के स्थिरीकरण के लिए है और microtiter प्लेट धोने.
  2. गर्म पानी में निष्क्रिय BSA के 5% के 10 मिलीलीटर पतला और 10x टीबीएस के 5 मिलीलीटर, ५० मिलीलीटर के लिए जल के साथ पीएच ७.४ । 1 M MgCl2 स्टॉक सॉल्यूशन के १०० µ l को जोड़ें और समाधान को अच्छी तरह से मिलाएं । यह बर्फ पर रखें और-20 डिग्री सेल्सियस पर आगे प्रयोगों के लिए यह दुकान. ध्यान दें कि टीबीएस में 1% BSA की २.५ मिलीलीटर, पीएच ७.४, 2 मिमी MgCl2 प्रत्येक अनुमापन वक्र के लिए आवश्यक हैं ।
  3. पतला २.५ एमएल का 1 एम HEPES/NaOH, पीएच ७.४ और १.५ मिलीलीटर 5 मीटर NaCl समाधान के लिए ५० मिलीलीटर पानी के साथ, १०० µ एल 1 एम MgCl2 समाधान जोड़ें, और समाधान अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए तैयार ५० एमएल एचबीएस, पीएच ७.४:५० मिमी HEPES/NaOH , १५० मिमी NaCl.
  4. 5 µ l को 1m MgCl2 शेयर हल और 2 µ l ०.५ m Zn (II)-एसीटेट शेयर हल को 5 मिलि ०.१ m glycine हल, पीएच १०.४ alkaline फॉस्फेट (एपी) बफर (०.१ मीटर glycine समाधान, पीएच १०.४, 1 मिमी MgCl2, ०.२ मिमी Zn (द्वितीय)-एसीटेट) तैयार करने के लिए ।

3. एक Microtiter प्लेट के लिए रिसेप्टर (Integrin α2A-डोमेन) के स्थिरीकरण

  1. टीबीएस में integrin α2A-डोमेन के शेयर समाधान पतला, पीएच ७.४, 2 मिमी MgCl2 5 µ g/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए ।
    नोट: कोटिंग समाधान की मात्रा एक अनुमापन वक्र के लिए ६५० µ एल है एक आधा क्षेत्र के एक 12 अच्छी तरह से पंक्ति-microtiter प्लेट शामिल है ।
  2. एक आधे क्षेत्र पर एक पंक्ति के हर अच्छी तरह से भरें-५० µ एल के साथ microtiter प्लेट/integrin α2A के 5 µ जी/एमएल कोटिंग समाधान-डोमेन (वंय-प्रकार या उत्परिवर्ती) । प्रत्येक अनुमापन पंक्ति को कम से डुप्लिकेट में निष्पादित करें (इस उदाहरण में quadruplets के रूप में; आरेख 1में microtiter प्लेट का लेआउट देखें) ।
  3. पंनी के साथ प्लेट सील या एक ढक्कन के साथ बंद करो । रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर थाली छोड़ दें ।

4. धो प्लेट के लेपित कुओं टीबीएस, पीएच ७.४, 2 मिमी MgCl2 के साथ दो बार

  1. घुलनशील रिसेप्टर अणुओं, जो भौतिक सोखना द्वारा प्लास्टिक की सतह के लिए स्थिर नहीं किया गया है हटाने के लिए, कोटिंग समाधान निकालें और टीबीएस के ५० µ एल के साथ एक अच्छी तरह से भरने, पीएच ७.४, 2 मिमी MgCl2.
  2. वाश समाधान निकालें । यह सुनिश्चित करें कि कुएँ सूख न जाएँ. इसलिए, अवशिष्ट द्रव को दूर करने के लिए एक ऊतक के कपड़े पर microtiter प्लेट नल नहीं है । कुएं को जल्दी भरने के लिए एक multistep पिपेट या मल्टी चैनल पिपेट का प्रयोग करें ।
  3. इस वाशिंग स्टेप को एक बार दोहराएं ।

5. ब्लॉक विशिष्ट बाइंडिंग साइटों

  1. टीबीएस में 1% BSA समाधान के ५० µ एल जोड़ें, पीएच ७.४, 2 मिमी MgCl2 प्रत्येक अच्छी तरह से ।
  2. पंनी के साथ कुओं को सील या एक ढक्कन के साथ बंद ।
  3. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए कुओं की मशीन ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल की मशीन कदम के किसी भी एक कमाल या मिलाते हुए मंच पर प्रदर्शन किया जा सकता है । हालांकि, यह आवश्यक नहीं है और प्रयोग के परिणाम में परिवर्तन नहीं करता है ।

6. Ligand, Rhodocetin की एक धारावाहिक कमजोर पड़ने पंक्ति की तैयारी

  1. rhodocetin की शुरुआत एकाग्रता और धारावाहिक कमजोर पड़ने के कमजोर पड़ने कारक, ligand सांद्रता की एक उपयुक्त सीमा प्राप्त करने के लिए और एक ंयूनतम और अधिकतम संकेत के साथ एक पूर्ण अनुमापन वक्र रिकॉर्ड करने के लिए बदलती हैं । इस प्रयोग में, २४३ एनएम rhodocetin की एक शुरुआत एकाग्रता और २.३ के एक कमजोर पड़ने कारक रोजगार । rhodocetin स्टॉक समाधान सीरियल कमजोर पड़ने पंक्ति के उच्चतम ligand एकाग्रता को पतला । २.३ के एक कमजोर कारक के साथ प्रत्येक अनुमापन वक्र के लिए, २४३ एनएम के ११५ µ एल तैयार (यानी, 15, 2 µ जी/BSA, पीएच ७.४, 2 मिमी टीबीएस2 टेस्ट ट्यूब में #1 ।
  2. भरें ६५ µ एल के 1% BSA समाधान में टीबीएस, पीएच ७.४, 2 मिमी MgCl2 में 10 टेस्ट ट्यूबों, लेबल के माध्यम से #2 #11.
  3. स्थानांतरण ५० टेस्ट ट्यूब #1 से rhodocetin कमजोर पड़ने के µ l टेस्ट ट्यूब #2, मिश्रण दोनों समाधान (कुल मात्रा: ११५ µ l; कमजोर पड़ने फैक्टर: 1:2.3) trituration द्वारा, और फिर ५० µ एल इस मिश्रण से परीक्षण ट्यूब #3, आदि के लिए स्थानांतरण ।
  4. जारी रखें इस धारावाहिक कमजोर पड़ने तक टेस्ट ट्यूब #11 ।
    नोट: ६.१-६.४ चरणों में दिए गए वॉल्यूम एक अनुमापन वक्र के लिए पर्याप्त हैं । इन वॉल्यूंस को दोहराने की संख्या से गुणा । इस स्थिति में, आठ अनुमापन curves (quadruplets दो α2A-डोमेन प्रपत्रों की) निष्पादित करें और निम्न वॉल्यूम तैयार: ९२० परीक्षण ट्यूब में सबसे अधिक एकाग्रता में rhodocetin समाधान के µ एल #1; ५२० µ एल के 1% BSA में टीबीएस, पीएच ७.४, 2 मिमी MgCl2 में से प्रत्येक में भरने के लिए परीक्षण ट्यूबों #2 #11; और एक ट्यूब से अगले एक करने के लिए स्थानांतरण मात्रा के ४०० µ एल.

7. अलग सांद्रता पर Ligand (Rhodocetin) के बंधन में स्थिर रिसेप्टर (Integrin α2A-डोमेन)

  1. एक वैक्यूम लाइन से microtiter प्लेट कुओं से अवरुद्ध समाधान निकालें ।
  2. तुरंत rhodocetin समाधान के ५० µ l को 1% BSA/टीबीएस में जोड़ें, pH 7.4/MgCl2 परीक्षण ट्यूब का समाधान स्तंभ 1 के कुओं में #1, परीक्षण ट्यूब का समाधान स्तंभ 2 के कुओं के लिए #2,आदि टीबीएस में 1% BSA के ५० µ एल जोड़ें, पीएच ७.४ , 2 मिमी MgCl2 (अवरुद्ध और कमजोर पड़ने बफर) स्तंभ 12 के कुओं के लिए एक ligand मुक्त नियंत्रण के रूप में (microtiter प्लेट के लेआउट देखें, चित्रा 1).
  3. पंनी के साथ कुओं को सील या एक ढक्कन के साथ बंद ।
  4. कमरे के तापमान पर १.५ घंटे के लिए (20-22 डिग्री सेल्सियस के आसपास) कुओं की मशीन ।

8. प्लेट के कुओं धो दो बार एचबीएस, पीएच ७.४, 2 मिमी MgCl2 के साथ

  1. गैर बंधे ligand अणुओं को दूर करने के लिए, बाध्यकारी समाधान को दूर करने और एचबीएस के ५० µ एल के साथ एक अच्छी तरह से भरने, पीएच ७.४, 2 मिमी MgCl2। फिर, धो समाधान निकालें ।
  2. ध्यान रखें कि कुएँ सूख न जाएँ. इसलिए, अवशिष्ट द्रव को दूर करने के लिए एक ऊतक के कपड़े पर microtiter प्लेट नल नहीं है । कुएं को जल्दी भरने के लिए एक multistep पिपेट या मल्टी चैनल पिपेट का प्रयोग करें ।
  3. इस वाशिंग स्टेप को एक बार दोहराएं ।

9. एचबीएस में २.५% Glutaraldehyde के साथ रिसेप्टर-बाउंड Ligand फिक्स, पीएच ७.४, 2 मिमी MgCl2

  1. 25% glutaraldehyde समाधान और एचबीएस के 9 भागों, पीएच ७.४, 2 मिमी MgCl2के 1 भाग को मिलाकर एक ताजा २.५% glutaraldehyde समाधान तैयार करें ।
  2. एचबीएस, पीएच ७.४, 2 मिमी MgCl2में २.५% glutaraldehyde समाधान के ५० µ एल के साथ microtiter प्लेट के हर कुआं भरें । कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए microtiter प्लेट की मशीन ।

10. प्लेट के कुओं को धोकर तीन बार ५० µ l/टीबीएस, पीएच ७.४, 2 मिमी MgCl2 के साथ

  1. अतिरिक्त glutaraldehyde को हटाने और निष्क्रिय करने के लिए, निर्धारण समाधान निकालें और टीबीएस, pH ७.४, 2 mM MgCl2के ५० µ l के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से भरें । फिर धो समाधान निकालें ।
    नोट: glutaraldehyde-युक्त निर्धारण समाधान microtiter प्लेट से एक डिश में डालो और यह टीबीएस, पीएच ७.४ के एक बराबर मात्रा द्वारा निष्क्रिय किया गया है के बाद निर्धारण समाधान त्यागें ।
  2. ध्यान रखें कि कुएँ सूख न जाएँ. इसलिए, अवशिष्ट द्रव को दूर करने के लिए एक ऊतक के कपड़े पर microtiter प्लेट नल नहीं है । कुएं को जल्दी भरने के लिए एक multistep पिपेट या मल्टी चैनल पिपेट का प्रयोग करें ।
  3. इस धुलाई चरण को दो बार दोहराएं ।

11. ठहराव रिसेप्टर की बाध्य Ligand एलिसा द्वारा

  1. जोड़ें ५० µ में प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 1% BSA में टीबीएस, pH ७.४, 2 mM MgCl2। प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान एक खरगोश के खिलाफ उठाया आनटिसम है rhodocetin19, पतला 1:2000 में 1% BSA में टीबीएस, पीएच ७.४, 2 मिमी MgCl2.
  2. कमरे के तापमान पर ७५-९० मिनट के लिए थाली मशीन । प्लेट के सभी कुओं को धोकर तीन बार ५० µ l/टीबीएस, पीएच ७.४, 2 मिमी MgCl2के साथ । तीन धोने चरणों के दौरान, एक ऊतक कपड़े पर microtiter प्लेट के दोहन की आवश्यकता नहीं है ।
  3. जोड़ें ५० µ में माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 1% BSA में टीबीएस, पीएच ७.४, 2 मिमी MgCl2। इस अंत करने के लिए, माध्यमिक एंटीबॉडी, खरगोश immunoglobulin-लक्ष्यीकरण बकरी एंटीबॉडी alkaline फॉस्फेट के साथ संयुग्मित, 1 के लिए: 2000 में 1% BSA में टीबीएस, पीएच ७.४, 2 मिमी MgCl2। कमरे के तापमान पर ७५-९० मिनट के लिए थाली मशीन ।
  4. एपी-एक 5 मिलीग्राम गोली भंग द्वारा समाधान का पता लगाने तैयार 4-nitrophenyl फॉस्फेट disodium नमक hexahydrate (फॉस्फेट सब्सट्रेट) एपी बफर के 5 मिलीलीटर (०.१ मीटर glycine समाधान, पीएच १०.४, युक्त 1 मिमी MgCl2 और ०.२ मिमी Zn (II)-एसीटेट).
  5. प्लेट के सभी कुओं को धोकर तीन बार ५० µ l/टीबीएस, pH ७.४, 2 mM MgCl2, के साथ तुरंत अगले कदम पर प्रदर्शन करने से पहले । तरल के सभी निशान को दूर करने के लिए पिछले धुलाई कदम के बाद एक ऊतक कपड़े पर microtiter प्लेट टैप करें ।
  6. जोड़ें ५० µ l/एपी के microtiter प्लेट के कुओं का पता लगाने के समाधान । एक साथ संभव के रूप में एंजाइमी रूपांतरण शुरू करने के लिए सभी कुओं को तुरंत एपी का पता लगाने के समाधान जोड़ें । इसलिए, एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग करें ।
  7. उच्चतम ligand एकाग्रता के साथ कुओं में समाधान तक कमरे के तापमान पर थाली गर्मी पीले रंग की बारी है ।
    नोट: मशीन समय संकेत तीव्रता के आधार पर 5 मिनट और 1 एच के बीच भिन्न हो सकते हैं.
  8. फॉस्फेट सब्सट्रेट का रूपांतरण बंद करो जोड़कर ५० µ l/अच्छी तरह से १.५ मीटर NaOH समाधान । दोनों समाधानों की लकीर मुक्त मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए कई मिनट के लिए खड़े प्लेट छोड़ दें । सभी कुओं में एक ही मशीन अवधि वारंट, एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग करें और एक ही क्रम में १.५ मीटर NaOH जोड़ें एपी के रूप में कुओं को जोड़ा-११.८ कदम में सब्सट्रेट का पता लगाने ।
  9. एक एलिसा पाठक द्वारा एक अच्छी तरह से ४०५ एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो) उपाय ।

12. अनुमापन संकेतों का मूल्यांकन

  1. Excel के साथ raw डेटा की तालिका, आयुध डिपो405nm मान खोलें । के रूप में अनुमापन curves के इन संकेत मूल्यों पंक्तियों में पढ़ रहे हैं, एक कॉलम और लेबल के लिए एक और कॉलम में जोड़ा ligand की सांद्रता के साथ मूल्यों स्थानांतरित ।
  2. Graphpad चश्मे 5 (संस्करण ५.०) खोलें । मुख्य मेनू में कोई नई प्रोजेक्ट फ़ाइल खोलें । नया डेटा & ग्राफ़के अंतर्गत XY स्वरूप चुनें । Y-अक्ष के लिए प्रत्येक मान के लिए कोई एकल बिंदु दर्ज करें और प्लॉट विकल्प चुनें ।
  3. दो कॉलम, एक्सेल फ़ाइल से जोड़ा ligand और संकेत मूल्यों (ओडी405nm मूल्यों) की एकाग्रता और एक्स और वाई मूल्यों, क्रमशः के रूप में GraphPad चश्मे के डेटा पत्रक में पेस्ट की प्रतिलिपि ।
  4. GraphPad चश्मे 5 के विश्लेषण उप-प्रोग्राम खोलें और XY-विश्लेषणके अंतर्गत विकल्प गैर रेखीय प्रतीपगमन चुनें । यूज़र-डिफ़ाइंड समीकरण चुनें और नया समीकरण बनाने के लिए नया बटन दबाएं ।
  5. प्रपत्र में अनुमापन वक्र समीकरण लिखें: Y = (Smax-Smin) * ((x + r + k)-sqrt ((x + r + k) ^ 2-4 * r * x))/(2 * r) + Smin + B * X नए खोले गए टेम्पलेट पत्रक में, वाई के साथ संकेत मूल्य जा रहा है, एक्स जोड़ा ligand की एकाग्रता जा रहा है L , आर स्थिर रिसेप्टर की एकाग्रता जा रहा है, कश्मीर पृथक्करण लगातार जा रहा है, और बी पृष्ठभूमि ढलान जा रहा है. उपयुक्त बाधाओं को परिभाषित करें, जैसे कि K > 0 और R > 0 ।
    नोट: यह समीकरण एक अलग रूप में समीकरण 9 का समीकरण है ।
  6. नया बनाया गया था जो यूज़र-डिफ़ाइंड समीकरण, चुनकर डेटा पत्रक के मान का विश्लेषण करें । परिकलित सन्निकटन मानों (K, Rt, smax, smin, और B) के साथ तालिका खोलें जो सॉफ़्टवेयर स्क्रीन के बाईं ओर परिणाम अनुभाग के अंतर्गत दिखाए जाते हैं.
    नोट: सॉफ़्टवेयर निर्धारित करता है 5 पैरामीटर चलने फिटिंग गैर-रेखीय प्रतीपगमन के द्वारा केवल यदि अनुमापन वक्र कम से 5 डेटा बिंदुओं के होते हैं ।
  7. मानकों का मूल्यांकन करें K, Rt, smax, smin, और B अनुमापन curves के हर समूह के लिए सांख्यिकीय, और समूह के विशिष्ट सुविधा के साथ मापदंडों सहसंबंधी बनाना (या रूपांतरित या रासायनिक संशोधित ligand या रिसेप्टर).

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Representative Results

एलिसा विकसित किया गया है के बाद, परिवर्तित alkaline फॉस्फेट सब्सट्रेट, पैरा-nitrophenolate के पीले रंग, इंगित करता है कि बंधे rhodocetin ligand की मात्रा से जोड़ा rhodocetin के घटते सांद्रता के साथ कम हो जाती है स्तंभ 1 से 11 (चित्र 1) । स्तंभ 12 में rhodocetin-मुक्त कुओं में बेरंग कुएँ एक कम पृष्ठभूमि संकेत दिखाएँ.

४०५ एनएम पर भामिति ठहराव डेटा है, जो सीधे एक विश्लेषण सॉफ्टवेयर में खिलाया जा सकता है प्रदान करता है, और एक गैर रेखीय प्रतिगमन और समीकरण 9का उपयोग करके, प्रत्येक अनुमापन पंक्ति के कच्चे डेटा अनुमानित और संकेत एस की गणना (जो ओडी के बराबर होती है 405nm) की कुल एकाग्रता का एक समारोह के रूप में जोड़ा rhodocetin ligand एलटी (चित्रा 2) । चार अनुमापन एक रिसेप्टर फार्म के लिए घटता है (जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती) अत्यधिक reproducible और लगभग एक दूसरे को superpose हैं । इस कम अंतर समूह विचरण के विपरीत, अनुमापन curves के दो समूहों को स्पष्ट रूप से एक दूसरे से अलग हैं । rhodocetin ligand के उच्च सांद्रता उत्परिवर्ती α2A के लिए बाध्यकारी के लिए आवश्यक हैं-डोमेन जंगली प्रकार के फार्म के लोगों के लिए इसी तरह के मूल्यों के संकेतों को प्राप्त करने के लिए । अनुमापन curves का यह सही बदलाव दर्शाता है कि उत्परिवर्ती ligand ligand के लिए एक कम अपनत्व है । इस प्रकार, α2A डोमेन में शुरू उत्परिवर्तन rhodocetin बाध्यकारी है क्योंकि यह integrin डोमेन के rhodocetin बंधन साइट का हिस्सा है18।

अनुमापन वक्र 5 विशिष्ट मापदंडों द्वारा वर्णित किया जा सकता है: (i) पृथक्करण निरंतर K, (ii) स्थिर की एकाग्रता, जैविक रूप से सक्रिय रिसेप्टर आरटी, (iii) अधिकतम और (iv) न्यूनतम संकेतों (एसमैक्स और एसमिन), साथ ही (वी ) बैकग्राउंड सिग्नल की ढलान बी. इन मापदंडों के बीच, पृथक्करण निरंतर कश्मीर आवश्यक है और सबसे अनुमापन curves की जैविक व्याख्या के लिए प्रासंगिक है । हर अनुमापन वक्र कश्मीर के लिए एक मूल्य प्रदान करता है । इस प्रकार, एक और भी समूहीकृत अनुमापन curves सांख्यिकीय एक दूसरे के साथ तुलना की जा सकती है । जंगली प्रकार के लिए चार अनुमापन curves के इस तरह के एक सांख्यिकीय विश्लेषण और रूपांतरित α2A-डोमेन में दिखाया गया है चित्रा 3। वंय-प्रकार α2A-डोमेन के लिए rhodocetin के बंधन के लिए समानता स्थिरांक ५.८० ± ०.१५ एनएम है, जबकि rhodocetin के एक काफी कम अपनत्व के साथ रूपांतरित रिसेप्टर को बांध ९.६८ ± ०.१८ एनएम (पी < 0.0001) ।

इस प्रकार, इस गणितीय मूल्यांकन के साथ अनुमापन एलिसा एक और एक रिसेप्टर और उसके रूपांतरित या रासायनिक संशोधित डेरिवेटिव के लिए बाध्यकारी ligand के एक तेजी से और सांख्यिकीय ध्वनि मूल्यांकन की अनुमति देता है । इसलिए, दोनों अनुमापन एलिसा और मूल्यांकन एल्गोरिथ्म संरचना-समारोह संबंधों का विश्लेषण करने के लिए मूल्यवान उपकरण हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: एक अनुमापन एलिसा के लिए एक microtiter प्लेट के प्रतिनिधि लेआउट । प्रत्येक पंक्ति एक अनुमापन वक्र के लिए डेटा प्रदान करता है । rhodocetin (आर सी) ligand के अपने बंधन की तुलना करने के लिए, जंगली प्रकार (पंक्तियों ए डी) या उत्परिवर्ती फार्म (पंक्तियों ई-एच) α2A के-डोमेन चार पंक्तियों प्रत्येक (quadruplet निर्धारण) के कुओं में मैटीरियल हैं । क्षैतिज डॉट लाइन अनुमापन curves के दो समूहों को अलग करता है । rhodocetin ligand की एकाग्रता स्तंभ 1 से 11 तक घट जाती है, जबकि स्तंभ 12 के कुंए, अनुलंब डॉट लाइन के दाईं ओर इंगित, किसी भी rhodocetin को शामिल नहीं करते हैं और पृष्ठभूमि नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करते हैं । प्लेट को ligand के बाद दिखाया जाता है जो एलिसा द्वारा quantified है जिसमें क्षारीय फॉस्फेट सब्सट्रेट पीले पैरा-nitrophenolate में परिवर्तित हो जाता है । डेटा तीन दोहराए जाने वाले प्रयोगों में से एक से दिखाया जाता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि अनुमापन घटता । titrating मैटीरियल वाइल्ड-टाइप और उत्परिवर्ती रूपों के integrin α2A-डोमेन का कच्चा डाटा rhodocetin के साथ घुलनशील ligand (प्रतीकों) के रूप में, साथ ही संरा अनुमापन curves (लाइनें) एक अर्द्ध लघुगणक भूखंड में दिखाए जाते हैं । quadruplet निर्धारणों के कच्चे डेटा (हलकों, त्रिकोण ऊपर और नीचे, चार अनुमापन पंक्तियों में से प्रत्येक के लिए चौकों) मैटीरियल जंगली प्रकार (खुला प्रतीकों) के लिए दिखाए जाते है और (भरा प्रतीकों) α2A-रिसेप्टर्स । परिकलित अनुमापन curves (ठोस, लघु डैश्ड, डॉटेड, श्रृंखला-डॉटेड) जंगली-प्रकार (काली रेखाएं) और उत्परिवर्ती (धूसर रेखाएं) रिसेप्टर के रूप के लिए लाइनों के रूप में दिखाया जाता है । दो समूहों (जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती रिसेप्टर) superpose में से प्रत्येक के भीतर चार अनुमापन घटता है, जबकि अनुमापन घटता स्पष्ट रूप से दो समूहों के बीच अलग है । उत्परिवर्ती α2A के titrations curves-डोमेन उच्च rhodocetin संकेत है कि rhodocetin रूपांतरित रिसेप्टर के लिए कम संबंध के साथ बांधों को स्थानांतरित कर रहे हैं । डेटा तीन दोहराए जाने वाले प्रयोगों में से एक से दिखाया जाता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: अनुमापन curves से व्युत्पंन पृथक्करण स्थिरांक कश्मीर की सांख्यिकीय तुलना ।
चित्रा 2 से आठ अनुमापन curves की dissociations स्थिरांकों की साजिश रची और α2A डोमेन के जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती फार्म के लिए समूहीकृत कर रहे हैं । व्यक्तिगत मान, समूह का अर्थ है, और मानक विचलन बिंदुओं द्वारा, डैश्ड काली रेखाओं द्वारा, और धूसर त्रुटि पट्टियों द्वारा क्रमशः इंगित किए जाते हैं । प्रत्येक समूह के भीतर छोटे प्रसरण और समूह के बीच अंतर का अर्थ है एक महत्वपूर्ण अंतर (p < 0.0001) को ligand के संबध में जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती रिसेप्टर में प्रदर्शित करना । एक दो पूंछ के छात्र ´ एस टीपरीक्षण की तुलना के लिए इस्तेमाल किया गया था । डेटा तीन दोहराए जाने वाले प्रयोगों में से एक से दिखाया जाता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

अनुमापन एलिसा एक बहुमुखी परीक्षण प्रणाली के लिए एक रिसेप्टर ligand बातचीत के पृथक्करण निर्धारित है । के रूप में अनुमापन एलिसा आवश्यकता को दरकिनार स्वतंत्र और समयबद्ध लाइगैंडों प्रभावी ढंग से और उनकी सांद्रता का विश्लेषण करने के लिए मात्रात्मक, काफी अधिक अध्ययन और प्रकाशनों के बजाय रिकॉर्डिंग बाइंडिंग curves अनुमापन एलिसा कार्यरत है . इसके अलावा, अनुमापन एलिसा करने के लिए आसान प्रदर्शन कर रहे है और रिसेप्टर और ligand की काफी कम मात्रा की आवश्यकता है । पृथक्करण स्थिरांक के सटीक विश्लेषण के लिए, दोनों रिसेप्टर और ligand की शुद्ध तैयारी का इस्तेमाल किया जाना चाहिए. रिसेप्टर तैयारी के भीतर प्रोटीन दूषित microtiter प्लेट की प्लास्टिक की सतह पर सोखना साइटों के लिए रिसेप्टर के साथ प्रतिस्पर्धा. के रूप में वे ligand बांध नहीं है, लेकिन ligand-बाध्यकारी रिसेप्टर्स की संख्या को कम करने, रिसेप्टर समाधान की अशुद्धियों अनुमापन एलिसा के संकेतों को कम. यदि रिसेप्टर तैयारी की पवित्रता किसी भी आगे नहीं सुधार किया जा सकता है, एक एंटीबॉडी रिसेप्टर के खिलाफ निर्देशित microtiter प्लेट को मैटीरियल किया जा सकता है और, कुओं को अवरुद्ध करने के बाद, अशुद्धियों से युक्त एक तैयारी से रिसेप्टर पर कब्जा होगा. फिर भी, ध्यान तो लिया जाना चाहिए कि कैप्चरिंग एंटीबॉडी क्योंकि प्रजातियों में से प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ बाध्य ligand का पता लगाने परेशान नहीं करता है एंटीबॉडी के हस्तक्षेप, या कि यह बाध्यकारी ligand बाधा ।

डेटा का एक व्यापक सेट प्राप्त करने के लिए, यह एक पारस्परिक तरीके से अनुमापन एलिसा प्रदर्शन की सराहना की है, जो अंय प्रयोग में रिसेप्टर के रूप में एक प्रयोग की घुलनशील ligand का उपयोग करने के लिए यह microtiter प्लेट को स्थिर करने और यह अनुमापन के साथ है पूर्व रिसेप्टर जो घुलनशील ligand साथी के रूप में लागू किया जाएगा । यह आमतौर पर अच्छी तरह से काम करता है जब तक कि स्थिरीकरण भागीदारों में से एक की बाध्यकारी गतिविधि को निष्क्रिय या जब तक उपकरण, ऐसे एंटीबॉडी के रूप में titrated साथी का पता लगाने के लिए मौजूद नहीं है या प्राप्त करने के लिए मुश्किल है । rhodocetin-α2A डोमेन बाइंडिंग प्रणाली में, यह एक glutathione-S-ट्रांस्फ़्रेज़ (जीएसटी) के बाद अच्छी तरह से काम किया-moiety जीएसटी-एंटीबॉडी के साथ अपने पता लगाने की सुविधा के लिए α2A-डोमेन से जुड़े थे16.

अनुमापन एलिसा का एक अंय लाभ यह है कि केवल जोड़ा ligand (एलटी) की एकाग्रता, लेकिन स्वतंत्र और बंधे ligand (एलएफ और एलबी, क्रमशः) की नहीं, के लिए जाना जाता है की जरूरत है । इसलिए ligand तैयारी यथासंभव साफ-सुथरी होनी चाहिए । यदि यह असंभव है या केवल एक सीमित सीमा तक संभव है, अनुमापन एलिसा अभी भी नियोजित किया जा सकता है, तैयारी के भीतर ligand के दाढ़ अनुपात के बाद स्वतंत्र रूप से निर्धारित किया गया है, जैसे, एसडीएस द्वारा, पृष्ठ, immunoblotting, या सैंडविच एलिसा ।

अनुमापन एलिसा के साथ समस्या हो सकती है यदि रिसेप्टर और ligand के बीच संबंध बहुत कम है या यदि glutaraldehyde निर्धारण बंधन बातचीत समाप्त । उत्तरार्द्ध मामले में, अनुमापन एलिसा के एक निर्धारण-मुक्त प्रोटोकॉल की स्थापना की जरूरत है । व्यावहारिक रूप से, पृथक्करण स्थिरांक केवल तभी पता लगाया जा सकता है यदि बाइंडिंग साझेदार यथोचित उच्च आत्मीयता के साथ इंटरैक्ट करते हैं, जो लगभग २०० एनएम से नीचे की श्रेणी में है.

अनुमापन संकेत तीव्रता प्रदान करता है जोड़ा ligand की कुल सांद्रता के एक समारोह के रूप में एस, एलटी नि: शुल्क और असीम लाइगैंडों की सांद्रता के रूप में, एलएफ और एलबी, एलटीतक राशि, और के रूप में एलबी के उत्पाद के बराबर Y · आरटी समीकरण 3के अनुसार, समीकरण 4 के लिए बदल गया है:

Equation 5           समीकरण 5

द्विघात समीकरण में जिसके परिणामस्वरूप,

Equation 6         समीकरण 6

जिसका व्यावहारिक समाधान है,

Equation 7         समीकरण 7

इसके अलावा, संकेत तीव्रता एस (एलटी) के एक विशिष्ट एकाग्रता में जोड़ा ligand एलटी संतृप्ति की उपज का प्रतिनिधित्व करता है Y, के बाद यह न्यूनतम संकेत मूल्य के घटाव के द्वारा ठीक किया गया है, एसमिन, और गतिशील रेंज के लिए सामान्यीकृत , अधिकतम और ंयूनतम संकेत मूल्यों के बीच अंतर के रूप में दिया,अधिकतम और एसमिनट:

Equation 8           समीकरण 8

समीकरण 7 और समीकरण 8 के संयोजन गणितीय समारोह पैदावार जो संकेत तीव्रता एस (एलटी) के साथ जोड़ा ligand एलटीकी एकाग्रता के साथ संबद्ध । एक टर्म बी · एलटी के लिए विशिष्ट पृष्ठभूमि संकेत है जो रैखिक एलटीके साथ उठाती का वर्णन करने के लिए जोड़ा जा सकता है । B पृष्ठभूमि का समानता स्थिरांक है । इस प्रकार, सामांय समारोह में एक अनुमापन वक्र का वर्णन है:

Equation 9         समीकरण 9

एक अनुमापन वक्र के इस समारोह में एक वर्ग जड़ शब्द और एक रैखिक शब्द है, जो रिसेप्टर और ligand और ligand के विशिष्ट बातचीत, क्रमशः के बीच विशिष्ट बातचीत का वर्णन के साथ एक रचना समारोह से मेल खाती है । यह फ़ंक्शन बाइंडिंग वक्र (L bvs की अतिपरवलयिक फ़ंक्शन से भिंन है। Lच).

बाध्यकारी वक्र के विपरीत, जिसमें बंधे ligand की सांद्रता y-अक्ष पर रची जाती है, अनुमापन वक्र अधिक लचीला होता है और किसी भी संकेत की अनुमति देता है, जो कि बाउंड ligand की एकाग्रता के साथ संबद्ध होता है, को y-अक्ष पर प्लॉट किया जा सकता है । यह संकेत हो सकता है photometrically एक एंजाइम से जुड़े एंटीबॉडी के बंधन का पता लगाया (के रूप में एक एलिसा के इस मामले में), लेकिन यह भी अंय spectrometric संकेत, जैसे अवशोषक में परिवर्तन, परिपत्र dichroism9, प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण हो सकता है21 , और एनएमआर संकेत22। इसके अलावा, इज़ोटेर्माल अनुमापन calorimetry23 से भी ऊष्मा संकेतों का मूल्यांकन किया जाना संभव होना चाहिए । अंय अध्ययनों पर काइनेटिक से बाध्यकारी समानता का निर्धारण और गठन और रिसेप्टर के पृथक्करण-ligand परिसर की सतह से evanescent क्षेत्र में वास्तविक समय में परिवर्तन को मापने के लिए बंद की दर plasmon अनुनाद24,25 , एक क्वार्ट्ज क्रिस्टल microbalance द्वारा जन जमाव में26, या प्रतिदीप्ति में अतिसूक्ष्म thermophoresis26,27द्वारा । इन वास्तविक समय माप उनके परिष्कृत मूल्यांकन सॉफ्टवेयर की वजह से शक्तिशाली उपकरण बन गए हैं । अनुमापन एलिसा और SPR आम तौर पर पसंद की विधि के लिए प्रोटीन रासायनिक विश्लेषण में बाध्यकारी भागीदारों की जांच कर रहे हैं । जबकि अनुमापन एलिसा अलग संतुलन राज्यों में बंधे ligand की राशि को बढ़ाता है, SPR एक काइनेटिक दृष्टिकोण का इस्तेमाल और काइनेटिक दर लगातार अनुमानित, कश्मीर केबंद और कश्मीर पर के साथ संबंध स्थिर उपाय , जो का अनुपात काइनेटिक निर्धारित पृथक्करण लगातार24,25प्रदान करता है । दो विभिंन तरीकों के आधार पर, K मान एक दूसरे से अलग हो सकता है । rhodocetin-α2A डोमेन बाइंडिंग प्रयोगों में, SPR डेटा केबंद कश्मीर और दर स्थिरांकपर कश्मीर का पता चला, और फलस्वरूप एक काइनेटिक समानता लगातार कश्मीर, rhodocetin-α2A परिसर19है, जो बहुत समान है के लिए निर्धारित कश्मीर मूल्यों अनुमापन एलिसा द्वारा इस अध्ययन में मापा । मामूली मतभेद विभिंन बैचों या विभिंन स्थितियों और प्रोटीन के नमूनों के भंडारण की अवधि की गतिविधि परिवर्तनों से समझाया जा सकता है । यह बाद में संमान में, अनुमापन एलिसा सभी नमूनों में एक साथ मापा और SPR मशीन में की तरह नहीं क्रमिक रूप से कर रहे हैं । अब, गणितीय सुलभ और अनुमापन वक्र समीकरण (समीकरण 9) के साथ प्रबंधित करने के लिए आसान जा रहा है, अनुमापन एलिसा के इस अंत बिंदु माप के रूप में बस के रूप में शक्तिशाली हो सकता है काइनेटिक मूल्यांकन वास्तविक समय माप है, जो एक लागत गहन SPR मशीन की आवश्यकता होती है ।

इस समीकरण को ध्यान में रखती है कि ligand की कुल एकाग्रता सीमित ligand की एकाग्रता से कम है, विशेष रूप से कम ligand सांद्रता पर । यह ligand सांद्रता की पूरी रेंज पर डेटा के लिए अनुमापन वक्र के बहुत बेहतर संनिकटियों की अनुमति देता है । अनुमापन एलिसा की एक खामी, के रूप में बाध्यकारी वक्र की तुलना में, अब तक कठिनाई को गणितीय अनुमापन वक्र का मूल्यांकन किया गया है । जबकि एक बंधन वक्र में मुक्त ligand एलएफ की एकाग्रता में आधा-अधिक से अधिक संतृप्ति पृथक्करण लगातार बराबर होती है, यह एक अनुमापन वक्र के लिए सच नहीं है । दो एल्गोरिदम स्वतंत्र रूप से रेखांकन linearize अनुमापन curves करने के लिए विकसित किया गया है और पृथक्करण स्थिरांक निर्धारित करने के लिए । हालांकि, दोनों एल्गोरिदम Stockell एट अल द्वारा स्पेक्ट्रोस्कोपी अनुमापन प्रयोगों के लिए विकसित की है । 8 और द्वारा Heyn & Weischet9 नुकसान से ग्रस्त है कि संतृप्ति के लिए अधिकतम संकेत उपज वाई रेखांकन निर्धारित किया जाना चाहिए । के रूप में इस मूल्य asymptotically संपर्क किया है, संतृप्ति उपज और फलस्वरूप परिकलित पृथक्करण स्थिरांक आंतरिक रूप से त्रुटि प्रवण हैं । इसके विपरीत, एल्गोरिथ्म समीकरण 9 पर आधारित अनुमापन प्रयोगों से raw डेटा का उपयोग करता है और पृथक्करण स्थिरांक K के साथ ही अन्य पैरामीटर्स को एक गैर-रेखीय प्रतिगमन में सबसे अच्छा-फ़िट समाधान (चित्र 2 और चित्र 3 ). इसके अलावा, के रूप में इस एल्गोरिथ्म रेखांकन संभवतः बाहर ligand संतृप्ति पर अधिकतम संकेत पहुंचने का अनुमान लगाने की जरूरत नहीं है, मूल्यांकन प्रक्रिया बहुत तेजी से और सही हो जाता है और यह चित्रमय मूल्यांकन से कम पूर्वाग्रह भालू । कई अनुमापन curves समानांतर में मूल्यांकन किया जा सकता है । इस प्रकार, अनुमापन curves के कई समूहों के साथ मापा जा सकता है, और उनके मापदंडों सांख्यिकीय विश्लेषण किया जा सकता है और तुलना । इसके अलावा, हर अनुमापन वक्र मूल्यों का एक सेट देता है, उनमें पृथक्करण लगातार कश्मीर, स्थिर और बाध्यकारी के एकाग्रता-सक्रिय रिसेप्टर आरटी, अधिकतम और ंयूनतम संकेत मूल्यों के अंतर के रूप में गतिशील रेंज एसअधिकतम और एसमिन , साथ ही रैखिक कारक बी जो इन मूल्यों का उपयोग कर प्रयोगात्मक पृष्ठभूमि संकेत करने के लिए संगत है, संतृप्ति उपज Y की गणना की जा सकती है और जोड़ा ligand एलटीकी एकाग्रता की निर्भरता में साजिश रची । ऐसे में एक संतृप्ति उपज भूखंड, आधा-अधिक से अधिक मैक्सिम संतृप्ति संकेत लेफ्टिनेंट में जोड़ा ligand की एकाग्रता (50%) पृथक्करण के योग के बराबर लगातार कश्मीर प्लस आधा मैटीरियल सक्रिय रिसेप्टर आरटी की एकाग्रता

Equation 10        समीकरण 10

यह Y = ०.५ के लिए समीकरण 7के साथ प्राप्त किया जा सकता है । इस प्रकार, स्थिर सक्रिय रिसेप्टर आरटी की एकाग्रता रिसेप्टर के विभिंन कोटिंग सांद्रता के साथ अनुमापन एलिसा प्रदर्शन द्वारा निर्धारित किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखक का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

प्रोटोकॉल और एल्गोरिथ्म एक ड्यूश Forschungsgemeinschaft द्वारा वित्त पोषित परियोजना के भीतर विकसित किया गया था (DFG अनुदान SFB1009 A09 और EB177/ लेखक धंयवाद बारबरा Schedding और फेलिक्स तकनीकी सहायता के लिए Schmalbein और गंभीर पांडुलिपि पढ़ने के लिए डॉ Niland ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TRIS neoFrox 1125KG001
HEPES Sigma-Aldrich H4034
NaCl Applichem 1,316,591,214
MgCl2 Merck 172571
integrin a2A, wild-type and mutant, recombinant isolated in author's lab
NiNTA superflow column  Qiagen, Germany 30821
Coomassie-Brilliant Blue R250 Serva 35050
bicinchoninic acid assay (BCA), protein concentration determination kit Fisher Scientific 23225
bovine serum albumine (BSA), fraction V Applichem A1391
25 % solution of glutaraldehyde Merck 354400
anti-rabbit immunglobulin-antibodies from goat, conjugated with alkaline phosphatase Sigma-Aldrich A9919
Glycine Applichem A1377
Zn(II)-acetate Applichem A4324
NaOH Applichem A1551
Alkaline phosphatase substrate tablet (5 mg) Sigma-Aldrich S0942
Costar half-area microtiter plate Thermo Scientific Corning 3690
micro reaction tubes Eppendorf 30120086
Microplate ELISA reader BioTek Synergy HT

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References

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जैव रसायन अंक १३२ एलिसा अनुमापन परख पृथक्करण निरंतर गैर रेखीय प्रतिगमन रिसेप्टर ligand-संपर्क rhodocetin
एक विधि के रूप में अनुमापन एलिसा रिसेप्टर Ligand बातचीत के पृथक्करण स्थिरांक निर्धारित करने के लिए
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Eble, J. A. Titration ELISA as a… More

Eble, J. A. Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction. J. Vis. Exp. (132), e57334, doi:10.3791/57334 (2018).

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