Summary
En detaljeret protokol til at udføre en titrering ELISA er beskrevet. Derudover præsenteres en roman algoritme at evaluere titrering ringprøver og opnå en dissociationskonstant af bindingen af et opløseligt ligand til en mikrotiter plade-immobiliseret receptor.
Abstract
Dissociationskonstant beskriver samspillet mellem to partnere i bindende ligevægt og er et mål for deres affinitet. Det er en afgørende parameter for at sammenligne forskellige ligander, f.eks., kompetitive inhibitorer, protein isoformer og mutanter, for deres bindende styrke til en bindende partner. Dissociation konstanter bestemmes af plotte koncentrationer af bundne versus frie ligand som bindende kurver. Derimod er titrering kurver, hvor et signal, der er proportional med koncentrationen af bundne ligand er plottes i den samlede koncentration af tilsat ligand, meget lettere at optage. Signalet kan påvises hjælp og enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA). Dette er eksemplificeret i en protokol for en titrering ELISA, der måler bindingen af snake venom-afledte rhodocetin til sin immobiliseret destinationsdomænet af α2β1 integrin. Titrering ringprøver er alsidig og udbredte. Ethvert par af interagerende proteiner kan bruges som immobiliseret receptor og opløselige ligand, forudsat at begge proteiner er ren, og deres koncentrationer er kendt. Problemet har hidtil været at bestemme dissociationskonstant fra en titreringskurven. I denne undersøgelse, er en matematisk funktion underliggende titrering kurver indført. Uden noget fejlbehæftet grafisk skøn over en mætning udbytte tillader denne algoritme behandling af de rå data (signal intensiteter i forskellige koncentrationer af tilsat ligand) direkte af matematiske evaluering via ikke-lineær regression. Således flere titrering kurver kan registreres samtidigt og omdannet til et sæt af parametre, blandt dem dissociationskonstant og koncentrationen af bindende-aktive receptor, og de kan evalueres statistisk. Når det kombineres med denne algoritme, titrering ringprøver få fordel af direkte præsenterer dissociationskonstant. Derfor, de kan anvendes mere effektivt i fremtiden.
Introduction
Dissociationskonstant K er en vigtig parameter til at beskrive en receptor (R) affinitet for dets ligand (L). Baseret på loven massevirkningsloven, er K defineret for ligevægt, hvor receptor-ligand komplekse RL dissocieres til receptoren Rasmussen og ligand L:
Ligning 1
med indeks f , der angiver tilstanden gratis/ubundet af receptor og ligand. Koncentrationen af receptor-ligand kompleks, RL, er identisk med koncentrationen af receptor-bundet ligand Lb. Da den samlede koncentration af receptor Rt er summen af de gratis receptor Rf og ligand-bundet receptor Rb = Lb, dissociationskonstant kan også skrives som:
Ligning 2
Derfor, mætning udbytte Y, defineret som brøkdel af bundne ligand Lb i forholdet mellem den samlede koncentration af receptor Rt,
Ligning 3
afhænger af koncentrationen af frie ligand Lf:
Ligning 4
Denne hyperbolske relation beskriver bindende kurven af en receptor-ligand interaktion og dens plot viser koncentrationen af bundne ligand Lb som funktion af koncentrationen af frie ligand Larsenf. Fra den bindende kurve, kan dissociationskonstant K afledes som koncentrationen af frie ligand på halv-maksimal mætning udbytte. Derudover har været etableret forskellige algoritmer til linearize bindende kurver som dobbelt-reciprokke plot af Klotz1,2, eller transformationer Scatchard eller Hanes (gennemgået ved Bisswanger3). Men alle algoritmer lider af det problem, at den maksimale værdi af mætning udbytte, der er asymptotisk nærmede sig i høje koncentrationer af gratis ligand i bindende kurve, skal vurderes i en grafisk pre evaluering og derfor er fejlbehæftet.
Derudover kræver fastsættelsen af en bindende kurve kvantificering af frie og bundne ligand under bindende ligevægt. Med henblik herpå har den gratis ligand adskilles fra receptor-bundet ligand og kvantificeret. Ligand og receptor skal derfor adskiller sig i deres egenskaber, såsom en ikke-proteinholdige ligand i modsætning til et protein receptor. Hvis begge bindende partnere er proteiner, skal de være adskiller sig i deres størrelse, afgifter eller andre molekylære funktioner. Kvantificering af ligand koncentrationer i mindre bindende strategier er imidlertid en vanskelig opgave. Radioaktive mærkning af liganden har ofte været nødvendige for at påvise en lav koncentration af bundne ligand, især hvis betydelige mængder af receptorer ikke var tilgængelige eller økonomisk overkommelig. Desuden, receptor-bundet ligand kan adskille under og efter isolation i en ikke uvæsentlig måde. Derfor, komplekse metoder, såsom ligevægt gel filtrering4, kapillær elektroforese5og pulse proteolyse6, er forpligtet til at kvantificere receptor-bundet ligand og adskille det fra gratis ligand.
I modsætning til disse bindende assays kræver titrering eksperimenter ikke den kvantitative adskillelse af bundne og gratis ligand. Med henblik herpå, er en receptor på en konstant koncentration titreres med forskellige koncentrationer af tilsat ligand. Af binding til receptoren har den bundne ligand en Biofysisk egenskab, som adskiller det fra den frie ligand og måles ved fx, fotometri, fluorometry eller påvisning af antistof. Således et signal S, som er proportional med mætning udbytte Y og derfor også til koncentration af receptor-bundet ligand (Lb), er registreret som en funktion af den samlede koncentration af tilsat ligand (Lt). Både parametre, signal S og den samlede koncentration af tilsat ligand er kvantificeret i en direkte og lettere måde end koncentrationerne af bundne og gratis ligand. Især, påvisning af receptor-bundet ligand ved enzymmaerket assay (ELISA) tilladt reduktion af prøven diskenheder til under 100 µL og parallelle målinger af flere ligand koncentrationer i multi godt mikrotiter plader. I en titrering ELISA, er en receptor fysisk adsorberet til en mikrotiter plade på den samme koncentration og titreres med opløselige ligand. Receptoren er immobiliseret på plast overfladen hovedsagelig af hydrofobe adsorption. Overflade koncentrationen af immobiliserede receptor korrelerer med belægning koncentrationen af receptor i en ikke-lineær relation, sandsynligvis efter Langmuir´s adsorption isoterm7. Ud over det samlede antal adsorberet receptor molekyler er deres aktivitet tilstand en anden vigtig parameter for titreringen assays. Kun immobiliseret receptorer, som har bevaret ligand bindende aktivitet, er relevante for titreringen assay og i sidste ende bidrager til den samlede koncentration af aktive receptorer Rt af titrering assay, som ikke kan bestemmes direkte.
Websteder på plastik overflade, som ikke er omfattet af immobiliserede receptoren er tilbøjelige til adsorberes andre proteiner, som liganden. Fysiske adsorption af ligand til sådanne plastik overflade seværdigheder ville resultere i en lignende signal som receptor-bundet ligand, men i en uspecifik måde. At reducere denne uspecifik signal, de plastik overflade seværdigheder i mikrotiter plader, som ikke er blevet belagt med protein endnu vil blive blokeret med bovint serumalbumin (BSA). Men for nogle receptor-ligand titrering assays, uspecifik baggrund signaler kan observeres. Derefter, andre blokerende stoffer, såsom en løsning af 0,2% gelatine eller 0,04% Tween 20, anbefales.
Efter binding til receptoren fjernes den gratis ligand ved to vaske trin. Bundne ligand forbliver hos den receptor, som er immobiliseret mikrotiter godt plastic overflade, og eventuelt styrket af kemisk fiksering. For de efterfølgende kovalente cross-sammenkædning af bundne ligand og immobiliseret receptor med glutaraldehyd, buffer stof TRIS erstattes for HEPES, uden ændring af ligand bindende. HEPES, i modsætning til TRIS, ikke inaktivere glutaraldehyd. Den kovalente cross-kobling med glutaraldehyd løser den bundne ligand med dens receptor og forhindrer dens dissociation under efterfølgende vask og inkubering trin. Således, receptor-ligand interaktion er kemisk frosset og garanterer en titreringskurven, som er upåvirket af efterfølgende trin af vask og inkubation. Glutaraldehyd fiksering kan dog kemisk ændre ligand og receptor på en sådan måde, at deres interaktion er reduceret eller afskaffet. Desuden, ændring af epitoper inden for liganden kan ændre bindingsaffinitet afsløre antistof, især hvis et monoklonalt antistof, der bruges til at kvantificere bundne ligand. Selv om ingen af disse negative virkninger af glutaraldehyd fiksering sker i denne titrering ELISA, skal følsomheden af test mod glutaraldehyd testes for hver receptor-ligand interaktion forud for titreringen eksperiment. Efter fiksering fjernes overskydende glutaraldehyd i tre vaske trin med TRIS-holdige buffer. TRIS inaktiverer resterende aldehyd grupper, som kan nonspecifically reagerer med påvisning af antistoffer i de efterfølgende trin.
Mængden af bundne ligand er kvantificeret med enzym-forbundet antistoffer, som giver et fotometrisk ELISA signal S. Dette er afbildet versus den samlede ligand koncentration Lt føjet til hver brønd. På trods af sin lettere erhvervelse er titreringskurven ikke hyperbolske funktion i modsætning til den bindende kurve. Derudover har det været uklart hvordan man beregner dissociationskonstant K fra en titreringskurven. Selvom algoritmer til linearize hjælp erhvervede titrering kurver er indberettet uafhængigt af Stockell8 og Heyn og Weischet9, de kom til kort på grund af deres usikkerhed på estimering af den maksimale signal værdi, som den mætning udbytte tilgange ved høje koncentrationer af tilsat ligand.
Her, er en titrering ELISA og en ikke-lineær regression algoritme beskrevet til at udlede dissociationskonstant K for en receptor ligand interaktion fra en titreringskurven. Denne protokol er eksemplificeret for samspillet mellem kollagen-bindende A-domæne integrin α2β1 med en snake venom-afledte hæmmer. Integriner er celle adhæsionsmolekyler, der mægle forankring af celler til den omkringliggende ekstracellulære matrix eller det underliggende basalmembranen10,11. Derudover formidle integriner vigtige signaler mellem celler og den ekstracellulære matrix ved at rekruttere yderligere signalering molekyler og danner nye celle organeller, adhesomes, på celle-matrix interaktion12,13, 14. kollagen, ligand i α2β1 Integra, er den mest rigelige protein af det menneskelige legeme og er en afgørende stilladser bestanddel af bindevæv15. Samspillet mellem α2β1 integrin og kollagen er medieret af A-domæne af integrin en2 subunit. Integrin α2A-domænet indeholder en divalent kation, der er nødvendig for kollagen bindende og stabiliserer dens struktur. Wild-type form samt mutanter af domænet α2A, som, hvori den overflade-eksponerede rest Y216 var blevet udskiftet for en glycin, kan nemt produceret recombinantly i en bakteriel ekspressionssystem og isoleret via deres oligo-hans-tags med en NiNTA SuperFlow kolonne med en efterfølgende dialyse mod TRIS-bufferet saltvand (TBS; 50 mM TRIS/HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl) indeholdende 2 mM MgCl216. Deres koncentrationer blev fastsat med bicinchoninic syre assay (BCA) og deres purities er testet af konventionelle SDS-PAGE og farves med Coomassie-Brilliant blå R250.
Samspillet mellem α2β1 integrin og kollagen er blokeret af bindingen af snake venom komponent, rhodocetin, fra Malaysisk pit viper (Calloselasma rhodostoma)16,17. Bruges som en opløselig ligand i denne titrering ELISA, rhodocetin blev renset fra rå venom som beskrevet tidligere16. Det er opløst i HEPES-bufferet saltvand (HBS; 10 mM HEPES/NaOH, pH 7,4, 150 mM NaCl) og opbevares frosset ved-20 ° C. Dets koncentration var bestemt af BCA og dens renhed var bevist af SDS-PAGE. Som en antagonist, rhodocetin ikke kun blokerer kollagen binding til integrin α2β1 A-domæne, men også stabiliserer den inaktive kropsbygning af integrin derved forhindre enhver signalering fra kollagen i celler eller blodplader18. Det er af stor biomedicinsk betydning til at bestemme dissociationskonstant af rhodocetin med sit receptor mål og dermed udrede sin molekylære mekanisme og farmaceutiske potentielle fxsom antitrombotisk agent. Til dette formål, en titrering ELISA er beskrevet herunder dens evaluering, som er gælder for næsten enhver receptor-ligand interaktion med en 1:1 interaktion støkiometrisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. stamopløsninger
- For at forberede 100 mL 10 x TBS pH 7,4 løsning, 6.06 g af TRIS og 8,77 g NaCl i 90 mL deioniseret vand opløses, ph indstilles til 7.4 med 37% HCl løsning, fylde volumen til 100 mL med deioniseret vand og opløsningen filtreres.
- Til at forberede 100 mL 1 M HEPES/NaOH, pH 7,4 løsning, 23.83 g HEPES i 90 mL deioniseret vand opløses, ph indstilles til 7.4 med 1,5 M NaOH, fylde volumen til 100 mL med deioniseret vand og opløsningen filtreres.
- For at forberede 100 mL 5 M NaCl opløsning, opløse 29,2 g NaCl i 90 mL deioniseret vand. Fyld volumen til 100 mL med deioniseret vand og opløsningen filtreres.
- For at forberede 100 mL 1 M MgCl2 opløsning, opløse 20.33 g MgCl2 · 6H2O i 90 mL deioniseret vand. Fyld volumen til 100 mL med deioniseret vand og opløsningen filtreres.
- For at forberede 5% varme-inaktiverede BSA i vand, vejer 2,5 g af BSA (brøkdel V, pH 7,0) i en 50 mL tube og opløse den i 45 mL deioniseret vand. Fyld løsningen til 50 mL med deioniseret vand og varme løsning i et vandbad ved 68 ° C til 45 min. afkøles det i isbad, og opbevar den ved-20 ° C.
- Forberede 25% glutaraldehyd Vandopløsning.
Forsigtig: Glutaraldehyd er skadeligt, hvis det sluges, giftig ved indånding, og forårsager forbrændinger. Bære beskyttelsesdragt, handsker, og øjen beskyttelse. - Hæve kanin antiserum som tidligere beskrevet19. Titer af antiserum var bestemt efter standardprotokoller20.
- Forberede anti-kanin immunoglobulin-antistoffer fra ged konjugeret med alkalisk fosfatase.
- For at forberede 100 mL 0,1 M Glycin opløsning, opløse 0,75 g af glycin i 90 mL deioniseret vand. PH indstilles til 10.4 med 1,5 M NaOH-opløsning, fylde volumen til 100 mL med deioniseret vand, og opløsningen filtreres.
- Til at forberede 100 mL 0,5 M Zn (II)-acetat løsning, opløse 10,98 g af Zn (II)-acetat · 2H2O i 90 mL deioniseret vand. Fyld volumen til 100 mL med deioniseret vand og opløsningen filtreres.
- For at forberede 100 mL 1,5 M NaOH opløsning, opløse 6,0 g NaOH i 90 mL deioniseret vand. Fyld volumen til 100 mL med deioniseret vand og opløsningen filtreres.
2. klargør buffere og arbejder løsninger
- Fortynd 5 mL af 10 x TBS pH 7,4, med 45 mL deioniseret vand og tilsættes 100 µL af en 1 M MgCl2 stamopløsning. Holde det ved stuetemperatur. TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2 løsning er for immobilisering af receptoren og vask mikrotiter plade.
- 10 mL af 5% af varmen-inaktiverede BSA i vand og 5 mL 10 x TBS, pH 7,4 med deioniseret vand til 50 mL fortyndes. Tilsæt 100 µL 1 M MgCl2 stamopløsning og bland løsningen godt. Holde det på is og gemme det til yderligere forsøg på-20 ° C. Bemærk at 2,5 mL af 1% BSA i TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2 er påkrævet for hver titreringskurven.
- Fortynd 2,5 mL 1 M HEPES/NaOH, pH 7,4 og 1,5 mL 5 M NaCl løsning til 50 mL med deioniseret vand, Tilsæt 100 µL 1 M MgCl2 løsning, og bland løsning grundigt for at forberede 50 mL af HBS, pH 7,4: 50 mM HEPES/NaOH , 150 mM NaCl.
- Tilsæt 5 µL 1M MgCl2 stamopløsning og 2 µL 0,5 M Zn (II)-acetat stamopløsning til 5 mL 0,1 M Glycin løsning, pH 10.4 at forberede alkalisk fosfatase (AP) buffer (0,1 M Glycin løsning, pH 10.4, 1 mM MgCl2, 0,2 mM Zn(II)-acetate).
3. immobilisering af Receptor (Integrin α2A-domæne) til en mikrotiter plade
- Fortynd stamopløsningen af integrin α2A-domæne i TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2 til en endelig koncentration på 5 µg/mL.
Bemærk: Mængden af belægning løsning er 650 µL til én titreringskurven bestående af 12 nå-træk af en halv område-mikrotiter plade. - Fyld hver brønd af træk på en halv område-mikrotiter plade med 50 µL/brønd af 5 µg/mL belægning løsning af integrin α2A-domæne (wild-type eller mutant). Udføre hver titrering række mindst i dubletter (i dette eksempel som firlinger; Se layout af mikrotiter plade i figur 1).
- Forsegle pladen med folie eller lukke det med et låg. Lad pladen ved 4 ° C natten over.
4. vask coatede brønde af plade dobbelt med TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2
- For at fjerne opløseligt receptor molekyler, der ikke har været immobiliserede til plast overfladen af fysiske adsorption, fjerne belægning løsningen og fylde hver godt med 50 µL af TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2.
- Fjerne Vaskeopløsningen. Sikre, at brøndene ikke bliver tør. Derfor ikke tryk mikrotiter plade på en vævet klud til at fjerne resterende væske. Bruge en omstændelig pipette eller en multikanal-pipette til at fylde brøndene hurtigt.
- Gentag trinnet vask en gang.
5. blokere uspecifik bindingssteder
- Tilsæt 50 µL af 1% BSA løsning i TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2 til hver brønd.
- Forsegl brønde med folie eller lukkes med et låg.
- Inkubér brøndene i 1 time ved stuetemperatur.
Bemærk: Inkubation trin af denne protokol kan udføres på en vuggende eller ryster platform. Men dette er ikke påkrævet og ændrer ikke resultatet af eksperimentet.
6. forberedelse af en seriel fortynding række Ligand, Rhodocetin
- Variere start koncentration af rhodocetin og fortyndingsfaktoren af seriel fortynding, at opnå en passende vifte af ligand koncentrationer og registrere en fuld titreringskurven med en minimums- og signal. I dette eksperiment, ansætte en start koncentration af 243 nM rhodocetin og en fortyndingsfaktor på 2,3. Fortynd rhodocetin stock løsning på den højeste ligand koncentration af rækken seriel fortynding. For hver titreringskurven med en fortyndingsfaktor på 2,3, forberede 115 µL af 243 nM (dvs., 15,2 µg/mL) rhodocetin opløsning i 1% BSA/TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2 i reagensglas #1.
- Fyld 65 µL af 1% BSA løsning i TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2 i 10 reagensglas, mærket #2 gennem #11.
- Overføre 50 µL af rhodocetin fortynding fra reagensglas #1 til reagensglas #2, bland begge løsninger (samlede volumen: 115 µL; fortyndingsfaktoren: 1:2. 3) af ændring, og derefter overføre 50 µL fra denne blanding til reagensglas #3, osv.
- Fortsæt denne seriel fortynding indtil reagensglas #11.
Bemærk: De mængder, der er angivet i trin 6.1-6.4 er tilstrækkelige for en titreringskurven. Multiplicere disse mængder med antallet flergangsbestemmelser. I dette tilfælde udføre otte titrering kurver (firlinger af to α2A-domæne former) og forberede de følgende bind: 920 µL af rhodocetin løsning på den højeste koncentration i reagensglas #1; 520 µL af 1% BSA i TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2 udfylde hvert af reagensglassene #2 og #11; og 400 µL af overførsel volumen fra et rør til den næste.
7. binding af liganden (Rhodocetin) i forskellige koncentrationer til immobiliseret Receptor (Integrin α2A-domæne)
- Fjern blokering løsningen fra plade mikrotiterbrøndene ved en vakuum linje.
- Straks tilføje 50 µL af rhodocetin opløsning i 1% BSA/TBS, pH 7,4/MgCl2 løsning af reagensglas #1 i brønd i kolonne 1, løsning af reagensglas #2 brønde i kolonne 2,etc. tilsættes 50 µL af 1% BSA i TBS, pH 7,4 , 2 mM MgCl2 (blokering og fortynding buffer) som en ligand-gratis kontrol brønde af kolonne 12 (Se layout af mikrotiter plade, figur 1).
- Forsegl brønde med folie eller lukkes med et låg.
- Inkubér brøndene i 1,5 timer ved stuetemperatur (omkring 20-22 ° C).
8. vask Wells af plade to gange med HBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2
- For at fjerne ikke-bundet ligand molekyler, fjerne den bindende løsning og fylde hver med 50 µL af HBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2. Fjern derefter Vaskeopløsningen.
- Passe på, at brøndene ikke bliver tør. Derfor ikke tryk mikrotiter plade på en vævet klud til at fjerne resterende væske. Bruge en omstændelig pipette eller en multikanal-pipette til at fylde brøndene hurtigt.
- Gentag trinnet vask en gang.
9. fix Receptor-bundet Ligand med 2,5% glutaraldehyd i HBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2
- Forberede en frisk 2,5% glutaraldehyd løsning ved at blande 1 del af 25% glutaraldehyd løsning og 9 dele af HBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2.
- Fyld hver brønd i mikrotiter-pladen med 50 µL af opløsningen 2,5% glutaraldehyd i HBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2. Inkuber mikrotiter plade i 10 min ved stuetemperatur.
10. vask Wells plade tre gange med 50 µL/brønd af TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2
- For at fjerne og inaktivere overskydende glutaraldehyd, Fjern fiksering løsning og fylde hver med 50 µL af TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2. Derefter fjerne Vaskeopløsningen.
Bemærk: Hæld glutaraldehyd-holdige fiksering løsning fra mikrotiter pladen i et fad og kassér fiksering løsning, efter det er blevet inaktiveret ved et lige saa stort volumen af TBS, pH 7,4. - Passe på, at brøndene ikke bliver tør. Derfor ikke tryk mikrotiter plade på en vævet klud til at fjerne resterende væske. Bruge en omstændelig pipette eller en multikanal-pipette til at fylde brøndene hurtigt.
- Gentag trinnet vask to gange.
11. kvantificering af Receptor-bundet Ligand ved ELISA
- Tilsæt 50 µL/brønd af primære antistof løsning i 1% BSA i TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2. Den primære antistof løsning er en kanin antiserum rejst mod rhodocetin19, fortyndet 1:2,000 i 1% BSA i TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2.
- Inkuber plade i 75-90 min. ved stuetemperatur. Vask alle pladens huller, tre gange med 50 µL/brønd af TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2. Der kræves ikke klud under de tre vaske trin, aflytning af mikrotiter plade på en væv.
- Tilsæt 50 µL/brønd af sekundær antistof løsning i 1% BSA i TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2. Med henblik herpå, fortyndes sekundær antistof, kanin immunoglobulin-targeting ged antistoffer konjugeret med alkalisk fosfatase, at 1:2,000 i 1% BSA i TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2. Inkuber plade i 75-90 min. ved stuetemperatur.
- Forberede AP-afsløring løsning ved at opløse en 5 mg tablet indeholder 4-nitrophenylfosfat fosfat dinatrium salt hexahydrat (fosfatase substrat) i 5 mL af AP buffer (0,1 M Glycin løsning, pH 10.4, indeholdende 1 MgCl2 og 0,2 mM Zn(II)-acetate).
- Vask alle huller i pladen tre gange med 50 µL/brønd af TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2, umiddelbart før du udfører det næste trin. Tryk på mikrotiter plade på en vævet klud efter den sidste vask skridt til at fjerne alle spor af væske.
- Tilføje 50 µL/brønd af AP-afsløring løsningen til brønde i mikrotiter-pladen. Tilføje AP-afsløring løsning hurtigt til alle brønde til at starte den enzymatiske omdannelse så samtidigt som muligt. Derfor bruge en multikanal-pipette.
- Inkuber plade ved stuetemperatur, indtil løsningen i wells med den højeste ligand koncentration bliver gule.
Bemærk: Inkubationstiden kan variere mellem 5 min og 1 h afhængigt af signal intensitet. - Stoppe omdannelse af fosfatase underlaget ved at tilføje 50 µL/hul 1,5 M NaOH-opløsning. Forlade den plade stående i flere minutter for at sikre streak-gratis blanding af begge løsninger. For at berettige den samme inkubationstiden i alle brønde, bruge en multikanal-pipette og tilføje 1,5 M NaOH i samme rækkefølge, føjet til brønde som for AP-afsløring underlaget i trin 11,8.
- Måle det optisk densitet (OD) ved 405 nm for hver brønd ved en ELISA-læseren.
12. evaluering af signalerne, titrering
- Åbn tabellen i rådata, OD405nm værdier, med Excel. Som disse signal værdier af titrering kurver er læst i rækker, omsætte værdier til en kolonne og etiket med koncentrationen af tilsat ligand i en anden kolonne.
- Åbn Graphpad prisme 5 (Version 5.0). Åbn en ny projektfil i hovedmenuen. Vælg formatet XY under nye data & graf. Vælg indstillingen Enter og plot et enkelt kontaktpunkt for hver værdi i y-aksen.
- Kopiere de to kolonner, koncentrationen af tilsat ligand og signal værdier (OD405nm værdier) fra excel fil og indsætte dem i datablad i GraphPad prisme som X- og Y-værdier, henholdsvis.
- Åbn programmet analyse sub GraphPad prisme 5 og vælge indstillingen ikke-lineær regression under XY-analyse. Vælg bruger-defineret ligning og tryk på den nye knap til at oprette en ny ligning.
- Skriv titrering kurve ligning i formen: Y =(Smax-Smin)*((X+R+K)-sqrt((X+R+K)^2-4*R*X)) /(2*R) + Smin + B * X i den nyåbnede skabelon ark, med Y at være signalværdi S, X er koncentrationen af tilsat ligand L , R er koncentrationen af immobiliserede receptor, K bliver dissociationskonstant, og B er baggrunden hældning. Definere de passende begrænsninger, såsom K > 0 og R > 0.
Bemærk: Denne ligning er den samme ligning af ligning 9 i en anden form. - Analysere værdierne i dataarket ved at vælge bruger-defineret ligning, som var nyligt lavet. Åbn tabellen med beregnede tilnærmelse værdier (K, Rt, Smax, Smin.og B) der er vist under afsnittet resultat på venstre side af skærmbilledet software.
Bemærk: Softwaren bestemmer de 5 parametre ved iterative montering af den ikke-lineære regression kun hvis titreringskurven består af mindst 5 datapunkter. - Vurdere den parametre K, Rt, Smax, Smin.og B for hver gruppe af titrering kurver statistisk, og korrelere parametre med den specifikke funktion af gruppen (muterede eller kemisk modificerede ligand eller receptor).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter ELISA er blevet udviklet, den gule farve af den konverterede alkalisk fosfatase substrat, para- nitrophenolate, viser, at mængden af bundne rhodocetin ligand falder med faldende koncentrationer af ekstra rhodocetin fra kolonner 1 til 11 (figur 1). Farveløs brøndene i de rhodocetin-fri brønde i kolonne 12 Vis en lav baggrunden signal.
Fotometriske kvantificering ved 405 nm indeholder data, som kan direkte fodres i en analyse software, og ved hjælp af en ikke-lineær regression og ligning 9, tilnærmer de rå data for hver række, titrering og beregner signalet S (som er lig med OD 405) som en funktion af den samlede koncentration af tilføjet rhodocetin ligand Lt (figur 2). De fire titrering kurver for hver receptor form (wild-type og mutant) er yderst reproducerbare og superpose næsten hinanden. I modsætning til denne lav inden for en gruppe varians, er de to grupper af titrering kurver klart adskilt fra hinanden. Højere koncentrationer af rhodocetin ligand er påkrævet for binding til den mutant α2A-domæne til få signaler af lignende værdier til dem af formen vildtype. Denne højre Skift af titrering kurver viser, at den mutante ligand har en lavere affinitet for liganden. Således forringer mutationen indført i domænet α2A rhodocetin bindende, fordi det er en del af webstedet rhodocetin binding til integrin domæne18.
Titreringskurven kan beskrives af 5 karakteristiske parametre: (i) dissociationskonstant K, (ii) koncentration af immobiliserede, biologisk aktive receptor Rt, (iii) grænseværdierne og (iv) minimum signaler (Smax og Smin), samt (v ) hældningen af baggrunden signal B. Blandt disse parametre er dissociationskonstant K væsentlige og mest relevant for biologiske fortolkning af titrering kurver. Hver titreringskurven giver én værdi for K. Således kan enkelt og også grupperet titrering kurver statistisk sammenlignet med hinanden. Sådan en statistisk analyse af fire titrering kurver for wild-type og det muterede α2A-domæne er vist i figur 3. Konstanten affinitet for binding af rhodocetin til wild-type α2A-domæne er 5,80 ± 0,15 nM, mens rhodocetin binder til de muterede receptor med en betydeligt lavere affinitet af 9.68 ± 0,18 nM (p < 0,0001).
Således titrering ELISA sammen med denne matematiske evaluering giver mulighed for en hurtig og statistisk forsvarlig vurdering af ligand binding til en receptor og dens muterede eller kemisk modificerede derivater. Derfor er både titrering ELISA og evaluering algoritme værdifulde værktøjer til at analysere struktur-funktion relationer.
Figur 1: repræsentative layout af en mikrotiter plade for en titrering ELISA. Hver række indeholder dataene til en titreringskurven. For at sammenligne deres binding af rhodocetin (RC) ligand, er wild-type (rækker A-D) eller mutant form (rækker E-H) af α2A-domæne immobiliseret i wells af fire rækker hver (Firling bestemmelse). Horisontal dot linje adskiller de to grupper af titrering kurver. Koncentrationen af rhodocetin ligand falder fra kolonne 1 til 11, mens wells af kolonne 12, angivet på højre side af den lodrette prik linje, ikke indeholder nogen rhodocetin og repræsenterer baggrund kontrol. Pladen er vist efter den bundne ligand er kvantificeret ved ELISA, alkalisk fosfatase substrat omdannes til gul para- nitrophenolate. Data er vist fra en ud af tre gentagne forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative titrering kurver. De rå data over tilsætningen immobiliseret vildtype og mutante former af integrin α2A-domæne med rhodocetin som opløselige ligand (symboler), samt tilnærmet titrering kurver (linjer) er vist i en semi-logaritmiske plot. Rå data af Firling bestemmelser (cirkler, trekanter op og ned, pladser til hver af de fire titrering rækker) er vist for immobiliseret wild-type (åben symboler) og muterede (fyldt symboler) α2A-receptorer. Den beregnede titrering kurver er vist som linjer (solid, korte stiplet, punkteret, kæde-punkteret) for wild-type (sorte linjer) og mutant (grå linjer) form af receptor. De fire titrering kurver inden for hver af de to grupper (vildtype og mutant receptor) superpose, titrering kurver klart er forskellige mellem de to grupper. Titreringer kurver af mutant α2A-domænet er flyttet til højere rhodocetin koncentrationer der angiver, at rhodocetin binder med lavere affinitet til de muterede receptor. Data er vist fra en ud af tre gentagne forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Statistisk sammenligning af dissociation konstanter K afledt af titrering kurver.
Dissociations konstanter af otte titrering kurver fra figur 2 er afbildet og grupperet for wild-type og mutant form af α2A domæne. Individuelle værdier, gruppe betyder, og standardafvigelser er angivet point, stiplede sorte linjer og grå fejllinjer, henholdsvis. Den lille variansen inden for hver gruppe og den tydelig forskel mellem gruppen betyder, at påvise en signifikant forskel (p < 0,0001) i liganden affinitet til wild-type og til mutant receptor. En to-sidet Student´s t-test blev anvendt til sammenligningen. Data er vist fra en ud af tre gentagne forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Titrering ELISA er en alsidig testsystem til at bestemme dissociation af en receptor-ligand interaktion. Som titreringen ELISA omgår nødvendighed at adskille frie og bundne ligander effektivt og at analysere deres koncentrationer kvantitativt betydeligt flere undersøgelser og publikationer har ansat titrering ringprøver i stedet for optagelse bindende kurver . Desuden titrering ringprøver er nemme at udføre og kræver forholdsvis lavt beløb af receptor og ligand. For nøjagtig analyse af dissociation konstanter, skal ren præparater af både receptor og ligand anvendes. Kontaminerende proteiner i receptor forberedelse konkurrere med receptor for adsorption websteder på plast overfladen af mikrotiter plade. Da de ikke binde ligand men reducere antallet af ligand-bindende receptorer, reducere urenheder af receptor løsning signaler af titrering ELISA. Hvis renheden af receptor forberedelse ikke kan forbedres enhver yderligere, et antistof rettet mod receptoren kan være immobiliseret på mikrotiter pladen og, efter blokering brøndene, vil fange receptor fra et præparat, der indeholder urenheder. Dog skal udvises forsigtighed, således at erobre antistoffet ikke forstyrrer påvisning af bundne ligand med de primære og sekundære antistoffer på grund af arter interferens af antistoffer, eller at det hindrer ligand bindende.
For at opnå en omfattende sæt af data, er det værdsat for at udføre titrering ELISA i en gensidig måde, som er at bruge den opløselige ligand et eksperiment som receptor i andre eksperimentet ved at immobilisere det til mikrotiter pladen og titreres med den tidligere receptor, som vil blive anvendt som opløselige ligand partner. Dette fungerer normalt godt medmindre immobilisering inaktiverer bindende aktivitet af en af partnerne eller værktøjer som antistoffer til at opdage den titreret partner, ikke findes eller er vanskelige at opnå. I rhodocetin-α2A domæne bindende system, det fungerede godt efter en glutathion-S-transferase (GST)-gruppe var sammenvokset til α2A-domænet for at lette sin afsløring med GST-antistoffer16.
En anden fordel ved titrering ELISA er at kun koncentrationen af det tilføjede ligand (Lt), men ikke af den frie og bundne ligand (Lf og Lb, henholdsvis), skal være kendt. Ligand forberedelse bør derfor så rene som muligt. Hvis dette er umuligt eller mulig kun i begrænset omfang, titreringen ELISA kan stadig være ansat, når kindtand forholdet mellem ligand inden for forberedelsen har været fastsat uafhængigt, fxaf SDS-PAGE, immunoblotting eller sandwich ELISA.
Problemer med titrering ELISA kan opstå hvis affinitet mellem receptor og ligand er for lavt, eller hvis glutaraldehyd fiksering afskaffer bindende interaktion. I sidstnævnte tilfælde skal en fiksering-fri protokol af titrering ELISA etableres. Praktisk, dissociation konstanter kun kan påvises hvis bindende partnere interagere med rimeligt høj affinitet, som er inden for rækkevidde af under ca 200 nM.
Titreringen giver signal intensiteter S som funktion af samlede koncentrationer af tilsat ligand, Lt. Som koncentrationer af fri og ubunden ligander, Lf og Lb, sum til Lt, og som Lb er lig med produktet af Y· Rt efter ligning 3, ligning 4 er omdannet til:
Ligning 5
resulterer i andengradsligning,
Ligning 6
Hvis praktisk løsning er,
Ligning 7
Derudover repræsenterer signal intensitet S (Lt) ved en bestemt koncentration af tilsat ligand Lt mætning udbytte Y, efter det er blevet korrigeret ved fratrækning af værdien minimum signal, Smin., og normaliseret til det dynamiske område , givet som forskellen mellem største og mindste signal værdier, Smax og Smin:
Ligning 8
Kombinationen af ligning 7 og ligning 8 giver den matematisk funktion, som korreleres signal intensitet S (Lt) med koncentrationen af tilsat ligand Lt. En sigt B· Lt kan føjes til at beskrive den uspecifikke baggrund signal, som lineært rejser med Lt. B er proportionalitet konstant i baggrunden. Den generelle funktion til at beskrive en titreringskurven er således:
Ligning 9
Denne funktion af en titreringskurven svarer til en sammensat funktion med en kvadratrod sigt og et lineært begreb, som beskriver den specifikke interaktion mellem receptor og ligand og uspecifik samspillet mellem ligand, henholdsvis. Denne funktion er forskellig fra den hyperbolske funktion af bindende kurve (Lbvs. Lf).
I modsætning til den bindende kurve, hvori koncentrationerne af bundne ligand er afbildet på y-aksen, titreringskurven er mere fleksibel og giver et signal, som korrelerer med koncentrationen af bundne ligand, afbildes på y-aksen. Dette signal kunne fotometrisk detekterede bindingen af en enzym-forbundet antistof (som i dette tilfælde af en ELISA), men det kunne også være andre spektrometrisk signaler, som en ændring i absorbans, cirkulære dichroism9, fluorescens polarisering21 , og NMR-signaler22. Derudover bør også termodynamiske signaler fra isotermisk titrering kalorimetri23 være muligt at blive evalueret. Andre undersøgelser fastslå bindingsaffinitet fra den kinetiske on - og off satser for dannelsen og dissociation af receptor-ligand kompleks af måling real-time ændringer i feltet flygtige af overfladen plasmon resonans24,25 , i masse aflejring af et kvartskrystal microbalance26, eller i fluorescens af individuel thermophoresis26,27. Disse real-time målinger er blevet kraftfulde værktøjer på grund af deres avancerede evalueringssoftware. Titrering ELISA og SPR er generelt metode til valg at undersøge bindende partnere i protein-kemisk analyse. Titrering ELISA foranstaltninger konstanten affinitet termodynamisk af kvantificere mængden af bundne ligand på forskellige equilibrium stater, SPR udnytter en kinetisk tilgang og tilnærmer den kinetiske sats konstanter, kud og kpå , forholdet mellem som giver kinetically beslutsomme dissociation konstant24,25. Afhængigt af de to forskellige tilgange, kan K-værdier afvige fra hinanden. I rhodocetin-α2A domæne bindende eksperimenter, SPR data viste kud og kpå sats konstanter, og dermed en kinetisk bestemme affinitet konstanten K, for den rhodocetin-α2A komplekse19, som er meget lig K-værdier målt i denne undersøgelse ved titrering ELISA. Mindre forskelle kan forklares ved aktivitet variationer af forskellige partier eller forskellige betingelser og varigheden af opbevaring af protein prøver. Herom senere i titrering ELISA måles alle prøver samtidigt og ikke sekventielt ligesom i SPR maskine. Nu, at være matematisk tilgængelig og nem at administrere med titrering kurve ligning (ligning 9), denne end-point måling af titrering ELISA kan blive lige så stærk som de kinetisk evaluerede real-time målinger, som kræve en omkostningskrævende SPR maskine.
Denne ligning tager i betragtning at den samlede koncentration af ligand er reduceret med koncentrationen af bundne ligand, især ved lav ligand koncentrationer. Dette giver mulighed for meget bedre tilnærmelser af titreringskurven til data over hele spektret af ligand koncentrationer. En ulempe ved titrering ELISA, i forhold til den bindende kurve, har hidtil været vanskeligt matematisk evaluere titreringskurven. Der henviser til, at i en bindende kurve koncentrationen af frie ligand Lf på halv-maksimal mætning er lig med dissociationskonstant, er dette ikke sandt for en titreringskurven. To algoritmer er selvstændigt udviklet til grafisk linearize titrering kurver og til at bestemme dissociationskonstant. Men begge algoritmer udviklet til spektroskopiske titrering eksperimenter af Stockell et al. 8 og af Heyn & Weischet9 lider under de handicap, bestemmes den maksimale signal for mætning udbytte Y grafisk. Da denne værdi er nærmede asymptotisk, er mætning udbytte og dermed den beregnede dissociationskonstant uløseligt fejl liggende. Derimod algoritme baseret på ligningen 9 bruger rå data fra titrering eksperimenter og beregner dissociationskonstant K samt andre parametre i en ikke-lineær regression til at finde den bedste-fit løsning (figur 2 og figur 3 ). Desuden, som denne algoritme ikke er nødvendigt at grafisk anslå den muligvis ud til at nå maksimal signal på ligand mætning, evalueringsprocessen bliver meget hurtigere og præcist og det bærer mindre bias end den grafiske evaluering. Flere titrering kurver kan evalueres parallelt. Således flere grupper af titrering kurver kan måles samtidigt, og deres parametre kan være statistisk analyseret og sammenlignet. Desuden hver titreringskurven giver et sæt af værdier, blandt dem dissociationskonstant K, koncentration af immobiliserede og bindende-aktive receptor Rt, dynamikområde som forskellen mellem største og mindste signal værdier Smax og Smin , såvel som den lineære faktor B, hvilket svarer til eksperimentelle baggrund signalet ved hjælp af disse værdier, mætning udbyttet Y kan beregnes og afbildet i afhængighed af koncentrationen af tilføjet ligand Lt. I sådan en mætning udbytte plot, koncentrationen af den tilføjede ligand på halv-maksimal mætning signal Lt(50%) er lig med summen af dissociationskonstant K plus halv koncentration af immobiliserede aktive receptor Rt
Ligning 10
Dette kan afledes til Y = 0,5 med ligning 7. Således kan koncentrationen af immobiliserede aktive receptor Rt bestemmes ved at udføre titrering ELISA med forskellige belægning koncentrationer af receptor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har intet at videregive.
Acknowledgments
Protokol og algoritme blev udviklet inden for et projekt finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG grant SFB1009 A09 og EB177/13-1). Forfatteren tak Barbara Schedding og Felix Schmalbein for teknisk support og Dr. Niland for kritisk læsning af manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIS | neoFrox | 1125KG001 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| NaCl | Applichem | 1,316,591,214 | |
| MgCl2 | Merck | 172571 | |
| integrin a2A, wild-type and mutant, recombinant | isolated in author's lab | ||
| NiNTA superflow column | Qiagen, Germany | 30821 | |
| Coomassie-Brilliant Blue R250 | Serva | 35050 | |
| bicinchoninic acid assay (BCA), protein concentration determination kit | Fisher Scientific | 23225 | |
| bovine serum albumine (BSA), fraction V | Applichem | A1391 | |
| 25 % solution of glutaraldehyde | Merck | 354400 | |
| anti-rabbit immunglobulin-antibodies from goat, conjugated with alkaline phosphatase | Sigma-Aldrich | A9919 | |
| Glycine | Applichem | A1377 | |
| Zn(II)-acetate | Applichem | A4324 | |
| NaOH | Applichem | A1551 | |
| Alkaline phosphatase substrate tablet (5 mg) | Sigma-Aldrich | S0942 | |
| Costar half-area microtiter plate | Thermo Scientific | Corning 3690 | |
| micro reaction tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| Microplate ELISA reader | BioTek | Synergy HT |
References
- Klotz, I. M. The application of the law of mass action to binding by proteins; interactions with calcium. Arch Biochem. 9, 109-117 (1946).
- Klotz, I. M. Ligand-receptor complexes: origin and development of the concept. J Biol Chem. 279 (1), 1-12 (2004).
- Bisswanger, H. Ch. 1: Multiple Equilibria, Principles and Derivations. Enzyme Kinetics: Principles and Methods. , Wiley VCH Verlag GmbH. 1-26 (2017).
- Shimura, K., Kasai, K. Affinity gel titration: quantitative analysis of the binding equilibrium between immobilized protein and free ligand by a continuous titration procedure. Anal Biochem. 149 (2), 369-378 (1985).
- Gong, M., Nikcevic, I., Wehmeyer, K. R., Limbach, P. A., Heineman, W. R. Protein-aptamer binding studies using microchip affinity capillary electrophoresis. Electrophoresis. 29 (7), 1415-1422 (2008).
- Hanes, M. S., Ratcliff, K., Marqusee, S., Handel, T. M. Protein-protein binding affinities by pulse proteolysis: application to TEM-1/BLIP protein complexes. Protein Sci. 19 (10), 1996-2000 (2010).
- Latour, R. A. The Langmuir isotherm: a commonly applied but misleading approach for the analysis of protein adsorption behavior. J Biomed Mater Res A. 103 (3), 949-958 (2015).
- Stockell, A. The binding of diphosphopyridine nucleotide by yeast glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. J Biol Chem. 234 (5), 1286-1292 (1959).
- Heyn, M. P., Weischet, W. O. Circular dichroism and fluorescence studies on the binding of ligands to the α subunit of tryptophan synthase. Biochem. 14 (13), 2962-2968 (1975).
- Campbell, I. D., Humphries, M. J. Integrin structure, activation, and interactions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (3), (2011).
- Zeltz, C., Gullberg, D. The integrin-collagen connection--a glue for tissue repair? J Cell Sci. 129 (4), 653-664 (2016).
- Kanchanawong, P., et al. Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions. Nature. 468 (7323), 580-584 (2010).
- Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annu Rev Immunol. 25, 619-647 (2007).
- Luo, B. H., Springer, T. A. Integrin structures and conformational signaling. Curr Opin Cell Biol. 18 (5), 579-586 (2006).
- Ricard-Blum, S. The collagen family. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a004978 (2011).
- Eble, J. A., Tuckwell, D. S. The α2β1 integrin inhibitor rhodocetin binds to the A-domain of the integrin α2 subunit proximal to the collagen-binding site. Biochem J. 376 (Pt 1), 77-85 (2003).
- Eble, J. A., et al. The α2β1 integrin-specific antagonist rhodocetin is a cruciform, heterotetrameric molecule. FASEB J. 23 (9), 2917-2927 (2009).
- Eble, J. A., et al. Dramatic and concerted conformational changes enable rhodocetin to block α2β1 integrin selectively. PLoS Biol. 15 (7), e2001492 (2017).
- Bracht, T., Figueiredo de Rezende, F., Stetefeld, J., Sorokin, L. M., Eble, J. A. Monoclonal antibodies reveal the alteration of the rhodocetin structure upon α2β1 integrin binding. Biochem J. 440 (1), 1-11 (2011).
- Harlow, E., Lane, D. Chapter 5: Immunizations. Antibodies, a laboratory manual. 5, Cold Spring Harbor Laboratory. 53-138 (1988).
- Lu, D. Analyzing interactions between SSB and proteins by the use of fluorescence anisotropy. Methods Mol Biol. 922, 155-159 (2012).
- Fielding, L. NMR methods for the determination of protein-ligand dissociation constants. Curr Top Med Chem. 3 (1), 39-53 (2003).
- Leavitt, S., Freire, E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry. Curr Opin Struct Biol. 11 (5), 560-566 (2001).
- McDonnell, J. M. Surface plasmon resonance: towards an understanding of the mechanisms of biological molecular recognition. Curr Opin Chem Biol. 5 (5), 572-577 (2001).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis. Curr Opin Biotechnol. 11 (1), 54-61 (2000).
- Pesquero, N. C., et al. Real-time monitoring and kinetic parameter estimation of the affinity interaction of jArtinM and rArtinM with peroxidase glycoprotein by the electrogravimetric technique. Biosens Bioelectron. 26 (1), 36-42 (2010).
- Scheuermann, T. H., Padrick, S. B., Gardner, K. H., Brautigam, C. A. On the acquisition and analysis of microscale thermophoresis data. Anal Biochem. 496, 79-93 (2016).
