Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Titrering ELISA som metode for å bestemme dissosiasjon konstant reseptor Ligand interaksjon

Published: February 15, 2018 doi: 10.3791/57334
Automatic Translation
1
1Institute of Physiological Chemistry and Pathobiochemistry, University of Münster

Summary

En detaljert protokoll for å utføre en titrering ELISA er beskrevet. Dessuten vises en ny algoritme evaluere titrering ELISAs og hente en dissosiasjon konstant av binding av en løselig ligand til en være ferdig innen plate-immobilisert reseptor.

Abstract

Dissosiasjon konstant beskriver samspillet mellom to partnere i bindingen likevekt og er et mål på deres slektskap. Det er en viktig parameter å sammenligne forskjellige ligander, f.eks, konkurrerende hemmere, protein isoformene og mutanter, for deres bindende styrke til en bindende partner. Dissosiasjon konstanter bestemmes ved å plotte konsentrasjoner av bundet versus gratis ligand som bindende kurver. Titrering kurver, som er et signal som er proporsjonal med konsentrasjonen av bundet ligand plottet mot den totale konsentrasjonen av ekstra ligand, er mye enklere å registrere. Signalet kan oppdages tyske og enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA). Dette er eksemplifisert i en protokoll for en titrering ELISA som måler binding av snake venom-avledet rhodocetin til sin immobilisert måldomene av α2β1 integrin. Titrering ELISAs er allsidig og brukte. Noen par samspill proteiner kan brukes som immobilisert reseptoren og løselig ligand, forutsatt at begge proteiner er rene og konsentrasjonene er kjent. Vanskeligheten har så langt vært å finne dissosiasjon konstant fra en titrering kurve. I denne studien introdusert en matematisk funksjon underliggende titrering kurver. Uten noen feilutsatte grafisk estimering av en metning avkastning kan denne algoritmen behandling av rådata (signal intensiteter i ulike konsentrasjoner av ekstra ligand) direkte av matematiske evaluering via ikke-lineær regresjon. Dermed flere titrering kurver kan registrert samtidig og forvandlet til et sett med karakteristiske parametere, blant dem dissosiasjon konstant og konsentrasjonen av binding-aktiv reseptoren, og de kan evalueres statistisk. Kombinert med denne algoritmen, titrering ELISAs får fordelen av direkte presentere dissosiasjon konstant. Derfor kan de brukes mer effektivt i fremtiden.

Introduction

Dissosiasjon konstant K er en viktig parameter å beskrive affinitet til en reseptor (R) for sin ligand (L). Basert på loven massevirkningsloven, er K definert for likevekt, der reseptor-ligand komplekse RL dissociates reseptoren R og ligand L:

Equation 1             Formel 1

med indekser f indikerer gratis/ubundet staten reseptor og ligand. Konsentrasjonen av reseptor-ligand komplekset, RL, er identisk med konsentrasjonen av reseptor-bundet ligand Lb. Den totale konsentrasjonen av reseptor Rt er summen av gratis reseptor Rf og ligand binding reseptor Rb = Lbdissosiasjon konstant kan også skrives som:

Equation 2         Ligning 2

Derfor metning gir Y, definert som brøkdel av bundet ligand Lb i forhold til den totale konsentrasjonen av reseptor Rt,

Equation 3         Formel 3

avhengig av konsentrasjonen av gratis ligand Lf:

Equation 4         Ligningen 4

Denne hyperbolsk relasjonen beskriver bindende kurven av en reseptor-ligand interaksjon og tomten sin viser konsentrasjonen av bundet ligand Lb som en funksjon av konsentrasjonen av gratis ligand Lf. Fra binding kurven, kan dissosiasjon konstant K avledes som konsentrasjonen av gratis ligand på halv maksimal metning gir. Videre er ulike algoritmer for å linearize binding kurver etablert, for eksempel dobbel-gjensidige tomten av Klotz1,2eller transformasjoner etter Scatchard eller Hanes (anmeldt av Bisswanger3). Men lider alle algoritmer problemet som maksimumsverdien for metning avkastningen, som er asymptotisk nærmet på høye konsentrasjoner av gratis ligand i bindingen kurven, fastsettes i en grafisk pre vurdering og derfor feilutsatte.

I tillegg krever fastsettelse av en bindende kurve kvantifisering av gratis og bundet ligand under binding likevekt. Dette må gratis ligand være atskilt fra reseptor-bundet ligand og kvantifisert. Det ligand og reseptor må derfor varierer i sine egenskaper, for eksempel en ikke-protein ligand i motsetning til en protein reseptor. Hvis begge bindende partnere proteiner, har de skal skilles i størrelsene, kostnader eller andre molekylære funksjoner. Likevel er kvantifisering av ligand konsentrasjoner i småskala bindende tilnærminger en vanskelig oppgave. Radioaktivt merking av ligand har ofte vært nødvendig å finne den lav konsentrasjonen av bundet ligand, spesielt hvis betydelige mengder reseptorer ikke var tilgjengelige og rimelige. Videre kan reseptor-bundet ligand distansere under og etter isolasjon i et ikke-ubetydelig måte. Derfor er komplekse metoder, for eksempel likevekt gel filtrering4, kapillære geleelektroforese5og puls proteolyse6, pålagt å kvantifisere reseptor-bundet ligand og skiller den fra gratis ligand.

I motsetning til disse bindende analyser krever ikke titrering eksperimenter kvantitative separasjon av bundet og gratis ligand. Dette er en reseptor i en konstant konsentrasjon titreres med ulike konsentrasjoner av ekstra ligand. Ved binding til reseptoren har bundet ligand en Biofysiske egenskap som skiller den fra gratis ligand og målbare f.eks, fotometri, fluorometry eller antistoff gjenkjenning. Dermed et signal S, som er proporsjonal med metning gir Y og følgelig også til konsentrasjonen av reseptor-bundet ligand (Lb), registreres som en funksjon av den totale konsentrasjonen av ekstra ligand (Lt). Både parametere, signalet S og den totale konsentrasjonen av ekstra ligand er kvantifisert på en direkte og enklere måte enn konsentrasjonen av bundet og gratis ligand. Spesielt, gjenkjenning av reseptor-bundet ligand av enzymet knyttet immunosorbent analysen (ELISA) tillatt reduksjon av eksempel volumer til under 100 µL og parallelle målinger av flere ligand konsentrasjoner i flere godt microtiter plater. I en titrering ELISA, en reseptor fysisk adsorbert til en være ferdig innen plate på samme konsentrasjonen og titreres med løselig ligand. Reseptoren er immobilisert til plast overflaten i hovedsak av hydrofobe adsorpsjon. Overflaten konsentrasjonen av immobilisert reseptor korrelerer med belegg konsentrasjonen av reseptoren i en lineær relasjon, trolig etter Langmuir´s adsorpsjon isotherm7. I tillegg til det totale antallet adsorbert reseptor-molekyler er deres aktivitetstilstand en viktig parameter for titrering analyser. Bare immobilisert reseptorer som har beholdt ligand binding aktivitet, er relevante for titrering analysen og til slutt bidrar til den totale konsentrasjonen av aktive reseptorer Rt av titrering analysen, som ikke kan bestemmes direkte.

Nettsteder på plast overflaten, som ikke dekkes av immobilisert reseptoren er utsatt for adsorberes andre proteiner, som ligand. Fysisk adsorpsjon av ligand til slike plast overflaten nettsteder vil resultere i en lignende signal som reseptor-bundet ligand, men på en uspesifisert måte. Redusere uspesifikke signalet, plast overflaten nettstedene til de microtiter platene som ikke har vært belagt med protein, men vil bli blokkert med bovin serum albumin (BSA). Men for noen reseptor-ligand titrering analyser, kan uspesifikke bakgrunn signaler observeres. Så, andre blokkerer agenter, som en løsning av 0,2% eller 0,04% mellom 20, anbefales.

Etter binding til reseptoren, er gratis ligand fjernet av to vask trinn. Bundet ligand fortsatt med reseptoren, som er immobilisert til plast overflaten av være ferdig innen brønnen, og eventuelt forsterket av kjemiske fiksering. For påfølgende kovalente kryss-sammenhengen bundet ligand og immobilisert reseptor med glutaraldehyde erstattes buffer stoffet TRIS for HEPES, uten noen endring i ligand binding. HEPES, i motsetning til TRIS, deaktivere ikke glutaraldehyde. Kovalente kryss-sammenhengen med glutaraldehyde løser bundet ligand med sin reseptoren og hindrer sin avstandtagen under vask og inkubasjon fremgangsmåten. Dermed reseptor-ligand samspillet er kjemisk frosset og garanterer en titrering kurve som ikke påvirkes av etterfølgende trinnene vask og inkubasjon. Imidlertid kan glutaraldehyde fiksering kjemisk endre ligand og reseptor slik at deres samspill er redusert eller avskaffet. Videre endres modifikasjon av epitopes innen ligand forpliktende tilhørighet oppdage antistoff, spesielt hvis et monoklonalt antistoff brukes å kvantifisere bundet ligand. Selv om ingen av disse bivirkninger av glutaraldehyde fiksering oppstår i denne titrering ELISA, må følsomheten til testen mot glutaraldehyde testes for hver reseptor-ligand interaksjon før titrering eksperimentet. Etter fiksering fjernes overflødig glutaraldehyde i tre vask trinn med TRIS inneholder buffer. TRIS deaktiverer gjenværende aldehyd grupper som nonspecifically kan reagere med oppdage antistoffer i det påfølgende trinnet.

Mengden av bundet ligand er kvantifisert med koblede enzym-antistoffer, som gir en fotometriske ELISA signal S. Dette er plottet mot den totale ligand konsentrasjon Lt lagt i hver brønn. Til tross for oppkjøpet enklere er titrering kurve ikke en hyperbolsk funksjon i motsetning til bindende kurven. Videre har vært uklart hvordan beregne dissosiasjon konstant K fra en titrering kurve. Selv om algoritmer for å linearize tyske ervervet titrering kurver er uavhengig rapportert av Stockell8 og Heyn og Weischet9, de falt kort på grunn av deres usikkerhet beregne maksimalt signalet verdi som den metning avkastning tilnærminger på høye konsentrasjoner av ekstra ligand.

Her er en titrering ELISA og en ikke-lineær regresjon algoritmen beskrevet å utlede dissosiasjon konstanten K for en reseptor ligand interaksjon fra en titrering kurve. Denne protokollen er eksemplifisert for samspillet av kollagen-bindende A-domenet integrin α2β1 med en slange gift-avledet inhibitor. Integrins er celle vedheft molekyler, som megle ankerplass celleområdet til den omkringliggende ekstracellulær matrisen eller den underliggende kjelleren membran10,11. Videre formidle integrins viktig signaler mellom cellene og den ekstracellulære matrisen ved rekruttere ytterligere signalnettverk molekyler og danner nye cellen organeller, adhesomes, på cellen matrise samhandling12,13, 14. kollagen, ligand av α2β1 Integra er det mest rikelig proteinet i kroppen og er en avgjørende stillas komponent av bindevev15. Samspillet mellom α2β1 integrin og kollagen er formidlet av A-domenet integrin α2 delenhet. Integrin α2A-domenet inneholder en divalent kasjon, som kreves for kollagen bindende og stabiliseres dets struktur. Vill-type form samt mutanter α2A domenet, slik som den som overflaten-eksponerte rester Y216 hadde blitt erstattet for glysin, lett produsert recombinantly i en bakteriell uttrykk system og isolert via deres oligo-hans-koder med en NiNTA superflow kolonne med en påfølgende dialyse mot TRIS-bufret saltvann (SS, 50 mM TRIS/HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl) inneholder 2 mM MgCl216. Konsentrasjonene var bestemt med bicinchoninic syre analysen (BCA) og deres purities er testet av konvensjonelle SDS side og farget med Coomassie-Brilliant blå R250.

Samspillet mellom α2β1 integrin og kollagen blokkeres ved binding av snake venom komponenten, rhodocetin, Malayan grav viper (Calloselasma rhodostoma)16,17. Brukes som en løselig ligand i denne titrering ELISA, rhodocetin var renset fra råoljen gift som beskrevet tidligere16. Det er oppløst i HEPES-bufret saltvann (HBS, 10 mM HEPES/NaOH, pH 7.4, 150 mM NaCl) og lagres fryses på 20 ° C. Konsentrasjonen ble bestemt av BCA og sin renhet ble påvist av SDS-side. Som opptrer, rhodocetin ikke bare blokkerer kollagen binding til integrin α2β1 A-domenet, men også stabiliserer inaktive konformasjon av integrin og dermed hindre noen signalene fra kollagen i celler eller blodplater18. Det er stor biomedisinsk betydning dissosiasjon konstant av rhodocetin med reseptor målet og dermed rakne sin molekylære mekanisme og farmasøytiske potensielle f.ekssom en antithrombotic agent. For dette formål, en titrering ELISA beskrives inkludert evalueringen er som gjelder for nesten alle reseptor-ligand interaksjon med en 1:1 samhandling støkiometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. lager løsninger

  1. For å forberede 100 mL 10 x TBS pH 7.4 løsning, oppløse 6.06 g TRIS og 8.77 g NaCl i 90 mL deionisert vann, justere pH 7,4 med 37% HCl løsning, fylle volumet til 100 mL med deionisert vann og filtrere løsningen.
  2. For å forberede 100 mL 1 M HEPES/NaOH, pH 7.4 løsning, oppløse 23.83 g HEPES i 90 mL deionisert vann, justere pH 7,4 med 1,5 M NaOH, fylle volumet til 100 mL med deionisert vann og filtrere løsningen.
  3. For å forberede 100 mL 5 M NaCl løsning, løses 29,2 g NaCl i 90 mL deionisert vann. Fylle volumet til 100 mL med deionisert vann og filtrere løsningen.
  4. For å forberede 100 mL 1 M MgCl2 løsning, oppløse 20.33 g MgCl2 · 6H2O i 90 mL deionisert vann. Fylle volumet til 100 mL med deionisert vann og filtrere løsningen.
  5. For å forberede 5% inaktivert BSA i vann, veie 2.5 g av BSA (brøkdel V, pH 7.0) i et 50 mL rør og oppløse den i 45 mL deionisert vann. Fylle 50 mL løsningen med deionisert vann og varme løsningen i et vannbad på 68 ° C for 45 min. avkjøle den i en isbadet og lagre den på 20 ° C.
  6. Forberede 25% glutaraldehyde vannoppløsning.
    FORSIKTIG: Glutaraldehyde er skadelig hvis svelget, giftig ved innånding, og etsende. Bruk klær, hansker og beskyttelse for beskyttelse.
  7. Heve kanin antiserum som beskrevet tidligere19. Titer av antiserum ble fastsatt ifølge standardprotokoller20.
  8. Forberede anti-kanin immunglobulin-antistoffer fra geit konjugert med alkalisk fosfatase.
  9. For å forberede 100 mL 0.1 M glysin løsning, løses 0,75 g glysin i 90 mL deionisert vann. Justere pH til 10.4 med 1,5 M NaOH løsning, fylle volumet til 100 mL med deionisert vann og filtrere løsningen.
  10. Å forberede 100 mL 0,5 M Zn (II)-acetate løsning, oppløse 10.98 g av Zn (II)-acetate · 2H2O i 90 mL deionisert vann. Fylle volumet til 100 mL med deionisert vann og filtrere løsningen.
  11. For å forberede 100 mL 1,5 M NaOH løsning, løses 6.0 g av NaOH i 90 mL deionisert vann. Fylle volumet til 100 mL med deionisert vann og filtrere løsningen.

2. Forbered buffere og løsninger

  1. Fortynne 5 mL av 10 x TBS pH 7.4, med 45 mL vaskebuffer vann og legge til 100 µL på 1 M MgCl2 lager løsning. Holde det ved romtemperatur. TBSEN, pH 7.4, 2 mM MgCl2 løsning er immobilisering av reseptoren og vask være ferdig innen platen.
  2. Fortynne 10 mL av 5% av inaktivert BSA i vann og 5 mL 10 x TBS, pH 7.4 med deionisert vann og 50 mL. Legg 100 µL av 1 M MgCl2 lagerløsning og bland løsningen godt. Holde den på is og lagre den for videre eksperimenter på 20 ° C. Merk at 2,5 mL 1% BSA i SS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 er nødvendig for hver titrering kurve.
  3. Fortynne 2,5 mL 1 M HEPES/NaOH, pH 7.4 og 1.5 mL 5 M NaCl løsning til 50 mL med deionisert vann, tilsett 100 µL 1 M MgCl2 løsning, og bland løsningen grundig for å forberede 50 mL av HBS, pH 7.4: 50 mM HEPES/NaOH , 150 mM NaCl.
  4. Legge til 5 µL av 1M MgCl2 lagerløsning og 2 µL 0,5 M Zn (II)-acetate lagerløsning til 5 mL 0.1 M glysin løsning, pH 10.4 å forberede alkalisk fosfatase (AP) buffer (0.1 M glysin løsning, pH 10.4, 1 mM MgCl2, 0.2 mM Zn(II)-acetate).

3. immobilisering av reseptoren (Integrin α2A-domene) til en Microtiter Plate

  1. Fortynne lagerløsning for integrin α2A-domenet i SS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 en endelig konsentrasjon av 5 µg/mL.
    Merk: Volumet av belegg løsningen er 650 µL for en titrering kurve som består av 12 vel-rad av en halv området-være ferdig innen plate.
  2. Fyll hver vel en rad på en halv området-være ferdig innen plate med 50 µL/vel 5 µg/mL belegg løsningen av integrin α2A-domene (vill-type eller mutant). Utføre hver titrering rad minst i duplikater (i dette eksemplet som quadruplets, se oppsett av være ferdig innen plate i figur 1).
  3. Forsegle platen med folie eller lukke den med lokk. La platen på 4 ° C over natten.

4. vask belagt Wells fra Plate dobbelt med SS, pH 7.4, 2 mM MgCl2

  1. Fjerne løselig reseptor molekyler, som ikke har blitt blokkert på plast overflaten av fysiske adsorpsjon, fjerne belegg løsningen og fyll hver godt med 50 µL av TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2.
  2. Fjerne vaskeløsning. Kontroller at brønnene ikke blir tørr. Derfor ikke trykk være ferdig innen platen på en vev klut for å fjerne gjenværende væske. Bruk en må pipette eller en flerkanals pipette fylle brønnene raskt.
  3. Repeter dette vask en gang.

5. blokkere uspesifikke bindende

  1. Legge til 50 µL av 1% BSA løsning i SS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 i hver brønn.
  2. Tette brønnene med folie eller tett med lokk.
  3. Inkuber brønnene 1t ved romtemperatur.
    Merk: Noen av inkubasjon trinnene i denne protokollen kan utføres på en rock eller risting plattform. Men dette er ikke nødvendig og endrer ikke resultatet av eksperimentet.

6. forberedelse av en seriell fortynning rekke Ligand, Rhodocetin

  1. Variere start konsentrasjonen av rhodocetin og fortynningsfaktoren for seriell uttynnet, å få et passende utvalg av ligand konsentrasjoner og registrere en full titrering kurve med et minimum og maksimum signal. I dette eksperimentet, kan du bruke en start konsentrasjon av 243 nM rhodocetin og en fortynningsfaktoren av 2.3. Fortynn rhodocetin lager løsningen på den høyeste ligand konsentrasjonen av raden føljetong fortynning. For hver titrering kurve med en fortynningsfaktoren av 2.3, forberede 115 µL 243 nM (dvs., 15,2 µg/mL) rhodocetin løsning i 1% BSA/SS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 i reagensglasset #1.
  2. Fyll 65 µL av 1% BSA løsning i SS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 i 10 test-rør, merket #2 gjennom #11.
  3. Overføre 50 µL av rhodocetin fortynning fra reagensglasset #1 til reagensglasset #2, blande både løsninger (totalt volum: 115 µL; fortynningsfaktoren: 1:2. 3) av føden, og deretter overføre 50 µL fra denne blandingen til reagensglasset #3, osv.
  4. Fortsett denne føljetong fortynning til reagensglasset #11.
    Merk: Volumene i trinn 6.1-6.4 er nok for en titrering kurve. Multiplisere disse volumene på antall gjentak. I dette tilfellet utføre åtte titrering kurver (quadruplets av to α2A-domene) og forberede følgende volumer: 920 µL rhodocetin løsning på høyest konsentrasjon i reagensglasset #1; 520 µL av 1% BSA i SS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 å fylle hver av reagensglass #2 #11; og 400 µL av overføringen volumet fra en tube til den neste.

7. binding av Ligand (Rhodocetin) i ulike konsentrasjoner til immobilisert reseptor (Integrin α2A-domene)

  1. Fjerne blokkering løsningen fra platen mikrotiterbrønnene ved en vakuum linje.
  2. Straks legge 50 µL rhodocetin løsningen i 1% BSA/SS, pH 7.4/MgCl2 løsning av reagensglasset #1 i brønner i kolonne 1, løsning av reagensglasset #2 brønner i kolonne 2,etc. legge 50 µL av 1% BSA i SS, pH 7.4 , 2 mM MgCl2 (blokkering og fortynning buffer) som en ligand-free kontroll brønner kolonnen 12 (se oppsett av være ferdig innen plate, figur 1).
  3. Tette brønnene med folie eller tett med lokk.
  4. Inkuber brønnene 1.5 h ved romtemperatur (rundt 20-22 ° C).

8. vask brønner til Plate to ganger med HBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2

  1. For å fjerne ikke-bundet ligand molekyler, fjerne bindingen løsningen og fyll hver med 50 µL av HBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2. Deretter Fjern vaskeløsning.
  2. Pass på at brønnene ikke blir tørr. Derfor ikke trykk være ferdig innen platen på en vev klut for å fjerne gjenværende væske. Bruk en må pipette eller en flerkanals pipette fylle brønnene raskt.
  3. Repeter dette vask en gang.

9. fastsette reseptor-bundet Ligand med 2,5% Glutaraldehyde i HBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2

  1. Utarbeide en fersk 2,5% glutaraldehyde løsning ved å blande 1 del av 25% glutaraldehyde løsning og 9 deler av HBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2.
  2. Fyll hver brønn av være ferdig innen plate med 50 µL av 2,5% glutaraldehyde løsningen i HBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2. Inkuber være ferdig innen platen i 10 min ved romtemperatur.

10. vask brønner Plate tre ganger med 50 µL/vel av TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2

  1. For å fjerne og deaktivere overflødig glutaraldehyde, fjerne fiksering løsningen og fyll hver med 50 µL av TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2. Deretter fjerne vaskeløsning.
    Merk: Hell glutaraldehyde inneholder fiksering løsningen fra være ferdig innen platen i en parabol og kast fiksering løsningen etter at det er blitt inaktivert av en like volum av TBS, pH 7.4.
  2. Pass på at brønnene ikke blir tørr. Derfor ikke trykk være ferdig innen platen på en vev klut for å fjerne gjenværende væske. Bruk en må pipette eller en flerkanals pipette fylle brønnene raskt.
  3. Repeter dette vaskemaskin to ganger.

11. kvantifisering av reseptor-bundet Ligand med ELISA

  1. Legge til 50 µL/vel av primære antistoff løsningen i 1% BSA i SS, pH 7.4, 2 mM MgCl2. Den primære antistoff løsningen er en kanin antiserum reist mot rhodocetin19, utvannet 1:2,000 i 1% BSA i SS, pH 7.4, 2 mM MgCl2.
  2. Inkuber platen i 75-90 min ved romtemperatur. Vask alle brønner av platen tre ganger med 50 µL/vel av TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2. I løpet av tre vaske trinn, stamper av være ferdig innen plate på en vev er klut ikke nødvendig.
  3. Legge til 50 µL/vel av sekundær antistoff løsningen i 1% BSA i SS, pH 7.4, 2 mM MgCl2. Dette fortynne den sekundære antistoff, kanin immunglobulin målretting geit antistoffer konjugert med alkalisk fosfatase, til 1:2,000 i 1% BSA i SS, pH 7.4, 2 mM MgCl2. Inkuber platen i 75-90 min ved romtemperatur.
  4. Forberede AP-oppdage løsning ved å løse opp en 5 mg tablett inneholder 4-nitrophenyl fosfat disodium salt hexahydrate (fosfatase substrat) i 5 mL AP bufferen (0.1 M glysin løsning, pH 10.4, som inneholder 1 mM MgCl2 og 0.2 mM Zn(II)-acetate).
  5. Vask alle brønner plate tre ganger med 50 µL/vel av TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2, umiddelbart før du utfører neste trinn. Tapp være ferdig innen platen på en vev klut etter siste vask trinn å fjerne alle spor av væske.
  6. Legge til 50 µL/vel av AP-oppdage løsningen brønnene av være ferdig innen plate. Legge til AP-oppdage løsning umiddelbart i alle brønnene starte enzymatisk konvertering som samtidig som mulig. Bruk derfor en flerkanals pipette.
  7. Inkuber platen ved romtemperatur før løsningen i brønnene med den høyeste ligand konsentrasjonen gule.
    Merk: Inkubasjon tiden kan variere mellom 5 minutter og 1 time avhengig av signal intensiteten.
  8. Stopp konvertering av fosfatase underlaget ved å legge til 50 µL/vel 1,5 M NaOH løsning. La den plate stående i flere minutter slik stripefrie blanding av begge løsninger. For å garantere samme inkubasjonstiden i alle brønnene, bruke en flerkanals pipette og legge den 1,5 M NaOH i samme rekkefølge fordelt som for AP-oppdage underlaget i trinn 11,8.
  9. Måle (OD) optisk densitet ved 405 nm i hver brønn ved en ELISA leser.

12. evaluering av titrering signaler

  1. Åpne tabellen med rådata, OD405nm verdiene i Excel. Som disse signalet verdier av titrering kurver er lest i rader, transponere verdiene i en kolonne og etikett med konsentrasjonen av ekstra ligand i en annen kolonne.
  2. Åpne Graphpad prismet 5 (versjon 5.0). Åpne en ny prosjektfil i hovedmenyen. Velg XY formatet nye data& grafen. Velge alternativet Angi og tomten ett punkt for hver verdi for y-aksen.
  3. Kopier de to kolonnene, konsentrasjonen av ekstra ligand og signalet verdier (OD405nm verdier) fra excel filen og lime dem inn i datablad av GraphPad prisme som X- og Y-verdier, henholdsvis.
  4. Åpne programmet analyse sub GraphPad prisme 5 og velg ikke-lineær regresjon under XY-analyse. Velg brukerdefinert formel og trykk på Ny-knappen til å opprette en ny formel.
  5. Skriv inn titrering kurve ligningen i form: Y =(Smax-Smin)*((X+R+K)-sqrt((X+R+K)^2-4*R*X)) /(2*R) + Smin + B * X i nyåpnede mal arket, y blir signalet verdien S, X være konsentrasjonen av ekstra ligand L , R er konsentrasjonen av immobilisert reseptoren, K blir dissosiasjon konstant, og B blir bakgrunnen skråningen. Definere de aktuelle betingelsene, for eksempel K > 0 og R > 0.
    Merk: Dette er samme ligningen av ligningen 9 i en annen form.
  6. Analysere verdiene i dataarket ved å velge egendefinerte ligningen, som nylig ble opprettet. Åpne tabellen med beregnede tilnærming verdiene (K, Rt, Smax, Sminog B) som vises i delen resultatet på venstre side av skjermbildet programvare.
    Merk: Programvaren bestemmer parameterne 5 iterativ omrisset av ikke-lineær regresjon bare hvis titrering kurve består av minst 5 datapunkt.
  7. Evaluere parameterne K, Rt, Smax, Smin, og B for hver gruppe titrering kurver statistisk og relatere parameterne med den bestemte funksjonen av gruppen (mutert eller kjemisk endret ligand eller reseptor).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter ELISA har blitt utviklet, den gule fargen av konverterte isoenzymer underlaget, para- nitrophenolate, indikerer at mengden av bundne rhodocetin ligand reduseres med minkende konsentrasjoner av ekstra rhodocetin fra kolonner 1 til 11 (figur 1). Fargeløs brønnene i rhodocetin-fri brønnene i 12-kolonnen viser en lav bakgrunn signal.

Fotometriske kvantifisering ved 405 nm gir data, som kan direkte mates inn i en analyseprogramvare, og med en ikke-lineær regresjon og ligningen 9, tilnærmet rådata om hver titrering rad og beregner signal S (som tilsvarer OD 405nm) som en funksjon av den totale konsentrasjonen av rhodocetin ligand Lt (figur 2). Fire titrering kurvene for hvert reseptor skjema (vill-type og mutant) er svært reproduserbare og superpose nesten hverandre. I motsetning til denne lav konsernintern varians, er de to gruppene av titrering kurver tydelig atskilt fra hverandre. Høyere konsentrasjoner av rhodocetin ligand kreves for binding til mutant α2A-domenet å få signaler av tilsvarende verdier til de i vill-type-skjemaet. Denne høyre SKIFT av titrering kurver viser at mutant ligand har en redusert affinitet for ligand. Dermed svekker mutasjon introdusert i α2A domenet rhodocetin bindende fordi det er del av rhodocetin binding området integrin domene18.

Titrering kurve kan beskrives ved 5 karakteristiske parametere: (i) dissosiasjon konstant K, (ii) konsentrasjon av immobilized, biologisk aktive reseptor Rt, (iii) maksimum og (iv) minimum signaler (Smax og Smin), og (v ) skråningen av bakgrunnen B. Blant disse parameterne er dissosiasjon konstant K viktig og mest relevant for biologiske tolkning av titrering kurver. Hver titrering kurve gir én verdi for K. Dermed kan enkelt, også gruppert titrering kurver statistisk sammenliknes med hverandre. Så statistisk analyse av fire titrering kurver for vill-type og muterte α2A-domenet vises i Figur 3. Affinitet konstant for binding av rhodocetin vill-type α2A-domenet er 5.80 ± 0,15 nM, mens rhodocetin binder til mutert reseptoren med en betydelig lavere affinitet av 9.68 ± 0,18 nM (p < 0,0001).

Dermed gir titrering ELISA sammen med denne matematiske evaluering en rask og statistisk lyd evaluering av ligand binding til en reseptor og cannabisstoffer mutert eller kjemisk endret. Derfor er både titrering ELISA og evaluering algoritmen verdifulle verktøy for å analysere struktur-funksjon relasjoner.

Figure 1
Figur 1: representant utformingen av en være ferdig innen plate for en titrering ELISA. Hver rad inneholder dataene for en titrering kurve. For å sammenligne deres binding av rhodocetin (RC) ligand, er vill-type (rader A-D) eller mutant form (rader eh) for α2A-domene immobilized i brønner fire rader hver (quadruplet vilje). Vannrett dot linjen skiller de to gruppene av titrering kurver. Konsentrasjonen av rhodocetin ligand reduseres fra kolonne 1 til 11, mens brønner kolonnen 12, angitt på høyre side av den vertikale prikk linjen, ikke inneholder noen rhodocetin og representerer på bakgrunn-skyveknappen. Platen vises etter bundet ligand er kvantifisert ved ELISA der alkalisk fosfatase underlaget konverteres til gul para- nitrophenolate. Data vises fra av tre repeterende eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: representant titrering kurver. Rådata om titrating immobilisert vill-type og mutant former for integrin α2A-domene med rhodocetin som løselig ligand (symboler), samt tilnærmet titrering kurver (linjer) vises i et halvt logaritmisk plott. Rådata om quadruplet bestemmelser (sirkler, trekanter opp og ned, ruter for hver av de fire titrering radene) vises for immobilisert vill-type (åpne symboler) og mutert (fylt symboler) α2A-reseptorer. Beregnet titrering kurvene vises som linjer (solid, kort stiplet, prikket, kjede-prikkete) for vill-type (svarte linjer) og mutant (grå linjer) form av reseptoren. Fire titrering svingene innenfor hver av de to gruppene (wild type og mutant reseptor) superpose, mens titrering kurvene klart forskjellig mellom de to gruppene. Titrations kurvene mutant α2A-domenet blir flyttet til høyere rhodocetin konsentrasjoner som angir at rhodocetin binder med lavere affinitet til mutert reseptoren. Data vises fra av tre repeterende eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Statistisk sammenligning av dissosiasjon konstanter K avledet fra titrering kurver.
Dissociations konstantene i åtte titrering kurvene fra figur 2 er plottet og gruppert for skjemaet vill-type og mutant α2A domene. Individuelle verdier, gruppe betyr og standardavvik er angitt med poeng av stiplede svarte linjer og av grå feilfelt, henholdsvis. Små avvik i hver gruppe og distinkte forskjellen mellom gruppen betyr viser en betydelig forskjell (p < 0,0001) i slektskap av ligand vill-type og mutant reseptoren. En tosidig Student´s t-test ble brukt for sammenligning. Data vises fra av tre repeterende eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Titrering ELISA er en allsidig test å finne ut av en reseptor-ligand interaksjon. Som serine ELISA omgår nødvendigheten å skille gratis og bundet ligander effektivt og analysere konsentrasjonene kvantitativt, vesentlig mer studier og publikasjoner har ansatt titrering ELISAs i stedet for innspillingen bindende kurver . Videre titrering ELISAs er enkle å utføre og krever rimelig lave mengder reseptoren og ligand. For nøyaktig analyse av dissosiasjon konstanter, må ren forberedelser reseptor og ligand brukes. Skadelige proteiner i reseptor utarbeidelse konkurrere med reseptoren for adsorpsjon nettsteder på plast overflaten av være ferdig innen plate. Som de ikke binde ligand men redusere antall ligand-bindende reseptorer, redusere urenheter, reseptor løsningen signalene fra titrering ELISA. Hvis renheten av reseptor preparatet ikke bli bedre noen videre et antistoff rettet mot reseptoren kan bli immobilisert til være ferdig innen platen og etter blokkerer brønnene, vil fange reseptoren fra en forberedelse inneholder urenheter. Likevel må utvises slik at fanger antistoffer forstyrrer ikke gjenkjenning av bundet ligand med primære og sekundære antistoffer på grunn av arter forstyrrelser av antistoffer, eller at det hindrer ligand binding.

For å skaffe et omfattende sett med data, er det verdsatt for å utføre titrering ELISA i en gjensidig måte, som er å bruke løselig ligand av et eksperiment som reseptoren i andre eksperimentet av immobilizing det å være ferdig innen platen og sjarmere med tidligere reseptoren som skal brukes som løselig ligand partner. Dette fungerer vanligvis bra med mindre immobilisering deaktiverer bindende aktiviteten til en av partnerne eller verktøy som antistoffer til å oppdage den titrerte partneren, finnes ikke eller er vanskelig å få. I rhodocetin-α2A domene bindende systemet, dette arbeidet frisk etter en glutathione-S-transferase (GST)-moiety var smeltet α2A-domenet å lette oppdagelsen med GST-antistoffer16.

En annen fordel med titrering ELISA er at bare konsentrasjonen av ekstra ligand (Lt), men ikke gratis og bundet ligand (Lf og Lb, henholdsvis), må være kjent. Derfor bør ligand preparatet være så rent som mulig. Hvis dette er umulig eller mulig bare i begrenset grad titrering ELISA kan fremdeles bli ansatt, etter molar forholdet mellom ligand i forberedelsene er fastsatt uavhengig, f.eksSDS side, immunoblotting eller sandwich ELISA.

Problemer med titrering ELISA kan oppstå hvis affinitet mellom reseptor og ligand er for lavt, eller hvis glutaraldehyde fiksering opphever bindende samhandlingen. I sistnevnte tilfelle må fiksering-fri protokollen titrering ELISA opprettes. Praktisk talt, dissosiasjon konstanter kan bare oppdages hvis bindingen partnerne samhandle med rimelig høy affinitet, som er i området under ca 200 nM.

Serine gir signal intensiteter S som en funksjon av totale konsentrasjoner av ekstra ligand, Lt. Som konsentrasjonen av gratis og ubundet ligander, Lf og Lb, oppsummere Lt, og som Lb er lik produktet av Y· Rt ifølge formel 3, ligningen 4 er forvandlet til:

Equation 5           Ligningen 5

resulterer i kvadratiske ligningen,

Equation 6         Ligningen 6

som praktisk løsning er,

Equation 7         Ligningen 7

I tillegg representerer signal intensiteten S (Lt) på en bestemt konsentrasjon av ekstra ligand Lt metning avkastningen Y, etter det er korrigert ved subtraksjon av verdien for minimum signal, Smin, og normalisert til dynamikkområdet , gitt som differansen mellom maksimum og minimum signalet verdier, Smax og Smin:

Equation 8           Ligningen 8

Kombinasjonen av ligningen 7 og ligningen 8 gir matematiske funksjonen som korrelerer signal intensiteten S (Lt) med konsentrasjonen av ekstra ligand Lt. En term B· Lt kan legges til å beskrive spesifikke bakgrunnen signalet som øker lineært med Lt. B er forholdsmessighet konstant i bakgrunnen. Dermed er den generelle funksjonen til å beskrive en titrering kurve:

Equation 9         Ligningen 9

Denne funksjonen på en titrering kurve tilsvarer en sammensatt funksjon med en kvadratrot sikt og en lineær term som beskriver bestemte samspillet mellom reseptoren og ligand og uspesifikke samhandling ligand, henholdsvis. Denne funksjonen er forskjellig fra hyperbolsk funksjon av bindende kurven (Lbvs. Lf).

I motsetning til bindende kurven, der konsentrasjonen av bundet ligand vises på y-aksen, titrering kurve er mer fleksible og gir noe signal, som korrelerer med konsentrasjonen av bundet ligand, skal tegnes på y-aksen. Signalet kan være photometrically oppdaget binding av et enzym knyttet antistoff (som i dette tilfellet av en ELISA), men det kan også være andre spectrometric signaler, for eksempel en endring i absorbansen, sirkulære dichroism9, fluorescens polarisering21 , og NMR signaler22. Videre bør også termodynamisk signaler fra isotermiske titrering calorimetry23 være mulig å evalueres. Andre studier fastslår forpliktende tilhørighet fra den kinetiske på og av priser for dannelse og av reseptor-ligand komplekset av måling sanntid endringer i feltet evanescent av overflaten plasmon resonans24,25 i masse deponering av en kvartskrystall microbalance26, eller i fluorescens ved Mikroskala thermophoresis26,27. Disse sanntidsmåling har blitt kraftig verktøy på grunn av deres sofistikert bedømmelse programvare. Titrering ELISA og SPR er generelt metoden for valg å undersøke bindende partnere i protein-kjemisk analyse. Mens titrering ELISA måler affinitet konstant thermodynamically av kvantifisere mengden bundet ligand forskjellige likevekt States, SPR benytter en kinetisk tilnærming og tilnærmet kinetic rate konstanter, kav og kpå , forholdet mellom som gir kinetically bestemt dissosiasjon konstant24,25. Avhengig av de to ulike tilnærmingene, kan K-verdier avvike fra hverandre. Rhodocetin-α2A domene bindende eksperimenter, SPR dataene viser kav og kpå rate konstanter, og dermed en kinetically bestemme affinitet konstant K, for rhodocetin-α2A komplekse19, som er svært lik K-verdier målt i denne studien ved titrering ELISA. Små forskjeller kan forklares av aktivitet variasjoner av forskjellige grupper eller ulike forhold og varighet for lagring av protein prøvene. Her vil rettspraksis senere i titrering ELISA er alle prøvene målt samtidig og ikke fortløpende som i SPR maskinen. Nå er matematisk tilgjengelig og enkel å administrere med titrering kurve formelen (formelen 9), dette sluttpunktet måling av titrering ELISA kan bli like mektige som kinetically evaluerte sanntid målingene, som kreve en kostnadskrevende SPR maskin.

Dette tar i betraktning at den totale konsentrasjonen av ligand reduseres ved at bundet ligand, spesielt ved lav ligand konsentrasjoner. Dette gir mye bedre tilnærmelser av titrering kurve til data over hele omfanget av ligand konsentrasjoner. En ulempe med titrering ELISA, sammenlignet med bindende kurven, har så langt vært er vanskelig å vurdere matematisk titrering kurve. Mens i en bindende kurve konsentrasjonen av gratis ligand L likf på halv maksimal metning dissosiasjon konstant, er dette ikke sant for en titrering kurve. To algoritmer er uavhengig utviklet grafisk linearize titrering kurver og bestemme dissosiasjon konstant. Men både algoritmer utviklet for spektroskopiske titrering eksperimenter av Stockell et al. 8 av Heyn & Weischet9 lider ulempen at maksimal signalet for metning avkastningen Y må bestemmes grafisk. Denne verdien er nærmet asymptotisk, er metning avkastningen og dermed beregnet dissosiasjon konstant egentlig feil. Derimot algoritmen basert på formelen 9 bruker rådata fra titrering eksperimenter og beregner dissosiasjon konstant K samt andre parametere i en ikke-lineær regresjon å finne tilpasset løsning (figur 2 og figur 3 ). Videre, som denne algoritmen ikke trenger grafisk beregne muligens ut nådde maksimum signalet på ligand metning, evalueringsprosessen blir mye raskere og nøyaktig og det bærer mindre bias enn grafisk evalueringen. Flere titrering kurver kan vurderes parallelt. Dermed flere grupper av titrering kurver kan måles samtidig, og deres parametere kan statistisk analysert og forhold. Videre hver titrering kurve gir et sett med verdier, blant dem dissosiasjon konstant K, konsentrasjonen av immobilisert og binding-aktiv reseptor Rt, dynamikkområdet som differansen mellom maksimum og minimum signalet verdier Smax og Smin , så vel som den lineære faktoren B som tilsvarer eksperimentelle bakgrunn signalet med disse verdiene, metning avkastningen Y kan beregnes og plottet avhengig av konsentrasjonen av ligand Lt. I en slik metning avkastning plan tilsvarer konsentrasjonen av ekstra ligand på halv maksimal metning signal Lt(50%) summen av dissosiasjon konstant K pluss halvparten konsentrasjonen av immobilisert aktive reseptor Rt

Equation 10        Ligningen 10

Dette kan utledes for Y = 0,5 med ligningen 7. Dermed kan konsentrasjonen av immobilisert aktive reseptor Rt bestemmes ved å utføre titrering ELISA med forskjellige belegg konsentrasjoner av reseptoren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatteren har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Protokollen og algoritmen ble utviklet i prosjektet finansiert av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG grant SFB1009 A09 og EB177/13-1). Forfatteren Takk Barbara Schedding og Felix Schmalbein kundestøtte og Dr. Niland for kritisk lesing manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TRIS neoFrox 1125KG001
HEPES Sigma-Aldrich H4034
NaCl Applichem 1,316,591,214
MgCl2 Merck 172571
integrin a2A, wild-type and mutant, recombinant isolated in author's lab
NiNTA superflow column  Qiagen, Germany 30821
Coomassie-Brilliant Blue R250 Serva 35050
bicinchoninic acid assay (BCA), protein concentration determination kit Fisher Scientific 23225
bovine serum albumine (BSA), fraction V Applichem A1391
25 % solution of glutaraldehyde Merck 354400
anti-rabbit immunglobulin-antibodies from goat, conjugated with alkaline phosphatase Sigma-Aldrich A9919
Glycine Applichem A1377
Zn(II)-acetate Applichem A4324
NaOH Applichem A1551
Alkaline phosphatase substrate tablet (5 mg) Sigma-Aldrich S0942
Costar half-area microtiter plate Thermo Scientific Corning 3690
micro reaction tubes Eppendorf 30120086
Microplate ELISA reader BioTek Synergy HT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klotz, I. M. The application of the law of mass action to binding by proteins; interactions with calcium. Arch Biochem. 9, 109-117 (1946).
  2. Klotz, I. M. Ligand-receptor complexes: origin and development of the concept. J Biol Chem. 279 (1), 1-12 (2004).
  3. Bisswanger, H. Ch. 1: Multiple Equilibria, Principles and Derivations. Enzyme Kinetics: Principles and Methods. , Wiley VCH Verlag GmbH. 1-26 (2017).
  4. Shimura, K., Kasai, K. Affinity gel titration: quantitative analysis of the binding equilibrium between immobilized protein and free ligand by a continuous titration procedure. Anal Biochem. 149 (2), 369-378 (1985).
  5. Gong, M., Nikcevic, I., Wehmeyer, K. R., Limbach, P. A., Heineman, W. R. Protein-aptamer binding studies using microchip affinity capillary electrophoresis. Electrophoresis. 29 (7), 1415-1422 (2008).
  6. Hanes, M. S., Ratcliff, K., Marqusee, S., Handel, T. M. Protein-protein binding affinities by pulse proteolysis: application to TEM-1/BLIP protein complexes. Protein Sci. 19 (10), 1996-2000 (2010).
  7. Latour, R. A. The Langmuir isotherm: a commonly applied but misleading approach for the analysis of protein adsorption behavior. J Biomed Mater Res A. 103 (3), 949-958 (2015).
  8. Stockell, A. The binding of diphosphopyridine nucleotide by yeast glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. J Biol Chem. 234 (5), 1286-1292 (1959).
  9. Heyn, M. P., Weischet, W. O. Circular dichroism and fluorescence studies on the binding of ligands to the α subunit of tryptophan synthase. Biochem. 14 (13), 2962-2968 (1975).
  10. Campbell, I. D., Humphries, M. J. Integrin structure, activation, and interactions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (3), (2011).
  11. Zeltz, C., Gullberg, D. The integrin-collagen connection--a glue for tissue repair? J Cell Sci. 129 (4), 653-664 (2016).
  12. Kanchanawong, P., et al. Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions. Nature. 468 (7323), 580-584 (2010).
  13. Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annu Rev Immunol. 25, 619-647 (2007).
  14. Luo, B. H., Springer, T. A. Integrin structures and conformational signaling. Curr Opin Cell Biol. 18 (5), 579-586 (2006).
  15. Ricard-Blum, S. The collagen family. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a004978 (2011).
  16. Eble, J. A., Tuckwell, D. S. The α2β1 integrin inhibitor rhodocetin binds to the A-domain of the integrin α2 subunit proximal to the collagen-binding site. Biochem J. 376 (Pt 1), 77-85 (2003).
  17. Eble, J. A., et al. The α2β1 integrin-specific antagonist rhodocetin is a cruciform, heterotetrameric molecule. FASEB J. 23 (9), 2917-2927 (2009).
  18. Eble, J. A., et al. Dramatic and concerted conformational changes enable rhodocetin to block α2β1 integrin selectively. PLoS Biol. 15 (7), e2001492 (2017).
  19. Bracht, T., Figueiredo de Rezende, F., Stetefeld, J., Sorokin, L. M., Eble, J. A. Monoclonal antibodies reveal the alteration of the rhodocetin structure upon α2β1 integrin binding. Biochem J. 440 (1), 1-11 (2011).
  20. Harlow, E., Lane, D. Chapter 5: Immunizations. Antibodies, a laboratory manual. 5, Cold Spring Harbor Laboratory. 53-138 (1988).
  21. Lu, D. Analyzing interactions between SSB and proteins by the use of fluorescence anisotropy. Methods Mol Biol. 922, 155-159 (2012).
  22. Fielding, L. NMR methods for the determination of protein-ligand dissociation constants. Curr Top Med Chem. 3 (1), 39-53 (2003).
  23. Leavitt, S., Freire, E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry. Curr Opin Struct Biol. 11 (5), 560-566 (2001).
  24. McDonnell, J. M. Surface plasmon resonance: towards an understanding of the mechanisms of biological molecular recognition. Curr Opin Chem Biol. 5 (5), 572-577 (2001).
  25. Rich, R. L., Myszka, D. G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis. Curr Opin Biotechnol. 11 (1), 54-61 (2000).
  26. Pesquero, N. C., et al. Real-time monitoring and kinetic parameter estimation of the affinity interaction of jArtinM and rArtinM with peroxidase glycoprotein by the electrogravimetric technique. Biosens Bioelectron. 26 (1), 36-42 (2010).
  27. Scheuermann, T. H., Padrick, S. B., Gardner, K. H., Brautigam, C. A. On the acquisition and analysis of microscale thermophoresis data. Anal Biochem. 496, 79-93 (2016).

Tags

Biokjemi problemet 132 ELISA titrering analysen dissosiasjon konstant ikke-lineær regresjon reseptor-ligand-interaksjon rhodocetin
Titrering ELISA som metode for å bestemme dissosiasjon konstant reseptor Ligand interaksjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eble, J. A. Titration ELISA as a… More

Eble, J. A. Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction. J. Vis. Exp. (132), e57334, doi:10.3791/57334 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter