Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Титрование ELISA как метод, чтобы определить константу диссоциации взаимодействия лигандов рецепторов

doi: 10.3791/57334 Published: February 15, 2018

Summary

Описан подробный протокол для выполнения титрования ELISA. Кроме того представлен Роман алгоритм оценки титрования ELISAs и получить Константа диссоциации связывание растворимых лигандом микротитровальных рецепторами пластины прикол.

Abstract

Константа диссоциации описывает взаимодействие между двумя партнерами в уравновешении привязки и является мерой их сходства. Это решающее значение параметра для сравнения различных лигандов, например, конкурентные ингибиторы, изоформ белка и мутантов, для прочности их привязки для привязки партнера. Константы диссоциации определяются путем построения концентрации связанных против свободного лиганд как привязки кривых. В отличие от кривых титрования, в которых сигнал, который пропорционален концентрации связанных лигандов заговор против общую концентрацию дополнительной ligand, гораздо проще для записи. Сигнал может быть обнаружен спектроскопически и энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA). Это проявляется в протокол для титрования ELISA измеряет привязки змея яд производные rhodocetin его подвижности конечный домен Интегрин α2β1. Титрование ELISAs универсальным и широко используется. Любая пара взаимодействующих белков может использоваться как иммобилизованных рецепторов и растворимых лиганд, условии, что оба белки являются чистыми, и известны их концентрации. Трудности пока определить константу диссоциации от кривой титрования. В этом исследовании лежащие в основе кривых титрования математическая функция вводится. Без каких-либо ошибок графического оценки доходности насыщения этот алгоритм позволяет обработку необработанных данных (сигнал интенсивности в различных концентрациях дополнительной ligand) непосредственно в математической оценки через нелинейной регрессии. Таким образом несколько кривых титрования могут быть записаны одновременно и превращается в набор характерных параметров, среди них Константа диссоциации и концентрации рецепторов привязки активные, и они могут быть оценены статистически. В сочетании с этим алгоритмом, титрование ELISAs получить преимущество непосредственно представления Константа диссоциации. Таким образом они могут использоваться более эффективно в будущем.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Константа диссоциации K является ключевым параметром для описания сродства рецепторов (R) для его лиганда (L). На основе закона о массовых действий, K определяется для равновесия, в котором RL комплекс рецептор лиганд диссоциирует в рецептор R и лигандом L:

Equation 1             Уравнение 1

с показатели f/несвязанные состояние рецепторов и лигандом. Концентрация комплекс рецептор лиганд, RL, идентичен концентрации рецепторов прыгните лигандом Lb. Как общая концентрация рецептор Rt сумма свободного рецептор Rf и лиганд прыгните рецептор Rb = Lb, Константа диссоциации также может быть записана как:

Equation 2         Уравнение 2

Таким образом насыщение выход Y, определяется как доля связанных лигандов Lb в отношении общей концентрации рецепторов Rt,

Equation 3         Уравнение 3

зависит от концентрации свободного лигандом Lf:

Equation 4         Уравнение 4

Это гиперболических отношение описывает кривую привязки рецептор лиганд взаимодействия и его график показывает концентрация связанных лигандов Lb как функция концентрации свободного лигандом Lf. От привязки кривой Константа диссоциации K могут быть получены как концентрация свободного лигандов на половину максимального насыщения урожайности. Кроме того были созданы различные алгоритмы для линеаризации кривых привязки, такие как двойной взаимные сюжет Klotz1,2, или преобразования согласно Scatchard или Хейнс (рассмотрены Bisswanger3). Однако все алгоритмы страдают от этой проблемы, что максимальное значение насыщенности доходности, который асимптотически приближается при высоких концентрациях бесплатные лиганд в кривой привязки, должен оцениваться в графической предварительной оценки и поэтому ошибкам.

Кроме того определение привязки кривой требует количественного определения свободного и связанными лиганда во время привязки равновесия. С этой целью бесплатно лигандом должна быть отделена от лигандов рецепторов прыгните и количественно. Таким образом лигандом и рецептор должны отличаются в их свойств, таких как не протеинового лиганд в отличие от белка рецептора. Если оба партнера привязки являются белки, они должны быть различимы в их размеров, обвинения или другие молекулярные особенности. Тем не менее количественная оценка концентраций лигандов в мелких привязки подходов является трудной задачей. Радиоактивные маркировки лигандом часто необходимо было обнаружить низкой концентрации связанных лигандов, особенно, если значительные количества рецепторов были не доступны или доступным. Кроме того рецептор прыгните лиганд может отмежеваться во время и после изоляции не незначительным образом. Таким образом сложные методы, такие как равновесия гель фильтрации4, капиллярного электрофореза5и импульсный протеолиза6, необходимы для количественной оценки лигандов рецепторов прыгните и отделить его от свободного лиганда.

В отличие от этих анализов привязки титрование эксперименты не требуют количественные разделения связанные и свободные лиганда. С этой целью с различными концентрациями дополнительной ligand является титруют рецепторов при постоянной концентрации. Связываясь с рецепторами, связанных лигандов имеет биофизические свойства, которое отличает его от свободного лиганда и измеримые путем, например, фотометрия, флюометрия или обнаружения антител. Таким образом сигнал S, который пропорциональн к насыщению выход Y и следовательно также концентрации рецепторов прыгните лиганда (Lb), определяется как функция общую концентрацию дополнительной ligand (Lt). Параметры, сигнал S и общую концентрацию дополнительной ligand количественная оценка на основе прямого и проще чем концентрации связанные и свободные лиганда. Особенно обнаружение лигандов рецепторов привязкой, энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) допускается сокращение объемов выборки для ниже 100 мкл, а также проводить параллельные измерения концентрации нескольких лигандов в нескольких хорошо микротитровальных пластины. При титровании ELISA рецептор физически адсорбированные микротитровальных пластины на такой же концентрации и титруют с растворимых лиганда. Рецептор иммобилизованных на пластиковую поверхность по существу гидрофобные адсорбция. Поверхности концентрация иммобилизованных рецепторов коррелирует с концентрацией покрытие рецептора в нелинейных отношение, скорее всего, по словам изотермы адсорбции Langmuir´s7. В дополнение к общее количество рецепторов адсорбированных молекул их деятельность государства является другим важным параметром для титрования анализов. Только прикол рецепторов, которые сохранили активность Связывание лиганда, актуальны для assay титрования и в конечном итоге способствовать общая концентрация активных рецепторов Rt титрования анализа, которые не могут быть определены непосредственно.

Сайты на пластиковой поверхности, которые не охватываются иммобилизованных рецептор подвержены адсорбировать другие белки, такие как лиганд. Физическая адсорбция лигандом такие пластиковые поверхности сайты приведет в аналогичный сигнал как лигандов рецепторов привязкой, но неспецифических образом. Чтобы уменьшить неспецифических сигнал, пластиковые поверхности сайты микротитровальных пластин, которые не были покрыты с белком, но будет заблокирована с бычьим сывороточным альбумином (БСА). Однако для некоторых анализов титрования рецептор лиганд, может наблюдаться неспецифические фон сигналы. Затем, других блокирующих агентов, таких как раствор 0,2% желатина или 0,04% рекомендуется анимации 20,.

После связывания с рецепторами, свободный лигандом удаляется две стиральные шаги. Связанные лигандом остается с рецепторами, который иммобилизован на пластиковой поверхности хорошо микротитровальных и дополнительно подкрепляется химической фиксации. Для последующих ковалентных кросс связь связанных лигандов и иммобилизованные рецепторов с глютаральдегид содержание буфера TRIS заменяется на HEPES, без каких-либо изменений в Связывание лиганда. HEPES, в отличие от трис, не инактивирует низкотемпературном растворе глютаральдегида. Ковалентный кросс связь с глютаральдегид исправления связанных лигандов с его рецептор и предотвращает ее диссоциации в ходе последующих этапов мойки и инкубации. Таким образом взаимодействие рецептор лиганд химически замораживается и ордеров на кривой титрования, которая не влияет на последующие шаги мытья и инкубации. Однако, глютаральдегид фиксации может химически лиганда и изменить рецептор таким образом, что их взаимодействие снижены или отменены. Кроме того модификация epitopes в лиганд может изменить сродство антитела детектирования, особенно если моноклональное антитело используется для количественного определения связанных лигандов. Хотя ни один из этих побочных эффектов глютаральдегид фиксация происходит в этом титрования ELISA, чувствительность теста к глютаральдегид необходимо проверить каждый рецептор лиганд взаимодействия до титрования эксперимента. После фиксации в трех шагах Стиральная с буфера TRIS-содержащих удаляется избыток глютаральдегид. Трис инактивирует оставшиеся альдегидными группами, которые могут nonspecifically реагируют с обнаружения антител на последующем шаге.

Количество связанных лигандов количественно с энзим соединенный антител, которые обеспечивают фотометрических ELISA сигнала S. Это заговор против всего лигандом концентрация Lt добавил к каждой скважины. Несмотря на его проще приобретения кривая титрования является не гиперболические функции в отличие от кривой привязки. Кроме того он был неясным как рассчитать Константа диссоциации K от кривой титрования. Хотя алгоритмы для линеаризации кривых титрования спектроскопически приобретенных самостоятельно сообщили Стокель8 и9Heyn и Weischet, они потерпели неудачу из-за их неопределенности оценки максимальный сигнал значение насыщенность доходность подходов при высоких концентрациях дополнительной ligand.

Здесь для получения константы диссоциации K для взаимодействия лигандов рецепторов от кривой титрования описаны титрования ELISA и алгоритм нелинейной регрессии. Этот протокол является примером взаимодействия коллаген привязки A-домен Интегрин α2β1 с змея яд производного ингибитора. Интегринов являются молекулы адгезии клеток, которые посредником Анкоридж клеток, окружающих внеклеточная матрица или базовой базальной мембраны10,11. Кроме того интегринов передать важные сигналы между клетками и внеклеточного матрикса путем найма дополнительных сигнальных молекул и формирования новых клеток органеллы, adhesomes, после ячейки матрицы взаимодействия12,13, 14. коллаген, лигандом α2β1 Интегрин, является наиболее распространенным белок, человеческого тела и является компонентом соединительной ткани15важнейших леса. Взаимодействие между α2β1 Интегрин и коллагена при посредничестве A-домен Интегрин α2 субъединицы. Интегрин α2A-домен содержит двухвалентной катион, которая требуется для привязки коллагена и стабилизирует его структуры. Одичал тип формы, а также мутантов α2A домена, как, например, в котором открытые поверхности остатки Y216 были заменены на глицин, легко могут быть произведены recombinantly в системе бактериальной выражения и изолированные через их oligo его метки с NiNTA SuperFlow столбец с последующим диализа против трис амортизированное saline (TBS; 50 мм трис/HCl, рН 7,4, 150 NaCl), содержащий 2 мм MgCl216. Их концентрации были определены с bicinchoninic кислоты assay (BCA) и их чистоты проверены обычных SDS-PAGE и витражи с Бриллиантово-Кумасси синий R250.

Взаимодействие между α2β1 Интегрин и коллаген заблокирован привязки компонента змея яд, rhodocetin,16,Малайский Ямкоголовые (Calloselasma rhodostoma)17. Используется как растворимые лиганд в этом титрования ELISA, rhodocetin был очищен от сырой яд, как описано ранее,16. Он растворяется в HEPES-амортизированное saline (HBS; 10 мм HEPES/NaOH, рН 7,4, 150 мм NaCl) и хранится в замороженном виде при температуре-20 ° C. Его концентрация определяется BCA и его чистоты был доказан SDS-PAGE. Как антагонист, rhodocetin не только блокирует коллагена, привязка к Интегрин α2β1 A-домен, но также стабилизирует неактивной конформации Интегрин, тем самым предотвращая любой сигнализации из коллагена в клетках или тромбоциты18. Это большое биомедицинское значение для определения Константа диссоциации rhodocetin с его целевой рецепторы и таким образом разгадать ее молекулярный механизм и фармацевтический потенциал например, как антитромботические агента. С этой целью, титрование, ELISA описан, включая свою оценку, которая применима к почти любой рецептор лиганд взаимодействие с 1:1 взаимодействия стехиометрии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. штока решения

  1. Для приготовления 100 мл 10 x TBS раствора рН 7,4, распустить 6.06 г трис и 8.77 г NaCl в 90 мл деионизированной воды, скорректировать рН 7,4 с 37% раствор HCl, заполнить объем 100 мл с дейонизированной водой и фильтровать решение.
  2. Подготовить 100 мл 1 М HEPES/NaOH, рН 7,4 решение, распустить 23,83 g HEPES в 90 мл деионизированной воды, скорректировать рН 7,4 с 1,5 М NaOH, заполнить объем 100 мл деионизированной водой и фильтровать решение.
  3. Подготовить 100 мл раствора NaCl 5 М, Растворите 29.2 г NaCl в 90 мл деионизованной воды. Заполните объем 100 мл деионизированной водой и фильтровать решение.
  4. Чтобы подготовить 100 мл раствора 1 М MgCl2 , Растворите 20,33 g MgCl2 · 6H2O в 90 мл деионизованной воды. Заполните объем 100 мл деионизированной водой и фильтровать решение.
  5. Подготовить 5% тепло инактивированная BSA в воде, весят 2,5 г BSA (часть V, pH 7.0) в 50 мл трубки и растворить его в 45 мл деионизованной воды. Заполните решение 50 мл с дейонизированной водой и тепла раствор в ванну с водой на 68 ° C на 45 минут охлаждения в ледяной ванне и хранить его при-20 ° C.
  6. Приготовьте водный раствор глютаральдегид 25%.
    Предупреждение: Глутаровый вредно если проглотил, токсичные при вдыхании и вызывает ожоги. Носите защитную одежду, перчатки и средствами защиты глаз/лица.
  7. Поднимите антисыворотка кролика, как ранее описанных19. Титр антисыворотка было определено согласно стандартных протоколов20.
  8. Подготовьте Иммуноглобулин анти кролик-антитела от козла, конъюгированных с щелочной фосфатазы.
  9. Чтобы подготовить 100 мл 0,1 М глицин раствора, Растворите 0,75 г глицина в 90 мл деионизированной воды. Отрегулируйте пэ-аш до 10.4 с 1,5 М растворе NaOH, заполнить объем 100 мл деионизированной водой и фильтрации решение.
  10. Подготовить 100 мл 0,5 М Zn (II)-ацетата раствор, распустить 10.98 g Zn (II)-ацетат · 2H2O в 90 мл деионизованной воды. Заполните объем 100 мл деионизированной водой и фильтровать решение.
  11. Подготовить 100 мл раствора NaOH 1,5 М, Растворите 6,0 г NaOH в 90 мл деионизованной воды. Заполните объем 100 мл деионизированной водой и фильтровать решение.

2. Подготовьте буферов и решения

  1. Развести 5 мл 10 x TBS рН 7,4, с 45 мл деионизированной воды и 100 мкл 1 M MgCl2 Стоковый раствор. Держите его при комнатной температуре. TBS, рН 7,4, 2 мм MgCl2 решение является для иммобилизации рецептора и промывки микротитровальных пластины.
  2. Развести 10 мл 5% тепло инактивированная BSA в воде и 5 мл 10 x TBS, рН 7,4 деионизированной водой до 50 мл. 100 мкл раствора 1 М MgCl2 запасов и хорошо перемешать раствор. Держите его на льду и хранить его для дальнейших экспериментов в-20 ° C. Примечание что 2,5 мл 1% BSA в TBS, рН 7,4, 2 мм MgCl2 необходимы для каждой кривой титрования.
  3. Разбавить 2,5 мл 1 М HEPES/NaOH, рН 7,4 и 1,5 мл раствора NaCl 5 М до 50 мл с дейонизированной водой, добавить 100 мкл 1 M MgCl2 решение и смешать раствор тщательно подготовить 50 mL HBS, рН 7,4: 50 мм HEPES/NaOH , мм 150 NaCl.
  4. Добавить 5 мкл раствора 1 М MgCl2 акций и 2 мкл 0,5 М Zn (II)-ацетата раствор по 5 мл 0,1 М глицин раствора, рН 10.4 подготовить щелочной фосфатазы (AP) буфера (раствор 0,1 М глицин, pH 10.4, 0.2 мм Zn(II)-acetate) мм MgCl2, 1.

3. Иммобилизация рецептора (интегрин α2A-домен) микротитровальных пластины

  1. Разбавьте раствор Интегрин α2A-домена в TBS, рН 7,4, 2 мм MgCl2 для конечной концентрации 5 мкг/мл.
    Примечание: Объем раствор для нанесения покрытия составляет 650 мкл для одной кривой титрования, состоящий из 12 хорошо строку половину области микротитровальных пластины.
  2. Заполните каждый хорошо строки на половину области микротитровальных пластина с 50 мкл/хорошо 5 мкг/мл раствора покрытие Интегрин α2A-домен (одичал тип или мутант). По крайней мере выполнения каждой строки титрования в дубликаты (в этом примере как шестнадцатые; см. макет микротитровальных пластины на рис. 1).
  3. Уплотнение пластину с фольгой или закройте его крышкой. Оставьте пластину на 4 ° C на ночь.

4. Вымойте покрытием скважин пластины дважды с TBS, рН 7,4, 2 мм2 MgCl

  1. Для удаления растворимых рецепторов молекул, которые не имеют была иммобилизованных на пластиковую поверхность путем физической адсорбции, удалить раствор для нанесения покрытия и заполнить каждый хорошо с 50 мкл TBS, рН 7,4, 2 мм MgCl2.
  2. Удаление Вымойте решения. Убедитесь, что колодцы не стать сухой. Таким образом не нажимайте пластину микротитровальных на ткани ткани для удаления остаточной жидкости. Для заполнения скважин быстро используйте многоступенчатый пипетки или многоканальные пипетки.
  3. Повторите этот шаг Стиральная один раз.

5. Блок сайтов неспецифического связывания

  1. Добавьте 50 мкл раствора 1% BSA в TBS, рН 7,4, 2 мм MgCl2 для каждой скважины.
  2. Запечатывание скважин с фольгой или закрыть крышкой.
  3. Инкубируйте скважин на 1 ч при комнатной температуре.
    Примечание: Любой из шагов инкубации настоящего Протокола может выполняться на платформе качания или встряхивания. Однако это не требуется и не изменяет результаты эксперимента.

6. Подготовка серийный разрежения ряд лигандов, Rhodocetin

  1. Различаются начало концентрации rhodocetin и коэффициент разбавления серийный разрежения, чтобы получить соответствующий диапазон концентраций лигандов и записать полный титрования кривой с минимального и максимального сигнала. В этом эксперименте используют начало концентрации 243 Нм rhodocetin и коэффициент разбавления 2.3. Развести rhodocetin запасов решение самая высокая концентрация лиганда последовательным разрежения строки. Для каждой кривой титрования с коэффициентом разбавления 2.3, подготовить 115 мкл раствора 243 Нм (то есть, 15,2 мкг/мл) rhodocetin в 1% BSA/TBS, рН 7,4, 2 мм MgCl2 в пробирке #1.
  2. Заполните 65 мкл 1% раствора БСА в TBS, рН 7,4, 2 мм MgCl2 в 10 пробирок, помечены #2 # 11.
  3. Передача 50 мкл rhodocetin разрежения из пробирки #1 в пробирке #2, смешать оба решения (общий объем: 115 мкл; коэффициент разбавления: 1: 2. 3) Тритурация, а затем передачи 50 мкл из этой смеси в пробирку #3 и т.д.
  4. Продолжить этот серийный разбавления до пробирку #11.
    Примечание: В шагах 6.1-6.4 объемы являются достаточными для одной кривой титрования. Умножьте количество реплицирует эти тома. В этом случае выполнить восемь кривых титрования (близнецов две формы α2A-домен) и подготовить следующие тома: 920 мкл раствора rhodocetin в максимальной концентрации в пробирке #1; 520 мкл 1% BSA в TBS, рН 7,4, 2 мм MgCl2 заполнить в каждом из пробирки #2 до #11; и 400 мкл объема передачи из одной трубы к следующему.

7. Связывание лиганда (Rhodocetin) в различных концентрациях для иммобилизованных рецептор (интегрин α2A-домен)

  1. Удалите блокирующий решение из микротитровальных тарелка скважин вакуумной линией.
  2. Немедленно добавьте 50 мкл раствора rhodocetin в 1% BSA/TBS, рН 7,4/MgCl2 решение пробирку #1 в скважины в колонке 1, решение пробирку #2 скважины в колонке 2,и т.д. добавьте 50 мкл 1% BSA в TBS, рН 7,4 , 2 мм MgCl2 (блокирование и разбавления буфер) как лиганд свободный элемент управления для скважин в колонке 12 (см. макет микротитровальных плиты, рис. 1).
  3. Запечатывание скважин с фольгой или закрыть крышкой.
  4. Инкубируйте скважин на 1,5 ч при комнатной температуре (около 20-22 ° C).

8. мыть скважин из плиты дважды с HBS, рН 7,4, 2 мм2 MgCl

  1. Чтобы удалить без привязки к лигандом молекул, удалить привязку решения и заполнить каждый хорошо с 50 мкл HBS, рН 7,4, 2 мм MgCl2. Затем удалите промывочного раствора.
  2. Позаботьтесь, что колодцы не стать сухой. Таким образом не нажимайте пластину микротитровальных на ткани ткани для удаления остаточной жидкости. Для заполнения скважин быстро используйте многоступенчатый пипетки или многоканальные пипетки.
  3. Повторите этот шаг Стиральная один раз.

9. Прикрепите лигандов рецепторов граница с 2,5% глютаральдегид в ОБД, рН 7,4, 2 мм2 MgCl

  1. Готовить свежий раствор 2,5% глютаральдегид, смешивая 1 часть 25% глютаральдегид раствора и 9 частей HBS, рН 7,4, 2 мм MgCl2.
  2. Заполните каждый хорошо микротитровальных плиты с 50 мкл глютаральдегид 2,5% раствора в ОБД, рН 7,4, 2 мм MgCl2. Инкубируйте микротитровальных пластина для 10 мин при комнатной температуре.

10. мыть Уэллс пластины три раза с 50 мкл/хорошо TBS, рН 7,4, 2 мм2 MgCl

  1. Чтобы удалить и инактивации избыточных глютаральдегид, удалить раствор фиксации и заполнить каждый хорошо с 50 мкл TBS, рН 7,4, 2 мм MgCl2. Затем удалите промывочного раствора.
    Примечание: Залейте раствор глютаральдегид содержащих фиксации от микротитровальных пластины в блюдо и отменить решение фиксации после того, как он был инактивированная с равным объемом TBS, рН 7,4.
  2. Позаботьтесь, что колодцы не стать сухой. Таким образом не нажимайте пластину микротитровальных на ткани ткани для удаления остаточной жидкости. Для заполнения скважин быстро используйте многоступенчатый пипетки или многоканальные пипетки.
  3. Повторите этот шаг Стиральная дважды.

11. Количественная оценка лигандов рецепторов привязкой по ELISA

  1. Добавьте 50 мкл/хорошо раствора первичного антитела в 1% BSA в TBS, рН 7,4, 2 мм MgCl2. Ослабленный первичный гуморальный решение является кролик антисыворотки против rhodocetin19, разбавленный стоматологов в 1% BSA в TBS, рН 7,4, 2 мм MgCl2.
  2. Инкубируйте пластину для 75-90 мин при комнатной температуре. Вымойте все скважины три раза с 50 мкл/хорошо TBS, рН 7,4, 2 мм MgCl2пластины. В ходе трех Стиральная шаги, разговоров о микротитровальных пластину на ткани ткани не является обязательным.
  3. Добавьте 50 мкл/хорошо решения вторичного антитела в 1% BSA в TBS, рН 7,4, 2 мм MgCl2. С этой целью разбавленных вторичных антител, кролик против иммуноглобулина антитела козочки проспряганное с щелочной фосфатазы, для стоматологов в 1% BSA в TBS, рН 7,4, 2 мм MgCl2. Инкубируйте пластину для 75-90 мин при комнатной температуре.
  4. Готовят раствор AP-обнаружение, растворяя 5 мг таблетки, содержащей 4-нитрофенил фосфат динатриевая соль гексагидрата (фосфатазы субстрата) в 5 мл буфера AP (раствор 0,1 М глицин, pH 10.4, содержащие 1 мм2 MgCl и 0,2 мм Zn(II)-acetate).
  5. Вымойте все скважины пластины три раза с 50 мкл/хорошо TBS, рН 7,4, 2 мм MgCl2, непосредственно перед выполнением следующего шага. Кран микротитровальных пластину на ткани ткани после последний шаг Стиральная, чтобы удалить все следы жидкости.
  6. Добавьте 50 мкл/хорошо AP-обнаружение решения к добрам плиты микротитровальных. AP-обнаружение решение оперативно добавьте для всех скважин, чтобы как можно одновременно запустить Энзиматическая конверсия. Таким образом используйте многоканальные пипетки.
  7. Инкубируйте пластины при комнатной температуре до тех пор, пока решение в скважинах с высокой концентрацией лигандом желтеют.
    Примечание: Время инкубации варьируется между 5 минут и 1 час в зависимости от интенсивности сигнала.
  8. Остановка преобразования фосфатазы субстрата, добавляя 50 мкл/колодец 1,5 М растворе NaOH. Оставьте пластины стоя за несколько минут, чтобы обеспечить штриховатост свободно смешивания обоих решений. Для того чтобы гарантировать же инкубационный период на всех скважинах, использовать многоканальные пипетки и добавить 1,5 М NaOH в том же порядке, добавлены к скважинам, что AP-обнаружение субстрата в шаге 11,8.
  9. Измерение оптической плотности (OD) на 405 нм каждой скважины ELISA читателем.

12. Оценка сигналов титрования

  1. Откройте таблицу необработанных данных, значения405nm ОД, с Excel. Поскольку эти значения сигнала кривых титрования считываются в строках, транспонировать значения столбца и этикетка с концентрациями дополнительной ligand в другом столбце.
  2. Откройте Graphpad призму 5 (версия 5.0). Откройте файл нового проекта в главном меню. Выберите формат XY под новые данные и диаграммы. Выберите параметр Ввод и сюжет единую точку для каждого значения для оси y.
  3. Скопируйте два столбца, концентрация дополнительной ligand и сигнал значения (OD405nm ) от excel файла и вставить их в лист данных GraphPad призмы как X и Y значения, соответственно.
  4. Откройте анализа подпрограмма 5 Призма GraphPad и выберите опцию Non линейная регрессия в XY-анализ. Выберите определяемые пользователем уравнение и нажмите кнопку Создать , чтобы создать новое уравнение.
  5. В форме введите уравнение кривой титрования: Y =(Smax-Smin)*((X+R+K)-sqrt((X+R+K)^2-4*R*X)) /(2*R) Smin + B * X в недавно открывшийся шаблон листа, с Y, будучи значение сигнала S, X является концентрация дополнительной ligand L , R, что концентрация иммобилизованных рецепторов, будучи Константа диссоциации, K и B будучи фон склон. Определить соответствующие ограничения, такие как K > 0 и R > 0.
    Примечание: Это уравнение является же уравнения уравнения 9 в другой форме.
  6. Анализ значения данных листа, выбрав уравнение определяемые пользователем, который был недавно создан. Откройте таблицу со значениями вычисляемого аппроксимации (K, Rt, SМакс,минS и B) которого указаны в разделе результат на левой стороне экрана программного обеспечения.
    Примечание: Программа определяет 5 параметров путем итеративного установки нелинейной регрессии, только если кривой титрования состоит из точек данных по крайней мере 5.
  7. Статистически оценить параметры K, Rt, SМакс, Sмини B для каждой группы кривых титрования и сопоставить параметры с особенностью группы (лигандом мутировавших или химически модифицированные или рецепторов).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

После ELISA был разработан, желтый цвет преобразованные щелочной фосфатазы субстрата, пункт- nitrophenolate, указывает, что количество связанного rhodocetin лигандом уменьшается с уменьшением концентрации добавил rhodocetin от колонки 1-11 (рис. 1). Бесцветный скважин в свободной rhodocetin скважин в колонке 12 показывают низкий фонового сигнала.

Фотометрические количественной оценки в 405 нм предоставляет данные, которые могут загружаться непосредственно в программное обеспечение для анализа и, используя нелинейную регрессию и уравнение 9, приближает необработанных данных каждой строки титрования и вычисляет сигнала S (которая равна ОД 405nm), добавлена функция общая концентрация rhodocetin лигандом Lt (рис. 2). Четыре кривых титрования для каждой формы рецептора (одичал типа и мутантов) высокую воспроизводимость и почти поставить друг на друга. В отличие от этой низкой дисперсией внутригрупповой две группы кривых титрования четко отделены друг от друга. Для привязки в мутантов α2A-домен для получения сигналов аналогичных ценностей на те формы дикого типа требуются более высокие концентрации rhodocetin лиганда. Этот сдвиг вправо кривых титрования демонстрирует мутант лигандом имеет снижение сродство лиганда. Таким образом мутации, представил в домен α2A повреждает rhodocetin привязки, потому, что он является частью rhodocetin привязки сайта Интегрин домена18.

Кривая титрования могут быть описаны 5 характерных параметров: (i) диссоциации константа K, (ii) концентрация прикол, биологически активные рецептор Rt, (iii) максимума и минимума (iv) сигналов (SМакс иминS), а также (v ) на склоне фонового сигнала б. Среди этих параметров Константа диссоциации K является основным и наиболее актуальным для биологических интерпретации кривых титрования. Каждая кривая титрования предоставляет одно значение K. Таким образом одно- и также сгруппированы титрования кривых может быть статистически по сравнению друг с другом. Статистический анализ четырех кривых титрования для одичал тип и мутировавших α2A-домен это показано на рисунке 3. Константа сродство для привязки rhodocetin одичал тип α2A-домен – 5.80 ± 0,15 Нм, в то время как rhodocetin связывает мутированных рецепторов с значительно более низкой сродством 9,68 Нм ± 0,18 (p < 0.0001).

Таким образом титрование ELISA вместе с этой математической оценки позволяет быстро и статистически достоверного оценки привязки лигандов рецепторов и его производные мутировавших или химически модифицированных. Таким образом титрование ELISA и алгоритм оценки являются ценными инструментами для анализа структуры функция отношения.

Figure 1
Рисунок 1: представитель макет микротитровальных плиты для титрования ELISA. Каждая строка содержит данные для одной кривой титрования. Чтобы сравнить их Связывание лиганда rhodocetin (RC), одичал типа (строки A-D) или мутантные формы (строки E-H) α2A-домена иммобилизованных в скважинах четырех строк каждого (четверню определение). Линия горизонтальная точка отделяет две группы кривых титрования. Концентрация rhodocetin лигандом уменьшается от столбца 1 до 11, в то время как скважин в колонке 12, указывается на правой стороне линии вертикальных точка, не содержат каких-либо rhodocetin и представляют фон элемента управления. Пластину отображается после того, как количественно связанных лигандов, ELISA, в котором щелочной фосфатазы субстрат преобразуется в желтый пункт- nitrophenolate. Приводятся данные из одного из трех повторяющихся экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: представитель титрования кривые. Необработанные данные титрования иммобилизованных одичал тип и мутантных форм Интегрин α2A-домен с rhodocetin как растворимые лиганда (символов), а также приближенная титрования кривых (линии) приведены в полу логарифмический график. Необработанные данные четверню определений (круги, треугольники вверх и вниз, квадраты для каждого из четырех строк титрование) указаны для иммобилизованных одичал тип (открытые символы) и мутировал (заполненные символы) α2A-рецепторов. Кривые вычисляемых титрирования отображаются как линии (твердых, короткий штрих, пунктирная, цепи пунктирные) для одичал типа (черные линии) и мутанта (серые линии) формы рецептора. Совместить четыре кривых титрования в рамках каждой из двух групп (дикого типа и мутантов рецепторов), тогда как кривых титрования четко различаются между двумя группами. Более высокие концентрации rhodocetin, указывающее, что rhodocetin связывает с нижней сродством к мутированных рецепторов сдвинуты кривых титрования мутантов α2A-домена. Приводятся данные из одного из трех повторяющихся экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Статистическое сравнение константы диссоциации K производный от кривых титрования.
Диссоциацией константы восьми кривых титрования из рисунка 2 заговор и сгруппированы для дикого типа и мутантов формы α2A домена. Отдельные значения, Группа средства и стандартные отклонения указаны точками, пунктирными линиями, черный и серый погрешностей, соответственно. Маленький отклонение в пределах каждой группы и четкое различие между группой означает, демонстрируют значительные различия (p < 0,0001) в сродство лиганда дикого типа и мутантов рецепторов. Student´s двустороннее t-тест использовался для сравнения. Приводятся данные из одного из трех повторяющихся экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Титрование ELISA является универсальный тест-системы для определения диссоциации рецептор лиганд взаимодействия. Как титрования ELISA обходит необходимость эффективно отделить свободных и связанных лигандов и анализа их концентрации количественно, существенно больше исследований и публикаций использовали вместо записи привязки кривых титрования ELISAs . Кроме того титрование ELISAs легко выполнить и требуют достаточно низкого количества рецепторов и лиганда. Для точного анализа констант диссоциации необходимо использовать чистые препараты рецепторов и лиганда. Загрязняясь протеины в рамках подготовки рецептор конкурировать с рецепторами для сайтов адсорбции на поверхности пластиковой микротитровальных пластины. Как они не связать лиганд, но уменьшить количество лиганд связывания рецепторов, примесей решения рецепторов снижают сигналы титрования ELISA. Если чистоту рецептор подготовки не может быть улучшена любой Кроме того, антитела, направленные против рецептора может быть иммобилизованным на микротитровальных пластину и, после блокирования скважин, будет захватить рецепторов от подготовки, содержащих примеси. Тем не менее необходимо позаботиться чтобы захвата антитела не беспокоить обнаружение связанных лигандов с первичных и вторичных антител из-за вмешательства видов антител, или что он препятствует Связывание лиганда.

Чтобы получить полный набор данных, он оценил выполнение титрования ELISA образом взаимные, который является использовать растворимых лигандом одного эксперимента как рецептор в другой эксперимент по иммобилизации микротитровальных пластины и титровать его с бывший рецептор, который будет применяться в качестве партнера растворимых лиганда. Обычно это работает хорошо, если иммобилизация инактивирует действие привязки одного из партнеров или инструменты, такие как антитела для обнаружения титруемая партнера, не существует или получить трудно. В системе привязки домена rhodocetin-α2A, это работало хорошо после глутатион S-трансферазы (GST)-остаток был сливается в α2A-домен для облегчения обнаружения с GST-антитела16.

Еще одно преимущество титрования ELISA-что только концентрация добавлен лиганда (Lt), но не бесплатно и связанными лиганда (Lf и Lb, соответственно), нужно знать. Таким образом подготовка лигандом должна быть как можно более чистым. Если это невозможно или возможно лишь в ограниченной степени, титрование, которую ELISA может все еще использоваться, после того, как был молярное соотношение лиганд в рамках подготовки определяется самостоятельно, например, SDS-PAGE, immunoblotting или сэндвич ELISA.

Могут возникнуть проблемы с титрования ELISA, если сходство между рецепторами и лигандом является слишком низким или глютаральдегид фиксации отменяет связывание взаимодействия. В последнем случае необходимо быть свободной от фиксации протокол титрования ELISA. Практически, константы диссоциации может быть обнаружено только если привязки партнеры взаимодействуют с достаточно высоким сродством, который находится в диапазоне ниже примерно 200 Нм.

Титрование обеспечивает интенсивности сигнала S как функция полной концентрации дополнительной ligand, Lt. Концентрации свободных и несвязанных лигандов Lf и Lb, подводя к Lt, а как Lb равно продукта Y· T R согласно 3 уравнения, уравнения 4 преобразуется в:

Equation 5           Уравнение 5

в результате в квадратное уравнение,

Equation 6         Уравнение 6

Практическое решение которых является,

Equation 7         Уравнение 7

Кроме того интенсивности сигнала S (tL) на конкретную концентрацию дополнительной ligand Lt представляет насыщенность доходность Y, после того, как он исправлены путем вычитания значения минимального сигнала, Sмини нормализуется до динамического диапазона , как разница между сигнала максимального и минимального значений, SМакс и Sмин:

Equation 8           Уравнение 8

Сочетание 7 уравнения и уравнения 8 дает математическая функция, которая сопоставляет интенсивности сигнала S (tL) с концентрацией дополнительной ligand Lt. Срок B· Lt могут добавляться для описания неспецифических фонового сигнала, который линейно поднимает с Lt. B — константа пропорциональности фона. Таким образом общее назначение для описания кривой титрования является:

Equation 9         Уравнение 9

Эта функция кривой титрования соответствует входят функции с квадратного корня срок и линейной перспективе, которые описывают конкретные взаимодействия между рецепторами и лигандов и неспецифического взаимодействия лигандов, соответственно. Эта функция отличается от функции гиперболические привязки кривой (Lbvs. Lf).

В отличие от кривой привязки, в которых концентрации связанных лигандов строится на оси y, кривая титрования является более гибким и позволяет любой сигнал, который коррелирует с концентрацией связанных лигандов изобразить на оси y. Этот сигнал может быть фотометрических обнаруженных привязки энзим соединенный антитела (как в этом случае ELISA), но она также может быть другие спектрометрического сигналов, таких как изменение поглощения, круговой дихроизма9, поляризации флуоресценции21 , и NMR сигналов22. Кроме того также термодинамических сигналы из изотермических титрования калориметрии23 должно быть возможность оценивать. Другие исследования определяют сродство от кинетических на - и от цен для формирования и диссоциации рецептор лиганд комплекса путем измерения реального времени изменения в поле, исчезающий, поверхностного плазмон резонанс24,25 , в массовых осаждений кварцевый микровзвешивания26, или в флуоресцировании микромасштабной thermophoresis26,27. Эти в реальном времени измерения стали мощными инструментами из-за их сложные оценки программного обеспечения. Титрование ELISA и СРП, как правило, методом выбора для изучения привязки партнеров в белок химического анализа. Титрование ELISA измеряет сродство константа термодинамически количественной количество связанных лигандов на равновесие различных государств, в то время как СРП использует кинетический подход и приближает константы кинетической скорости, kс и kна , соотношение которых обеспечивает кинетически определяется диссоциации постоянной24,25. В зависимости от двух разных подходов K значения могут отличаться друг от друга. В экспериментах привязки домена rhodocetin-α2A, SPR данные показали kс и kна константы скорости и следовательно кинетически определить сходства константа K, rhodocetin-α2A комплекс19, которые очень похожи на в этом исследовании значения K измеряется титрования ELISA. Незначительные различия можно объяснить деятельность вариации различных партий или различных условий и длительности хранения образцов белка. В этом позже израсходованное ELISA все образцы измеряются одновременно, а не последовательно, как в машине СРП. Теперь, будучи математически доступным и легко управлять с помощью уравнения кривой титрования (уравнение 9), измерение этой конечной точки титрования ELISA может стать столь же мощными, как кинетически оценку реального времени измерения, который требуются машины СРП сопряжено с большими расходами.

Это уравнение принимает во внимание, что общая концентрация лигандом уменьшается концентрация связанных лигандов, особенно при низкой лигандом концентрациях. Это позволяет гораздо лучше приближения кривой титрования в данных по всему диапазону концентраций лигандов. Один из недостатков титрования ELISA, по сравнению с кривой привязки, пока трудно оценить математически кривой титрования. В то время как в привязке кривой концентрация свободного лигандом Lf на половину максимального насыщения равно Константа диссоциации, это не верно для кривой титрования. Два независимо разработаны алгоритмы графически линеаризации кривых титрования и определить константу диссоциации. Однако оба алгоритма разработан для спектроскопических титрования экспериментов Стокель et al. 8 и9 Heyn и Weischet страдают от недостаток, что максимальный сигнал для насыщения доходность Y должны определяться графически. Как асимптотически приближается это значение, насыщенность доходность и, следовательно, Константа диссоциации вычисляемый неразрывно ошибкам В противоположность этому алгоритм, основанный на уравнение 9 использует необработанные данные от экспериментов титрования и вычисляет Константа диссоциации K, а также другие параметры в нелинейной регрессии, чтобы найти наилучшее решение (рис. 2 и Рисунок 3 ). Кроме того, поскольку этот алгоритм не нужно графически оценить возможно вне достижения максимального сигнала при насыщении лиганд процесс оценки становится намного быстрее и точные и он несет меньше предвзятости чем графической оценки. Параллельно может вычисляться несколько кривых титрования. Таким образом несколько групп кривых титрования могут быть измерены одновременно, и их параметры могут быть статистически проанализированы и сравнить. Кроме того, каждая кривая титрования дает набор ценностей, среди них Константа диссоциации K, концентрация иммобилизованных и привязки активных рецептор Rt, динамический диапазон как разница сигнала максимального и минимального значений SМакс и Sмин , а также линейные фактор B, который соответствует экспериментальной фонового сигнала, используя эти значения, насыщенность выход Y может быть рассчитана и заговор в зависимости от концентрации добавил лигандом Lt. В такой сюжет доходность насыщения концентрация добавлен лигандов на половину максимальное насыщение сигнала Lt(50%) равен сумме Константа диссоциации K плюс половина концентрация иммобилизованных активных рецептор Rt

Equation 10        Уравнение 10

Это могут быть получены для Y = 0,5 с 7 уравнение. Таким образом концентрация иммобилизованных активных рецептор Rt можно определить, выполнив титрования ELISA с различным покрытием концентрации рецепторов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Автор не имеет ничего, чтобы раскрыть.

Acknowledgments

Протокол и алгоритм были разработаны в рамках проекта, финансируемого Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG Грант SFB1009 A09 и EB177/13-1). Автор благодарит Барбара Schedding и Феликс Schmalbein для технической поддержки и доктор Ниланд для критически читать рукопись.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TRIS neoFrox 1125KG001
HEPES Sigma-Aldrich H4034
NaCl Applichem 1,316,591,214
MgCl2 Merck 172571
integrin a2A, wild-type and mutant, recombinant isolated in author's lab
NiNTA superflow column  Qiagen, Germany 30821
Coomassie-Brilliant Blue R250 Serva 35050
bicinchoninic acid assay (BCA), protein concentration determination kit Fisher Scientific 23225
bovine serum albumine (BSA), fraction V Applichem A1391
25 % solution of glutaraldehyde Merck 354400
anti-rabbit immunglobulin-antibodies from goat, conjugated with alkaline phosphatase Sigma-Aldrich A9919
Glycine Applichem A1377
Zn(II)-acetate Applichem A4324
NaOH Applichem A1551
Alkaline phosphatase substrate tablet (5 mg) Sigma-Aldrich S0942
Costar half-area microtiter plate Thermo Scientific Corning 3690
micro reaction tubes Eppendorf 30120086
Microplate ELISA reader BioTek Synergy HT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klotz, I. M. The application of the law of mass action to binding by proteins; interactions with calcium. Arch Biochem. 9, 109-117 (1946).
  2. Klotz, I. M. Ligand-receptor complexes: origin and development of the concept. J Biol Chem. 279, (1), 1-12 (2004).
  3. Bisswanger, H. Ch. 1: Multiple Equilibria, Principles and Derivations. Enzyme Kinetics: Principles and Methods. Wiley VCH Verlag GmbH. 1-26 (2017).
  4. Shimura, K., Kasai, K. Affinity gel titration: quantitative analysis of the binding equilibrium between immobilized protein and free ligand by a continuous titration procedure. Anal Biochem. 149, (2), 369-378 (1985).
  5. Gong, M., Nikcevic, I., Wehmeyer, K. R., Limbach, P. A., Heineman, W. R. Protein-aptamer binding studies using microchip affinity capillary electrophoresis. Electrophoresis. 29, (7), 1415-1422 (2008).
  6. Hanes, M. S., Ratcliff, K., Marqusee, S., Handel, T. M. Protein-protein binding affinities by pulse proteolysis: application to TEM-1/BLIP protein complexes. Protein Sci. 19, (10), 1996-2000 (2010).
  7. Latour, R. A. The Langmuir isotherm: a commonly applied but misleading approach for the analysis of protein adsorption behavior. J Biomed Mater Res A. 103, (3), 949-958 (2015).
  8. Stockell, A. The binding of diphosphopyridine nucleotide by yeast glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. J Biol Chem. 234, (5), 1286-1292 (1959).
  9. Heyn, M. P., Weischet, W. O. Circular dichroism and fluorescence studies on the binding of ligands to the α subunit of tryptophan synthase. Biochem. 14, (13), 2962-2968 (1975).
  10. Campbell, I. D., Humphries, M. J. Integrin structure, activation, and interactions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (3), (2011).
  11. Zeltz, C., Gullberg, D. The integrin-collagen connection--a glue for tissue repair? J Cell Sci. 129, (4), 653-664 (2016).
  12. Kanchanawong, P., et al. Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions. Nature. 468, (7323), 580-584 (2010).
  13. Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annu Rev Immunol. 25, 619-647 (2007).
  14. Luo, B. H., Springer, T. A. Integrin structures and conformational signaling. Curr Opin Cell Biol. 18, (5), 579-586 (2006).
  15. Ricard-Blum, S. The collagen family. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (1), a004978 (2011).
  16. Eble, J. A., Tuckwell, D. S. The α2β1 integrin inhibitor rhodocetin binds to the A-domain of the integrin α2 subunit proximal to the collagen-binding site. Biochem J. 376, (Pt 1), 77-85 (2003).
  17. Eble, J. A., et al. The α2β1 integrin-specific antagonist rhodocetin is a cruciform, heterotetrameric molecule. FASEB J. 23, (9), 2917-2927 (2009).
  18. Eble, J. A., et al. Dramatic and concerted conformational changes enable rhodocetin to block α2β1 integrin selectively. PLoS Biol. 15, (7), e2001492 (2017).
  19. Bracht, T., Figueiredo de Rezende, F., Stetefeld, J., Sorokin, L. M., Eble, J. A. Monoclonal antibodies reveal the alteration of the rhodocetin structure upon α2β1 integrin binding. Biochem J. 440, (1), 1-11 (2011).
  20. Harlow, E., Lane, D. Chapter 5: Immunizations. Antibodies, a laboratory manual. 5, Cold Spring Harbor Laboratory. 53-138 (1988).
  21. Lu, D. Analyzing interactions between SSB and proteins by the use of fluorescence anisotropy. Methods Mol Biol. 922, 155-159 (2012).
  22. Fielding, L. NMR methods for the determination of protein-ligand dissociation constants. Curr Top Med Chem. 3, (1), 39-53 (2003).
  23. Leavitt, S., Freire, E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry. Curr Opin Struct Biol. 11, (5), 560-566 (2001).
  24. McDonnell, J. M. Surface plasmon resonance: towards an understanding of the mechanisms of biological molecular recognition. Curr Opin Chem Biol. 5, (5), 572-577 (2001).
  25. Rich, R. L., Myszka, D. G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis. Curr Opin Biotechnol. 11, (1), 54-61 (2000).
  26. Pesquero, N. C., et al. Real-time monitoring and kinetic parameter estimation of the affinity interaction of jArtinM and rArtinM with peroxidase glycoprotein by the electrogravimetric technique. Biosens Bioelectron. 26, (1), 36-42 (2010).
  27. Scheuermann, T. H., Padrick, S. B., Gardner, K. H., Brautigam, C. A. On the acquisition and analysis of microscale thermophoresis data. Anal Biochem. 496, 79-93 (2016).
Титрование ELISA как метод, чтобы определить константу диссоциации взаимодействия лигандов рецепторов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eble, J. A. Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction. J. Vis. Exp. (132), e57334, doi:10.3791/57334 (2018).More

Eble, J. A. Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction. J. Vis. Exp. (132), e57334, doi:10.3791/57334 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter