Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Titrasyon ELISA reseptör Ligand etkileşim ayrışma sabiti belirlemek için bir yöntem olarak

doi: 10.3791/57334 Published: February 15, 2018

Summary

Titrasyon ELISA gerçekleştirmek için detaylı bir protokol açıklanmıştır. Ayrıca, yeni bir algoritma titrasyon ELISAs değerlendirmek için ve plaka immobilize microtiter reseptör için çözünür bir ligand bağlayıcı bir ayrışma sabiti edinmek için sunulmaktadır.

Abstract

Ayrışma sabiti bağlama denge iki ortağı arasındaki etkileşim açıklar ve onların ilgi bir ölçüsüdür. Farklı ligandlar, örneğin, rekabetçi inhibitörleri, protein izoformlarının ve mutantlar için bağlama güçlerini bağlama ortağa karşılaştırmak için çok önemli bir parametredir. Ayrılma sabitler ilişkili karşı ücretsiz ligand konsantrasyonu olarak bağlama eğrileri komplo tarafından belirlenir. Buna ek olarak, ilişkili ligand konsantrasyonu orantılı bir sinyal eklenen ligand, toplam konsantrasyonu karşı çizilen titrasyon eğrileri kaydetmek çok daha kolaydır. Sinyal spectroscopically ve enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) tarafından tespit edilebilir. Bu bir titrasyon yılan zehri elde edilen rhodocetin α2β1 Integra, onun immobilize hedef etki alanına bağlama ölçer ELISA için bir protokol içinde örneklenir. Titrasyon ELISAs çok yönlü ve geniş kullanılmış. Herhangi bir çiftini etkileşen proteinlerin immobilize reseptörü ve çözünür ligand her iki protein saf ve onların konsantrasyonları bilinen koşuluyla kullanılabilir. Zorluk defa ayrışma sabiti titrasyon eğrisi üzerinden belirlemek olmuştur. Bu çalışmada, titrasyon eğrileri altta yatan bir matematiksel işlev giriliyor. Bir doygunluk verim herhangi bir hataya grafik tahmini, bu algoritma doğrusal olmayan regresyon ile matematiksel değerlendirme tarafından doğrudan ham veri (sinyal kırmızının koyulukları eklenen ligand farklı konsantrasyonlarda) işleme izin verir. Böylece, birkaç titrasyon eğrileri aynı anda kaydedildi ve aralarında ayrışma sabiti ve bağlama-aktif reseptör, konsantrasyon karakteristik parametreleri kümesini haline dönüştürdü ve istatistiksel olarak değerlendirilebilir. Bu algoritma ile birleştirildiğinde, titrasyon ELISAs doğrudan ayrışma sabiti sunma avantajı kazanmak. Bu nedenle, onlar daha verimli bir şekilde gelecekte kullanılabilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ayrışma sabiti K bir reseptör (R) benzeşim onun ligand (L) açıklamak için önemli bir parametredir. Kitlesel eylem hukuk üzerinde bağlı olarak, K içinde Reseptör-ligand karmaşık RL R reseptörü ve ligand L: ayrışıp denge için tanımlanan

Equation 1             Denklem 1

reseptör ve ligand ücretsiz/ilişkisiz durumunu gösteren endeksi f ile. Reseptör-ligand kompleks RL, konsantrasyon reseptör bağlı ligand Lbkonsantrasyon için aynıdır. Reseptör Rt toplam konsantrasyonu ücretsiz reseptör Rf ve ligand bağlı reseptör Rb toplamı olarak = Lb, ayrışma sabiti olarak da yazılabilir:

Equation 2         Denklem 2

Bu nedenle, doygunluk ilişkili ligand Lb reseptör Rttoplam konsantrasyonu ilişkisi kesir olarak tanımlanmış Y, verim,

Equation 3         Denklem 3

Ücretsiz ligand Lfkonsantrasyon üzerinde bağlıdır:

Equation 4         Denklem 4

Hiperbolik bu ilişki bir Reseptör-ligand etkileşim bağlama eğriyi tanımlayan ve onun arsa ilişkili ligand Lb toplama ücretsiz ligand Lfkonsantrasyonu bir fonksiyonu olarak gösterir. Bağlama eğrisi ayrışma sabiti K, yarı-azami doygunluk verim ücretsiz ligand konsantrasyonu olarak elde edilebilir. Ayrıca, bağlama eğrileri linearize farklı algoritmaları, gibi çift karşılıklı arsa Klotz1,2veya Scatchard veya Hanes (Bisswanger3tarafından gözden) göre dönüşümleri tarafından kurulmuştur. Ancak, tüm algoritmaları asimptotik ücretsiz ligand bağlayıcı eğri yüksek konsantrasyonlarda yaklaştı doygunluk verim maksimum değeri bir grafik öncesi değerlendirilmesinde tahmin edilecek sahip ve bu nedenle sorunu muzdarip hataya.

Buna ek olarak, bir bağlama eğrisi belirlenmesi ücretsiz ve ilişkili ligand miktar sırasında bağlama denge gerektirir. Bu amaçla, ücretsiz ligand reseptör bağlı ligand ayrılmış ve sayısal gerekiyor. Bu nedenle, ligand ve reseptör protein ligand olarak karşı bir protein reseptörü gibi özellikleri, farklı gerekir. Her iki bağlama ortak proteinler ise, kendi boyutları, ücret veya diğer moleküler özellikleri ayırt olmak zorundalar. Yine de, küçük ölçekli bağlama yaklaşımlar konsantrasyonlarda ligand miktar zor bir iştir. Özellikle reseptörleri önemli miktarda kullanılabilir veya uygun olmasa radyoaktif ligand etiketleme genellikle ilişkili ligand, düşük yoğunlukta algılamak gerekli oldu. Ayrıca, reseptör bağlı ligand-ihmal edilebilir bir şekilde sırasında ve sonrasında yalıtım ayırmak. Bu nedenle, denge jel filtrasyon4, Kapiler Elektroforez5ve nabız proteolizis6, gibi karmaşık yöntemler reseptör bağlı ligand ölçmek ve ücretsiz ligand ayırmak için gereklidir.

Bu bağlama deneyleri aksine titrasyon deneyler ilişkili ve ücretsiz ligand nicel ayrılması gerek yoktur. Bu amaçla, bir reseptör sabit bir konsantrasyon, eklenen ligand farklı konsantrasyonları ile titre. Reseptör için bağlama tarafından ilişkili ligand ücretsiz ligand ayıran ve örneğin, fotometri, fluorometry veya antikor algılama, ölçülebilir biyofiziksel bir özelliğe sahiptir. Böylece, bir sinyal ile doygunluğu ile doğru orantılıdır S Y verim ve sonuç olarak da reseptör bağlı ligand (Lb) konsantrasyon için eklenen ligand (Lt) toplam konsantrasyonu bir fonksiyonu olarak algılanır. Parametreleri, sinyal S ve eklenen ligand toplam konsantrasyonu ilişkili ve ücretsiz ligand konsantrasyonu daha doğrudan ve kolay bir şekilde sayılabilir. Özellikle, reseptör bağlı ligand enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) tarafından algılanmasını 100 µL aşağıda örnek birimlere azaltılması yanı sıra birkaç ligand konsantrasyonu paralel ölçümleri çok iyi microtiter levha izin. Bir titrasyon ELISA, bir reseptör fiziksel olarak aynı toplama bir microtiter plaka adsorbe ve çözünür ligand ile titre. Reseptör plastik yüzeye aslında hidrofobik adsorpsiyon tarafından immobilize. İmmobilize reseptör ilişkilendirir yüzey konsantrasyon reseptör Langmuir´s adsorpsiyon izoterm7göre muhtemel bir doğrusal olmayan ilişkide kaplama konsantrasyonu ile. Genel adsorbe reseptör molekülleri ek olarak, etkinlik durumlarına titrasyon deneyleri için başka bir önemli parametre sayısıdır. Sadece hangi ligand bağlayıcı faaliyet korunur, titrasyon tahlil için uygundur ve sonunda etkin reseptörleri Rt doğrudan belirlenemez titrasyon testin toplam konsantrasyonu katkıda reseptörleri immobilize.

İmmobilize reseptör tarafından kapsanmayan siteleri plastik yüzeyi ligand gibi diğer proteinler absorbe yatkındır. Tür plastik yüzey sitelerde ligand fiziksel adsorpsiyon reseptör bağlı ligand olarak benzer bir sinyal, henüz belirsiz bir şekilde sonuçlanır. Bu nonspesifik sinyal plastik yüzey siteleri hangi protein ile kaplı değil henüz sığır serum albumin (BSA)-ecek var olmak kütük parçası microtiter plakaların azaltmak için. Ancak, bazı Reseptör-ligand titrasyon deneyleri için spesifik olmayan arka plan sinyalleri gözlenen. O zaman, engelleme diğer ajanlar gibi bir çözüm % 0,2 jelatin veya %0,04 ara 20, önerilir.

Reseptör için bağlama sonra ücretsiz ligand tarafından iki çamaşır adımı kaldırılır. Microtiter iyi plastik yüzeye immobilize ve isteğe bağlı olarak kimyasal fiksasyonu tarafından güçlendirilmiş reseptör ile ilişkili ligand kalır. Sonraki kovalent çapraz-bağlantı için ilişkili ligand ve oxazolidin ile immobilize reseptör arabellek madde TRIS ligand bağlayıcı herhangi bir değişiklik olmadan HEPES için değiştirilir. TRIS, aksine HEPES oxazolidin devre dışı değil. Oxazolidin ile kovalent çapraz bağlantı ile onun reseptör ilişkili ligand giderir ve onun ayrılma sonraki çamaşır ve kuluçka adımları sırasında engeller. Böylece, Reseptör-ligand etkileşimi kimyasal dondurulur ve çamaşır ve kuluçka sonraki adımlarla etkilenmez bir titrasyon eğrisi garanti eder. Ancak, oxazolidin fiksasyon kimyasal olarak ligand ve reseptör etkileşimlerini azaltılmış veya kaldırılmış şekilde değiştirebilir. Ayrıca, özellikle Monoklonal antikor ilişkili ligand ölçmek için kullanılıyorsa epitopları ligand içinde değişiklik algılama antikor bağlama benzeşme değişebilir. Oxazolidin fiksasyon bu olumsuz etkilerin ikisi de bu titrasyon ELISA oluşmakla birlikte, test oxazolidin karşı duyarlılığını titrasyon deney öncesinde her Reseptör-ligand etkileşim için test edilmelidir. Fiksasyon sonra aşırı oxazolidin TRIS içeren bir arabellek ile üç yıkama adımda kaldırılır. TRIS nonspecifically antikorlar sonraki adımda algılama ile tepki kalan aldehit gruplarını inaktive.

Fotometrik ELISA sinyal S. sağlayan enzim bağlı antikorlar ile ilişkili ligand miktarını sayısal Bu eklenen toplam ligand konsantrasyonu Lt karşı çizilir her şey için. Onun daha kolay satın alma rağmen titrasyon eğrisi hiperbolik işlevi bağlama eğrisi aksine değil. Ayrıca, nasıl bir titrasyon eğrisi üzerinden ayrışma sabiti K hesaplamak için belli olmuştur. Algoritmalar spectroscopically Edinsel titrasyon eğrileri linearize bağımsız olarak Stockell8 ve Hey ve Weischet9tarafından bildirilmiştir rağmen yüksek sinyal tahmin onların belirsizlik nedeniyle yetersiz kalmışlar değeri doygunluk verim eklenen ligand yüksek konsantrasyonları yaklaşıyor.

Burada, bir titrasyon ELISA ve doğrusal regresyon algoritması titrasyon eğrisi Reseptör ligand müdahalesini ayrışma sabiti K türetmek açıklanmıştır. Bu protokol ile bir yılan zehri elde edilen inhibitörü kollajen bağlayıcı A-etki integrin α2β1, etkileşim için örneklenir. İntegrinler hücrelerin etrafındaki hücre dışı matriks veya temel membran10,11anchorage aracılık hücre adezyon molekülleri vardır. Ayrıca, ek moleküller sinyal ve yeni hücre organelleri, adhesomes, hücre-matris etkileşim12,13, üzerine şekillendirme işe integrinler hücreleri ve hücre dışı matriks arasında önemli sinyalleri iletmek 14. kollajen, α2β1 Integra, ligand insan vücudunun en bol protein ve bağ dokusu15önemli iskele bileşenidir. Α2β1 integrin ve kollajen arasındaki etkileşimi bir integrin α2 alt birimi A etki tarafından aracılık ettiği. İntegrin α2A-etki alanı, kollajen bağlama için gereklidir ve yapısını stabilize bir divalent ba * içerir. Mutantlar hangi biri gibi yüzey maruz kalan Y216 glycine için yerine α2A etki alanının yanı sıra yaban türü formlar kolayca recombinantly bir bakteriyel ifade sisteminde üretilen ve onların oligo-His-etiketleri ile bir NiNTA ile izole bir sonraki diyaliz TRIS arabelleğe alınmış serum (TBS; 50 mM TRIS/HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl) içeren 2 mM MgCl216karşı montaj sütun. Bicinchoninic asit tahlil (BCA) ile onların konsantrasyonları belirlenmiştir ve onların eroine geleneksel SDS-PAGE tarafından test edilmiş ve Coomassie-parlak mavi R250 ile lekeli.

Α2β1 integrin ve kollajen arasındaki etkileşimi bağlama yılan zehri bileşeninin Malaya çukur engerek (Calloselasma rhodostoma)16,17rhodocetin tarafından engellendi. Bu titrasyon ELISA içinde çözünür bir ligand olarak kullanılan, rhodocetin ham saflaştırıldı16daha önce açıklandığı gibi zehir. HEPES arabelleğe alınmış serum (HBS; 10 mM HEPES/NaOH, pH 7.4, 150 mM NaCl) içinde çözünmüş ve -20 ° C'de dondurulmuş depolanır Onun konsantrasyonu BCA tarafından tespit edildi ve saflığı SDS-PAGE tarafından kanıtlanmış oldu. Bir antagonisti rhodocetin sadece kollajen için integrin bağlama engeller α2β1 A etki alanı, ama aynı zamanda böylece herhangi bir kollajen hücreleri ya da trombosit18sinyal önleme integrin etkin olmayan biçimi stabilize. Rhodocetin reseptör hedefine ile ayrışma sabiti belirlemek ve böylece onun moleküler mekanizması ve ilaç potansiyel örneğin, antitrombotik bir ajan olarak çözmek Biyomedikal büyük önem taşımaktadır. Bu amaçla, ELISA onun değerlendirme de dahil olmak üzere anlatılan bir titrasyon hangi bir 1:1 etkileşim stoichiometry ile hemen hemen her Reseptör-ligand etkileşim için geçerlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. stok çözümleri

  1. 10 x TBS 100 mL pH 7.4 çözüm hazırlamak için 6,06 g TRIS ve NaCl 8,77 g 90 mL deiyonize su içinde dağıtılması, pH %7,4 37 HCl çözüm için ayarlamak, birimin 100 ml deiyonize su ile doldurun ve çözüm filtre.
  2. 100 mL 1 hazırlamak için M HEPES/NaOH, pH 7.4 çözüm, HEPES 23.83 g 90 mL deiyonize su içinde erimesi, pH 7.4 ile 1,5 M NaOH için ayarlamak, birimin 100 ml deiyonize su ile doldurun ve çözüm filtre.
  3. 100 mL 5 M NaCl çözeltisi hazırlamak için NaCl 29.2 g 90 mL deiyonize su içinde çözülür. Birimin 100 ml deiyonize su ile doldurun ve çözüm filtre.
  4. 100 mL 1 M MgCl2 çözeltisi hazırlamak için çözülür 20.33 g MgCl2 · 6H2O 90 mL deiyonize su içinde. Birimin 100 ml deiyonize su ile doldurun ve çözüm filtre.
  5. %5 ısı inaktive BSA su hazırlamak için BSA (kesir V, pH 7,0) 2.5 g 50 mL tüp içinde ağırlığında ve 45 mL deiyonize su geçiyoruz. Çözüm 50 ml deiyonize su ile doldurun ve 45 dk. bir buz banyosu içinde serin ve -20 ° C'de depolamak için bir su banyosu 68 ° C'de çözümde ısı
  6. Sulu % 25 oxazolidin çözüm hazırlamak.
    Dikkat: Oxazolidin zararlı olup olmadığını yuttu, toksik Solunduğunda ve burns neden olur. Koruyucu giysiler, eldiven, giyim ve göz/koruma yüz.
  7. Tavşan anti-serum yukarıda açıklanan19kaldırın. Anti-serum titresi standart protokolleri20göre belirlendi.
  8. Anti-tavşan immünglobulin-antikorlar ile alkalen fosfataz Birleşik keçi gelen hazır olun.
  9. 100 mL 0.1 M glisin çözeltisi hazırlamak için glisin 90 ml deiyonize su, 0.75 g geçiyoruz. 1,5 M NaOH çözüm ile 10.4 için pH ayarlama, birimin 100 ml deiyonize su ile doldurun ve çözüm filtre.
  10. 100 mL 0.5 M Zn (II) hazırlamak için-asetat çözüm, 10,98 g Zn (II) dağıtılması-asetat · 2H2O 90 mL deiyonize su içinde. Birimin 100 ml deiyonize su ile doldurun ve çözüm filtre.
  11. 100 mL 1,5 M NaOH çözeltisi hazırlamak için 90 mL deiyonize su 6.0 g NaOH geçiyoruz. Birimin 100 ml deiyonize su ile doldurun ve çözüm filtre.

2. arabellekleri hazırlayın ve çalışma çözümleri

  1. 5 deiyonize mL 10 x TBS pH 7.4, 45 mL ile su sulandırmak ve bir 1 M MgCl2 hisse senedi çözeltinin 100 µL ekleyin. Oda sıcaklığında tutmak. TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 çözüm için reseptör ve microtiter tabak yıkama immobilizasyon arasındadır.
  2. Isı inaktive BSA suda % 5 ve 10 x TBS, 5 mL pH 7.4 50 mL deiyonize su ile 10 mL seyreltik. 100 µL 1 M MgCl2 hisse senedi çözüm çözüm iyi ekleyip karıştırın. Buz üstünde tutmak ve -20 ° C'de daha fazla deneyler için saklayın Not % 1 BSA TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 içinde o 2.5 mL her titrasyon eğrisi için gereklidir.
  3. 1 2.5 mL seyreltik M HEPES/NaOH, pH 7,4 ve 1.5 mL 5 M NaCl çözüm 50 ml deiyonize su ile 100 µL 1 M MgCl2 çözüm ekleyip karıştırın iyice 50 mL HBS, pH 7.4: 50 mM HEPES/NaOH hazırlamak için çözüm , 150 mM NaCl.
  4. 1 M MgCl2 hisse senedi çözüm 5 µL ekleyip 2 µL 0,5 M Zn (II)-asetat hisse senedi çözüm 5 mL 0.1 M glisin çözüm, pH alkalen fosfataz (AP) arabellek (0.1 M glisin çözüm, pH 10.4, 1 mM MgCl2, 0.2 mM Zn(II)-acetate). hazırlamak için 10.4 için

3. immobilizasyon bir Microtiter plakasına reseptör (Integrin α2A-etki alanı)

  1. İntegrin α2A-etki alanında TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 5 µg/mL nihai bir konsantrasyon için hisse senedi çözüm sulandırmak.
    Not: 12 iyi satır yarım alan-microtiter plaka oluşan bir titrasyon eğrisi için 650 µL kaplama çözüm birimdir.
  2. Her şey yarım alan-microtiter tabakta bir satırın 50 µL/kuyu ile 5 µg/mL kaplama çözüm integrin α2A-etki alanı (vahşi-türü veya mutant) doldurun. Her titrasyon satır en az çoğaltmaları gerçekleştirin (Bu örnekte dördüz; olarak şekil 1' deki microtiter plaka yerleşimini bakın).
  3. Plaka folyo ile kapatın veya bir kapak ile kapatın. Plaka 4 ° C'de gece bırakın.

4. yıkama Kuyu yapımı tabak iki kez TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 ile kaplı

  1. Çözünür reseptör kaldırmak için plastik yüzey-değil var immobilize tarafından fiziksel adsorpsiyon, kaplama çözümü kaldırmak ve her doldurmak molekülleri MgCl2TBS, pH 7.4, 2 mM 50 µL ile iyi.
  2. Yıkama çözüm kaldırın. Kuyuları kuru olmazlar sağlamak. Bu nedenle, kalan sıvı kaldırmak için bir doku bez microtiter tabağa dokunun değil. Multistep bir pipet veya çok kanallı pipet kuyuları hızlı bir şekilde doldurmak için kullanın.
  3. Bir kez bu çamaşır tekrarlayın.

5. nonspesifik bağlama sitelerini engelleme

  1. TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 her şey için 50 µL % 1 BSA çözüm ekleyin.
  2. Wells folyo ile yeniden mühürlemek veya bir kapak ile kapatın.
  3. Wells, oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
    Not: Bu protokol kuluçka adımlardan herhangi birini bir sallanan veya sallayarak platform üzerinde gerçekleştirilebilir. Ancak, bu gerekli değildir ve denemenin sonucu değiştirmez.

6. Rhodocetin Ligand bir seri seyreltme satırı hazırlanması

  1. Rhodocetin başlangıç konsantrasyonu ve seri seyreltme ligand konsantrasyonu uygun bir dizi elde etmek için ve bir minimum ve maksimum sinyal ile tam titrasyon eğrisi kaydetmek için seyreltme faktörü değişir. Bu deneyde, 243 nM rhodocetin bir başlangıç konsantrasyonu ve 2.3 bir seyreltme faktörü istihdam. Rhodocetin hisse senedi çözüm seri seyreltme satır en yüksek ligand konsantrasyonu sulandırmak. 2.3 bir seyreltme faktörü ile her titrasyon eğrisi için 243 nM (Yani, 15,2 µg/mL) rhodocetin çözüm %1 115 µL hazırlamak BSA/TBS, pH 7.4, deney tüpü #1 2 mM MgCl2 .
  2. 65 µL % 1 BSA çözüm TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 #2-#11 etiketli 10 test tüpleri doldurun.
  3. #1 için tüp rhodocetin seyreltme 50 µL aktarmak tüp #2, her iki çözüm mix (Toplam birim: 115 µL; seyreltme faktörü: 1:2. 3) toz ve ardından test tube #3, vb bu karışım üzerinden transfer 50 µL
  4. Bu seri seyreltme test tüpü #11 kadar devam edin.
    Not: 6.1 6.4 adımda verilen birimleri bir titrasyon eğrisi için yeterlidir. Bu birimler çoğaltır sayısı ile çarpın. Bu durumda, sekiz titrasyon eğrileri (iki α2A etki alanı form dördüz) gerçekleştirmek ve aşağıdaki birimler hazır olun: rhodocetin çözüm test tüpü #1; en yüksek konsantrasyon, 920 µL TBS, pH 7.4 her test tüpleri #2 #11 içinde doldurmak için 2 mM MgCl%2 1 BSA 520 µL; ve bir tüp transferi birimden diğerine 400 µL.

7. bağlama Ligand (Rhodocetin) için farklı konsantrasyonlarda immobilize reseptör (Integrin α2A-etki alanı)

  1. Engelleme çözüm microtiter plaka kuyulardan vakum bir çizgiyle kaldırın.
  2. Hemen rhodocetin çözüm %1 50 µL eklemek BSA/TBS, pH 7.4/MgCl2 çözüm test tüpüne wells sütun 1, deney tüpü #2 sütun 2,vb ekle 50 µL TBS, pH %7,4 1 BSA, kuyu için çözüm #1 , 2 mM MgCl2 (arabellek engelleme ve seyreltme) ligand-Alerjik denetimi olarak sütun (bkz: microtiter plaka, şekil 1yerleşimini) 12 kuyu için.
  3. Wells folyo ile yeniden mühürlemek veya bir kapak ile kapatın.
  4. Wells, oda sıcaklığında (20-22 ° C civarında) 1,5 saat için kuluçkaya.

8. yıkama Wells, plaka iki kez HBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 ile

  1. Bağlı olmayan ligand molekülleri kaldırmak için bağlama çözüm kaldırın ve her doldurmak HBS, pH 7.4, 2 mM MgCl250 µL ile iyi. Sonra yıkama çözüm kaldırın.
  2. Kendine iyi bak kuyuları kuru olmazlar. Bu nedenle, kalan sıvı kaldırmak için bir doku bez microtiter tabağa dokunun değil. Multistep bir pipet veya çok kanallı pipet kuyuları hızlı bir şekilde doldurmak için kullanın.
  3. Bir kez bu çamaşır tekrarlayın.

9. reseptör bağlı Ligand %2.5 ile düzeltmek HBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 oxazolidin

  1. Bir taze % 2.5 oxazolidin çözüm %1 25 oxazolidin çözümün parçası ve HBS, pH 7.4, 2 mM MgCl29 bölümlerini karıştırarak hazırlayın.
  2. Her şey microtiter plaka HBS, pH 7.4, 2 mM MgCl%22.5 oxazolidin çözümünde 50 µL ile doldurun. Oda sıcaklığında 10 dk microtiter plaka kuluçkaya.

10. plaka üç kez yıkama Wells'le TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 50 µL/kuyu

  1. -E doğru çıkarmak ve aşırı oxazolidin devre dışı bırakabilirsiniz, fiksasyon çözümü kaldırmak ve her doldurmak TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl250 µL ile iyi. Yıkama çözüm kaldır.
    Not: microtiter plaka oxazolidin içeren fiksasyon çözüm bir tabak içine dökün ve sonra bu TBS, pH 7.4 eşit bir birimi tarafından inaktive fiksasyon çözüm atın.
  2. Kendine iyi bak kuyuları kuru olmazlar. Bu nedenle, kalan sıvı kaldırmak için bir doku bez microtiter tabağa dokunun değil. Multistep bir pipet veya çok kanallı pipet kuyuları hızlı bir şekilde doldurmak için kullanın.
  3. İki kez bu çamaşır tekrarlayın.

11. reseptör bağlı Ligand tarafından ELISA miktar

  1. TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl%21 BSA 50 µL/iyi birincil antikor çözüm ekleyin. Birincil antikor bir tavşan anti-serum rhodocetin19karşı kaldırdı, 1:2,000 TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl%21 BSA içinde seyreltilmiş çözümdür.
  2. 75-90 dk oda sıcaklığında plaka kuluçkaya. Plaka bütün wells üç kez TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl250 µL/kuyu ile yıkayın. Adımları yıkama, microtiter plaka üzerine bir doku dokunarak üç sırasında bez gerekli değildir.
  3. TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl%21 BSA 50 µL/iyi ikincil antikor çözüm ekleyin. Bu amaçla, ikincil antikor, keçi antikorlar immünglobulin hedefleme tavşan TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl%21 BSA içinde 1:2,000 için alkalen fosfataz ile Birleşik oranında seyreltin. 75-90 dk oda sıcaklığında plaka kuluçkaya.
  4. 4-nitrophenyl fosfat disodyum tuzu hekzahidrat (fosfataz substrat) AP arabellek (0.1 M glisin çözüm, 1 mM MgCl2 ve 0.2 mM Zn(II)-acetate) içeren pH 10.4,. 5 ml içeren bir 5 mg tablet çözülerek AP tespit edici çözüm hazırlamak
  5. Plaka bütün wells üç kez TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2, hemen sonraki adım gerçekleştirmeden önce 50 µL/kuyu ile yıkayın. Bir doku bez microtiter tabağa son yıkama adımdan sonra sıvı tüm izlerini kaldırmak için dokunun.
  6. 50 µL/iyi AP tespit edici çözüm microtiter plaka wells için ekleyin. AP tespit edici çözüm derhal mümkün olduğunca aynı anda enzimatik dönüşüm başlatmak için bütün wells ekleyin. Bu nedenle, bir çok kanallı pipet kullanın.
  7. En yüksek ligand konsantrasyonu Wells'le çözümde çevirmek kadar sarı oda sıcaklığında plaka kuluçkaya.
    Not: Kuluçka süresi 5 min ve sinyal şiddeti bağlı olarak 1 saat arasında değişebilir.
  8. Fosfataz substrat çevrimi 50 µL/iyi 1.5 M NaOH çözüm ekleyerek durdurmak. Her iki çözüm de çizgi-Alerjik karıştırma sağlamak birkaç dakika için plaka ayakta bırakın. Aynı kuluçka dönemi bütün wells emri için bir çok kanallı pipet kullanın ve kuyu Bu adımda 11,8 AP tespit edici substrat olarak eklenen aynı sırada 1.5 M NaOH ekleyin.
  9. Optik yoğunluk (OD) ölçmek 405 nm her iyi bir ELISA okuyucu tarafından.

12. titrasyon sinyalleri değerlendirilmesi

  1. Ham veri, OD405nm değerleri tablo Excel ile açın. Titrasyon eğrileri bu sinyal değerleri satırları okurken, değerleri bir sütun ve başka bir sütun eklenen ligand konsantrasyonları ile etiket işlemi tersine çevir.
  2. Graphpad prizma 5 (sürüm 5.0) açın. Ana menüde yeni bir proje dosyasını açın. Yeni veri ve grafikaltında XY biçimini seçin. Y ekseni için Enter ve arsa her değer için tek bir noktadan seçeneğini seçin.
  3. İki sütun, eklenen ligand konsantrasyonu kopyalayın ve değerleri (OD405nm ) Excel dosyası ve GraphPad prizma veri sayfası yapıştırın sinyal X ve Y değerleri, sırasıyla.
  4. GraphPad prizma 5 analiz alt programı açın ve Non-linear regresyon XY-analizaltında seçeneğini seçin. Kullanıcı tanımlı denklemi seçin ve yeni bir denklemi oluşturmak için Yeni düğmesine basın.
  5. Titrasyon eğrisi denklem şeklinde yazın: Y =(Smax-Smin)*((X+R+K)-sqrt((X+R+K)^2-4*R*X)) /(2*R) + Smin + B * X Y S, sinyal değeri eklenen ligand L konsantrasyonu varlık ile yeni açılan şablon sayfasına , Konsantrasyonu olmak R immobilize reseptör, ayrışma sabiti olan K ve B arka olmak inişli. K gibi uygun kısıtlamaları tanımlamak > 0 ve R > 0.
    Not: Bu denklem Denklem 9 farklı bir formu aynı denklemdir.
  6. Veri sayfasının değerleri yeni oluşturulan kullanıcı tanımlı denklem seçerek analiz. Tablo hesaplanan yaklaşım değerleri ile açın (K, Rt, Smax, Sminve B) hangi yazılım ekranın sol tarafında sonuç bölümü altında gösterilir.
    Not: Yazılım titrasyon eğrisi en az 5 veri noktalarından oluşuyorsa yinelemeli doğrusal olmayan regresyon yaklaştırarak 5 parametreleri belirler.
  7. Parametreleri K, Rt, Smax, Sminve B titrasyon eğrileri her grup için istatistiksel olarak değerlendirmek ve parametreleri (mutasyona uğramış veya kimyasal olarak değişikliğin ligand veya reseptör) grup belirli özelliği ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ELISA sonra geliştirilmiştir, dönüştürülmüş alkalen fosfataz substrat, para- nitrophenolate sarı rengini, ilişkili rhodocetin ligand tutarı eklenen rhodocetin konsantrasyonları azaltılarak azalır gösterir sütun 1-11 (şekil 1). Sütun 12 rhodocetin-Alerjik Wells renksiz wells bir düşük arka plan sinyal göster.

Fotometrik miktar itibariyle 405 nm doğrudan bir analiz yazılımı içine ve bir doğrusal regresyon ve Denklem 9kullanarak beslenebilir, her titrasyon satırın ham veri yaklasik ve (OD eşit olan sinyali S hesaplar veri sağlar 405nm) gibi bir fonksiyonu olan toplam konsantrasyonu rhodocetin ligand Lt (Şekil 2) ekledi. Dört titrasyon eğrileri her reseptör form (vahşi-tipi ve mutant) için son derece tekrarlanabilir ve neredeyse birbirlerine superpose. Bu düşük içi grup varyans aksine titrasyon eğrileri iki grubuna açıkça birbirinden ayrılır. Daha yüksek konsantrasyonlarda rhodocetin ligand bağlamanın mutant α2A-etki alanına sinyalleri vahşi türü formlar olanlar için benzer değerleri almak gereklidir. Titrasyon eğrileri bu sağa kaydırma mutant ligand ligand için azaltılmış bir yakınlık olduğunu gösterir. İntegrin etki alanı18rhodocetin bağlama sitenin parçası olduğundan α2A etki alanı tanıttı mutasyon rhodocetin bağlama yetini etkiler.

Titrasyon eğrisi 5 karakteristik parametreleri ile tarif edilebilir: (i) ayrışma sabiti K, (ii) konsantrasyonu immobilize, biyolojik olarak aktif reseptör Rt, maksimum (III) ve (IV) minimum sinyalleri (Smax ve Smin), (v yanı sıra ) arka plan sinyal B. eğimi Bu parametreler arasında ayrışma sabiti K biyolojik titrasyon eğrileri için temel ve en uygun yorumudur. Her titrasyon eğrisi bir değer K. için sağlar. Böylece, tek ve aynı zamanda gruplandırılmış titrasyon eğrileri istatistiksel olarak birbirleriyle karşılaştırılabilir. Bir istatistiksel analize vahşi türü ve mutasyona uğramış α2A-etki alanı için dört titrasyon eğrileri şekil 3' te gösterilmiştir. Benzeşme sabit rhodocetin vahşi tipi α2A-etki alanına bağlama için 5.80 ± 0,15 nM, rhodocetin daha düşük bir yakınlık 9.68 ± 0.18 nm ile mutasyona uğramış reseptör bağlar ise (p < 0.0001).

Böylece, bu matematiksel değerlendirme ile birlikte titrasyon ELISA ligand bağlayıcı bir reseptör ve mutasyona uğramış veya kimyasal olarak değiştirilmiş türevleri için hızlı ve istatistiksel ses bir değerlendirme sağlar. Bu nedenle, titrasyon ELISA ve değerlendirme algoritması yapı-fonksiyon ilişkileri analiz etmek için değerli araçlardır.

Figure 1
Şekil 1: microtiter plaka titrasyon ELISA için temsilcisi yerleşimini. Her satır bir titrasyon eğrisi için veriler sağlar. Kendi bağlama rhodocetin (RC) ligand karşılaştırmak için vahşi-tipi (satır A-D) ya da mutant formu (satırlar E-H) α2A-etki alanının immobilize dört satır her (dördüz belirlenmesi) wells. Yatay nokta hat titrasyon eğrileri iki gruba ayırır. Dikey nokta yolun sağ tarafında belirtilen sütun 12, kuyu değil herhangi bir rhodocetin içeren ve arka plan denetimi sunan iken sütun 1-11, rhodocetin ligand konsantrasyonu azalır. İlişkili ligand alkalen fosfataz substrat sarı para- nitrophenolate için dönüştürülür ELISA tarafından sayısal sonra plaka gösterilir. Veri üçte bir yinelenen deneylerden gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: temsilcisi titrasyon eğrileri. Titrating ham veri vahşi tipi immobilize ve mutasyona uğramış formlar çözünür ligand (semboller) olarak rhodocetin yanı sıra yaklaşık titrasyon eğrileri (satır) sahip Integra α2A-etki alanının yarı Logaritmik mezarlığına gösterilir. Dördüz tespitler (daireler, yukarı ve aşağı üçgenler, kareler her dört titrasyon satır için), ham veri için immobilize vahşi-tipi (açık sembolleri) ve (dolgulu semboller) α2A-reseptörleri mutasyona uğramış gösterilir. Hesaplanan titrasyon eğrileri çizgiler olarak gösterilmiştir (sağlam, kısa kesikli, noktalı, zincir noktalı) vahşi-tipi (siyah çizgiler) ve mutant (gri çizgiler) form reseptör için. Titrasyon eğrileri açıkça iki grup arasında farklılık gösterir, ancak her iki grubun (vahşi türü ve mutant reseptör) dört titrasyon eğrileri superpose. Mutant α2A etki titrations eğrileri bu rhodocetin mutasyona uğramış reseptör alt benzeşimi ile bağlar gösteren daha yüksek rhodocetin konsantrasyonları kaydırılır. Veri üçte bir yinelenen deneylerden gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Ayrışma sabitler K istatistiksel karşılaştırılması titrasyon eğrileri türetilmiş.
Sekiz titrasyon eğrileri Şekil 2 dissociations sabitler çizilen ve α2A etki alanı vahşi tipi ve mutant şeklinde gruplandırılır. Tek tek değerleri, grup ve standart sapmalar puan, kesikli SIYAH ÇIZGI ve gri hata çubukları tarafından sırasıyla gösterilir. Her grup ve grup arasında belirgin fark içinde küçük farkı önemli bir fark göstermek anlamına gelir (p < 0.0001) vahşi türü ve mutant reseptör benzeşme ligand, içinde. İki kuyruklu bir Student´s t-testi karşılaştırma için kullanıldı. Veri üçte bir yinelenen deneylerden gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Titrasyon ELISA Reseptör-ligand etkileşim ayrılma belirlemek için bir çok yönlü test sistemidir. Titrasyon ELISA ücretsiz ve ilişkili ligandlar etkili bir şekilde ayırmak için ve onların konsantrasyonları nicelik, çözümlemek için önemli ölçüde daha fazla çalışmalar zorunluluk kaçınmanızı sağlar ve yayınlar titrasyon ELISAs bağlama eğrileri kayıt yerine istihdam . Ayrıca, titrasyon ELISAs gerçekleştirmek ve reseptör ve ligand oldukça düşük miktarda gerektirir kolaydır. Ayrılma sabitler doğru analiz için reseptör ve ligand saf preparatları kullanılması gerekir. Reseptör hazırlık içinde bulaşıcı proteinlerin reseptör microtiter plaka plastik yüzey üzerindeki adsorpsiyon siteleri için rekabet. Onlar ligand bind yapmak ama ligand taşıması-reseptörleri sayısını azaltmak, reseptör çözüm kirleri titrasyon ELISA sinyalleri azaltmak. Reseptör hazırlık saflığı daha gelişmiş olamaz eğer Ayrıca, reseptör karşı yönettiği bir antikor microtiter plakasına immobilize ve, kuyuları engelleme sonra gelen yabancı maddeleri içeren bir hazırlık reseptör yakalayacaktır. Yine de, böylece yakalama antikor antikor tür etkileşimler nedeniyle birincil ve ikincil antikorlar ile ilişkili ligand tespiti rahatsız etmez veya bunun ligand bağlayıcı engel özen göstermelidir.

Kapsamlı bir veri kümesi elde etmek için onun titrasyon ELISA microtiter plakasına immobilizing tarafından bir deney çözünür ligand diğer denemede reseptör olarak kullanmak için ve titre için karşılıklı bir şekilde gerçekleştirmek için takdir etmek çözünür ligand ortağı olarak uygulanacak eski reseptör. Bu genellikle iyi bir ortak bağlama etkinliği immobilizasyon inaktive sürece veya titrated ortak algılamak için antikorlar gibi araçları yok veya elde etmek zordur sürece çalışır. Rhodocetin-α2A etki alanı bağlama sistemi bu amele iyi bir glutatyon-S-transferaz sonra (GST)-yan α2A-GST-antikorlar16ile onun algılama kolaylaştırmak için etki alanına erimiş.

Sadece konsantrasyon eklenen ligand (Lt), ama değil özgür ve ilişkili ligand titrasyon ELISA başka bir avantajdır (Lf ve Lb, sırasıyla), bilinmesi gerekiyor. Bu nedenle, ligand hazırlık kadar temiz olmalıdır. Eğer bu imkansız veya yalnızca sınırlı bir ölçüde, ligand hazırlık içinde molar oranı edildikten sonra ELISA hala, istihdam edilebilir titrasyon için uygun bağımsız olarak, belirlenen örneğin, SDS-sayfa, immunoblotting veya sandviç ELISA.

Titrasyon ELISA ile ilgili sorunlar reseptörü ve ligand arasındaki affinity çok düşükse veya oxazolidin fiksasyon bağlama etkileşim onuntemsilcilerini oluşabilir. İkinci durumda, titrasyon ELISA fiksasyon ücretsiz protokolünden kurulması gerekiyor. Yaklaşık 200 aralığında olan makul yüksek afinite, bağlama ortakları etkileşimde Eğer pratik olarak, ayrılma sabitler yalnızca tespit edilebilir nM.

Titrasyon sinyal yoğunluklarda S toplam eklenen ligand, Ltkonsantrasyonları bir fonksiyonu olarak sağlar. Ücretsiz ve ilişkisiz ligandlar konsantrasyonları, olarak Lf ve Lb, özetle Ltve Lb Y· ürün eşittir. Rt Denklem 3göre Denklem 4 için dönüştürüldükten:

Equation 5           Denklem 5

ikinci dereceden denklem kaynaklanan,

Equation 6         Denklem 6

Kimin pratik bir çözüm olduğunu,

Equation 7         Denklem 7

Sonra minimum sinyal değeri, Smin, çıkarma tarafından düzeltildi ve dinamik alan normalleştirilmiş Ayrıca, S (Lt) sinyal yoğunlukta eklenen ligand Lt belirli bir konsantrasyon doygunluk verim Y, temsil eder , maksimum ve minimum sinyal değerleri, Smax ve Sminarasındaki fark olarak verilen:

Equation 8           Denklem 8

Denklem 7 ve Denklem 8 ile birlikte eklenen ligand Ltkonsantrasyon ile olan sinyal şiddeti S (Lt) matematiksel işlev verir. Bir dönem B· Lt Ltile doğrusal olarak yükseltir olan spesifik olmayan arka plan sinyali açıklamak için eklenebilir. B arka plan ölçülülük sabitidir. Böylece, titrasyon eğrisi açıklamak için genel fonksiyonu şudur:

Equation 9         Denklem 9

Bu işlev bir titrasyon eğrisi oluşan bir işlev belirli etkileşimi reseptör ve ligand ve ligand, spesifik olmayan etkileşimleri arasında sırasıyla açıklamak bir kare kökü terim ve doğrusal bir terim ile karşılık gelir. Bu işlev bağlama eğrinin hiperbolik işlevinden farklıdır (LSaban. Lf).

İlişkili ligand konsantrasyonları y ekseni üzerinde çizilen bağlama eğrisi aksine titrasyon eğrisi daha esnektir ve y ekseninde çizilmek üzere olan ilişkili ligand konsantrasyonu ile herhangi bir sinyal, sağlar. Bu sinyal bir enzim bağlı antikor (olduğu gibi bu durumda bir ELISA) photometrically tespit bağlama olabilir, ama aynı zamanda Absorbans, dairesel dichroism9, Floresans polarizasyon21 bir değişiklik gibi diğer spektrometrik sinyallerini olabilir , ve NMR sinyalleri22. Ayrıca, aynı zamanda izotermal titrasyon Kalorimetre23 termodinamik sinyalleri değerlendirilecek mümkün olmalıdır. Diğer çalışmalar bağlama benzeşme Kinetik üzerinden açık - belirlemek ve oranları oluşumu ve ayrılma tarafından fani alanında ölçüm gerçek zamanlı değişikliklerden Reseptör-ligand kompleks için kapalı plasmon rezonans24,25 yüzey , içinde kitle ifade bir kuvars kristali microbalance26tarafından veya floresan microscale thermophoresis26,27tarafından. Bu gerçek zamanlı ölçümler güçlü araçlar Gelişmiş değerlendirme yazılımlarını nedeniyle olmuştur. Titrasyon ELISA ve SPR genellikle bağlama ortakları protein-kimyasal analiz incelemek için seçtiğiniz yöntemi vardır. Titrasyon ELISA benzeşme sabit thermodynamically farklı denge Birleşik, ilişkili ligand miktarı miktarının tarafından önlemler ise SPR Kinetik bir yaklaşım kullanır ve üzerinde Kinetik hızı sabitler, kkapalı ve kyaklasik , hangi oranı kinetically kararlı ayrılma sabit24,25sağlar. İki farklı yaklaşım bağlı olarak K değerleri birbirinden farklı olabilir. Rhodocetin-α2A etki alanı bağlama deneylerde ortaya SPR veri kkapalı ve k oranı sabitlerüzerinde ve sonuç olarak bir kinetically benzeşme sabiti K, rhodocetin-α2A karmaşık19, hangi çok benzer olduğunu belirlemek K-değerleri bu çalışmada titrasyon ELISA tarafından ölçülür. Küçük farklılıklar etkinlik varyasyonları farklı toplu işlemleri veya farklı koşullar ve süreleri depolama protein örneklerinin tarafından açıklanabilir. Aynı anda ve değil sırayla gibi daha sonra bu bağlamda titrasyon ELISA tüm örneklerini SPR makinesinde ölçülür. Şimdi, matematiksel olarak erişilebilir ve titrasyon eğrisi denklem (Denklem 9) ile yönetmek kolay olması, titrasyon ELISA bu son nokta ölçüm kinetically değerlendirilmiş gerçek zamanlı ölçümleri güçlü hale gelebilir ki bir maliyet yoğun SPR makine gerektirir.

Bu denklem ligand toplam konsantrasyonu düşük ligand konsantrasyonlarda özellikle ilişkili ligand konsantrasyonu azalır dikkate alır. Bu ligand konsantrasyonu tüm aralığında titrasyon eğrisi çok daha iyi yaklaşımları için veri sağlar. Bir dezavantaj-in bağlama eğrisi ile karşılaştırıldığında titrasyon ELISA, matematiksel olarak titrasyon eğrisi değerlendirmek için zorluk bugüne oldu. Bir bağlama eğrisi ücretsiz ligand L konsantrasyonuf yarı-azami doygunluk, ayrışma sabiti eşit ise, bu bir titrasyon eğrisi için doğru değildir. İki algoritma bağımsız grafik olarak titrasyon eğrileri linearize ve ayrışma sabiti belirlemek için geliştirilmiştir. Ancak, her iki algoritmaları spektroskopik titrasyon deneyler için Stockell vd tarafından geliştirilen 8 ve Hey & Weischet9 tarafından doygunluk verim Y için yüksek sinyal grafik olarak belirlenmelidir dezavantajı acı. Bu değer asimptotik yaklaşırken, doygunluk verim ve sonuç olarak hesaplanan ayrışma sabiti özünde hata eğilimli vardır. Buna ek olarak, Denklem 9 tarihinde alan algoritma titrasyon deneyler ham verileri kullanır ve ayrışma sabiti K yanı sıra diğer parametreleri (Şekil 2 ve şekil 3 en uygun çözümü bulmak için bir doğrusal regresyon hesaplar ). Ayrıca, bu algoritma grafik olarak muhtemelen dışarı ulaşan yüksek sinyal ligand doygunluk tahmin etmek gerekmez değerlendirme sürecinin çok daha hızlı ve doğru olur ve grafik değerlendirme daha az önyargı taşımaktadır. Birkaç titrasyon eğrileri paralel olarak değerlendirilebilir. Böylece, titrasyon eğrileri çeşitli gruplar aynı anda ölçülebilir ve onların parametrelerin istatistiksel analiz ve karşılaştırıldığında. Ayrıca, her titrasyon eğrisi ayrışma sabiti K, konsantrasyon immobilize ve bağlama-aktif reseptör Rt, farkı maksimum ve minimum sinyal değerleri Smax ve Solarak dinamik alan değerleri, aralarında bir dizi verir min , hem de bu değerleri, hesaplanan ve konsantrasyonu bağımlılık çizilen Y doygunluk verim kullanarak deneysel arka plan sinyal karşılık gelen doğrusal faktörü B ligand Lteklendi. Böyle bir doygunluk verim mezarlığına, yarı-azami doygunluk sinyal Lt(50%), eklenen ligand konsantrasyonu ayrışma sabiti K artı immobilize etkin reseptör Rt yarım konsantrasyon toplamına eşittir.

Equation 10        Denklem 10

Bu Y için elde edilebilir Denklem 7ile 0,5 =. Böylece, immobilize etkin reseptör Rt konsantrasyonu reseptör konsantrasyonları farklı kaplama ile titrasyon ELISA gerçekleştirerek belirlenebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazar ifşa etmek hiçbir şey vardır.

Acknowledgments

İletişim kuralı ve algoritma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG grant SFB1009 A09 ve EB177/13-1) tarafından finanse edilen bir proje içinde geliştirilmiştir. Yazar Barbara Schedding ve teknik destek için Felix Schmalbein ve Dr. eleştirel makale okumak için Niland teşekkürler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TRIS neoFrox 1125KG001
HEPES Sigma-Aldrich H4034
NaCl Applichem 1,316,591,214
MgCl2 Merck 172571
integrin a2A, wild-type and mutant, recombinant isolated in author's lab
NiNTA superflow column  Qiagen, Germany 30821
Coomassie-Brilliant Blue R250 Serva 35050
bicinchoninic acid assay (BCA), protein concentration determination kit Fisher Scientific 23225
bovine serum albumine (BSA), fraction V Applichem A1391
25 % solution of glutaraldehyde Merck 354400
anti-rabbit immunglobulin-antibodies from goat, conjugated with alkaline phosphatase Sigma-Aldrich A9919
Glycine Applichem A1377
Zn(II)-acetate Applichem A4324
NaOH Applichem A1551
Alkaline phosphatase substrate tablet (5 mg) Sigma-Aldrich S0942
Costar half-area microtiter plate Thermo Scientific Corning 3690
micro reaction tubes Eppendorf 30120086
Microplate ELISA reader BioTek Synergy HT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klotz, I. M. The application of the law of mass action to binding by proteins; interactions with calcium. Arch Biochem. 9, 109-117 (1946).
  2. Klotz, I. M. Ligand-receptor complexes: origin and development of the concept. J Biol Chem. 279, (1), 1-12 (2004).
  3. Bisswanger, H. Ch. 1: Multiple Equilibria, Principles and Derivations. Enzyme Kinetics: Principles and Methods. Wiley VCH Verlag GmbH. 1-26 (2017).
  4. Shimura, K., Kasai, K. Affinity gel titration: quantitative analysis of the binding equilibrium between immobilized protein and free ligand by a continuous titration procedure. Anal Biochem. 149, (2), 369-378 (1985).
  5. Gong, M., Nikcevic, I., Wehmeyer, K. R., Limbach, P. A., Heineman, W. R. Protein-aptamer binding studies using microchip affinity capillary electrophoresis. Electrophoresis. 29, (7), 1415-1422 (2008).
  6. Hanes, M. S., Ratcliff, K., Marqusee, S., Handel, T. M. Protein-protein binding affinities by pulse proteolysis: application to TEM-1/BLIP protein complexes. Protein Sci. 19, (10), 1996-2000 (2010).
  7. Latour, R. A. The Langmuir isotherm: a commonly applied but misleading approach for the analysis of protein adsorption behavior. J Biomed Mater Res A. 103, (3), 949-958 (2015).
  8. Stockell, A. The binding of diphosphopyridine nucleotide by yeast glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. J Biol Chem. 234, (5), 1286-1292 (1959).
  9. Heyn, M. P., Weischet, W. O. Circular dichroism and fluorescence studies on the binding of ligands to the α subunit of tryptophan synthase. Biochem. 14, (13), 2962-2968 (1975).
  10. Campbell, I. D., Humphries, M. J. Integrin structure, activation, and interactions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (3), (2011).
  11. Zeltz, C., Gullberg, D. The integrin-collagen connection--a glue for tissue repair? J Cell Sci. 129, (4), 653-664 (2016).
  12. Kanchanawong, P., et al. Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions. Nature. 468, (7323), 580-584 (2010).
  13. Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annu Rev Immunol. 25, 619-647 (2007).
  14. Luo, B. H., Springer, T. A. Integrin structures and conformational signaling. Curr Opin Cell Biol. 18, (5), 579-586 (2006).
  15. Ricard-Blum, S. The collagen family. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (1), a004978 (2011).
  16. Eble, J. A., Tuckwell, D. S. The α2β1 integrin inhibitor rhodocetin binds to the A-domain of the integrin α2 subunit proximal to the collagen-binding site. Biochem J. 376, (Pt 1), 77-85 (2003).
  17. Eble, J. A., et al. The α2β1 integrin-specific antagonist rhodocetin is a cruciform, heterotetrameric molecule. FASEB J. 23, (9), 2917-2927 (2009).
  18. Eble, J. A., et al. Dramatic and concerted conformational changes enable rhodocetin to block α2β1 integrin selectively. PLoS Biol. 15, (7), e2001492 (2017).
  19. Bracht, T., Figueiredo de Rezende, F., Stetefeld, J., Sorokin, L. M., Eble, J. A. Monoclonal antibodies reveal the alteration of the rhodocetin structure upon α2β1 integrin binding. Biochem J. 440, (1), 1-11 (2011).
  20. Harlow, E., Lane, D. Chapter 5: Immunizations. Antibodies, a laboratory manual. 5, Cold Spring Harbor Laboratory. 53-138 (1988).
  21. Lu, D. Analyzing interactions between SSB and proteins by the use of fluorescence anisotropy. Methods Mol Biol. 922, 155-159 (2012).
  22. Fielding, L. NMR methods for the determination of protein-ligand dissociation constants. Curr Top Med Chem. 3, (1), 39-53 (2003).
  23. Leavitt, S., Freire, E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry. Curr Opin Struct Biol. 11, (5), 560-566 (2001).
  24. McDonnell, J. M. Surface plasmon resonance: towards an understanding of the mechanisms of biological molecular recognition. Curr Opin Chem Biol. 5, (5), 572-577 (2001).
  25. Rich, R. L., Myszka, D. G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis. Curr Opin Biotechnol. 11, (1), 54-61 (2000).
  26. Pesquero, N. C., et al. Real-time monitoring and kinetic parameter estimation of the affinity interaction of jArtinM and rArtinM with peroxidase glycoprotein by the electrogravimetric technique. Biosens Bioelectron. 26, (1), 36-42 (2010).
  27. Scheuermann, T. H., Padrick, S. B., Gardner, K. H., Brautigam, C. A. On the acquisition and analysis of microscale thermophoresis data. Anal Biochem. 496, 79-93 (2016).
Titrasyon ELISA reseptör Ligand etkileşim ayrışma sabiti belirlemek için bir yöntem olarak
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eble, J. A. Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction. J. Vis. Exp. (132), e57334, doi:10.3791/57334 (2018).More

Eble, J. A. Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction. J. Vis. Exp. (132), e57334, doi:10.3791/57334 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter