Summary
여기, 우리는 PCL 두꺼운 섬유와 큰 모 공, 혈관 이식 조작 및 복 부 대동맥 교체의 쥐 모델에서 vivo에서 성능을 평가 하기 위해 프로토콜을 설명 하는 수정 된 전기 방법을 제시.
Abstract
여기, 우리는 macroporous PCL 혈관 이식 조작 및 복 부 대동맥 교체의 쥐 모델을 사용 하 여 평가 프로토콜을 설명 하는 프로토콜을 제시. Electrospun 혈관 이식 자주는 이식으로 세포 침투를 제한 하 고 재생성 하 고 개장 하는 신 동맥의 방해는 상대적으로 작은 구멍을가지고 있다. 이 연구에서는 두꺼운 섬유 (5-6 µ m)와 더 큰 모 (~ 30 µ m) PCL 혈관 이식 수정된 처리 기술을 사용 하 여 조작 했다. 이식의 장기 성능 쥐 복 부 대동맥 모델에 주입에 의해 평가 되었다. 초음파 분석은 이식 남아 동맥 또는 이식의 12 개월 후에 발생 하는 협 착 증 없이 특허를 보여주었다. Macroporous 구조는 셀 ingrowth를 개선 하 고 따라서 3 개월에서 재생성 조직 승진. 더 중요 한 것은, 12 개월 후 이식 벽 내 석 회화 등 불리 한 개장의 아무 표시도 없었다. 따라서, 처리 하는 수정 된 macroporous와 electrospun PCL 혈관 이식 장기 이식에 대 한 동맥 대체 될 잠재적인 개최.
Introduction
합성 중합체에서 만든 혈관 이식 심장 혈관 질병 (CVDs)의 치료를 위한 병원에 널리 활용 됩니다. 불행히도, 작은 직경의 혈관 이식의 경우 (D < 6 m m) 사용할 수 없습니다 종종 이르게 혈전 증, 내 증식, 그리고 다른 감소 된 혈액 흐름 속도 의해 발생 하는 낮은 patency 성공적인 제품 있다 합병증1.
조직 공학 장기 patency 및 항상성 비 계 기반 혈관 재생 및 재건에 따라 실현 하는 대체 전략을 제공 합니다. 자세히, 혈관 이식, 3 차원 서식 파일로 제공할 수 있는 기계적인 지원 및 혈관 조직 및 기능의 영향 세포, 세포 접착, 이동, 확산를 포함 하 여 재생 하는 동안 구조 지도 기질2분 지금까지, 다양 한 합성 폴리머 혈관 조직 공학에서 응용 프로그램에 대 한 평가. 이러한 고분자 중 poly(ε-caprolactone) (PCL)가 집중적으로 조사 좋은 셀 호환성 및 느린 저하 몇 개월에서 2 년3에 이르기까지. 쥐 대동맥 모델4,,56, PCL 혈관 이식 전기 처리 우수한 구조적 무결성 및 patency, 뿐만 아니라 지속적으로 증가 세포 침입과에서 neovascularization 전시는 최대 6 개월까지 이식 벽입니다. 그러나, 불리 한 조직 세포와 모세 혈관의 석 회화, 회귀를 포함 하 여 리 모델링 또한 관찰 되었다 더 긴 timepoints에서 최대 18 개월.
Cellularization 혈관 이식의 조직 재생을 결정 하 고7을 remolding 핵심 요소입니다. 전기, 다양 한 기법으로는 널리 고용 나노 섬유 구조8혈관 이식의 준비에 대 한. 불행히도, 상대적으로 작은 기 공 구조는 종종 후속 조직 재생을 제한 하는 electrospun 혈관 이식에 부족 한 세포 침투를 끈다. 이 문제를 해결 하려면 다양 한 기술은 시도 기 공 크기와 전반적인 다공성,9,10, 수집 장치, 레이저 방사선11에 의해 치료 후의 수정 leaching 소금/폴리머를 포함 하 여 증가 , 등등. 사실, electrospun 이식 (를 포함 하 여 섬유 직경, 기 공 크기 및 다공성)의 구조는 밀접 하 게 관련이 처리 조건12,13. 중 전기, 섬유 직경 폴리머 솔루션, 흐름 속도, 전압 등의 농도 같은 매개 변수를 변경 하 여 쉽게 제어할 수 있습니다. 14 , 15, 그러므로, 숨 구멍 크기와 다공성 향상 되었습니다 따라와.
우리는 최근 macroporous 구조 (5-7 µ m의 직경 및 30-40 µ m의 모 섬유) 수정된 PCL electrospun 이식을 했다. Vivo에서 쥐 복 부 대동맥을 대체 하 여 이식 3 개월 후 수술16patency, 좋은 endothelialization, 부드러운 근육 중생의 높은 비율을 보였다. 더 중요 한 것은, 아니 불리 한 조직의 석 회화 및 셀 회귀를 포함 하 여 개장 이식의 1 년 후에 관찰 될 수 있었다.
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Protocol
실험 동물의 사용은 동물 실험 윤리 위원회의 난카이 대학에 의해 승인 하 고 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 따라 실시.
1입니다. Electrospun PCL 이식의 제조
참고: 여기, 전기 기술 혈관 이식 조작에 이용 되었다.
- 각각, 메탄올과 클로 프롬의 혼합물에서 PCL을 용 해 하 여 25 wt %와 10 wt %의 PCL 솔루션을 준비 (1:5 볼륨 비율), 실 온 (RT) 12 시간에서.
- 10 mL 유리 주사기를 PCL 솔루션을 로드 합니다.
- 21-G 바늘 주사기를 놓습니다.
- 컬렉션 악기에 스테인리스 스틸 맨 드릴 (2 mm 직경, 길이 25 c m)를 놓습니다.
- 두꺼운 섬유 이식에 대 한 사용 하 여 25 wt %의 PCL 솔루션, 수집기 바늘 끝에서 17 cm의 거리, 8 mL/h의 유량 및 11의 전압 전기 매개 변수로 kV. 얇은 섬유 이식 10 wt %, 수집기에 바늘 끝에서 20 cm의 거리, 2 mL/h의 유량 및 18의 전압의 PCL 솔루션 사용 전기 매개 변수로 kV.
- 얻은 이식 하룻밤 잔여 용 매를 제거 하는 진공 상태에서 배치 됩니다 확인 하십시오. 소독 절차 전에 모든 악기 고 무 균 기술을 통해 유지 합니다.
- 주입 전에 이식 30 분 75% 에탄올 10 ml에서 그들을 immersing 및 다음 하룻밤 UV 빛에 노출에 의해 소독.
- 섬유 및 기 공 크기 측정: 스캐닝 전자 현미경 (SEM) 이미지에 따라 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 평균 섬유 직경을 계산.
- 기계 장비의 테스트:
- 면도날을 사용 하 여 길이 3 m m 섹션으로 관 건설 기계를 절단. 건설 기계는 마이크로미터를 사용 하 여 두께 측정 합니다.
- 100 북 아의 부하 용량 인장 테스트 기계에 관 건설 기계를 배치
- 파열까지 1mm 간 클램프 거리와 풀 10 m m/min의 속도로 경도 건설 기계 클램프. 인장 강도 및 파단 궁극적인 측정 합니다. 초기 선형 영역에서 탄성 계수를 계산 (최대 5% 변형) 응력-변형 곡선의.
2. 쥐 복 부 대동맥 이식 모델
참고: 모든 재료와 수술에 사용 되는 계기는 살 균. 수술 동안 거 즈 마스크와 감염을 피하기 위해 멸 균 장갑을 착용 하는 연산자 확인 하십시오. 실내 온도 동물 체온을 유지 하기 위해 27-30 ° C에서 유지 됩니다 확인 하십시오. 진통에 관한 현지 IACUC 지침을 따르십시오.
- 남성 Sprague Dawley 쥐 혈관 이식의 수신자로 240-270 g의 무게를 사용 합니다. 쥐 수술 하기 전에 24 시간 금식은 확인 합니다. 24 시간 단식 쥐의 목표는 빈 창 자에서 대변 충분히, 그로 인하여 확장 연산자의 수평선.
- 쥐의 백 목 잡고 아래쪽으로 머리를 유지, 낮은 복 부의 복 부 구멍으로 springe 바늘을 삽입. 복 주사에 의해 chloral 하이드 레이트 (330 mg/kg)과 마 취에 대 한 쥐를 유도.
- 쥐는 근육과 꾸준히 호흡을 완화 했다 함으로써 적절 한 anesthetization를 확인 합니다. 운영 현미경 쥐 부정사 위치에 놓습니다.
- 바 셀 린 안과 수 의사 연 고 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 눈에 적용 됩니다. 수술 전에 꼬리 정 맥 주입에 의해 heparinized 생리 염 분 해결책 (50 UI/mL)와 anticoagulation (UI/100kg)을 관리 합니다.
- 면도칼 블레이드를 사용 하 여 전방 복 벽에 털을 면도 하십시오 그리고 요오드 솔루션 및 의료 알코올 솔루션을 사용 하 여 피부를 청소.
- 수술가 위로 중간 개복 술 절 개를 수행 하 고 절 개 길이, 약 4-5 m 인지 확인 다음 복 부 구멍을 노출.
- 철회 하 고 우선적으로 생리 식 염 수를 적신 거 즈로 내장을 포장.
- 신중 하 게 복 부 대동맥 해 부.
- 식별 하 고 9-0 monofilament 나일론 봉합을 사용 하 여 모든 작은 가지를 선.
- 격리 된 섹션을 클램프 (길이 최대 1 c m) 2 개의 혈관 클램프를 사용 하 여 대동맥의. 대동맥 20-30 분 채워 남아 있을 수 있습니다.
- Anastomotic 사이트를 만들 마이크로-가 위를 사용 하 여 두 개의 클램프 사이의 복 부 대동맥 transect
- 잔여 혈액을 제거 하 heparinized 염 (UI/50ml) 솔루션을 사용 하 여 대동맥의 두 끝을 플러시.
- 마이크로-가 위를 사용 하 여 adventitia 벗기다.
- 9-0 monofilament 나일론 봉합을 사용 하 여 숫자의 8 봉합 패턴 2 m m 내경 및 쥐의 복 부 대동맥에 길이 1 cm 이식 anastomose.
- 첫째, 9, 3, 12, 및 근 위 측에 6 시 위치 순서 대로 4 개의 anastomoses을 구성 다음 두 봉합 사이 4 바늘 컷된 가장자리 anastomose. 근 위 봉합을 마치고 같은 방법으로 원심 측을 봉합.
참고: 모든 스티치는 네이티브 쪽은 약간은 이식에 포함 된 보장 합니다. - 이식, 흘러 혈액을 있도록 원심 클램프 다음 인접 클램프를 제거.
- 멸 균 면봉 또는 스폰지 작은 거 즈를 사용 하 여 출혈을 막으려고 봉합 끝을 누릅니다. 약 3 분, hemostasis 때까지 누릅니다.
- 복 부 구멍으로 내장을 반환 합니다.
- 플러시 gentamicin (320 U/mL)와 따뜻한 생리 식 염 수 솔루션을 사용 하 여 복 부 구멍.
- 각각 근육과 피부 층에 3-0 나일론 봉합 사를 사용 하 여 복 벽을 바느질.
- 깨끗 하 고 건조 감 금 소에 쥐를 놓고 동물 체온; 유지 케이지 난방 패드를 넣어 마 취에서 회복 하기 위해 쥐를 기다립니다. Sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지 동물에 참석.
- 후 의식 회복, 음식과 물을 함께 단일 케이지에 쥐를 넣어. 수술 후 감염을 방지 하기 위해 상처에 요오드를 적용 합니다. 그것은 완벽 하 게 복구 될 때까지 다른 동물의 회사에는 쥐를 반환 합니다.
- 미리 정해진된 시간 지점에서 기관 지침에 따라 쥐 안락사
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Representative Results
PCL 이식 했다 explanted 3 개월 및 12 개월에서 post-operatively 및 hematoxylin에 오신 (H & E), 표준 조직학 기술에 의해 trichrome Masson, 분석 Verhoeff 반 Gieson (VVG), 폰 Kossa, 면역 형광 α-SMA를 위한 얼룩 MYH, vWF, 그리고 엘라 스 틴입니다. 조직학 이미지 똑바로 현미경을 사용 하 여 찍은 그리고 면역 형광 이미지 fluorescence 현미경을 사용 하 여 찍은.
모든 데이터는 ± sd. 의미를 표현 했다 학생의 t쌍 두 꼬리-시험 차이 비교 하는 데 사용 되었다. P 의 값 < 0.05 통계적으로 간주 되었다.
최적화 된 구조, 즉, 두꺼운 섬유 및 더 큰 숨 구멍, 소설 electrospun PCL 이식이이 연구에 성공적으로 조작 했다. SEM 이미지 시연 평균된 섬유 직경은 약 8 시간에는 기존 보다 수정된 이식 (그림 1A)에서 두꺼운 하나 (그림 1B) (5.59 ± 0.69 ± 0.54 µ m 대 0.67). 그 결과, 평균된 기 공 크기는 현저 하 게 증가에서 ~를 얇은 섬유 이식에 4.66 µ m ~ 40.88 µ m는 두꺼운 섬유 하나에. 횡단면 두꺼운 섬유 (그림 1D-F)와 (그림 1G-나) 얇은 섬유 그룹 관 이식의 벽 내의 균질 섬유 분포를 보였다. 벽 두께 대해서는 400-500 µ m. 이식의 기계적 성질은 인장 테스트, 특징 그리고 일반적인 응력-변형 곡선 그림 1C에 표시 했다. 2 이식의 기계적 특성 신장 면에서 분명히 달랐다. 두꺼운 섬유 이식의 해당 값 약 3 배 이상 향상 된 인 성 제안 얇은 섬유 이식 했다.
준비 된 혈관 이식 (안 직경 2.0 m m)와 1 cm의 길이 (그림 2A) 대체 하는 라트 (그림 2B) 네이티브 복 부 대동맥의 세그먼트를 이식 했다. 미리 정해진된 시간 지점에서 이식된 이식의 patency 초음파에 의해 시험 되었다. 결과 이식의 대부분 특허 것으로 나타났다 (그림 2C). 또한, 혈액의 흐름의 속도 12 개월에 이식 및 인접 한 네이티브 혈관 사이 유사 했다. Explanted 이식 없이 동맥 (그림 2D), 좋은 형태를 유지 하 고 협 착 증 또는 혈전 luminal 표면 (그림 2E)에 관찰 될 수 있었다.
조직 재생 및 ECM 분 비 3 개월 더 조직학 분석으로 평가 됐다. H & E 염색 (그림 3G-H) 이식의 루멘에 네오-조직 계층 형성 되었다 보여주었다. 또한, vWF 얼룩이 보여 luminal 표면 닮은 네이티브 대동맥 (그림 3B)의 새로 형성된 된 피 (그림 3A)에 의해 완전히 덮여 있었다. 한편 여러 계층 MYH 긍정적인 세포의 혈관 미디어 (그림 3C-D)의 재생을 나타내는 원주 방향을 따라 조직 되었다. 세포 외 기질 합성 Masson VVG 얼룩, 각각에 의해 관찰 되었다. 섬유 엘라 스 틴과 콜라겐의 상당한 금액 혈관 재생 및 리 모델링에서 중요 한 역할 (그림 3I-J, K-L), 이식에서 관찰 될 수 있었다. 엘라 스 틴의 구조는 원주에서 정렬 패턴 그런 네이티브 동맥 (그림 3E-F)에 보였다 추가 면역 형광 염색 법.
또한, 피와 부드러운 근육 유지를 포함 한 재생된 조직 통합 및 주입 (그림 4A-C)의 12 개월 후 복귀 하지 않았다. 더 중요 한 것은, 석 회화 (그림 4D) 얼룩 Von Kossa에 따라 이식 벽 내 발생의 아무 표시도 없었다.
그림 1 : 구조 및 PCL 이식의 기계적 성질. Electrospun의 SEM 이미지 PCL 두꺼운 섬유 (A)와 (B) 얇은 섬유 매트. 두꺼운 섬유 관 이식 (D-F) 및 (G-나) 얇은 섬유 이식의 횡단면. 대표 긴장-긴장 곡선 (C)에 표시 됩니다. 이러한 수치 자오, 외 에서 수정 된 16 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 쥐 복 부 대동맥 모델에서 혈관 이식 술의 이식. 길이 (A)에서 1 cm의 Electrospun PCL 혈관 이식 수술 쥐 (B)에서 복 부 대동맥에 interposed 이었다. 초음파 이미지는 이식 했다 특허 vivo에서 1 년 (C)에서 나타났다. Stereomicroscopic 이미지 표시는 이식 했다 인접 한 네이티브 대동맥 동맥 (D) 없이 잘 통합 luminal 표면은 깨끗 하 고 혈전 (E)의 무료. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 조직 재생 및 네이티브 대동맥에 비해 3 개월 explanted 이식에 ECM의 증 착. 재생성 된 이식 (A, C, E) 및 (B, D및 F) 네이티브 동맥의 단면 이미지 내 피 세포, 평활 근 세포, 그리고 엘라 스 틴을 검출 하기 위하여 immunostained를 했다. H & E 염색 네이티브 대동맥 (H)에 비해 조직 재생 explanted 이식 (G)에 표시 됩니다. Masson의 얼룩이 지 계시 하는 (나) explanted 이식에 네이티브 대동맥 (J) 콜라겐의 존재. VVG 얼룩 explanted 이식 (K)에 네이티브 대동맥 (L) 엘라 스 틴의 존재를 보여주었다. 이러한 수치 자오, 외 에서 수정 된 16 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 12 개월 explanted 이식의 조직학 분석. (A) H & E 얼룩 했다 explanted 이식에서 조직 재생. (B) 피 vWF 항 체에 의해 immunostained 이었다. (C) 평활 근 α-SMA 항 체에 의해 immunostained 이었다. (D) 석 회화 Von Kossa 얼룩에 의해 평가 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
셀 침투는 중생에 대 한 중요 하 고16 vivo에서혈관 이식의 개장 이다. 제한 된 셀 침투는 종종 이식 벽으로 세포의 이동 방해는 이식의 상대적으로 작은 구멍 관련이 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 우리는 큰 기 공 구조 electrospun PCL 혈관 이식 준비 하 수정된 방법을 개발. 세부 사항에, 기 공 크기는 쉽게 처리 매개 변수에 의해 제어 될 수 있는 섬유 두께의 증가 함께 증가. 결과는 호스트 세포 vivo에서 이식 후이 macroporous 이식의 벽에 쉽게 침투 수와 cellularity 수술 12 개월 후에 명백한 셀 회귀 하지 않고 상대적으로 높은 수준에서 유지 했다.
네이티브 동맥 주로 이루어져 있다 3 개의 층, 즉, 내 피, tunica 매체, 및 adventitia. 피 안티 thrombogenic 인터페이스, 혈관의 장기 patency 유지 하는 중요 한 역할을 재생 합니다. 우리의 연구는 이식에 전체 endothelialization 3 개월에서 관찰 되었다. 또한, 부드러운 근육 세포의 여러 레이어로 구성 된 tunica 매체 동맥의 적절 한 기계적 특성을 제공 하 고 혈관 기능 조절에 매우 중요 하다. 현재 연구는 electrospun PCL 두꺼운 섬유와 이식 큰 기 공 현저 하 게 향상 된 기능 tunica 매체의 재생 밝혔다. 게다가, 재생성 된 부드러운 근육의 구조는 네이티브 tunica 매체 비슷합니다. 면역 형광 염색 원주 부드러운 근육 세포의 수축 성 표현 형을 반영 하는 엘라 스 틴 네트워크 내에서 분산 MYH+ 세포의 여러 계층으로 나타났다. 더 중요 한 것은, 조직 (내 피 및 평활 근) 그대로 유지를 재생성 하 고 ECM 합성 저하 사이의 불균형으로 인해 12 개월 후에 아무 불리 한 개장 했다.
석 회화는 여전히 특히 혈관 이식에서에서의 심혈 관 임 플 란 트와 관련 된 주요 문제 이다. 혈관 평활 근 세포 (VSMCs) 그들의 원래 표현 형을 잃게 되 고 혈관 석 회화의 과정에서 소성 강화로 이어지는 osteochondrogenic 방향으로 트랜스-차별화를 경험. 우리의 연구는 없는 칼슘 증 착 이식의 12 개월 후에 이식 벽 내에서 발생 했다 보여주었다. 매크로 다공성 혈관 이식에 금된 석 회화에 대 한 주요 이유는: (1) 매크로 다공성 이식의 구조 세포와 혈액; 사이 이온 교환 등 신진 대사를 촉진 (2) 이식 구조의 물리적 단서 수 규제 또는 osteoblast1에 VSMC의 분화를 억제, 큰 숨 구멍에서 (3) 좋은 세포 침투 ECM의 분 비를 촉진 하 고 일으킬 것 이다 그것의 저하를 억제 석 회화17, 그리고 (4) 정상 또는 기능 VSMCs18칼슘 증 착 방지 하기 위해 가능성이 있다.
요약 하자면, 쥐 복 부 대동맥 모델에서 매크로 다공성 electrospun PCL 혈관 이식의 장기 평가 다음과 같은 연구를 직접 것입니다 분해성 혈관 이식의 잠재적인 문제에 대 한 중요 한 통찰력을 제공 합니다.
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Disclosures
저자 아무 충돌 금융 관심 있다.
Acknowledgments
이 작품은 NSFC 프로젝트 (81522023, 81530059, 91639113, 81772000, 81371699, 및 81401534)에 의해 재정적으로 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(ε-caprolactone) (PCL) pellets (Mn=80,000) | Sigma | 704067 | |
| Methanol | Tianjin Chemical Reagent Company | 1060 | |
| Alcohol | Tianjin Chemical Reagent Company | 1083 | |
| Chloroform | Tianjin Chemical Reagent Company | A1007 | |
| Sucrose | Tianjin Fengchuan Company | 2296 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| Sprague Dawley rats | Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences | ||
| Normal saline | Hebei Tiancheng Pharmaceutical company | ||
| Chloral hydrate | Tianjin Ruijinte chemical company | 2223 | |
| Heparin sodium Injection | Tianjin Biochem Pharmaceutical company | ||
| Gentamycin Sulfate Injection | Jiangsu Lianshui Pharmaceutical company | ||
| Mouse anti-α-SMA primary antibody | Abcam | ab7817 | |
| Mouse anti-smooth MYH primary antibody | Abcam | ab683 | |
| Rabbit polyclonal anti-rat elastin antibody | Abcam | ab23748 | |
| Rabbit anti-von Willebrand factor primary antibody | Abcam | ab6994 | |
| Goat anti-mouse IgG (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | ab150117 | |
| Goat anti-rabbit IgG (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | ab150077 | |
| 5% normal goat serum | Zhongshan Golden bridge | ZLI9022 | |
| Hematoxylin and eosin (H&E) | Beijing leagene biotech | DH0006 | |
| Masson's trichrome | Beijing leagene biotech | DC0032 | |
| Verhoeff-van Gieson (VVG) | Beijing leagene biotech | DC0059 | |
| Von Kossa | Beijing leagene biotech | DS0003 | |
| Surgical sutures needles with thread,3-0 silk | Shanghai Jinhuan medical supplies company | G3002b | |
| Surgical sutures needles with thread,9-0 silk | Shanghai Jinhuan medical supplies company | H901 |
References
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