Summary
在此, 我们提出了一种改进的静电纺丝方法, 以制造粗纤维和大孔隙的 PCL 血管移植, 并描述了一个协议, 以评估在体内的性能在大鼠腹主动脉置换模型。
Abstract
在这里, 我们提出了一个制备大孔 PCL 血管移植的协议, 并描述了一个模型的应用腹主动脉替代模式的评估协议。静电纺丝血管移植通常具有相对较小的孔隙, 限制细胞浸润到移植物中, 阻碍新动脉的再生和重塑。本研究采用改良的工艺制备了较厚纤维 (5-6 µm) 和较大孔隙 (~ 30 µm) 的 PCL 血管移植。采用大鼠腹主动脉模型植入法对移植物的远期表现进行评价。超声分析显示, 即使植入12月后, 移植物仍未发生动脉瘤或狭窄。大孔结构改善细胞肉芽, 从而促进组织再生3月。更重要的是, 没有出现不良重塑的迹象, 例如12月后移植壁内的钙化。因此, 经改良大孔处理的静电纺丝 PCL 血管移植可作为长期植入的动脉替代物。
Introduction
合成高分子的血管移植广泛应用于心血管疾病 (心血管病) 的临床治疗。不幸的是, 在小直径血管移植 (D < 6 毫米) 的情况下, 没有成功的产品, 由于低通畅触发的血液流速降低, 这往往导致血栓形成, 内膜增生, 和其他并发症1。
组织工程提供了一个替代策略, 以实现长期通畅和动态平衡的基础上的支架引导血管再生和重建。详细来说, 血管移植作为一个三维模板, 可以在血管组织再生过程中提供机械支持和结构指导, 并影响细胞功能, 包括细胞黏附、迁移、增殖和分泌细胞外基质2。到目前为止, 各种合成聚合物已被评价为应用于血管组织工程。在这些聚合物中, 聚 (己内酯) (PCL) 由于良好的细胞相容性和缓慢的降解, 从几个月到两年不等, 已被深入研究。用静电纺丝处理的大鼠主动脉模型4、5、6、PCL 血管移植表现出优良的结构完整性和通畅性, 并不断增加细胞侵袭和新生血管移植壁长达6月。然而, 不良组织重塑, 包括细胞的回归和毛细血管和钙化, 也被观察到更长的 timepoints, 长达18月。
Cellularization 血管移植是决定组织再生和重塑7的关键因素。静电纺丝作为一种多功能技术, 已广泛应用于纳米纤维结构8的血管移植的制备。不幸的是, 相对较小的孔隙结构往往导致细胞浸润不足的静电纺丝血管移植, 这限制了随后的组织再生。为了解决这一问题, 尝试了各种技术来提高孔径和整体孔隙率, 包括盐/聚合物浸出9,10, 集热器的修改, 激光辐照后处理11等。事实上, 静电纺丝的结构 (包括纤维直径、孔隙大小和孔隙度) 与加工条件12、13密切相关。在静电纺丝过程中, 通过改变聚合物溶液的浓度、流量、电压等参数, 可以很容易地控制纤维的直径. 14,15, 因此, 孔隙大小和孔隙度得到了相应的增强。
我们最近报告了一个改良的 PCL 静电纺丝移植与大孔结构 (纤维直径 5-7 µm 和毛孔 30-40 µm)。在活体移植中, 取代大鼠腹主动脉显示出高的通畅率, 以及良好的内皮化和平滑肌再生3月后手术16。更重要的是, 即使在植入一年后, 也不会有钙化和细胞回归等不良组织重塑。
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Protocol
实验动物的使用由南开大学动物实验伦理委员会批准, 并按照《实验室动物护理和使用指南》进行。
1. 静电纺丝 PCL 移植物的制备
注: 本文采用静电纺丝技术制备血管移植。
- 制备 25 wt% 和 10 wt% 的 pcl 溶液, 分别在甲醇和氯仿混合物中溶解 pcl (1:5 体积比), 室温 (RT) 为12小时。
- 将 PCL 溶液装入10毫升的玻璃注射器中。
- 把注射器放在21克的针头上。
- 将不锈钢芯轴 (直径2毫米, 长度25厘米) 放在收集仪器上。
- 对于较厚的纤维移植, 使用 25 wt% 的 PCL 溶液, 从针尖到收集器17厘米的工作距离, 8 毫升/小时的流量, 以及11伏的电压作为静电纺丝参数。对于薄纤维移植, 使用 10 wt% 的 PCL 溶液, 从针尖到收集器的工作距离为20厘米, 流速为2毫升/小时, 电压为18伏, 静电纺丝参数。
- 确保所获得的移植物被放置在真空过夜, 以消除残留溶剂。在手术前消毒所有器械, 并保持无菌技术。
- 植入前, 通过浸泡10毫升75% 乙醇30分钟, 然后在一夜之间将其暴露在紫外线照射下, 对移植物进行消毒。
- 纤维和孔径测量: 使用基于扫描电子显微镜 (SEM) 图像的 ImageJ 软件计算平均光纤直径。
- 脚手架机械试验:
- 用剃刀刀片将管状支架切成3毫米的长度段。用千分尺测量脚手架的厚度。
- 将管状脚手架放在拉力试验机上, 负载能力为 100 N。
- 夹紧支架与1毫米之间的钳位距离和拉纵向以10毫米/分钟的速度, 直到破裂。测量断裂时的抗拉强度和极限伸长率。从应力-应变曲线的初始线性区域 (最多5% 个应变) 计算杨氏模量。
2. 大鼠腹主动脉植入模型
注意: 手术中使用的所有材料和仪器都是无菌的。在手术过程中, 确保操作者佩戴纱布面罩和无菌手套以避免感染。确保室温保持在 27-30 摄氏度, 以保持动物体温。遵循当地的 IACUC 指南, 关于镇痛。
- 用雄性大大鼠重 240-270 克作为血管移植的接受者。确保大鼠在手术前禁食24小时。禁食大鼠24小时的目的是充分清空肠道内的粪便, 从而拓宽操作者的视野。
- 抓住大鼠的后颈, 把头向下, 将 springe 针插入下腹部的腹腔。用腹腔注射水合氯醛 (330 毫克/千克) 诱导大鼠麻醉。
- 确认足够的麻醉, 确保老鼠放松肌肉和稳定呼吸。将老鼠放在手术显微镜下仰卧位。
- 将凡士林眼科兽医软膏涂抹于眼部, 以防麻醉时干燥。使用血气生理盐水 (50 界面/毫升) 进行抗凝治疗 (100 ui/千克), 术前采用尾静脉注射。
- 用剃刀刀片刮掉前腹壁上的皮毛, 用碘溶液和医疗酒精溶液清洁皮肤。
- 用手术剪刀进行中线开腹切口, 确保切口长约 4-5 厘米, 然后暴露腹腔。
- 优先用含盐水的纱布缩回和包裹肠道。
- 仔细解剖腹主动脉。
- 使用9-0 单丝尼龙缝线识别和结扎所有小枝。
- 用两个血管钳夹住主动脉的隔离段 (长度可达1厘米)。主动脉可保持钳位20-30 分钟。
- 用微型剪刀将腹主动脉与两个夹在一起, 创建吻合点。
- 用血气盐水 (50 界面/毫升) 溶液冲洗主动脉的两端, 以去除残余血液。
- 用微剪刀剥掉膜。
- 吻合2毫米内径和1厘米长到大鼠腹主动脉的移植, 用9-0 单丝尼龙缝合线的八个缝合模式。
- 首先, 根据近侧9、3、12和6点位置的顺序构造四吻合口, 然后在两条缝线之间吻合4针的切口边缘。完成近端缝合后, 用同一方法缝合远端。
注: 每针都需要确保本机侧是轻微嵌入在嫁接。 - 取出远端钳, 让血液流入移植物, 然后取出近端钳。
- 按缝合末端以停止使用无菌棉球或小纱布海绵止血。按压大约3分钟, 直到止血。
- 把肠子放回腹腔。
- 用庆大霉素 (320 U/毫升) 温热生理盐水溶液冲洗腹腔。
- 用3-0 尼龙缝合在肌肉和皮肤层缝上腹壁, 分别。
- 把老鼠放进干净干燥的笼子里, 在笼子下面放一个暖气垫, 保持动物体温;然后等待老鼠从麻醉中恢复。注意动物, 直到它恢复了足够的意识来维持胸骨卧床。
- 在它恢复知觉之后, 把老鼠放进一个笼子里, 里面有食物和水。在伤口上涂上碘, 以防手术后感染。把老鼠送到其他动物的公司, 直到它完全恢复。
- 弄死大鼠根据机构指南在预定的时间点。
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Representative Results
对 PCL 移植术后3月和12月说明, 用标准组织学技术对苏木精和伊红 (H & E)、马尾松三色、Verhoeff Gieson (VVG)、冯科萨和α SMA 的免疫荧光染色进行分析,MYH, vWF 和弹力蛋白。组织学图像采用直立显微镜, 用fluorescence 显微镜拍摄免疫荧光图像。
所有数据均以平均值表示。用双尾配对学生的t检验来比较差异。p < 0.05 的值被认为具有统计学意义。
本研究成功地制备了一种结构优化的静电纺丝 PCL 移植, 即较粗的纤维和较大的孔隙。SEM 图像表明, 在改性的移植物中, 平均纤维直径几乎是8倍厚 (图 1A), 而不是传统 (图1B) (5.59 英寸 0.67 vs 0.69 英寸0.54 µm)。结果表明, 在较厚纤维中, 从4.66 µm 的薄纤维接枝到40.88 µm, 平均孔隙大小明显增加。横断面显示在管状移植物的壁内均匀纤维分布在更厚的纤维 (图 1D-F) 和稀薄的纤维小组 (图 1GI)。壁厚约为 400-500 µm。采用拉伸试验的特点, 研究了移植物的力学性能, 并给出了典型的应力-应变曲线, 如图 1C所示。两种移植物的力学性能在伸长率上明显不同。粗纤维移植的对应值比薄纤维移植物高约3倍, 表明增强韧性。
所制备的血管移植 (内径为2.0 毫米, 长度为1厘米) (图 2A) 被植入以取代本机腹主动脉部分 (图 2B)。在预定的时间点, 超声检查植入的移植物的通畅性。结果表明, 大多数移植物是专利 (图 2C)。此外, 在12月内, 移植物与相邻的原生血管的血流速度相似。说明移植保留良好的形态学没有动脉瘤 (图 2D), 并没有狭窄或血栓可以观察到腔内表面 (图 2E)。
组织再生和 ECM 分泌在3月进一步评估的组织学分析。H & E 染色表明, 在移植腔内形成一层新组织 (图 3G-H)。此外, vWF 染色表明, 腔内表面完全覆盖新形成的内皮 (图 3A), 类似于原生主动脉 (图 3B)。同时, 沿周向方向组织了几层 MYH 阳性细胞, 表明血管介质的再生 (图 3C-D)。用马尾松和 VVG 染色分别观察细胞外基质的合成。在移植物中可以观察到大量的胶原蛋白和纤维弹性蛋白 (图 3I-J, KL), 在血管再生和重塑中起着重要的作用。免疫荧光染色进一步表明, 弹性蛋白的结构是对圆周的模式, 如在本地动脉 (图 3E-F)。
此外, 再生组织, 包括内皮和平滑肌保持整合, 并没有倒退后12月的植入 (图 4A-C)。更重要的是, 没有出现钙化的迹象, 在移植壁的基础上科萨染色 (图 4D)。
图 1: PCL 嫁接的结构和力学性能.静电纺丝 PCL 垫的扫描电镜图像 (a) 和较薄纤维 (B)。厚纤维管状移植物 (d-F) 和薄纤维移植 (GI) 的剖面。典型应变-应力曲线显示在 (C) 中。这些数字已经从赵,等等。16请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 大鼠腹主动脉模型中血管移植的植入.静电纺丝 PCL 1 厘米血管移植 (A) 经手术介入大鼠腹主动脉 (B)。超声图像显示, 移植物在体内1 年 (C) 为专利。Stereomicroscopic 图像表明, 移植物与邻近的原生主动脉无动脉瘤 (D) 紧密结合, 腔内表面干净无血栓 (E)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 与原生主动脉相比, 说明移植3月后组织再生和电解沉积.对再生移植物 (A、 C、 E) 和本机动脉 (B、 D、 F) 的横断面图像进行 immunostained, 以检测内皮细胞、平滑肌细胞和弹性蛋白。h & E 染色显示说明移植 (G) 与原生主动脉 (h) 的组织再生。马尾松染色显示说明移植 (I) 和原生主动脉 (J) 中存在胶原蛋白。VVG 染色显示说明移植物 (K) 和原生主动脉 (L) 中弹性蛋白的存在。这些数字已经从赵,等等。16请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 说明移植12月的组织学分析.(A) H & E 染色显示说明移植中的组织再生。(B) vWF 抗体 immunostained 内皮细胞。(C) 用α SMA 抗体 immunostained 平滑肌。(D) 科萨染色评价钙化。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
细胞浸润对16体内血管移植的再生和重塑至关重要。有限细胞浸润通常与移植的相对较小的毛孔有关, 阻碍细胞向移植壁迁移。为了解决这一困难, 我们开发了一种改进的方法来制备静电纺丝 PCL 血管移植的大孔结构。详细地说, 孔隙大小随纤维厚度的增加而增大, 其加工参数可以很容易地控制。结果表明,在体外植入后, 宿主细胞很容易渗入到大孔移植的壁内, 细胞构成在手术后12月内仍处于相对较高的水平, 且无明显的细胞回归。
本机动脉主要由三层组成, 即内皮、膜介质和膜。内皮作为一种抗血栓的界面, 在维持血管的长期通畅性方面起着至关重要的作用。在我们的研究中, 对移植物的全内皮化观察了3月。另外, 由几层平滑肌细胞组成的膜介质在调节血管功能和提供适当的血管力学性能方面具有重要意义。研究表明, 厚纤维大孔径静电纺丝 PCL 能显著增强功能性膜的再生。此外, 再生平滑肌的结构与原生的膜介质相似。免疫荧光染色显示在弹性蛋白网络中分布的 MYH+细胞数层, 反映平滑肌细胞圆周的收缩表型。更重要的是, 再生组织 (无论是内皮和平滑肌) 保持完好, 即使在12月后, 由于 ECM 合成与降解之间的失衡, 也没有不良重塑。
钙化仍然是与心血管植入物有关的主要问题, 特别是在血管移植中。血管平滑肌细胞 (VSMCs) 失去原有的表型, 经历 osteochondrogenic 方向的反式分化, 导致血管钙化过程中异位矿化。我们的研究表明, 即使在植入12月后, 移植壁内也没有发生钙沉积。大孔血管移植中抑制钙化的主要原因有: (1) 宏观多孔接枝结构促进细胞与血液离子交换等代谢;(2) 嫁接结构的物理线索可以调节或抑制 VSMC 分化成成骨细胞1, (3) 大孔隙中良好的细胞浸润促进 ECM 的分泌, 抑制其降解, 从而引发钙化17, (4) 正常或功能性 VSMCs 有潜在的预防钙沉积18。
总之, 大鼠腹主动脉模型中多孔静电纺丝 PCL 血管移植的长期评价对可降解血管移植的潜在挑战提供了重要的启示, 这将指导以下研究。
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Disclosures
作者没有相互矛盾的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了自然科学基金项目 (81522023、81530059、91639113、81772000、81371699和 81401534) 的财政支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(ε-caprolactone) (PCL) pellets (Mn=80,000) | Sigma | 704067 | |
| Methanol | Tianjin Chemical Reagent Company | 1060 | |
| Alcohol | Tianjin Chemical Reagent Company | 1083 | |
| Chloroform | Tianjin Chemical Reagent Company | A1007 | |
| Sucrose | Tianjin Fengchuan Company | 2296 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| Sprague Dawley rats | Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences | ||
| Normal saline | Hebei Tiancheng Pharmaceutical company | ||
| Chloral hydrate | Tianjin Ruijinte chemical company | 2223 | |
| Heparin sodium Injection | Tianjin Biochem Pharmaceutical company | ||
| Gentamycin Sulfate Injection | Jiangsu Lianshui Pharmaceutical company | ||
| Mouse anti-α-SMA primary antibody | Abcam | ab7817 | |
| Mouse anti-smooth MYH primary antibody | Abcam | ab683 | |
| Rabbit polyclonal anti-rat elastin antibody | Abcam | ab23748 | |
| Rabbit anti-von Willebrand factor primary antibody | Abcam | ab6994 | |
| Goat anti-mouse IgG (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | ab150117 | |
| Goat anti-rabbit IgG (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | ab150077 | |
| 5% normal goat serum | Zhongshan Golden bridge | ZLI9022 | |
| Hematoxylin and eosin (H&E) | Beijing leagene biotech | DH0006 | |
| Masson's trichrome | Beijing leagene biotech | DC0032 | |
| Verhoeff-van Gieson (VVG) | Beijing leagene biotech | DC0059 | |
| Von Kossa | Beijing leagene biotech | DS0003 | |
| Surgical sutures needles with thread,3-0 silk | Shanghai Jinhuan medical supplies company | G3002b | |
| Surgical sutures needles with thread,9-0 silk | Shanghai Jinhuan medical supplies company | H901 |
References
- Coombs, K. E., Leonard, A. T., Rush, M. N., Santistevan, D. A., Hedberg-Dirk, E. L. Isolated effect of material stiffness on valvular interstitial cell differentiation. J Biomed Mater Res A. 105 (1), 51-61 (2017).
- Zhang, L., et al. A sandwich tubular scaffold derived from chitosan for blood vessel tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 77 (2), 277-284 (2006).
- Thottappillil, N., Nair, P. D. Scaffolds in vascular regeneration: current status. Vasc Health Risk Manag. 11, 79-91 (2015).
- Pektok, E., et al. Degradation and healing characteristics of small-diameter poly (e-caprolactone) vascular grafts in the rat systemic arterial circulation. Circulation. 118 (24), 2563-2570 (2008).
- Innocente, F., et al. Paclitaxel-eluting biodegradable synthetic vascular prostheses: a step towards reduction of neointima formation? Circulation. 120 (11 Suppl), S37-S45 (2009).
- de Valence, S., et al. Advantages of bilayered vascular grafts for surgical applicability and tissue regeneration. Acta Biomater. 8 (11), 3914-3920 (2012).
- Assmann, A., et al. Acceleration of autologous in vivo recellularization of decellularized aortic conduits by fibronectin surface coating. Biomaterials. 34 (25), 6015-6026 (2013).
- Hasan, A., et al. Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts. Acta Biomater. 10 (1), 11-25 (2014).
- Baker, B. M., et al. The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers. Biomaterials. 29 (15), 2348-2358 (2008).
- Wang, K., et al. Creation of macropores in electrospun silk fibroin scaffolds using sacrificial PEO-microparticles to enhance cellular infiltration. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (12), 3474-3481 (2013).
- Lee, B. L. P., et al. Femtosecond laser ablation enhances cell infiltration into three-dimensional electrospun scaffolds. Acta Biomaterialia. 8 (7), 2648-2658 (2012).
- Rnjak-Kovacina, J., Weiss, A. S. Increasing the pore size of electrospun scaffolds. Tissue Eng Part B Rev. 17 (5), 365-372 (2011).
- Zhong, S., Zhang, Y., Lim, C. T. Fabrication of large pores in electrospun nanofibrous scaffolds for cellular infiltration: a review. Tissue Eng Part B Rev. 18 (2), 77-87 (2012).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospun poly(epsilon-caprolactone) microfiber and multilayer nanofiber/microfiber scaffolds: characterization of scaffolds and measurement of cellular infiltration. Biomacromolecules. 7 (10), 2796-2805 (2006).
- Rnjak-Kovacina, J., et al. Tailoring the porosity and pore size of electrospun synthetic human elastin scaffolds for dermal tissue engineering. Biomaterials. 32 (28), 6729-6736 (2011).
- Wang, Z., et al. The effect of thick fibers and large pores of electrospun poly(epsilon-caprolactone) vascular grafts on macrophage polarization and arterial regeneration. Biomaterials. 35 (22), 5700-5710 (2014).
- Hutcheson, J. D., et al. Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques. Nat Mater. 15 (3), 335-343 (2016).
- Tara, S., et al. Well-organized neointima of large-pore poly(L-lactic acid) vascular graft coated with poly(L-lactic-co-epsilon-caprolactone) prevents calcific deposition compared to small-pore electrospun poly(L-lactic acid) graft in a mouse aortic implantation model. Atherosclerosis. 237 (2), 684-691 (2014).
