Summary
Aqui, apresentamos um método eletrofiação modificado para fabricar enxertos vasculares PCL com fibras grossas e poros dilatados e descrever um protocolo para avaliar o desempenho na vivo em um modelo do rato de substituição da aorta abdominal.
Abstract
Aqui, apresentamos um protocolo para fabricar se enxerto vascular de PCL e descrever um protocolo de avaliação, usando um modelo do rato de substituição da aorta abdominal. Os enxertos vasculares electrospun muitas vezes possuem relativamente pequenos poros, que limitam a infiltração de células os enxertos e dificultam a regeneração e remodelação das artérias-neo. Neste estudo, enxertos vasculares PCL com fibras mais grossas (5-6 µm) e poros maiores (~ 30 µm) foram fabricados usando uma técnica de processamento modificado. O desempenho a longo prazo do enxerto foi avaliado pela implantação de um modelo de aorta abdominal de ratos. Análise de ultrassom mostrou que os enxertos permaneceram patentes sem aneurisma ou estenose ocorrendo mesmo após 12 meses da implantação. Estrutura se melhorou o crescimento celular e assim promovido o tecido regenerado em 3 meses. Mais importante, não havia nenhum sinal de remodelação adversos, tais como calcificação na parede do enxerto após 12 meses. Portanto, enxertos vasculares de electrospun PCL com modificados se processamento têm potenciais para ser um substituto de artéria para implantação de longo prazo.
Introduction
Enxertos vasculares feitos de polímeros sintéticos são amplamente utilizados na clínica para o tratamento de doenças cardiovasculares (doenças cardiovasculares). Infelizmente, no caso de enxertos vasculares de pequeno diâmetro (D < 6mm) não há nenhuma produtos de sucesso disponíveis devido a baixa permeabilidade desencadeada pela velocidade do fluxo de sangue reduzido, que muitas vezes leva a trombose, hiperplasia da íntima e outros complicações1.
Engenharia de tecidos fornece uma estratégia alternativa para realizar a patência a longo prazo e homeostase baseado na reconstrução e regeneração vascular andaime-guiada. No detalhe, o enxerto vascular, como um modelo tridimensional, poderia fornecer suporte mecânico e orientação estrutural durante a regeneração do tecido vascular e influência funções celulares, incluindo a adesão celular, migração, proliferação, e secreção de matriz extracelular2. Até agora, vários polímeros sintéticos foram avaliados para aplicações em engenharia de tecido vascular. Entre estes polímeros, poly(ε-caprolactone) (PCL) tem sido intensamente pesquisada devido à célula boa compatibilidade e degradação lenta que variam de vários meses a dois anos3. Em um rato aorta modelo4,5,6, enxertos vasculares PCL, processados por eletrofiação exibiram excelente integridade estrutural e patência, invasão da célula, bem como continuamente aumentado e neovascularização na parede da prótese por até 6 meses. No entanto, remodela o tecido adverso, incluindo regressão de células e capilares e calcificação, também foram observados em momentos mais, acima de 18 meses.
Celularização da prótese vascular é um factor-chave determinando a regeneração do tecido e remodelando o7. Eletrofiação, como uma técnica versátil, tem sido amplamente empregada para a preparação de enxertos vasculares com estrutura fibrosa nano8. Infelizmente, a estrutura relativamente pequenos poros conduz frequentemente a infiltração de células insuficientes no enxerto vascular electrospun, que limita a regeneração do tecido subsequentes. Para resolver este problema, tem sido tentadas várias técnicas para aumentar o tamanho dos poros e porosidade total, incluindo o sal/polímero lixiviação9,10, modificação do aparelho coletor, pós-tratamento por radiação laser11 , etc. Na verdade, a estrutura dos enxertos de electrospun (incluindo o diâmetro da fibra, tamanho dos poros e porosidade) está intimamente relacionada com as condições de processamento de12,13. Durante eletrofiação, o diâmetro da fibra pode ser facilmente controlado alterando os parâmetros, tais como a concentração da solução de polímero, vazão, tensão, etc. 14 , 15, e portanto, o tamanho dos poros e porosidade foram aprimorados em conformidade.
Recentemente, informou um enxerto de electrospun PCL modificado com estrutura se (fibras com diâmetro de 5 a 7 µm e poros de 30-40 µm). Implantação in vivo , substituindo aorta abdominal de ratos mostrou alta taxa de patência, bem como a boa regeneração endotelização e músculo liso no pós-operatório de 3 meses16. Mais importante, não remodela o tecido adverso incluindo regressão calcificação e célula podia ser observada mesmo após um ano de implantação.
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Protocol
O uso de animais experimentais foi aprovado pela Animal experiências éticas Comitê de Nankai University e realizado em conformidade com o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório.
1. fabricação de enxertos Electrospun PCL
Nota: Neste documento, uma técnica de eletrofiação foi utilizada para fabricar os enxertos vasculares.
- Preparar soluções PCL de 25% em peso e 10% em peso, dissolvendo PCL em uma mistura de metanol e clorofórmio, respectivamente, (relação de volume de 1:5), à temperatura ambiente (RT) para 12 h.
- Carrega a solução PCL em uma seringa de vidro de 10 mL.
- Coloque a seringa com uma agulha 21-G.
- Coloca o mandril de aço inoxidável (2 mm de diâmetro, 25 cm de comprimento) sobre o instrumento de coleta.
- Para enxertos de fibra mais grossa, use a solução PCL de 25% em peso, a distância de trabalho de 17 cm da ponta da agulha para colecionador, taxa de fluxo de 8 mL/h e tensão de 11 kV como eletrofiação parâmetros. Para enxertos de diluente-fibra, use a solução PCL de 10% em peso, distância de trabalho de 20 cm da ponta da agulha para colecionador, uma taxa de fluxo de 2ml/h e a tensão de 18 kV como eletrofiação parâmetros.
- Certifique-se que os enxertos obtidos são colocados no vácuo durante a noite para remover o solvente residual. Esterilizar todos os instrumentos antes do procedimento e manter técnica asséptica durante todo.
- Antes da implantação, desinfecte os enxertos por imersão-los em 10 mL de etanol a 75% por 30 min e expô-los à luz UV durante a noite.
- Medições de tamanho da fibra e dos poros: calcular o diâmetro da fibra média usando software ImageJ baseado na digitalização de imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV).
- Teste mecânico de andaimes:
- Corte os andaimes tubulares em seções de 3 mm de comprimento, usando uma lâmina de barbear. Medir a espessura de andaimes usando um micrômetro.
- Coloque os andaimes tubulares em uma máquina de ensaio de tração com capacidade de carga de 100 N.
- Fixe os andaimes com uma distância de 1 mm grampo inter e puxar longitudinalmente a uma taxa de 10 mm/min até ruptura. Medir a resistência à tração e alongamento final na ruptura. Calcular o módulo de Young da região linear inicial (até 5% de tensão) da curva tensão-deformação.
2. modelo de implantação do rato Aorta Abdominal
Nota: Todos os materiais e instrumentos utilizados na cirurgia são estéreis. Durante a cirurgia, certifique-se que o operador usa uma máscara de gaze e luvas estéreis para evitar infecções. Assegure que a temperatura é mantida a 27-30 ° C para manter a temperatura do corpo animal. Siga orientações IACUC locais sobre analgesia.
- Use ratos Sprague Dawley masculinos pesando 240-270 g como destinatários da prótese vascular. Certifique-se do que rato tem jejuado 24 h antes da cirurgia. O objectivo dos ratos jejum por 24 h é vazio as fezes no trato intestinal suficientemente, assim, ampliam o horizonte do operador.
- Segure o pescoço costas do rato e mantenha sua cabeça para baixo, insira a agulha de springe na cavidade abdominal do abdômen inferior. Induzi o rato para anestesia com hidrato de cloral (330 mg/kg) por uma injeção intraperitoneal.
- Confirme anesthetization adequada, garantindo que o rato tem relaxado os músculos e respiração firme. Coloque o rato sob o microscópio de operação na posição supina.
- Aplica pomada de vaselina oftálmica veterinário sobre os olhos para evitar ressecamento enquanto sob anestesia. Administre a anticoagulação (100 UI/kg) com fisiológico heparinizado (50 UI/mL) por injeção de veia cauda antes da cirurgia.
- Raspar a pele na parede abdominal anterior usando uma lâmina de barbear e limpar a pele usando solução de iodo e de solução de álcool.
- Realizar uma incisão laparotomia com tesoura cirúrgica e certifique-se de que a incisão é cerca de 4-5 cm de comprimento e em seguida expor a cavidade abdominal.
- Retraia e enrole os intestinos com gaze umedecida com soro fisiológico, preferencialmente.
- A aorta abdominal disse cuidadosamente.
- Identificar e ligar todos os pequenos ramos usando suturas de nylon monofilamento 9-0.
- Fixar a seção isolada (até 1 cm de comprimento) da aorta usando duas pinças vasculares. A aorta pode permanecer preso por 20-30 min.
- Transecto a aorta abdominal entre duas pinças usando microtesoura para criar os sites anastomótica.
- Lave as duas extremidades da aorta com solução salina heparinizada (50 UI/mL) para remover o sangue residual.
- Descole a adventícia usando microtesoura.
- Anastomose do enxerto com diâmetro interno de 2 mm e 1 cm de comprimento para a aorta abdominal de ratos com um padrão de sutura em forma de oito usando suturas de nylon monofilamento 9-0.
- Em primeiro lugar, construir quatro anastomoses de acordo com a sequência de 3, 9, 12 e 06:00 posições no lado proximal e, em seguida, se anastomosam as bordas cortadas em 4 pontos entre duas suturas. Depois de terminar a sutura proximal, sutura do lado distal pelo mesmo método.
Nota: Cada ponto é necessário para garantir que o lado nativo ligeiramente é incorporado no enxerto. - Remova a braçadeira distal para permitir que o sangue flua do enxerto e, em seguida, remova a braçadeira proximal.
- Pressione as extremidades de sutura para parar o sangramento usando uma bola de algodão estéril ou uma pequena compressa de gaze. Pressione para cerca de 3 min, a hemostasia.
- Retorne os intestinos na cavidade abdominal.
- Lave a cavidade abdominal com soro fisiológico morno com gentamicina (320 U/mL).
- Cosa a parede abdominal usando uma sutura de Nylon 3-0 na camada de músculo e pele, respectivamente.
- Coloque o rato em uma gaiola limpa e seca e coloque uma almofada de aquecimento sob a gaiola para manter a temperatura do corpo animal; Então espere o rato para se recuperar da anestesia. Cuidar do animal até que ele recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal.
- Depois de recuperar a consciência, coloque o rato em uma única gaiola com comida e água. Aplica iodo na ferida para prevenir a infecção após a cirurgia. Retorne o rato para a companhia de outros animais até que ele se recupere totalmente.
- Eutanásia em ratos de acordo com as normas institucionais em pontos de tempo predeterminado.
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Representative Results
Os enxertos PCL foram explantados em 3 meses e 12 meses de pós-operatório e analisaram por técnicas histológicas padronizadas de hematoxilina e eosina (H & E), corante tricromo de Masson, Verhoeff-van Gieson (Wagner), Von Kossa e mancha para α-SMA, MYH, vWF e elastina. As imagens histológicas foram tiradas usando um microscópio na posição vertical, e as imagens de imunofluorescência foram tiradas usando um microscópio fluorescence.
Todos os dados foram expressos como média ± SD Um bicaudal pareado de Student t-teste foi utilizado para comparar as diferenças. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Enxertos PCL electrospun romance com estrutura otimizada, ou seja, fibras mais grossas e poros maiores, foram fabricados com sucesso neste estudo. SEM imagens demonstraram que o diâmetro da fibra média foi quase 8 vezes mais espesso nos enxertos modificados (figura 1A) do que no convencional um (figura 1B) (5,59 ± 0,67 contra 0,69 ± 0,54 µm). Como resultado, o tamanho dos poros em média foi marcadamente aumentada, de ~ 4.66 µm em diluente-fibra do enxerto ~ 40.88 µm na mais espessa-fibra um. Secções transversais mostraram distribuição homogênea da fibra dentro da parede de enxertos tubulares em fibra mais grossa (Figura 1–F) e grupos de fibra mais fina (Figura 1–eu). A espessura da parede era sobre 400-500 µm. As propriedades mecânicas dos enxertos foram caracterizadas por meio de testes de tração, e as curvas tensão-deformação típico foram mostradas na Figura 1. As propriedades mecânicas dos dois enxertos eram evidentemente diferentes em termos de alongamento. O valor correspondente de enxertos de fibra mais grossa era cerca de 3 vezes maior do que os enxertos de diluente-fibra, sugerindo a dureza realçada.
Os enxertos vasculares preparados (diâmetro interno de 2,0 mm) e comprimento de 1 cm (Figura 2A) foram implantadas para substituir um segmento da aorta abdominal nativo de rato (Figura 2B). Nos pontos de tempo predeterminado, a patência dos enxertos implantados foi examinada por ultra-som. Resultados mostraram que a maioria dos enxertos eram patentes (Figura 2). Além disso, a velocidade do fluxo de sangue foi semelhante entre o enxerto e o nativos sangue dos vasos sanguíneos em 12 meses. Enxertos explantados manteve boa morfologia sem aneurisma (Figura 2D), e sem estenose ou trombos podem ser observados na superfície luminal (Figura 2E).
Regeneração tecidual e secreção de ECM em 3 meses foram de novo avaliadas por análises de histologia. Coloração H & E mostrou que uma camada de tecido-neo foi formada no lúmen do enxerto (Figura 3-H). Além disso, vWF coloração mostram que a superfície luminal estava totalmente coberta por endotélio recém-formado (Figura 3A), assemelhando-se a isso da aorta nativa (Figura 3B). Enquanto isso, várias camadas de células MYH-positivo organizaram-se ao longo da direção circunferencial, indicando a regeneração da mídia vascular (Figura 3–D). Síntese de matriz extracelular foi observado por Masson e Wagner, coloração, respectivamente. Uma quantidade significativa de colágeno e elastina fibrosa pode ser observada dentro do enxerto (Figura 3I–,J, K–L), que desempenha um papel importante na regeneração vascular e remodelação. Mancha da imunofluorescência revelou ainda que a estrutura da elastina foi alinhada circunferencialmente em um padrão assim na artéria nativa (Figura 3E–F).
Além disso, os tecidos regenerados, incluindo o endotélio e músculo liso mantida integrada e não regredir após 12 meses de implantação (Figura 4A–C). Mais importante, não havia nenhum sinal de calcificação ocorre dentro da parede da prótese baseada o Von Kossa coloração (Figura 4).
Figura 1 : A estrutura e as propriedades mecânicas do enxerto PCL. Imagens SEM de electrospun PCL esteiras com fibras mais grossas (A) e fibras mais finas (B). Secções transversais de fibra mais grossa enxertos tubulares (D–F) e enxertos de diluente-fibra (G–eu). A curva de tensão-estresse representativa é mostrada em (C). Estes números foram modificados de Zhao, et al 16 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Implantação de enxertos vasculares em um modelo de aorta abdominal de ratos. Prótese vascular Electrospun PCL de 1 cm de comprimento (A) foi cirurgicamente interposta em aorta abdominal em ratos (B). A imagem do ultra-som mostrou que o enxerto foi patente na vivo em 1 ano (C). Stereomicroscopic imagens mostram que o enxerto foi bem integrado com aorta nativa adjacente sem aneurisma (D), e a superfície luminal está limpo e livre de trombo (E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Regeneração tecidual e deposição de ECM nos enxertos explantados aos 3 meses, em comparação com a aorta nativa. Imagens transversais dos enxertos regenerados (A, Ce E) e artéria nativa (B, De F) foram immunostained para detectar as células endoteliais, células de músculo liso e elastina. Coloração H & E mostra a regeneração de tecidos nos enxertos explantados (G) em comparação com a aorta nativa (H). Masson está manchando revelou que a presença de colágeno no explantados enxertos (eu) e aorta nativa (J). Wagner coloração mostrou a presença de elastina na explantados enxertos (K) e aorta nativa (L). Estes números foram modificados de Zhao, et al 16 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Análise histológica dos enxertos explantados aos 12 meses. (A) H & E mancha mostrou a regeneração de tecidos nos enxertos explantados. (B) o endotélio foi immunostained pelo vWF anticorpo. Músculo liso de (C) foi immunostained pelo anticorpo α-SMA. (D) calcificação foi avaliada por Von Kossa coloração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Infiltração de células é fundamental para a regeneração e remodelação do enxerto vascular na vivo16. Infiltração de célula limitada é muitas vezes relacionada com os poros relativamente pequenos do enxerto que dificultam a migração de células na parede da prótese. Para resolver esta dificuldade, desenvolvemos um método modificado para preparar enxertos vasculares de electrospun PCL com estrutura de poros grandes. No detalhe, o tamanho dos poros aumentou com o aumento da espessura da fibra, que pode ser facilmente controlado pelos parâmetros de processamento. Os resultados mostraram que as células hospedeiras poderiam facilmente infiltrar-se na parede deste enxerto se após implantação na vivo e a celularidade permaneceu a um nível relativamente elevado sem regressão de célula óbvio no pós-operatório de 12 meses.
Artéria nativa consiste principalmente de três camadas, ou seja, endotélio, túnica média e adventícia. Endotélio, como uma interface de antitrombogénico, desempenha um papel vital em manter a patência a longo prazo do vaso sanguíneo. Em nosso estudo, observou-se a endotelização completa no enxerto em 3 meses. Além disso, a túnica média consiste em várias camadas de células musculares lisas é muito importantes na regulamentação função do vaso sanguíneo e fornecendo propriedades mecânicas adequadas da artéria. O presente estudo revelou que a electrospun PCL enxertos com fibra grossa e grande pore marcadamente reforçada a regeneração de funcional da túnica média. Além disso, a estrutura do regenerada músculo liso é semelhante da mídia túnica nativo. Mancha da imunofluorescência mostrou várias camadas de células MYH+ distribuídas dentro da rede de elastina, refletindo o fenótipo contrátil das células musculares lisas circunferencialmente. Mais importante ainda, regenerado tecidos (endotélio e músculo liso) mantidos intactos e não havia nenhuma remodelação adversas mesmo após 12 meses devido o desequilíbrio entre a síntese de ECM e degradação.
Calcificação é ainda um grande problema associado com implantes cardiovasculares, especialmente no enxerto vascular. Células de músculo liso vascular (VSMCs) perdem seu fenótipo original e experimentam trans-diferenciação da direção osteochondrogenic, levando a gravidez ectópica mineralização durante o processo de calcificação vascular. Nosso estudo mostrou que não havia nenhuma deposição de cálcio ocorrendo dentro da parede da prótese, mesmo após 12 meses da implantação. As principais razões para a calcificação inibida no macro porosa enxerto vascular incluem: (1) a estrutura do enxerto macro porosa promove o metabolismo, tais como a troca iônica entre as células e o sangue; (2) as pistas físicas da estrutura de enxerto poderiam regular ou inibir a diferenciação do 2R no osteoblasto1, (3) infiltração celular bom nos poros grandes promove a secreção de ECM e inibe sua degradação que acionará calcificação de17e (4) VSMCs normais ou funcionais tem um potencial para impedir a deposição de cálcio18.
Em resumo, a avaliação a longo prazo dos enxertos vasculares de macro porosa electrospun PCL no modelo do rato de aorta abdominal fornece dicas importantes para possíveis desafios de enxertos vasculares degradáveis, que irão direcionar a pesquisa a seguir.
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Disclosures
Os autores têm sem conflitos de interesses financeiros.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado financeiramente por projetos NSFC (81522023, 81530059, 91639113, 81772000, 81371699 e 81401534).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(ε-caprolactone) (PCL) pellets (Mn=80,000) | Sigma | 704067 | |
| Methanol | Tianjin Chemical Reagent Company | 1060 | |
| Alcohol | Tianjin Chemical Reagent Company | 1083 | |
| Chloroform | Tianjin Chemical Reagent Company | A1007 | |
| Sucrose | Tianjin Fengchuan Company | 2296 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| Sprague Dawley rats | Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences | ||
| Normal saline | Hebei Tiancheng Pharmaceutical company | ||
| Chloral hydrate | Tianjin Ruijinte chemical company | 2223 | |
| Heparin sodium Injection | Tianjin Biochem Pharmaceutical company | ||
| Gentamycin Sulfate Injection | Jiangsu Lianshui Pharmaceutical company | ||
| Mouse anti-α-SMA primary antibody | Abcam | ab7817 | |
| Mouse anti-smooth MYH primary antibody | Abcam | ab683 | |
| Rabbit polyclonal anti-rat elastin antibody | Abcam | ab23748 | |
| Rabbit anti-von Willebrand factor primary antibody | Abcam | ab6994 | |
| Goat anti-mouse IgG (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | ab150117 | |
| Goat anti-rabbit IgG (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | ab150077 | |
| 5% normal goat serum | Zhongshan Golden bridge | ZLI9022 | |
| Hematoxylin and eosin (H&E) | Beijing leagene biotech | DH0006 | |
| Masson's trichrome | Beijing leagene biotech | DC0032 | |
| Verhoeff-van Gieson (VVG) | Beijing leagene biotech | DC0059 | |
| Von Kossa | Beijing leagene biotech | DS0003 | |
| Surgical sutures needles with thread,3-0 silk | Shanghai Jinhuan medical supplies company | G3002b | |
| Surgical sutures needles with thread,9-0 silk | Shanghai Jinhuan medical supplies company | H901 |
References
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