Summary
यहां, हम एक संशोधित electrospinning विधि प्रस्तुत करने के लिए है और मोटी फाइबर और बड़े pores के साथ PCL संवहनी भ्रष्टाचार, और एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए एक चूहा मॉडल में vivo प्रदर्शन में मूल्यांकन उदर महाधमनी प्रतिस्थापन ।
Abstract
यहां, हम एक प्रोटोकॉल वर्तमान macroporous PCL संवहनी भ्रष्टाचार बनाना और उदर महाधमनी प्रतिस्थापन के एक चूहे मॉडल का उपयोग करके एक मूल्यांकन प्रोटोकॉल का वर्णन । electrospun संवहनी भ्रष्टाचार अक्सर अपेक्षाकृत छोटे pores के अधिकारी, जो भ्रष्टाचार में सेल घुसपैठ की सीमा और पुनर्जनन और नव धमनियों के पुनर्मॉडलिंग में बाधा । इस अध्ययन में, PCL संवहनी भ्रष्टाचार मोटा फाइबर (5-6 µm) और बड़ा pores (~ 30 µm) के साथ एक संशोधित प्रसंस्करण तकनीक का उपयोग करके गढ़े थे । भ्रष्टाचार के दीर्घकालिक प्रदर्शन एक चूहे उदर महाधमनी मॉडल में आरोपण द्वारा मूल्यांकन किया गया था । अल्ट्रासाउंड विश्लेषण से पता चला कि भ्रष्टाचार धमनीविस्फार या एक प्रकार का रोग प्रत्यारोपण के 12 महीने के बाद भी होने वाली बिना पेटेंट बने रहे । Macroporous संरचना सेल के विकास में सुधार और इस तरह पदोंनत ऊतक 3 महीने में पुनर्जीवित । इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि इस तरह के 12 महीनों के बाद भ्रष्टाचार की दीवार के भीतर पत्थराना के रूप में प्रतिकूल पुनर्मॉडलिंग का कोई संकेत नहीं था । इसलिए, electrospun PCL नाड़ी भ्रष्टाचार संशोधित macroporous प्रसंस्करण के साथ लंबे समय तक आरोपण के लिए एक धमनी विकल्प होने की क्षमता पकड़ ।
Introduction
संवहनी भ्रष्टाचार सिंथेटिक पॉलिमर से बने हृदय रोगों (सीवीडी) की चिकित्सा के लिए व्यापक रूप से क्लिनिक में उपयोग किया जाता है । दुर्भाग्य से, छोटे व्यास संवहनी भ्रष्टाचार के मामले में (D < 6 mm) कोई सफल उत्पादों को कम रक्त प्रवाह वेग है, जो अक्सर घनास्त्रता, intimal हाइपरप्लासिया की ओर जाता है, और अन्य द्वारा ट्रिगर प्रत्यक्षता के कारण उपलब्ध हैं जटिलताओं1.
टिशू इंजीनियरिंग लंबी अवधि के प्रत्यक्षता और homeostasis एक पाड़ निर्देशित नाड़ी पुनर्जनन और पुनर्निर्माण के आधार पर एहसास करने के लिए एक वैकल्पिक रणनीति प्रदान करता है । विस्तार में, संवहनी भ्रष्टाचार, एक तीन आयामी टेम्पलेट के रूप में, संवहनी ऊतक के उत्थान के दौरान यांत्रिक समर्थन और संरचनात्मक मार्गदर्शन प्रदान कर सकता है और सेलुलर कार्यों को प्रभावित, सेल आसंजन सहित, प्रवास, प्रसार, और extracellular-मैट्रिक्स2का स्राव । अब तक, विभिंन सिंथेटिक पॉलिमर संवहनी ऊतक इंजीनियरिंग में अनुप्रयोगों के लिए मूल्यांकन किया गया है । इन पॉलिमर के अलावा पॉली (ε-caprolactone) (PCL) में कई महीनों से लेकर दो साल3तक अच्छी सेल अनुकूलता और धीमी गिरावट के कारण गहन जांच की गई है । एक चूहा महाधमनी मॉडल में4,5,6, PCL संवहनी electrospinning द्वारा संसाधित भ्रष्टाचार उत्कृष्ट संरचनात्मक अखंडता और प्रत्यक्षता प्रदर्शन किया, साथ ही साथ लगातार सेल आक्रमण और neovascularization में वृद्धि 6 महीने तक के लिए भ्रष्टाचार की दीवार । हालांकि, कोशिकाओं और केशिकाओं और पत्थराना के प्रतिगमन सहित प्रतिकूल ऊतक remodeling, भी अब timepoints पर मनाया गया, अप करने के लिए 18 महीने ।
संवहनी भ्रष्टाचार के Cellularization ऊतक पुनर्जनन और7को फिर से ढालना का निर्धारण एक महत्वपूर्ण कारक है । Electrospinning, एक बहुमुखी तकनीक के रूप में, व्यापक रूप से नैनो-रेशेदार संरचना8के साथ संवहनी भ्रष्टाचार की तैयारी के लिए नियोजित किया गया है । दुर्भाग्य से, अपेक्षाकृत छोटे ताकना संरचना अक्सर electrospun संवहनी भ्रष्टाचार, जो बाद में ऊतक पुनर्जनन सीमा में अपर्याप्त कोशिका घुसपैठ की ओर जाता है । इस समस्या को हल करने के लिए, विभिन्न तकनीकों को ताकना आकार और समग्र porosity को बढ़ाने के लिए प्रयास किया गया है, नमक सहित9,10, कलेक्टर उपकरण के संशोधन, लेजर विकिरण द्वारा उपचार के बाद11 , आदि। वास्तव में, electrospun भ्रष्टाचार की संरचना (फाइबर व्यास, ताकना आकार सहित, और porosity) बारीकी से प्रसंस्करण शर्तों12,13से संबंधित है । electrospinning के दौरान, फाइबर व्यास आसानी से इस तरह के बहुलक समाधान, प्रवाह दर, वोल्टेज, आदिकी एकाग्रता के रूप में मापदंडों को बदलने के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है । 14 , 15, और इसलिए, ताकना आकार और porosity के अनुसार बढ़ाया गया है ।
हम हाल ही में macroporous संरचना के साथ एक संशोधित PCL electrospun भ्रष्टाचार की रिपोर्ट (5-7 µm के व्यास के साथ फाइबर और 30-40 µm के pores) । में चूहा उदर महाधमनी की जगह से vivo आरोपण में प्रत्यक्षता की उच्च दर, के रूप में अच्छी तरह के रूप में अच्छी endothelialization और चिकनी मांसपेशी पुनर्जनन 3 महीने के बाद सर्जरी16में दिखाया । इससे भी महत्वपूर्ण बात, पत्थराना और कोशिका हीनता सहित कोई प्रतिकूल ऊतक remodeling के आरोपण के एक वर्ष के बाद देखा जा सकता है ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
प्रायोगिक पशुओं के उपयोग ननकाि विश्वविद्यालय के पशु प्रयोगों एथिकल कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया था और देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए गाइड के साथ अनुरूप में किए गए.
1. Electrospun PCL भ्रष्टाचारियों का निर्माण
नोट: इस के साथ साथ, एक electrospinning तकनीक संवहनी भ्रष्टाचार निर्माण करने के लिए उपयोग किया गया था ।
- 25 wt% और 10 wt% के pcl समाधान तैयार, मेथनॉल और क्लोरोफॉर्म के एक मिश्रण में pcl भंग करके, क्रमशः, (1:5 volume अनुपात), कमरे के तापमान पर (RT) 12 घंटे के लिए ।
- एक 10-एमएल ग्लास सिरिंज में PCL समाधान लोड ।
- एक 21-जी सुई के साथ सिरिंज प्लेस ।
- संग्रह साधन पर स्टेनलेस स्टील खराद का धुरा (व्यास में 2 मिमी, लंबाई में 25 सेमी) रखें ।
- मोटा-फाइबर भ्रष्टाचार के लिए, 25 wt% के PCL समाधान का उपयोग करें, सुई टिप से कलेक्टर के लिए 17 सेमी की दूरी काम, 8 मिलीलीटर की दर/एच, और 11 केवी की वोल्टेज electrospinning मापदंडों के रूप में । पतले फाइबर भ्रष्टाचारियों के लिए, 10 wt% के PCL समाधान का उपयोग करें, सुई टिप से कलेक्टर के लिए 20 सेमी की दूरी काम, 2 मिलीलीटर की एक प्रवाह दर/एच, और electrospinning मापदंडों के रूप में 18 केवी की वोल्टेज ।
- सुनिश्चित करें कि प्राप्त भ्रष्टाचार वैक्यूम में रातोंरात रखा जाता है अवशिष्ट विलायक हटाने । प्रक्रिया से पहले सभी उपकरणों को निष्फल और भर अपूतित तकनीक को बनाए रखने.
- आरोपण से पहले, उंहें 30 मिनट के लिए ७५% इथेनॉल के 10 मिलीलीटर में डुबो और फिर उंहें यूवी प्रकाश को रात भर उजागर द्वारा भ्रष्टाचारियों को संक्रमित ।
- फाइबर और ताकना आकार माप: ImageJ सॉफ्टवेयर स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) छवियों पर आधारित का उपयोग औसत फाइबर व्यास की गणना ।
- पाड़ों के यांत्रिक परीक्षण:
- एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर लंबाई में 3 मिमी वर्गों में ट्यूबलर मचानों में कटौती । एक माइक्रोमीटर का उपयोग कर पाड़ की मोटाई को मापने ।
- १०० N की एक लोड क्षमता के साथ एक तन्यता परीक्षण मशीन पर ट्यूबलर पाड़ों प्लेस ।
- एक 1 मिमी इंटर दबाना दूरी के साथ पाड़ों दबाना और 10 मिमी की दर से longitudinally पुल/ तोड़ने में तंयता ताकत और अंतिम बढ़ाव उपाय । प्रारंभिक रैखिक क्षेत्र से युवा के मापांक की गणना (अप करने के लिए 5% तनाव) के दबाव की वक्र ।
2. चूहा उदर महाधमनी आरोपण मॉडल
नोट: सभी सामग्री और उपकरणों के शल्य चिकित्सा में इस्तेमाल बाँझ हैं । सर्जरी के दौरान, सुनिश्चित करें कि ऑपरेटर एक धुंध मुखौटा पहनता है और संक्रमण से बचने के लिए बाँझ दस्ताने । पशु शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए कमरे के तापमान 27-30 डिग्री सेल्सियस पर रखा है सुनिश्चित करें । analgesia के संबंध में स्थानीय IACUC दिशानिर्देशों का पालन करें ।
- संवहनी भ्रष्टाचार के प्राप्तकर्ताओं के रूप में २४०-२७० जी वजनी पुरुष Sprague Dawley चूहों का प्रयोग करें । सुनिश्चित करें कि चूहे ने सर्जरी से पहले 24 घंटे का उपवास किया है । 24 घंटे के लिए चूहों उपवास का उद्देश्य आंतों पथ में मल खाली करने के लिए पर्याप्त है, जिससे ऑपरेटर के क्षितिज व्यापक है ।
- चूहे की पीठ की गर्दन को पकड़ें और उसके सिर को नीचे की और रखें, पेट के निचले हिस्से के उदर गुहा में स्प्रिंग सुई डालें । एक intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा chloral हाइड्रेट (३३० मिलीग्राम/) के साथ संज्ञाहरण के लिए चूहे प्रेरित ।
- यह सुनिश्चित करके पर्याप्त anesthetization की पुष्टि करें कि चूहे की मांसपेशियों और स्थिर सांस लेने में आराम है । ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप के नीचे एक लापरवाह स्थिति में चूहे प्लेस ।
- जबकि संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर वेसिलीन नेत्र पशु चिकित्सक मरहम लागू करें । heparinized शारीरिक खारा समाधान (५० ui/एमएल) के साथ एंटिकोगुलेशन (१०० ui/kg) सर्जरी से पहले पूंछ नस इंजेक्शन द्वारा प्रशासन ।
- पूर्वकाल पेट की दीवार में बंद फर दाढ़ी एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग, और आयोडीन समाधान और चिकित्सा शराब समाधान का उपयोग कर त्वचा को साफ ।
- शल्य कैंची के साथ एक midline laparotomy चीरा प्रदर्शन और चीरा के बारे में 4-5 सेमी लंबी है कि यह सुनिश्चित करने, और फिर उदर गुहा बेनकाब.
- वापस लेना और धुंध के साथ आंतों लपेटो खारा समाधान तरजीही के साथ गीला ।
- उदर महाधमनी जतन काटना ।
- 9-0 monofilament नायलॉन टांकों का उपयोग करके सभी छोटी शाखाओं को पहचानें और ligate ।
- दो संवहनी clamps का उपयोग कर महाधमनी की (लंबाई में 1 सेमी) अलग अनुभाग दबाना । महाधमनी 20-30 मिनट के लिए clamped रह सकते हैं ।
- Transect को anastomotic साइट्स बनाने के लिए माइक्रो-कैंची का प्रयोग करते हुए दो क्लैंप के बीच उदर महाधमनी ।
- अवशिष्ट रक्त निकालने के लिए समाधान heparinized खारा (५० यूआई/एमएल) का उपयोग कर महाधमनी के दो सिरों फ्लश ।
- माइक्रो-कैंची का उपयोग कर adventitia को छील लें ।
- Anastomose 2 मिमी भीतरी व्यास और 1 सेमी लंबाई में एक आंकड़ा-आठ टांका 9-0 monofilament नायलॉन टांके का उपयोग कर पैटर्न के साथ चूहे के उदर महाधमनी के साथ भ्रष्टाचार ।
- सबसे पहले, समीपस्थ ओर में 9, 3, 12, और 6 बजे की स्थिति के अनुक्रम के अनुसार चार anastomoses का निर्माण, तो दो टांके के बीच 4 टांके में कट किनारों anastomose । समीपस्थ टांका परिष्करण के बाद, एक ही विधि द्वारा बाहर की ओर टांका ।
नोट: हर सिलाई के लिए देशी पक्ष को सुनिश्चित करने की आवश्यकता है थोड़ा भ्रष्टाचार में एंबेडेड है । - रक्त भ्रष्टाचार में प्रवाह करने के लिए अनुमति देने के लिए बाहर की क्लैंप निकालें, तो समीपस्थ क्लैंप निकालें ।
- प्रेस टांका एक बाँझ कपास गेंद या एक छोटे से धुंध स्पंज का उपयोग कर रक्तस्राव को रोकने के लिए समाप्त होता है । के बारे में 3 मिनट के लिए प्रेस, रक्तस्तम्भन जब तक ।
- उदर गुहा में आंतों वापस ।
- gentamicin (३२० यू/एमएल) के साथ गर्म शारीरिक खारा समाधान का उपयोग उदर गुहा फ्लश ।
- पेट की दीवार ऊपर सीना मांसपेशी और त्वचा की परत में एक 3-0 नायलॉन सीवन का उपयोग, क्रमशः ।
- एक साफ और शुष्क पिंजरे में चूहे प्लेस और पशु शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए पिंजरे के नीचे एक हीटिंग पैड डाल; फिर संज्ञाहरण से उबरने के लिए चूहे का इंतजार । पशु को भाग लेने के लिए जब तक यह पर्याप्त चेतना को प्राप्त कर लिया है स्टर्नल recumbency बनाए रखने के लिए ।
- इसके बाद चेतना लौटी, एक पिंजरे में चूहे को भोजन और पानी के साथ डाल दिया. घाव पर आयोडीन लागू सर्जरी के बाद संक्रमण को रोकने के लिए । अंय जानवरों की कंपनी को चूहे वापस जब तक यह पूरी तरह से ठीक हो ।
- पूर्व निर्धारित समय बिंदुओं पर संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार चूहों Euthanize.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PCL भ्रष्टाचारियों 3 महीने और 12 महीने के बाद में explanted थे और hematoxylin और eosin के लिए मानक ऊतकवैज्ञानिक तकनीकों (एच एंड ई), Masson trichrome, Verhoeff-वान Gieson (VVG), वॉन Kossa, और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला α-SMA के लिए द्वारा विश्लेषण, MYH, vWF, और elastin । ऊतकवैज्ञानिक छवियों एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग कर लिया गया है, और इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों एक fluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर लिया गया.
सभी डेटा अर्थ ± एसडी के रूप में व्यक्त किया गया । दो पूंछ वाली जोड़ी छात्र के टी-टेस्ट में अंतर की तुलना में इस्तेमाल की गई । p < 0.05 का मान सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना गया था ।
उपंयास electrospun PCL अनुकूलित संरचना के साथ भ्रष्टाचार, कि है, मोटा फाइबर और बड़ा pores, सफलतापूर्वक इस अध्ययन में गढ़े थे । SEM छवियों का प्रदर्शन किया है कि औसत फाइबर व्यास लगभग 8 बार संशोधित भ्रष्टाचार में मोटा था (चित्र 1a) पारंपरिक एक (आंकड़ा 1b) (५.५९ ± ०.६७ बनाम ०.६९ ± ०.५४ µm) की तुलना में । एक परिणाम के रूप में, औसत ताकना आकार स्पष्ट रूप से बढ़ गया था, से ~ ४.६६ µm पतले में फाइबर भ्रष्टाचार ~ करने के लिए ~ ४०.८८ µm में मोटा-फाइबर एक । पार वर्गों दोनों मोटा-फाइबर (चित्रा 1 डी-एफ) और पतले फाइबर समूहों (चित्रा 1G-मैं) में ट्यूबलर भ्रष्टाचार की दीवार के भीतर सजातीय फाइबर वितरण दिखाया । दीवार की मोटाई के बारे में ४००-५०० µm था । भ्रष्टाचारियों के यांत्रिक गुणों तन्यता परीक्षण द्वारा विशेषता थे, और ठेठ तनाव दबाव घटता चित्रा 1Cमें दिखाए गए थे । दो भ्रष्टाचारियों के यांत्रिक गुणों में बढ़ाव के मामले में स्पष्ट रूप से अलग थे । मोटा फाइबर भ्रष्टाचार के इसी मूल्य के बारे में था 3 गुना से अधिक पतले फाइबर भ्रष्टाचारियों, बढ़ाया मुश्किल का सुझाव.
तैयार संवहनी भ्रष्टाचार (२.० मिमी और 1 सेमी की लंबाई के भीतरी व्यास) (चित्रा 2a) को चूहे में देशी उदर महाधमनी के एक खंड (चित्रा 2 बी) की जगह प्रत्यारोपित किया गया । पूर्व निर्धारित समय बिंदुओं पर प्रत्यक्षता में प्रत्यारोपित कर अल्ट्रासाउंड की जांच की गई । परिणामों से पता चला कि अधिकांश भ्रष्टाचारियों का पेटेंट (फिगर 2c) था. इसके अलावा, रक्त के प्रवाह का वेग भ्रष्टाचार और 12 महीने में आसंन देशी रक्त वाहिकाओं के बीच समान था । Explanted भ्रष्टाचार धमनीविस्फार (चित्रा 2d) के बिना अच्छा आकृति विज्ञान बनाए रखा, और कोई भी प्रकार का रोग या थ्रोम्बी चमकदार सतह (चित्रा 2E) पर देखा जा सकता है ।
ऊतक पुनर्जनन और 3 महीने में ECM स्राव आगे प्रोटोकॉल विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन किया गया । एच एंड ई धुंधला दिखाया है कि नव ऊतक की एक परत भ्रष्टाचार के लुमेन पर गठित किया गया था (चित्रा 3 जी-एच) । इसके अलावा, vWF धुंधला दिखाना है कि चमकदार सतह पूरी तरह से नव गठित endothelium (आंकड़ा 3ए) द्वारा कवर किया गया था, जैसी कि देशी महाधमनी की (चित्र बी) । इस बीच MYH की कई परतें-सकारात्मक कोशिकाओं circumferential दिशा के साथ आयोजित किया गया, संवहनी मीडिया के उत्थान का संकेत (3 सी आंकड़ाडी) । Extracellular मैट्रिक्स संश्लेषण Masson और VVG धुंधला, क्रमशः द्वारा मनाया गया था । कोलेजन और रेशेदार elastin का एक महत्वपूर्ण राशि भ्रष्टाचार के भीतर देखा जा सकता है (चित्रा 3I-जंमू, कश्मीर-एल), जो संवहनी पुनर्जनन और remodeling में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला आगे elastin की संरचना में दिखाया गया है कि देशी धमनी (चित्रा 3E-एफ) में जैसे एक पैटर्न में circumferentially गठबंधन था ।
इसके अलावा, endothelium और चिकनी मांसपेशी सहित पुनर्जीवित ऊतकों एकीकृत बनाए रखा है और निकासी के 12 महीने के बाद आरोपण (आंकड़ा 4a-सी) नहीं किया । इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि भ्रष्टाचार की दीवार के भीतर होने वाले पत्थराना का कोई संकेत नहीं था वॉन Kossa धुंधला (चित्रा 4d) के आधार पर ।
चित्रा 1 : संरचना और PCL भ्रष्टाचार की यांत्रिक संपत्ति । electrospun PCL मैट के SEM छवियां मोटा फाइबर (ए) और पतले फाइबर (बी) के साथ । मोटा-फाइबर ट्यूबलर भ्रष्टाचार के पार वर्गों (डीएफ) और पतले फाइबर भ्रष्टाचारियों (जी-I). प्रतिनिधि दबाव तनाव वक्र (सी) में दिखाया गया है । ये आंकड़े Zhao, एट अल से संशोधित किए गए हैं । 16 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 : एक चूहा उदर महाधमनी मॉडल में संवहनी भ्रष्टाचार के आरोपण । Electrospun PCL संवहनी भ्रष्टाचार की लंबाई में 1 सेमी (एक) शल्य चिकित्सा चूहा (ख) में उदर महाधमनी में लगाया गया था । अल्ट्रासाउंड इमेज से पता चला कि भ्रष्टाचारी ने 1 साल (सी) में वीवो में पेटेंट कराया था । Stereomicroscopic छवियां बताते है कि भ्रष्टाचार धमनीविस्फार (डी) के बिना आसंन देशी महाधमनी के साथ अच्छी तरह से एकीकृत किया गया था, और चमकदार सतह साफ और थक्का (ई) से मुक्त है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 : ऊतक पुनर्जनन और ECM का जमाव explanted में 3 महीने में देशी महाधमनी के साथ तुलना में भ्रष्टाचार । पुनर्जीवित भ्रष्टाचार के पार अनुभागीय छवियों (ए, सी, और ई) और देशी धमनी (बी, डी, और एफ) endothelial कोशिकाओं का पता लगाने के लिए immunostained थे, चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं, और elastin. एच एंड ई धुंधला explanted भ्रष्टाचार (जी) में ऊतक पुनर्जनन देशी महाधमनी (एच) की तुलना में पता चलता है । है Masson धुंधला से पता चला कि explanted भ्रष्टाचार में कोलेजन की उपस्थिति (मैं) और देशी महाधमनी (जे) । VVG धुंधला explanted भ्रष्टाचार (कश्मीर) और देशी महाधमनी (एल) में elastin की उपस्थिति दिखाई । ये आंकड़े Zhao, एट अल से संशोधित किए गए हैं । 16 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 : 12 महीने में explanted भ्रष्टाचारियों के ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण । (क) एच और ई धुंधला explanted भ्रष्टाचार में ऊतक पुनर्जनन दिखाया । (ख) Endothelium को vWF एंटीबॉडी द्वारा immunostained गया था । (ग) चिकनी पेशियों को α-SMA एंटीबॉडी द्वारा immunostained गया था. (घ) वॉन Kossa धुंधलान द्वारा पत्थराना का मूल्यांकन किया गया. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
सेल घुसपैठ के उत्थान और vivo16में संवहनी भ्रष्टाचार के पुनर्मॉडलिंग के लिए महत्वपूर्ण है । सीमित सेल घुसपैठ अक्सर भ्रष्टाचार के अपेक्षाकृत छोटे pores कि भ्रष्टाचार की दीवार में कोशिकाओं के प्रवास में बाधा से संबंधित है । इस कठिनाई का पता करने के लिए, हम बड़े-ताकना संरचना के साथ electrospun PCL नाड़ी भ्रष्टाचार तैयार करने के लिए एक संशोधित विधि विकसित की है । विस्तार में, ताकना आकार फाइबर मोटाई है कि आसानी से प्रसंस्करण मापदंडों द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है की वृद्धि के साथ वृद्धि हुई है । परिणाम से पता चला कि मेजबान कोशिकाओं को आसानी से इस macroporous भ्रष्टाचार की दीवार में vivo आरोपण के बाद घुसपैठ और सेलुलर स्पष्ट सेल प्रतिगमन के बिना एक अपेक्षाकृत उच्च स्तर पर 12 महीने के बाद सर्जरी में बने रहे ।
देशी धमनी मुख्य रूप से तीन परतों के होते हैं, कि है, endothelium, tunica मीडिया, और adventitia । Endothelium, एक विरोधी thrombogenic इंटरफेस के रूप में, रक्त वाहिनियों के दीर्घकालिक प्रत्यक्षता को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । हमारे अध्ययन में, भ्रष्टाचार पर पूर्ण endothelialization 3 महीने में मनाया गया । इसके अलावा, tunica चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं के कई परतों से मिलकर मीडिया रक्त वाहिका समारोह को विनियमित करने और धमनी के उपयुक्त यांत्रिक गुणों प्रदान करने में बहुत महत्वपूर्ण हैं । वर्तमान अध्ययन से पता चला है कि मोटी फाइबर और बड़े ताकना के साथ electrospun PCL भ्रष्टाचार स्पष्ट रूप से कार्यात्मक tunica मीडिया के पुनर्जनन बढ़ाया । इसके अलावा, पुनर्जीवित चिकनी मांसपेशी की संरचना है कि देशी tunica मीडिया के समान है । इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला MYH के कई परतों दिखाया+ elastin नेटवर्क के भीतर वितरित कोशिकाओं, चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं phenotype के सिकुड़ा circumferentially को दर्शाती है । इससे भी महत्वपूर्ण बात, पुनर्जीवित ऊतकों (दोनों endothelium और चिकनी मांसपेशी) बरकरार रखा है और यहां तक कि 12 ECM संश्लेषण और क्षरण के बीच असंतुलन के कारण महीने के बाद कोई प्रतिकूल remodeling था ।
पत्थराना अभी भी एक प्रमुख हृदय प्रत्यारोपण के साथ जुड़े समस्या है, विशेष रूप से संवहनी भ्रष्टाचार में । संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (VSMCs) संवहनी mineralization की प्रक्रिया के दौरान अस्थानिक पत्थराना के लिए अग्रणी, osteochondrogenic दिशा की ओर अपने मूल phenotype और अनुभव ट्रांस भेदभाव खो देते हैं । हमारे अध्ययन से पता चला है कि वहां कोई कैल्शियम आरोपण के 12 महीने के बाद भी भ्रष्टाचार की दीवार के भीतर होने वाली थी । मैक्रो-छिद्रित संवहनी भ्रष्टाचार में हिचकी पत्थराना के लिए मुख्य कारणों में शामिल हैं: (1) स्थूल-छिद्रीय भ्रष्टाचार की संरचना चयापचय को बढ़ावा देता है, जैसे कोशिकाओं और रक्त के बीच आयन विनिमय; (2) भ्रष्टाचार संरचना के भौतिक cues को विनियमित या osteoblast1में VSMC के भेदभाव को बाधित सकता है, (3) बड़े pores में अच्छा सेल घुसपैठ ECM के स्राव को बढ़ावा देता है और उसके क्षरण को रोकता है कि ट्रिगर होगा 17पत्थराना, और (4) सामान्य या कार्यात्मक VSMCs कैल्शियम जमाव को रोकने के लिए एक संभावित है18.
सारांश में, चूहे पेट महाधमनी मॉडल में स्थूल-छिद्रित electrospun PCL नाड़ी भ्रष्टाचार के दीर्घकालिक मूल्यांकन क्षरण संवहनी भ्रष्टाचार की संभावित चुनौतियों में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, जो निंनलिखित अनुसंधान निर्देशित करेंगे ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों का कोई परस्पर विरोधी वित्तीय हित नहीं है.
Acknowledgments
यह काम NSFC प्रोजेक्ट्स (८१५२२०२३, ८१५३००५९, ९१६३९११३, ८१७७२०००, ८१३७१६९९, और ८१४०१५३४) द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(ε-caprolactone) (PCL) pellets (Mn=80,000) | Sigma | 704067 | |
| Methanol | Tianjin Chemical Reagent Company | 1060 | |
| Alcohol | Tianjin Chemical Reagent Company | 1083 | |
| Chloroform | Tianjin Chemical Reagent Company | A1007 | |
| Sucrose | Tianjin Fengchuan Company | 2296 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| Sprague Dawley rats | Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences | ||
| Normal saline | Hebei Tiancheng Pharmaceutical company | ||
| Chloral hydrate | Tianjin Ruijinte chemical company | 2223 | |
| Heparin sodium Injection | Tianjin Biochem Pharmaceutical company | ||
| Gentamycin Sulfate Injection | Jiangsu Lianshui Pharmaceutical company | ||
| Mouse anti-α-SMA primary antibody | Abcam | ab7817 | |
| Mouse anti-smooth MYH primary antibody | Abcam | ab683 | |
| Rabbit polyclonal anti-rat elastin antibody | Abcam | ab23748 | |
| Rabbit anti-von Willebrand factor primary antibody | Abcam | ab6994 | |
| Goat anti-mouse IgG (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | ab150117 | |
| Goat anti-rabbit IgG (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | ab150077 | |
| 5% normal goat serum | Zhongshan Golden bridge | ZLI9022 | |
| Hematoxylin and eosin (H&E) | Beijing leagene biotech | DH0006 | |
| Masson's trichrome | Beijing leagene biotech | DC0032 | |
| Verhoeff-van Gieson (VVG) | Beijing leagene biotech | DC0059 | |
| Von Kossa | Beijing leagene biotech | DS0003 | |
| Surgical sutures needles with thread,3-0 silk | Shanghai Jinhuan medical supplies company | G3002b | |
| Surgical sutures needles with thread,9-0 silk | Shanghai Jinhuan medical supplies company | H901 |
References
- Coombs, K. E., Leonard, A. T., Rush, M. N., Santistevan, D. A., Hedberg-Dirk, E. L. Isolated effect of material stiffness on valvular interstitial cell differentiation. J Biomed Mater Res A. 105 (1), 51-61 (2017).
- Zhang, L., et al. A sandwich tubular scaffold derived from chitosan for blood vessel tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 77 (2), 277-284 (2006).
- Thottappillil, N., Nair, P. D. Scaffolds in vascular regeneration: current status. Vasc Health Risk Manag. 11, 79-91 (2015).
- Pektok, E., et al. Degradation and healing characteristics of small-diameter poly (e-caprolactone) vascular grafts in the rat systemic arterial circulation. Circulation. 118 (24), 2563-2570 (2008).
- Innocente, F., et al. Paclitaxel-eluting biodegradable synthetic vascular prostheses: a step towards reduction of neointima formation? Circulation. 120 (11 Suppl), S37-S45 (2009).
- de Valence, S., et al. Advantages of bilayered vascular grafts for surgical applicability and tissue regeneration. Acta Biomater. 8 (11), 3914-3920 (2012).
- Assmann, A., et al. Acceleration of autologous in vivo recellularization of decellularized aortic conduits by fibronectin surface coating. Biomaterials. 34 (25), 6015-6026 (2013).
- Hasan, A., et al. Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts. Acta Biomater. 10 (1), 11-25 (2014).
- Baker, B. M., et al. The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers. Biomaterials. 29 (15), 2348-2358 (2008).
- Wang, K., et al. Creation of macropores in electrospun silk fibroin scaffolds using sacrificial PEO-microparticles to enhance cellular infiltration. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (12), 3474-3481 (2013).
- Lee, B. L. P., et al. Femtosecond laser ablation enhances cell infiltration into three-dimensional electrospun scaffolds. Acta Biomaterialia. 8 (7), 2648-2658 (2012).
- Rnjak-Kovacina, J., Weiss, A. S. Increasing the pore size of electrospun scaffolds. Tissue Eng Part B Rev. 17 (5), 365-372 (2011).
- Zhong, S., Zhang, Y., Lim, C. T. Fabrication of large pores in electrospun nanofibrous scaffolds for cellular infiltration: a review. Tissue Eng Part B Rev. 18 (2), 77-87 (2012).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospun poly(epsilon-caprolactone) microfiber and multilayer nanofiber/microfiber scaffolds: characterization of scaffolds and measurement of cellular infiltration. Biomacromolecules. 7 (10), 2796-2805 (2006).
- Rnjak-Kovacina, J., et al. Tailoring the porosity and pore size of electrospun synthetic human elastin scaffolds for dermal tissue engineering. Biomaterials. 32 (28), 6729-6736 (2011).
- Wang, Z., et al. The effect of thick fibers and large pores of electrospun poly(epsilon-caprolactone) vascular grafts on macrophage polarization and arterial regeneration. Biomaterials. 35 (22), 5700-5710 (2014).
- Hutcheson, J. D., et al. Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques. Nat Mater. 15 (3), 335-343 (2016).
- Tara, S., et al. Well-organized neointima of large-pore poly(L-lactic acid) vascular graft coated with poly(L-lactic-co-epsilon-caprolactone) prevents calcific deposition compared to small-pore electrospun poly(L-lactic acid) graft in a mouse aortic implantation model. Atherosclerosis. 237 (2), 684-691 (2014).
