Summary
Qui, presentiamo un metodo di elettrofilatura modificate per fabbricare gli innesti vascolari PCL con fibre spesse ed i grandi pori e descrivere un protocollo per valutare l'efficacia in vivo in un modello del ratto di sostituzione dell'aorta addominale.
Abstract
Qui, presentiamo un protocollo per fabbricare macroporosa innesto vascolare di PCL e descrivere un protocollo di valutazione utilizzando un modello del ratto di sostituzione dell'aorta addominale. Gli innesti vascolari elettrofilate possiedono spesso relativamente piccoli pori, che limitare l'infiltrazione delle cellule in innesti e ostacolano la rigenerazione e rimodellamento delle neo-arterie. In questo studio, gli innesti vascolari PCL con fibre più spesse (5-6 µm) e più grandi pori (~ 30 µm) sono stati realizzati utilizzando una tecnica di lavorazione modificate. Le prestazioni a lungo termine dell'innesto è stata valutata tramite impianto in un modello di ratto dell'aorta addominale. Analisi di ultrasuono hanno mostrato che gli innesti rimasero brevetti senza aneurisma o stenosi che si verificano anche dopo 12 mesi dall'impianto. Struttura macroporosa migliorato il ingrowth delle cellule e così promosso tessuto rigenerato a 3 mesi. Ancora più importante, non c'era nessun segno di rimodellamento negativi, come la calcificazione all'interno della parete dell'innesto dopo 12 mesi. Pertanto, con modificate macroporosa elaborazione gli innesti vascolari elettrofilate PCL tenere potenziali per essere un sostituto dell'arteria per l'impianto a lungo termine.
Introduction
Gli innesti vascolari fatti da polimeri sintetici sono ampiamente utilizzati in clinica per la terapia delle malattie cardiovascolari (CPV). Purtroppo, nel caso di innesti vascolari di piccolo diametro (D < 6 mm) non sono presenti prodotti di successo disponibile dovuto la pervietà bassa innescata dalla velocità del flusso sanguigno ridotto, che spesso porta a trombosi, iperplasia intimale e altri le complicazioni1.
Ingegneria tissutale fornisce una strategia alternativa per realizzare evidenza a lungo termine e l'omeostasi basato su una rigenerazione vascolare impalcatura-guidata e ricostruzione. In dettaglio, l'innesto vascolare, come un modello tridimensionale, potrebbe fornire supporto meccanico e strutturale durante la rigenerazione del tessuto vascolare e influenza funzioni cellulari, tra cui l'adesione delle cellule, la migrazione, la proliferazione, e secrezione di matrice extracellulare2. Fino ad ora, sono stati valutati vari polimeri sintetici per applicazioni in ingegneria del tessuto vascolare. Tra questi polimeri, poly(ε-caprolactone) (PCL) è stato intensamente studiato a causa delle cellule di buona compatibilità e lento degrado che vanno da parecchi mesi a due anni3. Nel ratto dell'aorta modello4,5,6, innesti vascolari PCL elaborati da elettrofilatura espone eccellente integrità strutturale e la pervietà, l'invasione delle cellule come pure continuamente aumentato e neovascolarizzazione nella parete dell'innesto per fino a 6 mesi. Tuttavia, rimodellamento tissutale negativi, tra cui la regressione delle cellule e vasi capillari e calcificazione, inoltre sono stati osservati timepoints più a lungo, fino a 18 mesi.
Cellularization dell'innesto vascolare è un fattore chiave per determinare la rigenerazione tissutale e rimodellamento7. Elettrofilatura, come una tecnica versatile, è stato ampiamente impiegato per la preparazione di innesti vascolari con struttura fibrosa nano8. Purtroppo, la struttura di poro relativamente piccolo conduce spesso ad infiltrazione cellulare insufficiente nell'innesto vascolare elettrofilate, che limita la rigenerazione successiva del tessuto. Per risolvere questo problema, diverse tecniche sono state tentate per aumentare la dimensione dei pori e la porosità totale, tra cui il sale/polimero lisciviazione9,10, modificazione dell'apparato collettore, post-trattamento di radiazione laser11 , ecc. Infatti, la struttura degli innesti elettrofilate (tra cui il diametro della fibra, la dimensione dei pori e porosità) è collegato strettamente al trattamento condizioni12,13. Durante elettrofilatura, il diametro della fibra può essere facilmente controllato modificando i parametri, quali la concentrazione della soluzione polimerica, portata, tensione, ecc. 14 , 15, e di conseguenza, la dimensione dei pori e la porosità sono stati migliorati di conseguenza.
Recentemente abbiamo segnalato un innesto di elettrofilate PCL modificato con struttura macroporosa (fibre con diametro di 5-7 µm e pori di 30-40 µm). L'impianto in vivo mediante la sostituzione dell'aorta addominale del ratto ha mostrato alto tasso di pervietà, come pure buona rigenerazione endotelizzazione e muscolo liscio a 3 mesi post-intervento chirurgico16. Ancora più importante, nessun rimodellamento del tessuto negativo compreso regressione calcificazione e cella potrebbe essere osservato anche dopo un anno di impianto.
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Protocol
L'uso di animali da esperimento è stato approvato dal animale esperimenti etico Comitato di Nankai University e svolte in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio.
1. fabbricazione di innesti elettrofilate PCL
Nota: Nel presente documento, una tecnica di elettrofilatura è stata utilizzata per fabbricare gli innesti vascolari.
- Preparare soluzioni PCL di 25 wt % e 10% in peso, sciogliendo PCL in una miscela di metanolo e cloroformio, rispettivamente, (rapporto volume 1:5), a temperatura ambiente (TA) per 12 h.
- Caricare la soluzione PCL in una siringa di vetro da 10 mL.
- Posizionare la siringa con un ago 21G.
- Posizionare il mandrino in acciaio inox (2 mm di diametro, 25 cm di lunghezza) lo strumento di raccolta.
- Per gli innesti più spessa-fibra, utilizzare la soluzione PCL del 25% in peso, la distanza di lavoro di 17 cm dalla punta dell'ago al collezionista, portata di 8 mL/h e la tensione di 11 kV come i parametri di elettrofilatura. Per gli innesti di diluente-fibra, utilizzare la soluzione PCL di 10% in peso, distanza di lavoro di 20 cm dalla punta dell'ago al collezionista, una portata di 2 mL/h e la tensione di 18 kV come i parametri di elettrofilatura.
- Assicurare che gli innesti ottenuti siano immessi nel vuoto durante la notte per rimuovere il solvente residuo. Sterilizzare tutti gli strumenti prima della procedura e mantenere asettiche.
- Prima dell'impianto, è necessario disinfettare gli innesti di immergendole in 10 mL di etanolo al 75% per 30 min e poi esporli ai raggi UV durante la notte.
- Misure di dimensione del poro e fibra: calcolare il diametro medio della fibra utilizzando software ImageJ basato sulla scansione immagini di microscopia elettronica (SEM).
- Prove meccaniche dei ponteggi:
- Tagliare i ponteggi tubolari in sezioni di 3 mm di lunghezza con una lama di rasoio. Misurare lo spessore degli scaffold utilizzando un micrometro.
- Posizionare i ponteggi tubolari su una macchina con una capacità di carico di 100 N. prove di trazione
- Fissare i ponteggi con un 1 mm di distanza inter-morsetto e tirare longitudinalmente ad un tasso di 10 mm/min fino alla rottura. Misurare la resistenza alla trazione e allungamento a rottura. Calcolare il modulo di Young della regione lineare iniziale (fino al 5% di deformazione) della curva sforzo-deformazione.
2. ratto Aorta addominale l'impianto modello
Nota: Tutti i materiali e gli strumenti utilizzati nella chirurgia sono sterili. Durante l'intervento, assicurarsi che l'operatore indossa una maschera di garze e guanti sterili per evitare le infezioni. Garantire che la temperatura ambiente è mantenuta in 27-30 ° C per mantenere la temperatura del corpo animale. Seguire le linee guida locali IACUC per quanto riguarda l'analgesia.
- Utilizzare i ratti maschii di Sprague Dawley pesano 240-270 g come destinatari dell'innesto vascolare. Garantire che il ratto ha digiunato 24 h prima dell'intervento chirurgico. Lo scopo del digiuno ratti per 24 h è a vuoto le feci nel tratto intestinale, sufficientemente, quindi allargare orizzonte dell'operatore.
- Sul retro del collo del ratto di afferrare e tenere la testa verso il basso, inserire l'ago di springe nella cavità addominale dell'addome più basso. Indurre il ratto per anestesia con cloralio idrato (330 mg/kg) tramite un'iniezione intraperitoneale.
- Confermare amputate adeguata facendo in modo che il ratto ha rilassato i muscoli e la respirazione costante. Posto il ratto sotto il microscopio operatorio in posizione supina.
- Applicare unguento oftalmico IFP petrolato sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Amministrare l'anticoagulazione (100 UI/kg) con soluzione fisiologica eparinizzata (50 UI/mL) di iniezione della vena della coda prima della chirurgia.
- Radersi la pelliccia nella parete addominale anteriore con una lama di rasoio e pulire la pelle con soluzione di iodio e alcool medico soluzione.
- Eseguire un'incisione laparotomia del midline con forbici chirurgiche e garantire che l'incisione è circa 4-5 cm di lunghezza e quindi esporre la cavità addominale.
- Ritrarre e avvolgere l'intestino con una garza inumidita con soluzione fisiologica preferenzialmente.
- La dissezione dell'aorta addominale con attenzione.
- Identificare e legare tutti i piccoli rami utilizzando suture in nylon monofilamento di 9-0.
- Morsetto della sezione isolata (fino a 1 cm di lunghezza) dell'aorta utilizzando due pinze vascolari. L'aorta può rimanere bloccato per 20-30 min.
- Transetto dell'aorta addominale tra due morsetti utilizzando micro-forbici per creare luoghi anastomotic.
- Lavare le due estremità dell'aorta con soluzione fisiologica eparinata (50 UI/mL) per rimuovere i residui di sangue.
- Staccare il adventitia utilizzando micro-forbici.
- Anastomotizzare l'innesto con diametro interno di 2 mm e 1 cm di lunghezza per aorta addominale del ratto con un modello di figura di otto sutura con punti di sutura di 9-0 monofilamento in nylon.
- In primo luogo, costruire quattro anastomosi secondo la sequenza di 9, 3, 12 e 6 posizioni sul lato prossimale, quindi anastomotizzare i bordi tagliati in 4 punti di sutura tra due punti di sutura. Dopo aver terminato la sutura prossimale, suturare il lato distale con lo stesso metodo.
Nota: Ogni punto è necessario affinché che il lato nativo è leggermente incorporato nell'innesto. - Rimuovere il morsetto distale per permettere al sangue di fluire nell'innesto, quindi rimuovere il morsetto prossimale.
- Premere le estremità della sutura per fermare l'emorragia utilizzando un batuffolo di cotone sterile o una piccola garza-spugna. Premere per circa 3 minuti, finché l'emostasi.
- Restituire l'intestino nella cavità addominale.
- Sciacquare la cavità addominale utilizzando soluzione fisiologica tiepida con gentamicina (320 U/mL).
- Cucire la parete addominale utilizzando una sutura in Nylon 3-0 nello strato del muscolo e la pelle, rispettivamente.
- Luogo il ratto in una gabbia pulita ed asciutta e mettere un rilievo di riscaldamento sotto la gabbia per mantenere la temperatura corporea degli animali; quindi attendere che il topo a recuperare dall'anestesia. Partecipare all'animale fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale.
- Dopo esso riprende conoscenza, mettere il ratto in una gabbia singola con cibo e acqua. Applicare iodio sulla ferita per prevenire l'infezione dopo l'intervento chirurgico. Tornare il ratto la compagnia di altri animali fino a quando non viene completamente ripristinata.
- Eutanasia ratti secondo le linee guida istituzionali a intervalli di tempo predeterminati.
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Representative Results
Gli innesti PCL explanted a 3 mesi e 12 mesi postoperatorio e analizzati mediante tecniche istologiche standard per ematossilina ed eosina (H & E), Masson tricromica, Verhoeff-van Gieson (LCA), Von Kossa e immunofluorescenza che macchia per α-SMA, MYH, sindrome di Raynaud e l'elastina. Le immagini istologiche sono state prese utilizzando un microscopio dritto, e le immagini di immunofluorescenza sono state prese utilizzando un microscopio fluorescenti.
Tutti i dati sono stati espressi come media ± SD Un due code accoppiato di Student t-test è stato utilizzato per confrontare le differenze. Un valore di p < 0,05 è stato considerato essere statisticamente significativa.
Romanzo elettrofilate PCL innesti con struttura ottimizzata, vale a dire fibre più spesse e più grandi pori, sono stati realizzati con successo in questo studio. Immagini di SEM hanno dimostrato che il diametro della fibra media era quasi 8 volte più spesso negli innesti modificati (Figura 1A) che nel convenzionale uno (Figura 1B) (5,59 ± 0,67 contro 0,69 ± 0.54 µm). Di conseguenza, la dimensione media dei pori era contrassegnato aumentato, da ~ 4.66 µm nell'innesto di diluente-fibra di ~ 40.88 µm nella più spessa-fibra uno. Sezioni trasversali hanno mostrato la fibra omogenea distribuzione all'interno della parete degli innesti tubolari in entrambi i gruppi di diluente-fibra (Figura 1–io) e più spesso-fibra (Figura 1–F). Lo spessore della parete era circa 400-500 µm. Le proprietà meccaniche degli innesti sono state caratterizzate da prove di trazione, e le curve sforzo-deformazione tipici sono state mostrate in Figura 1. Le proprietà meccaniche dei due innesti erano evidentemente differenti in termini di allungamento. Il valore corrispondente di innesti più spessa-fibra era circa 3 volte superiore agli innesti di diluente-fibra, suggerendo la tenacità migliorata.
Gli innesti vascolari preparati (diametro interno di 2,0 mm) e lunghezza di 1 cm (Figura 2A) sono stati impiantati per sostituire un segmento dell'aorta addominale nativa nel ratto (Figura 2B). Intervalli di tempo prestabiliti, la pervietà degli innesti impiantati è stata esaminata dall'ultrasuono. Risultati hanno mostrato che la maggior parte degli innesti erano brevetto (Figura 2). Inoltre, la velocità di flusso sanguigno era simile fra l'innesto e vasi sanguigni adiacenti nativi a 12 mesi. Gli innesti explanted mantenuto buona morfologia senza aneurisma (Figura 2D), e nessuna stenosi o gli emboli hanno potuto essere osservati sulla superficie luminal (Figura 2E).
Rigenerazione tissutale e la secrezione di ECM a 3 mesi sono stati ulteriormente valutati dalle analisi di istologia. Macchiatura di H & E ha mostrato che si era formato uno strato di neo-tessuto sul lume dell'innesto (Figura 3-H). Inoltre, vWF macchiatura mostrano che la superficie luminale era completamente coperto da neonata endotelio (Figura 3A), che assomiglia a quello dell'aorta nativa (Figura 3B). Nel frattempo parecchi strati delle cellule MYH-positive sono stati organizzati lungo la direzione circonferenza, che indica la rigenerazione dei media vascolare (Figura 3–D). Sintesi di matrice extracellulare è stata osservata da Masson e LCA macchiatura, rispettivamente. Una notevole quantità di collagene ed elastina fibroso potrebbe essere osservata entro l'innesto (Figura 3I–J, K–L), che svolge un ruolo importante nella rigenerazione vascolare e rimodellamento. Colorazione di immunofluorescenza ha mostrato ulteriormente che la struttura dell'elastina è stata stata allineata lungo la circonferenza in un modello come quello nell'arteria nativa (Figura 3E–F).
Inoltre, i tessuti rigenerati tra cui endotelio e muscolo liscio mantenuto integrato e non ha fatto regredire dopo 12 mesi dall'impianto (Figura 4A–C). Ancora più importante, non c'era nessun segno di calcificazione che accade all'interno della parete dell'innesto basata su Von Kossa macchiatura (Figura 4).
Figura 1 : La struttura e le proprietà meccaniche dell'innesto PCL. Immagini di SEM di elettrofilate PCL mats con fibre più spesse (A) e le fibre più sottili (B). Sezioni trasversali di più spessa-fibra tubolari innesti (D–F) e gli innesti di diluente-fibra (G–io). La curva rappresentante tensioni è mostrata in (C). Queste cifre sono state modificate da Zhao, et al. 16 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Impianto degli innesti vascolari in un modello di ratto dell'aorta addominale. Electrospun PCL innesto vascolare di 1 cm di lunghezza (A) era chirurgicamente interposto nell'aorta addominale nel ratto (B). L'immagine di ultrasuono ha mostrato che l'innesto era brevetto in vivo a 1 anno (C). Stereomicroscopia immagini mostrano che l'innesto era ben integrato con l'aorta adiacente nativo senza aneurisma (D), e la superficie luminale è pulito e privo di embolo (E). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Rigenerazione tissutale e deposizione di ECM in innesti espiantati a 3 mesi rispetto al nativo aorta. Immagini a sezione trasversale del rigenerato innesti (A, Ced E) e dell'arteria nativa (B, De F) immunostained per rilevare le cellule endoteliali, cellule muscolari lisce ed elastina. Macchiatura di H & E Mostra la rigenerazione dei tessuti in innesti espiantati (G) rispetto al nativo dell'aorta (H). Masson di colorazione ha rivelato che la presenza di collagene nell'innesti espiantati (io) e l'aorta nativa (J). VVG macchiatura ha mostrato la presenza di elastina nel explanted innesti (K) e nativo dell'aorta (L). Queste cifre sono state modificate da Zhao, et al. 16 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Analisi istologica degli innesti espiantati a 12 mesi. (A) H & E che macchia ha mostrato la rigenerazione dei tessuti in innesti espiantati. (B) endotelio era immunostained dall'anticorpo di vWF. Muscolo liscio (C) era immunostained dall'anticorpo di α-SMA. (D) la calcificazione è stata valutata da Von Kossa macchiatura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'infiltrazione delle cellule è fondamentale per la rigenerazione e rimodellamento dell'innesto vascolare in vivo16. L'infiltrazione delle cellule limitato è spesso legato ai pori relativamente piccoli dell'innesto che ostacolano la migrazione delle cellule nella parete dell'innesto. Per risolvere questa difficoltà, abbiamo sviluppato un metodo modificato per preparare con grande poro struttura gli innesti vascolari elettrofilate PCL. In dettaglio, il formato del poro aumentato con l'aumento di spessore della fibra che può essere facilmente controllato da parametri di lavorazione. I risultati hanno mostrato che le cellule dell'ospite potrebbero facilmente infiltrarsi nel muro di questo innesto macroporosa dopo l'impianto in vivo e la cellularità è rimasto ad un livello relativamente elevato senza regressione evidente delle cellule a 12 mesi post-chirurgia.
Nativo dell'arteria principalmente consiste di tre strati, vale a dire, endotelio, mezzi di tunica e adventitia. Endotelio, come un'interfaccia anti-trombogenica, svolge un ruolo fondamentale nel mantenere la pervietà a lungo termine del vaso sanguigno. Nel nostro studio, completa endotelizzazione sull'innesto è stato osservato a 3 mesi. Inoltre, la tunica media che consiste di parecchi strati di cellule muscolari lisce è molto importante nel regolare la funzione del vaso sanguigno e fornendo adeguate proprietà meccaniche dell'arteria. Il presente studio ha rivelato che l'elettrofilate PCL innesti con fibra di spessore e grande poro contrassegnato migliorato la rigenerazione dei mezzi di tunica funzionale. Inoltre, la struttura del muscolo liscio rigenerata è simile a quello dei nativi tunica media. Colorazione di immunofluorescenza ha mostrato parecchi strati delle cellule MYH+ distribuiti all'interno della rete di elastina, riflettendo il fenotipo contrattile delle cellule muscolari lisce circonferenzialmente. Più d'importanza, rigenerate tessuti (muscolo liscio e dell'endotelio) mantenuti intatti e non c'era nessun ritocco negativi anche dopo 12 mesi a causa dello squilibrio tra ECM sintesi e degradazione.
La calcificazione è ancora un grave problema connesso con gli impianti cardiovascolari, soprattutto nell'innesto vascolare. Cellule muscolari lisce vascolari (VSMCs) perdono il loro fenotipo originale ed esperienza trans-differenziazione verso la direzione di osteochondrogenic, che conduce alla mineralizzazione ectopica durante il processo di calcificazione vascolare. Il nostro studio ha mostrato che non c'era nessun deposito di calcio che si verificano all'interno della parete dell'innesto anche dopo 12 mesi dall'impianto. Le ragioni principali per la calcificazione inibita nell'innesto vascolare macroporoso includono: (1) la struttura dell'innesto macroporoso promuove il metabolismo, come scambio di ioni tra cellule e sangue; (2) i segnali fisici della struttura dell'innesto potrebbero regolare o inibiscono la differenziazione delle VSMC in osteoblasti1, (3) buona cella infiltrazione nei grandi pori favorisce la secrezione della ECM e inibisce la degradazione che attiverà calcificazione17e (4) VSMCs normale o funzionali hanno un potenziale per impedire la deposizione di calcio18.
In sintesi, la valutazione a lungo termine degli innesti vascolari di PCL macroporoso elettrofilate nel modello del ratto dell'aorta addominale fornisce importanti approfondimenti potenziali sfide degli innesti vascolari degradabile, che dirigeranno la ricerca seguente.
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Disclosures
Gli autori non hanno nessun conflitto di interessi finanziario.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente da progetti NSFC (81522023, 81530059, 91639113, 81772000, 81371699 e 81401534).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(ε-caprolactone) (PCL) pellets (Mn=80,000) | Sigma | 704067 | |
| Methanol | Tianjin Chemical Reagent Company | 1060 | |
| Alcohol | Tianjin Chemical Reagent Company | 1083 | |
| Chloroform | Tianjin Chemical Reagent Company | A1007 | |
| Sucrose | Tianjin Fengchuan Company | 2296 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| Sprague Dawley rats | Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences | ||
| Normal saline | Hebei Tiancheng Pharmaceutical company | ||
| Chloral hydrate | Tianjin Ruijinte chemical company | 2223 | |
| Heparin sodium Injection | Tianjin Biochem Pharmaceutical company | ||
| Gentamycin Sulfate Injection | Jiangsu Lianshui Pharmaceutical company | ||
| Mouse anti-α-SMA primary antibody | Abcam | ab7817 | |
| Mouse anti-smooth MYH primary antibody | Abcam | ab683 | |
| Rabbit polyclonal anti-rat elastin antibody | Abcam | ab23748 | |
| Rabbit anti-von Willebrand factor primary antibody | Abcam | ab6994 | |
| Goat anti-mouse IgG (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | ab150117 | |
| Goat anti-rabbit IgG (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | ab150077 | |
| 5% normal goat serum | Zhongshan Golden bridge | ZLI9022 | |
| Hematoxylin and eosin (H&E) | Beijing leagene biotech | DH0006 | |
| Masson's trichrome | Beijing leagene biotech | DC0032 | |
| Verhoeff-van Gieson (VVG) | Beijing leagene biotech | DC0059 | |
| Von Kossa | Beijing leagene biotech | DS0003 | |
| Surgical sutures needles with thread,3-0 silk | Shanghai Jinhuan medical supplies company | G3002b | |
| Surgical sutures needles with thread,9-0 silk | Shanghai Jinhuan medical supplies company | H901 |
References
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