Summary
En procedure for opdræt stabil fluer (Stomoxys calcitrans) er præsenteret. Proceduren, der bruger lokalt tilgængelige materialer for kost komponenter, udstyr og forsyninger.
Abstract
Stabil fluer, Stomoxys calcitrans, er alvorlige skadedyr i husdyr, mennesker, kæledyr og dyreliv på verdensplan. I løbet af de sidste 20 + år resulterede ændringer i dyrkningspraksis i alvorlige udbrud af stabil fluer i flere lande. Disse udbrud forstyrret husdyrproduktion og menneskelige rekreation resulterer i offentlige krav for at øge forskning og forvaltning indsats for denne skadeorganisme. En enkel og billig procedure for opdræt stabil fluer til laboratorieundersøgelser er præsenteret. Proceduren, der bruger lokalt tilgængelige kost komponenter, udstyr og forsyninger. Proceduren, der kan tilpasses til opdræt andre muscoid fluer herunder ansigt fluen (Musca autumnalis), horn flyve (Haematobia irritans), og huset fluen (Musca domestica). Proceduren, der producerer stabile flyve puparia gennemsnit 12,5 mg og ~ 35% æg til voksen overlevelse. Ca 3000 fluer er produceret i hver gryde.
Introduction
Stabil fluer, Stomoxys calcitrans (L.), er hematophagous fluer hvis smertefulde bid forstyrre funktionen græsning af husdyr, forårsage smerte og lidelse for følgesvend dyr og forstyrre menneskelige rekreative aktiviteter på verdensplan. Umodne stabil fluer udvikle i gæring vegetativt materiale, ofte kontamineret med animalsk affald. Skiftende dyrkningspraksis og afgrøder har produceret alvorlige udbrud af stabil fluer i afgrøderester, grøntsager i Australien1, sukkerrør i Brasilien2og ananas i Costa Rica3. Selv om kun 14 stabil fluer per dyr anses for at være økonomisk tærskel4, er observationer af mere end 2.000 fluer per dyr foretaget i løbet af de seneste udbrud5. Sådanne angreb niveauer reducere vært produktivitet til nær nul og kan forårsage dødelighed6. Agronomisk tilknyttede udbrud, stabil fluer får fornyet interesse og efterspørgsel for laboratoriet kolonier er steget dramatisk.
Som for alle holometamorphic insekter får stabil fluer alle de næringsstoffer, der kræves for vækst stadiet umodne eller larver. Derfor er en vigtig komponent i et opdræt system larve kost eller substrat. Stabil flyve larver er blevet observeret under udvikling i en bred vifte af substrater i felt7 og de er afhængige af den mikrobielle samfund af substrat8,9. Naturlige larve substrater er primært sammensat af nedbrydes eller gæring vegetativt materiale ofte kontamineret med kvælstofholdige affald.
Til laboratoriet opdræt, er stabil flyve larver substrater normalt sammensat af et vegetativt materiale og en ekstra kvælstof kilde. Talrige materialer er blevet brugt til stabil flyve larver kost. De første larve kost efterlignede naturlige substrater og inkluderet gæring havre halm og hest eller ko gødning10,11. Kulhydrat kilder omfatter hvede klid12,13,14, Lucerne måltid12,13,14 og en kommerciel formulering udviklet af kemiske specialiteter Producenter Association (CSMA, 33% hvedeklid, 27% Lucerne måltid, 40% ølgær granulat)13,14,15,16. Kvælstof kilder omfatter gær suspension12, fiskemel og ammoniumbicarbonat17. Inert bulking materialer er ofte inkluderet i kost herunder havre skrog12, bagasse13, vermiculit16, træflis13,18 og pelleted peanut skrog14.
En primær målsætning for laboratoriet opdræt er at producere et produkt, der er så fysiologisk ligner "vildtype" som muligt, så laboratorieforsøg vil producere resultater afspejler dem af feltet populationer. Dette kræver, at i avl og udvalg minimeres for at opretholde genetiske mangfoldighed og ernæringsmæssige ressourcer være sammenlignelige med dem i feltet. Sekundære mål er at minimere arbejdskraft og udgifter. En større komponent af minimere omkostninger er brugen af lokalt tilgængelige kost komponenter. Stabil flue opdræt system præsenteret blev udviklet for at opfylde disse mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. æg samling (figur 1)
- Forberede æggede cup, placere ene ende af klud i ~ 500 mL bægerglas fyldt med varm (~ 40 ° C) vand. Overlapper siderne af koppen og lave med en elastik. Fold den løse ende af kluden tilbage over toppen af koppen.
- Sted æggede cup i bur af 8-10 dages gamle fluer til ~ 2 h. fælderne kvinde stabil flyver vil oviposit på kluden.
- Fjerne æggede cup fra buret og skyl æg ud egging klud i en lille gryde med squeeze vaskeflaske.
2. klargør larve opdræt Pan
-
Forberede medium (mængder for 1 opdræt pan)
- Kombiner hvedeklid (500 g), træspåner (200 g) og fiskemel (115 g) i 10 L plastik fad gryden og bland godt.
- Tilføje ammoniumbicarbonat (50 g) til vand (~ 25 ° C, 1600 mL) og bland indtil opløst.
- Tilføje opløsning i vand til tørre ingredienser og bland til at sikre, at ingen unwetted materiale. Niveau medium i gryde, men ikke komprimere.
-
Tilføje stabil flyve æg
- Gøre en lavvandet fure i medium længde af gryden.
- Deponere 1 mL af stabil flyve æg (~ 8.000 æg) i fure med æg pipette (figur 2).
Bemærk: Æg pipette lavet ved at skære en plastik gradueret pipette på ønsket sted, du indsætter 100 mesh skærm og limning pipette sammen igen. - Dække æg med et tyndt lag af medium til at forhindre udtørring.
- Cover pan med pudebetræk, lukke med en elastik og etiket. Placere pander i larve værelse (23 ± 2 ° C, 30-50% RH og 12:12 [L:D] h lysperiode).
Bemærk: Larve udvikling tager 10 – 14 dage fra tidspunktet for oviposition.
3. puppe forarbejdning, larver bevæge sig på kanten af mediet 7-9 dage efter Oviposition og Pupariate af dage 13 eller 14
- SCOOP puparia, primært beliggende omkring kanterne af pan under den skorpe, der danner på overfladen af mediet, ud og placeres i en ren gryde.
- Fyld gryde, med puparia, ½ til ¾ fuld af vand. Bryde op klumper af puparia og medium. Hvede klid og protein komponenter af medium synke mens puparia > 1 dag gamle float19.
- Fjerne flydende materialer, puparia og nogle mellemstore komponenter med en si og vask gennem en serie af sigterne (#5, #7, #12, #20) til at fjerne tilbageværende medium. #12 sigten indsamler for puparia og #20 holder fast affald ind i afløbet. Vask puparia mellem sigter med en køkkenvask sprayer.
- Skyl puparia, i #12 sigten i en ren gryde. Fyld gryde ½ fuld af vand. Hæld flydende puparia i et dørslag og lad overskydende vand kan løbe.
- Overførsel drænet puparia til tørring skærm med ventilator og forlade indtil tør (figur 3).
4. puppe hylde, en alternativ metode til indsamling af Puparia er med en puppe hylde18
Bemærk: Hylden er lavet af et stykke plastic klip fra slutningen af en 10 L parabol pan (10,2 cm høj x 10,2 cm bred x 31,9 cm lang).
- Forberede medium, som beskrevet i punkt 2.1. Koniske medium i gryde fra ~2.5 cm dybt på ene ende til ~7.5 cm dybt på den anden.
-
Læg hylden på medium i de lavvandede ende af opdræt pan og tape til at forhindre, at larver kravler sammen med hylde (figur 4).
- Mætte svamp (~14.5 x 9,0 x 4,5 cm3, regenereret cellulose) og pak det ind i en vand gennemblødt klud (30,5 x 42 cm2, bomuld) og sted på hylden omkring en halv tomme fra mediet.
-
Tilsæt æg, som beskrevet i punkt 2.2 og fortsætte som før.
- Kontrollere pander dagligt for at sikre, at svampen forbliver fugtig.
- Skyl puparia fra hylden, svamp og klud i en ren skål panorere og hælde i salatslynge 14 dage efter oviposition.
5. kvalitetskontrol
- Veje alle puparia produceret i pan (samlede wt.).
- Isolere 100 puparia, afvejes og anbringes i en 9 cm petriskål.
- Count og sex voksne ~ 5 – 8 dage senere at bestemme fremkomsten sats og kønsfordeling. Gemme petriskåle med opstået voksne i en fryser til optælling på et senere tidspunkt, hvis det er nødvendigt. Fluer er sexed af formen af deres øjne og bredde af fronto-orbital plade20 eller kønsorganer under lav forstørrelse.
- Optag samlede vægt, vægt over 100 puparia, og antallet af opstået voksne hanner og hunner.
6. forberede blod
- Indsamle frisk okseblod fra en lokal slagteri i 19 L spande indeholder 70 g natrium citrat tribasisk dihydrat i 500 mL vand. Stir blod energisk for 5-10 min og vendte tilbage til laboratoriet.
- Stamme blod gennem et dørslag at fjerne blodpropper og opdelt i 2 L containere, etiket med datoen for samling og opbevares i en fryser (-20 ° C).
- Fjern container fra fryseren og plads i køleskabet 2 dage før behov. Blod kan bruges til ~ 2 uger når optøet og opbevares i fryseren i op til 1 år.
7. voksen vedligeholdelse
- Forberede bure, linje cage bund med slagter papir at lette rengøring.
- 50 g af tørre stabile flyve pupper (~ 3.500) anbringes i hvert bur. Voksne velsmagende et par timer til et par dage efter puppe forarbejdning.
- Sted en frisk blod gennemblødt feminine serviet på toppen af hvert bur til fodring. Begynde fodring inden for 24 timer af voksne eclosion og gentage dagligt, indtil en dag i oviposition (9-10 dage efter opståen).
- Efter oviposition (afsnit 1), placerer bur i fryseren i 4-8 h og derefter rense ved at fjerne papiret, skylning frass fra sider og gulv med varmt vand og skrubbe alle overflader med vaskemidler og klor blegemiddel. Skyl burene med varmt vand og lad tørre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Larverne pupariate 10 – 14 dage og voksne fremstå 14-16 dage efter oviposition. Generationstid, æg til æg, er ~ 24 dage. Opdræt data for maj 2013 til januar 2017 med tre forskellige bulking agenter og to kolonier er præsenteret i figur 5. Cottonwood gav det bedste udbytte, 3867 ±1442 (
± standardafvigelse) pupper vejer 12,5 ±1.6 mg med 74 ±19% eclosion producerer 2,872 ±1294 voksen flyver til etablerede laboratorium koloni. Kønsfordelingen var lidt forudindtaget mod hunner 0.97:1 (mand: kvinde, 77,141 fluer sexed fra 1.184 pander). Æg til voksen overlevelse er ca. 36%. Desværre, cottonwood spåner er blevet mere vanskeligt at opnå tvinger os til at bruge pine spåner ofte. Selv om produktionen med pine er lavere, ~ 1.700 voksne pr. pan, størrelsen er lidt større, 13 mg.
Ved hjælp af metoden puppe hylde, omkring 85% af larverne vandrer ind på hylden, puparia er renere, og det meste af det medium, der er indsamlet på hylden er nemt at fjerne ved flotation. Denne metode kan også bruges til at overvåge antallet af larver udvikling, når man sammenligner opdrætsmetoder. Ulempen er, at pander skal overvåges dagligt for at sikre, at svampe forbliver fugtig.
De nuværende omkostninger til mellemstore komponenter er $1.17/pan eller $ 0,39/1.000 stabil fluer produceret (tabel 1).
| Komponent | Mængde | Omkostninger/Pan |
| Hvedeklid | 500 g | $0,35 |
| Høvlspåner, træ | 200 g | $0,06 |
| Fiskemel | 115 g | $0,27 |
| Vand (≈25 ° C) | 1600 mL | |
| Ammoniumbicarbonat | 50 g | $0,48 |
Tabel 1: stabil flyve larver kost. Kombinere tørre ingredienser undtagen ammoniumbicarbonat og blandes grundigt. Tilføje ammoniumbicarbonat til vand og bland indtil opløst. Tilføje ammoniumbicarbonatopløsning til tørre ingredienser og bland til at sikre, at ingen unwetted materiale. Mængde for en gryde.
Figur 1: materialer, der anvendes til indsamling af stabil flyve æg. Æggede cup, klemme vaskeflaske og lille gryde til modtagelse af æg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: æg anvendes til rede medium i pan. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: apparatet bruges til tørring puparia. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: larve opdræt pan med puppe hylde. Bemærk ophobning af puparia oven på og omkring kluden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Resumé af opdræt data. Betyde antallet af puparia pr. pan (A), puparia vægt (B), og antallet af voksne pr. pan (C) for stabil flyve opdræt fra maj 2013 til januar 2017 ved hjælp af tre bulking agenter, cottonwood spåner, pine spåner og vermiculit og to kolonier . Lab koloni har været opdrættet løbende i vores laboratorium for omkring 10 år. PL-kolonien grundlagt fra vilde fluer indsamlet på et mejeri i Lancaster Co, NE, USA i efteråret 2014. Fejllinjer udgør standardafvigelser. N repræsenterer antallet af pander, som dataene er baseret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stabil fluer kan findes under udvikling i en bred vifte af substrater i naturen og kan være opdrættet i mange typer af medier i laboratoriet. Vi har brugt træspåner og vermiculit som bulking agenter. Vermiculit arbejdede godt, men lavet adskille puparia fra opdræt medium svært og dyrt (~$0.60/pan). Muligvis på grund af den ekstra stringens om at adskille puparia fra mediet, var eclosion også lavere med vermiculit, 57% vs. 75% for træspåner. Cottonwood spåner var sammenlignelig med vermiculit, men til tider vanskeligt at skaffe. De vigtigste komponenter tilsyneladende vegetativ eller celluloseholdigt materiale til at gære og vedligeholde en "åben" eller godt beluftet medium og ammonium kvælstof21,22. Stabil flyve larver findes ikke i ren gødning, foretrækker alderen møg blandet med vegetabilsk materiale. Med disse tanker i sindet, kan opdræt procedurerne skitseret her tilpasses til lokalt tilgængelige materialer at udvikle billige procedurer for opdræt stabil fluer.
Fluer opdrættet ved hjælp af disse metoder er sammenlignelige i størrelse til feltet indsamlet fluer. Wing længde er korreleret med stabil flyve organ vægt23. Fordi vingerne af vilde fluer er ofte trævlet, bruger vi længden på cellen discal-mediale som en indikator for wing længde. Gennemsnitlig længde af cellen discal-mediale af 249 fluer opdrættet med denne metode var 2,49 ±0.15 mm (range 1,96-2,81) mens 3,713 fluer indsamlet på klæbrige fælder i løbet af sommeren 2011 og 2012 i nærheden af Ithaca, NE var 2,52 ±0.21 mm (range 1,80-3.58) (unpubl. data). Vægten af puparia opdrættes med denne metode er højere end rapporteret for tidligere opdræt protokoller14,24 og overlevelse, æg til voksen, er højere end de 5% observeret i felt25.
Lignende metoder kan anvendes til opdræt af andre muscoid fluer herunder ansigt fluer, horn fluer og stuefluer. Ansigt flyve og horn flyve larver kræver en frisk bovin møg medium. House flyve medium er lavet af 470 g kalv foder, 500 g hvedeklid og 1.600 mL vand (~ 25 ° C). Som stabil fluer, horn flyve voksne lever af blod. Ansigt flyve og hus flyve voksne kan fodres en tør blanding af mælkepulver og sukker. Ansigt flyve og hus flyve voksne også har brug for en kilde til vand. Vi bruger 100 mL plastik flasker med et dental vægen passerer gennem låget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Anthony Weinhold og de mange studerende, der har arbejdet sammen med os over år for teknisk support samt forslag til forbedring af vores insekt opdræt procedurer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diamalt | Premier Malt Products, Inc., Saddle Brook, NJ | 2540 | |
| CSMA Fly media | Purina Animal Nutrition, Arden Hills, MN | 5S6Z | |
| Thin Maxi Pad | The Tranzonic Co., Cleveland, OH, USA | 5001M | |
| Calf Manna | MannaPro, Chesterfield, MO, USA | Manna Pro | |
| Ammonium Bicarbonate | Spectrum Chemical Manufacturing Corp, Gardena, CA | A1125 | |
| Wheat bran, Coarse | Siemer Milling Company, Teutopolis, IL | ||
| Wood shavings | Tractor Supply Company, Brentwood, TN | 502770699 | |
| Fishmeal | Consumer Supply Distributing, North Sioux City, SD | F1550 | |
| Adult cages | All Aluminum Window Company, Lincoln, Ne | Custom | 45 × 45 × 45 cm, 18 × 16 mesh aluminum screen, stockinette access |
| 9 × 28 cm black cotton cloth | Robert Kaufman Fabrics, Los Angeles, CA | K040-114 | Egging cloth |
| 10 L plastic dish pans | Rubbermaid, Saratoga Springs, NY | FG2951ARWHT | Larval pans |
| Stockinette, Cotton, 12 inch x 25 yard roll | Tex-Care Medical Company, Burlington, NC | 91311-225 |
References
- Cook, D. F., Dadour, I. R., Keals, N. J. Stable fly, house fly (Diptera: Muscidae), and other nuisance fly development in poultry litter associated with horticultural crop production. J. Econ. Entomol. 92 (6), 1352-1357 (1999).
- Dominghetti, T. F., de Barros, A. T., Soares, C. O., Cançado, P. H. Stomoxys calcitrans (Diptera: Muscidae) outbreaks: current situation and future outlook with emphasis on Brazil. Rev. Bras. Parasitol. Vet. 24 (4), 387-395 (2015).
- Solórzano, J. -A., Guilles, J., Bravo, O., Vargas, C., Gomez-Bonilla, Y., Bingham, G., Taylor, D. B. Biology and trapping of stable flies (Diptera: Muscidae) developing in pineapple residues (Ananas comosus) in Costa Rica. J. Insect Sci. 15 (1), 145 (2015).
- Berry, I. L., Stage, D. A., Campbell, J. B. Populations and economic impacts of stable flies on cattle. Trans. Am. Soc. Agric. Eng. 26, 873-877 (1983).
- Taylor, D. B. Area-wide management of stable flies. Area-wide management of insect pests. Vreysen, J., Hendrichs, R., Cardoso Pereira, R. , in press (2017).
- Bishopp, F. C. The stable fly (Stomoxys calcitrans L.), an important live stock pest. J.Econ. Entomol. 6 (1), 112-126 (1913).
- Hogsette, J. A., Ruff, J. P., Jones, C. J. Stable fly biology and control in northwest Florida. J. Agric. Entomol. 4 (1), 1-11 (1987).
- Lysyk, T., Kalischuk-Tymensen, L., Selinger, L., Lancaster, R., Wever, L., Cheng, K. Rearing stable fly larvae (Diptera: Muscidae) on an egg yolk medium. J. Med. Entomol. 38, 382-388 (1999).
- Romero, A., Broce, A., Zurek, L. Role of bacteria in the oviposition behaviour and larval development of stable flies. Med. Vet. Entomol. 20, 115-121 (2006).
- Glaser, R. W. Rearing flies for experimental purposes with biological notes. J. Econ. Entomol. 17 (4), 486-496 (1924).
- Melvin, R. Physiological studies on the effect of flies and fly sprays on cattle. J. Econ. Entomol. 25 (6), 1151-1164 (1932).
- Doty, A. E. Convenient method of rearing the stable fly. J. Econ. Entomol. 30 (2), 367-369 (1937).
- Bridges, A. C., Spates, G. E. Larval medium for the stable fly Stomoxys calcitrans (L.). Southwest. Entomol. 8 (1), 6-10 (1983).
- Hogsette, J. A. New diets for production of house flies and stable flies (Diptera: Muscidae) in the laboratory. J. Econ. Entomol. 85 (6), 2291-2294 (1992).
- McGregor, W. S., Dreiss, J. M. Rearing stable flies in the laboratory. J. Econ. Entomol. 48 (3), 327-328 (1955).
- Goodhue, L. D., Cantrel, K. E. The use of vermiculite in medium for stable fly larvae. J. Econ. Entomol. 51 (2), 250 (1958).
- Friesen, K., Berkebile, D. R., Zhu, J. J., Taylor, D. B. Augmenting laboratory rearing of stable fly (Diptera: Muscidae) larvae with ammoniacal salts. J. Insect Sci. 17 (1), 1-6 (2017).
- Berkebile, D. R., Weinhold, A. P., Taylor, D. B. A new method for collecting clean stable fly (Diptera:Muscidae) pupae of known age. Southwest. Entomol. 34 (4), 469-476 (2009).
- Champlain, R. A., Fisk, F. W., Dowdy, A. C. Some improvements in rearing stable flies. J. Econ. Entomol. 47 (5), 940-941 (1954).
- Zumpt, F. The stomoxyine biting flies of the world. , Gustav Fischer Verlag. Stuttgart. (1973).
- Wienhold, B. J., Taylor, D. B. Substrate properties of stable fly (Diptera: Muscidae) developmental sites associated with round bale hay feeding sites in eastern Nebraska. Environ. Entomol. 41 (2), 213-221 (2012).
- Friesen, K., Berkebile, D. R., Wienhold, B. J., Durso, L., Zhu, J., Taylor, D. B. Environmental parameters associated with stable fly (Diptera: Muscidae) development at hay feeding sites. Environ. Entomol. 45 (3), 570-576 (2016).
- Albuquerque, T. A., Zurek, L. Temporal changes in the bacterial community of animal feces and their correlation with stable fly oviposition, larval development, and adult fitness. Front. Microbiol. 5 (590), 1-9 (2014).
- Bailey, D. L., Whitfield, T. L., LaBrecque, G. C. Laboratory biology and techniques for mass producing the stable fly, Stomoxys calcitrans (L.) (Diptera: Muscidae). J. Med. Entomol. 12 (2), 189-193 (1975).
- Smith, J. P., Hall, R. D., Thomas, G. D. Field studies on mortality of the immature stages of the stable fly (Diptera: Muscidae). Environ. Entomol. 14 (6), 881-890 (1985).
