Summary
同時に単一の土壌サンプルからの代謝、蛋白質および脂質の抽出、低下したサンプル準備時間を許して、数量限定でサンプルのマルチ弔質量分析を有効にするプロトコルが表示されます。
Abstract
質量分析法 (MS)-ベースの統合された metaproteomic、メタボローム、リピドミクス (マルチ弔) 研究私たちの能力を理解し、環境および生物学的システムにおける微生物群集の特性を変形させています。これらの測定は、最も複雑な土壌微生物の有効な解析結果を有効にしても複雑な微生物システムの日付に知られています。別々 に抽出は通常準備時間と必要なサンプル量を大幅増幅の本腰を入れて研究に必要なのでマルチ弔解析では、ただし、サンプル準備課題を必要は。この制限に対処するため、同じ土壌サンプルから代謝、蛋白質および脂質 (MPLEx) の同時抽出法 3-1 では、溶剤ベースのアプローチの適応によって作成されました。この MPLEx プロトコルは、複雑な土壌サンプルの数量限定に利用する場合も簡単でかつ多くのサンプルの種類、強健をあると証明しました。MPLEx メソッドには、生物的および環境の摂動に起きている変化を評価しながらそれぞれの微生物のコミュニティのメンバーのより良い理解を得るために必要な高速マルチ本腰を入れて測定も大きく有効になります。
Introduction
炭素循環と気候変動を理解するための重要な含意がある土壌微生物の評価最近の研究はしかし各種土壌中の細菌のゲノムをシーケンスの欠如など検出される蛋白質の多くの未知関数の難しさを強調しています。これらの課題は、1,2,3これまで知られている最も複雑な微生物群集をされている土壌から起因します。メタゲノム、metatranscriptomic、metaproteomic、メタボローム、リピドミクス研究からの結果を組み合わせると、マルチ弔分析は存在中の微生物により深い理解を得るために多数の土壌調査で最近実装されています。環境変動1,4、5のため起きている分子変化について包括的な情報を取得します。マルチ本腰を入れて研究課題の 1 つは質量分析法 (MS)-ベース metaproteomic、メタボローム、リピドミクスの測定通常各 MS の互換性6,7に本腰を入れての特定抽出処理が必要,8,9. これらの正確な手順を作るその実装非常に困難または不可能なときだけのサンプルの数量限定。これらの課題は、方法の検討を同時代謝・蛋白質・脂質抽出 (MPLEx) 小さいサンプル ボリュームまたは固まりを使用して、精度、およびすべての 3 つの解析の高速サンプル準備を提供することができる私たちを求めています。10. までに、これらの目標をすべて達成することができます代替土壌抽出手順がないです。
グローバル マルチ弔単一の土壌サンプルの分析を有効にするには、クロロホルム、メタノール、水分離に基づく有機溶媒抽出プロトコルは利用10だったこのメソッドは総脂質抽出9,11のために開発、最近では単一のサンプル12,13 代謝、蛋白質および脂質の同時抽出のため改正されました。、14,15,16,17,18,19,20,21,22、 23,24,25,26,27,28,29,30より少ないサンプル量を有効にして実験的変動10。MPLEx プロトコルでクロロホルムは異なる画分にサンプル成分の三相の化学分離のための基礎を提供する水と混和性ではありません。トップの水相にはしたがって蛋白質ディスクおよび脂質層の順下クロロホルム段階 (図 1) で親水性の代謝物が含まれます。ほとんどの土に MPLEx を適用すると、微粒子の残骸はサンプリング チューブの一番下で蓄積し、すべてのレイヤーが収集された後に破棄することができます。各土壌の種類が異なる、ただし、泥炭などの高有機質土、土の破片中間層にとどまり、サンプリング チューブの底にも該当しません。MPLEx マルチ弔解析で同じサンプル低下 2) マルチ弔抽出 1) サンプルの少量を使用できるよう、同じサンプルから型複数分子を分離するときにいくつかの利点を提供します全体的に実験的変動と3) より多くのサンプルは、高スループット研究10はるかに速く準備できます。一緒にこれらの利点が評価土壌試料および彼らの複雑な微生物群集のより優れた計測機能を提供するために不可欠です。
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Protocol
注: 非常にウェット土壌は抽出の有効性を損なうことがなく抽出前に凍結乾燥することができます。湿った土も使用できますが、特定の比率で試薬を追加する場合に考慮すべき。
注: 2 つの 50 mL チューブ (最大 50 mL チューブあたり 10 g 土) 間で分割する必要があります抽出あたりの乾燥した土壌重量の 20 g を使用することをお勧めします。抽出は、使用可能なサンプルに依存する上下に拡張できます。
注: 乾燥した土壌サンプルは均質化し、小さな根や岩を削除するために 3 mm のスクリーンを通してふるわれたことができます。サンプル画面でスタックを取得しますと、ウェット土壌試料をふるいないか。
1. 土壌のセル換散と代謝、蛋白質および脂質 (タイミング 〜 1 d) の抽出
- 20 g の土壌サンプルあたりメタノール/クロロホルム互換性のあるは、2 つの別の 50 mL チューブに 10 g の重量を量る。クロロホルムはほとんどのプラスチック、サンプルの汚染を溶出するように選択すると、チューブに非常に注意をします。ポリプロピレンまたはポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) から可能なまたはプラスチック管が行われるたびに、ガラスを使用します。
: 注意氷、クールな土壌初期の重量を量ると均質化の手順中に可能な限り。 - 各管に 10 mL のクロロホルム洗浄ステンレスとガーネットのビーズを追加します。氷の上を追加 4 mL 冷たい超純水の各管 (2 つの管の間の 1 つのサンプル分割) に (浄化システムの材料の表を参照) を水し、ヒューム フードに氷バケットにサンプルを転送。
- 25 mL ガラス製血清ピペットを使用して、簡単に 20 mL の冷たい 2:1 クロロホルム: メタノール (v/v) を追加します。
注意: クロロホルム: メタノールは潜在的な健康への急性影響: 皮膚刺激、可能な化学熱傷および呼吸器系への刺激。腎臓、肝臓、心臓に影響を与える可能性があります。適切な保護眼鏡、衣類、手袋を着用し、発煙のフードとは限りません。 - ソリューションには、蓋と渦を締めます。2:1 choloroform:methanol は原核生物の細胞壁を破ることができます、また酵素を不活性化します。
- 可能であれば 50 mL チューブ渦添付ファイルと水平方向に冷蔵庫内の 4 ° C で 10 分間の渦にチューブを接続します。その後、完全にそれらを冷却するために 〜 15 分-80 ° C のフリーザーの中サンプルを置きます。
- 30 に対する振幅 60% で 6 mm (1/4") プローブを各サンプルを超音波ヒューム フード内プローブ超音波発生装置を使用して s の各氷の上。
注意: sonicating ながら筐体と耳の保護を和らいでサウンドを使用することをお勧めします。高電圧は電源の供給と高周波ケーブルであります。アクティブ ・ プローブ; と下部またはサンプル容器の側面に触れないようにそれは亀裂、プラスチックを溶かします。 - 多くの熱を生成することができます sonicating として 〜 15 分-80 ° C のフリーザーにサンプルを配置します。
- 1.5 1.7 の手順を繰り返します。
注: サンプルは換散プロシージャ全体で寒い日になっていることを確認します。 - 遠心分離機の 4 ° C、5 分間 4,000 x g でサンプルこの時点で、サンプルは上部の代謝物層、蛋白質中間層と下層脂質 (および残りの破片ペレット) に分離されます。図 1を参照してください。
- アイスバ ケットに氷のサンプルを場所外し、ヒューム フード、10 mL のガラス製血清ピペットを使用して、内部上部代謝物層 2 つの 50 mL チューブから 1 つの大きなガラスの瓶に。
注: を避ける; ピペットに蛋白質のレイヤーのいずれかを吸引必要な場合は、代謝物の小さな層をままにします。 - 低脂質層に浮遊して蛋白質中間膜をリリースする 50 mL のチューブに少しだけ傾けます。きれいなステンレス フラット ヘッド ラボへらを使用して、慎重に蛋白質の中間層の両方をスクープ、一緒に 1 つの新しい 50 mL のチューブにそれらを置きます。
- 25 mL ガラス製血清ピペットを使用して、1 つの大きなガラス瓶に下位の脂質層を削除します。
注: 意欲的な土壌粒子を回避しようとしてください。ただし、いくつかの土の破片や粒子を一緒に志しました脂質は後で削除されます。 - 代謝と脂質の上に通気性膜ガラス瓶と真空濃縮乾燥まで乾燥 (脂質 4 〜 5 h、代謝産物の一夜)。
- タンパク質サンプル チューブおよび残りの破片ペレット チューブ、それぞれに冷たいメタノール 20 mL、渦を追加します。これは、それを投げる前に残骸から任意の可能な残りのタンパク質を可溶化する前に、クロロホルムを洗い流す破片ペレットのため。
- 破片ペレットし蛋白質 4 ° C、5 分間 4,000 x g で層間、ヒューム フード内有害廃棄物コンテナーにメタノールをデカントを遠心します。
- 蛋白質および残骸のペレットを液体窒素で凍結し、乾 (-105 ° C メタノール-98 ° C の凍結ポイントを非常に低いことが原因のことができるコレクター温度) とエアカーテン 〜 2 時間。
注: は過剰の可溶化が難しくなるために、ペレットを乾燥します。 - 蛋白質中間チューブおよび破片ペレットのそれぞれに 20 mL にタンパク質の可溶化バッファー (4 %sds、100 mM DTT (DL ジチオトレイトール) 50 mM tris バッファー、pH 8.0; 参照補助試薬セットアップ) の 10 mL を追加します。
注意: SDS により、急性毒性、可燃性です。それは、皮膚、眼、気道刺激性です。手袋と安全メガネを着用してください。 - 発煙のフード プローブ超音波 30 20% 振幅のサンプル ソリューションに持参する s。2 分の渦。
- 300 rpm、50 ° C で 30 分間ラボ チューブ回転子にタンパク質の可溶化蛋白質の層間サンプルを配置します。
- 水平渦任意の残りのままの細胞を溶解にさらに 10 分間破片サンプルと共に回転して残り 20 分間蛋白質層間のサンプル。
- すべての 10 分間、室温 (RT)、4,500 x g でサンプルを遠心し、サンプルあたり各管から 2 つの 50 mL チューブに上清を収集します。
- 10 mL の可溶化バッファー蛋白質層間ペレットを超音波し、渦戻るソリューション、遠心分離前に追加します。
- 固定角バケット ローター内の 4 ° C, 10 分間 8,000 × g で遠心分離機し、均等に 2 つの 50 mL チューブに培養上清を組み合わせます。
メモ: 最終的なの遠心分離は過度の汚染フミン物質を除去する必要が。 - これが各 30 mL がある 2 つの 50 mL チューブに培養上清をデカントします。その後、10 mL のガラス製血清ピペットを使用して、各管に TCA (トリクロロ酸) 7.5 mL を追加します。ソリューションに渦。これにより、20% 各 30 mL サンプルの TCA (調整)
注意: TCA は腐食性、有毒であり 5 月皮膚のやけどを引き起こします。手袋と安全メガネを着用してください。 - 一夜にして 2 時間-20 ° C のフリーザーにサンプルを配置します。
注意: 蛋白質 1 h 以内通常沈殿させるが左一晩 (18 h まで) することができます。
注意: 蛋白質の酸加水分解可能なため 18 h より長く行く TCA 抽出てはいけないです。サンプルは凍結されている場合は; 氷の上それを解凍します。過去の雪解けのウォーム アップのサンプルを聞かせてはいけません。 - 沈殿したタンパク質を餌に 4 ° C, 10 分間 4,500 x g でサンプルを遠心し、廃棄物に上清をデカントします。
- 各蛋白ペレット、渦とペレットのような結合する 1 つの管に 100% 氷冷アセトン 10 mL を追加します。
- (バランスを使用)、結合された餌を含んでいる管を遠心し、廃棄物に上清をデカントします。
注意: アセトン気道や皮膚や目の炎症の原因し、は、可燃性の液体および蒸気。手袋・保護メガネと白衣を着用、ヒューム フードの仕事します。 - 2 回 1.5 mL のアセトンおよび最終的に 5 分 10,000 x g で最後のスピンの 2 mL チューブへの転送を使用してペレットを洗浄します。
- 廃棄物に上清をデカント乾燥ペレットを発煙のフードの 〜 20 分または窒素気流下における紙ワイプ倒立ペレットは少し亀裂を開始するまで許可する.
- ペレットのサイズによって、タンパク質の可溶化バッファーの 100-200 μ L を追加します。
注意: 可能な限り低くサンプルに追加可溶化バッファーのボリューム。その後フィルター支援サンプル準備 (FASP) のみ列ごとに可溶化されたサンプルの 50 μ L まで使用できます。いずれかはより複数の FASP 列に分割する必要があります。 - 超音波および渦のソリューションにペレット。サンプルはその後遠心分離と削除されるタンパク質と共に沈降腐植物質による粘性かもしれないことに注意してください。
- ソリューションにタンパク質を可溶化し、タンパク質の消化に進む 300 rpm、40 ° C で 30 分間、インキュベーター/シェーカーでサンプルを振る。
- スナップは、タンパク質消化の準備ができるまで液体窒素、-80 ° C のフリーザーの店でサンプルを凍結します。
2. 脂質準備 (タイミング 〜 20 分)
- 脂質サンプルは乾燥、バイアル、ソリューションに渦と 1.5 mL ポリプロピレン チューブに転送する 2:1 クロロホルム: メタノール 200 μ L を加えるガラス追加 200 μ L を追加バイアル、渦とピペットの残りの脂質とチューブに転送します。
- 遠心分離機の 4 ° C で 5 分間、12,000 × g でサンプルから破片
- クロマトグラフィー-タンデム質量分析 (LC ・ MS/MS補正方法の詳細) まで脂質バイアル、-20 ° C でストアに上澄みを転送します。
- 作製直後にサンプルを分析することはできません、する場合、脂質は酸化・劣化を防ぐために-20 ° C で溶剤に格納される必要があります。
3. 代謝物の調製及び誘導体化 (タイミング 〜 5 h)
- 抽出の翌日には、速度 Vac から代謝物サンプルを削除し、GC での誘導体化と分析準備が整うまで-20 ° C で乾燥保存します。そうでない場合は楽器のための適切なプロトコルを使用してそれらを準備して GC での代謝産物を実行しています。
- 前処理の直前に GC の分析のための代謝物はメタノール、ボルテックス、1.5 mL ポリプロピレン チューブに追加の 200 μ L の追加によって大規模なガラスの瓶からそれらを転送します。もう一度繰り返します。
- 4 ° C、10 分間 12,000 × g でチューブを遠心分離します。小さなガラスの瓶に上清を移す、追加通気性膜上に速度 Vac で完全に乾燥します。
- サンプルバイアルと 30 の渦に methoxyamine 溶液 20 μ L を追加することによって、代謝を derivatize 上の中程度の速度で vortexer 秒。
注意: Methoxyamine 塩酸塩は重度の火傷や目に深刻な被害が発生、皮膚への接触により感作性を引き起こす可能性があります。安全眼鏡、手袋、白衣を着るとヒューム フード。 - 風呂超音波発生装置を使用すると、サンプルを完全に溶解します。
- 揺れ 1,000 rpm で 1 時間 30 分の 37 ° C で維持結露防止ふた付けインキュベーターでサンプルをインキュベートします。
- キャップ表面に凝縮滴とサンプルを混合する 1 回のバイアルを反転します。1 分、右の 1,000 x g でサンプルをスピンダウンします。
- シリル化を実行 80 μ (注射器を使用して) N を追加-メチル - N-(トリメチルシリル) トリフルオロアセトアミド 1% トリメチルクロロシランと。10 秒のための渦。
注意: MSTFA + 1 %tmcs 皮膚腐食性、眼に対する重篤な損傷および特定標的臓器毒性を引き起こす可能性が、可燃性の液体および蒸気。安全眼鏡、手袋、白衣を着るとヒューム フード。 - 揺れ 1,000 rpm で 30 分の 37 ° C で維持結露防止ふた付けインキュベーターでサンプルをインキュベートします。
- キャップ表面に凝縮滴とサンプルを混合する 1 回のバイアルを反転します。
- スピン ・ ダウンした 2,000 x g で 5 分サンプル
- ガスクロマトグラフィー質量分析に適したバイアルに反応液を転送します。
4. 蛋白質消化 (タイミング 〜 1 d)
- 5 分、任意の残骸をペレットに RT 15,000 × g のサンプルを遠心します。
- FASP を使用して消化キット (材料の表を参照してください) のフィルター支援サンプル準備 (FASP) を実行する次の製造元の手順31,32を変更します。
- FASP 列 (500 μ L 30 K MWCO スピン フィルター) に 8 M 尿素バッファーの 400 μ L を追加します。
- サンプルの遠心分離が終了すると、ピペットの上澄み (廃棄ペレット) を離れて、最大 50 μ L のサンプルを列で 8 M 尿素の 400 μ L に追加します。
注: は、列ごとにサンプルののみ最大 50 μ L を追加します。以上 50 μ L のサンプルの場合、複数の列を使用し、消化後、ペプチドを結合します。それは最高のこのボリュームを可能な限り低く残して (30 μ L が理想的です)、FASP を確保するために列が削除されます大量スペック解析を妨げることができます劇的に SDS のすべて。 - 付属の 1.5 mL のチューブに列を置き、RT。 30 分 14,000 x g でサンプルを遠心分離
- 廃棄物に流れを削除列に 8 M 尿素の 400 μ L を追加し、再び遠心分離します。
- 3 尿素リンスの合計は 1 つのより多くの時間前の手順を繰り返します。
注: サンプル行く確認乾燥に近い列のいずれかがある場合以上 〜 30 μ L フィルターの各回転後、残り続ける遠心分離します。 - 20 分間 14,000 x g で 50 mM NH4HCO3および遠心分離機の 400 μ L を追加、廃棄物を破棄、もう一度繰り返します。
- きれいな 1.5 mL 遠心チューブに列を転送します。
- 列にトリプシン消化バッファーの 75 μ L を追加し、750 rpm で結露防止ふた付けインキュベーターで 3 h の 37 ° C で孵化させなさい。
- 50 mM NH4HCO3の 40 μ L を列に追加します。
- 列の上に高分子量の汚染物質を保ちながらチューブにペプチドを収集するために 15 分間 14,000 x g でサンプルを遠心します。
- 再度列と遠心分離機に 50 mM NH4HCO3の 40 μ L を追加します。
- 列を捨てて、乾燥速度 Vac 〜 30 μ L と BCA 法 (ビシンコニン酸タンパク質アッセイ キット; 参照テーブルの材料) が管内にペプチドをペプチド。
- SDS の汚染は (目に見える泡)33を疑いがある場合、必要に応じて、クリーンアップ手順を実行します。このオプションを選択する場合、固相抽出法はその後行う必要があります。このクリーンアップ メソッドの詳細については、補助的な手段で利用可能です。
- MS 分析用サンプルを希釈または必要に応じて HPLC 分画 (次の 2 つの手順) に進みます.
- 分別、10 mM アンモニウム ギ酸緩衝 (pH 10.0) 400 μ L のボリュームにサンプルを希釈します。
- C18 カラムで解決 (材料の表を参照してください) pH 10.0/アセトニ トリル (10: 90) 10 mM ギ酸アンモニウムを 0.5 mL/分移動相 (A) 10 mM ギ酸アンモニウム, pH 10.0 および (B) を用いた高速液体クロマトグラフィー システムで区切ります。
- 最小 10 を 70 分 85 に 70、85、95 分以上 30 %a で維持を 30%、65%、100%、95% は最初の 10 分、95% の上でから 65 %a へのグラデーションを調整します。
- 100 パーセント分 95 に 105 以上で再平衡し、100% A 120 分まで押し続けます。
- 分数 1.25 分毎に (全体のグラデーションの上 96 分数) を収集し、最後に 12 のサンプルまたは 24 サンプルの各行の合計のすべての行を組み合わせる (各 n = 8 または n = プール 4 分画)。
- 真空下ですべての画分を乾燥し、クロマトグラフィー-タンデム質量分析までそれぞれ-20 ° C で保存用に 15 μ L の純水を追加します。
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Representative Results
カンザス ネイティブ草原土壌 (Mollisol 土) から分子を抽出する MPLEx プロトコルを使用すると、帳票分析結果 3376 ペプチド、105 の脂質および提供 102 代謝物 (すべての一意の識別子)。MPLEx プロトコルは脂質代謝12,13,14,15,16,17,18 の一般的な抽出のために確立されています。 ,,1920,21,22,23,24,25,26,27 ,28,29,30,34, 土壌タンパク質抽出キット (のテーブルを参照などの微生物学的解析の一般的な土壌タンパク質抽出方法の比較材料) SDS (ドデシル硫酸ナトリウム) 抽出35がここで評価されるさらに。これらの技術を評価するためにカンザス ネイティブ草原土壌タンパク質はそれぞれの方法で抽出され逆相 LC-MS/MS ハイブリッド Orbitrap/四重極質量分析計と相まって高精度システムを使用しての直接分析します。補助的な手段にメソッドのパラメーターに関する詳細情報があります。各抽出アプローチから MS/MS スペクトル予測ペプチドと比較した結果として得られる実験的ペプチド シーケンス代表からカンザス ネイティブ草原メタゲノム2厳格な MS を使用して-GF + 1 x 10 のスペクトルの確率カットオフ-1036,37 5 ppm 以下の質量エラー カットオフ。MPLEx プロトコルを使用して土壌から抽出された検体が MS ベースの研究と他の分析手法に適していることに注意してください。MoBio と SDS の既知のメソッドの複製最初 3 つを比較すると、微生物群集と別の抽出効果 (図 2) の複雑さを示す 2 つの手法の間のペプチドの 12% だけがオーバー ラップ。MoBio と SDS の抽出物と MPLEx の比較で、MPLEx メソッドを使用して観測されたペプチドの 〜 38% は SDS および/または MoBio 抽出 (図 2) を使用する場合も検出されました。カンザスシティの種の数を考慮した土壌細菌群集構造とメタゲノム2ペプチド id の重複が合理的とアプローチの組み合わせが一人一人よりもより多くのペプチドを抽出、その複雑さのため35です。 また、これらのサンプルと未分画のみ 1 次元-MS LC/MS による分析、ので非常に高いサンプルの複雑さ可能性を引き起こしていたいくつかのバイアス各手法によって抽出された異なるペプチド濃度による検出の。MPLEx プロトコルは、永久凍土や湿地など他の土質に適用されているそしてすべてのケースで予備的なプロテオーム結果ここに提示カンザス ネイティブ草原の土壌データを同様の品質です。
以前評価されています MPLEx のアプローチの広範な適用性は始原スルフォロバス属 acidocaldarius、unicyanobacterial コンソーシアム38マウス脳皮質組織、人間の尿を含むサンプルの多様なセットを使用して、シロイヌナズナを用いた(図 2)10から出発します。結果を除くすべてのサンプルに対して尿素抽出、制御手法として用いられる評価のためのタンパク質を抽出する最も一般的な方法です。A.シロイヌナズナMPLEx 結果は、植物葉 MS 解析39前に削除する必要があるフェノール化合物が豊富なのでトリクロロ酢酸 (TCA) と、抽出に比較しました。すべてのケースで MPLEx メソッドからタンパク質の数はコントロールの10、多くの別のサンプル タイプへの応用を示すことに似ていた。また、特定タンパク質のクラス (土を含む) すべてのサンプル タイプの抽出に関連付けられている傾向はありませんでした。したがって、多数の生物学的および環境システム MPLEx の広範な適用はそれに有望なアプローチをなります。
図 1。どの代謝産物の MPLEx プロセスを示す模式図タンパク質や脂質が MS 分析に同じ土壌サンプルから抽出同時にします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。通常 MPLEx と標準的な尿素を用いたタンパク質抽出法を使用して抽出したサンプルの多様なセットのペプチドの重複を示すベン図を実行します。古S.acidocaldariusの MPLEx 抽出、unicyanobacterial コンソーシアム、尿、マウス大脳皮質および結果植物のデータは葉中安、e. s.ら201610から適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
それは、すべてではない所が同じ利用可能な機器特定のメソッドは、たとえば散のステップを合わせることができるので注意してください。ここで我々 はボルテックスと sonicating、ただし 50 mL の大きいビード ビーターの使用動作を使用します。-105 ° C のコレクターの温度とエアカーテンを使用できない場合は、窒素気流下におけるサンプルを乾かすことができます。また土壌の種類が大きく異なるし、砂、シルト、粘土、泥炭、およびローム (など) を含めることができます、彼らは、pH、塩分、有機物の豊かさによっても変わることができます。柔軟に対応するときに必要な調整を行うことが重要ですので、それぞれこれらの差異のプロトコル上影響を持つことができます。ただし、比と割合が同じままが重要です。
MPLEx プロトコルは、多数の生物学的および環境システムとマルチ弔土壌微生物群集の解析を有効にする機能のアプリケーションの偉大な約束を示しています。多様なシステムの他の抽出のプロトコル MPLEx の前の比較には、ペプチド重複10の高度が示されています。しかし、1 つは制限された MPLEx が枯渇する必要がある血血しょう蛋白質に適用できなかったことを観察しました。これらのケースで、沈殿したタンパク質が血漿プロテオームの広範な適用範囲のために必要な immunodepletion 列中の抗体によっても認識されません。したがってより標準的な抽出方法を使用して、このような状況の下でください。MPLex 抽出アプローチの 1 つの追加の制限は、それが細胞内と細胞外のタンパク質間識別できませんこれはすべてその他土壌タンパク質抽出プロトコルにも同様に当てはまります。
本稿では、MPLEx は 3376 ペプチド、105 の脂質およびプロトコルのセクションで詳細な抽出と分析方法を用いたカンザス ネイティブ草原土壌の極性代謝物 102 の結果を提供.コントロールと土壌微生物群集 (図 2) と比較して、個々 のシステムの MPLEx アプローチの抽出ペプチド間よい重複が認められました。これは、制限が極めて複雑な土壌微生物群集での作業の 1 つの結果ではありません。これらの結果はいずれかの偉大な多様性と抽出の難しさのために土壌タンパク質の同じように SDS と MoBio のよく知られている土壌抽出技術がうまく重ならないようにさらに指摘しました。興味深いことに、MPLEx プロトコル SDS または MoBio のいずれかよりもより多くの合計ペプチドの同定、またいずれかの分析では見られない追加コンポーネントを検出します。
これらの観察は、小さなサンプル サイズでの作業、全体的なマルチ弔実験可変性を減らす、サンプル準備時間の短縮に非常に有望な技術 MPLEx を作る。MPLEx で可能な利点を見てマルチ弔機能と大規模な群集の研究に必要な分析を有効にします。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
著者らは、彼について数字を準備ネイサン ジョンソンを感謝したいです。この研究は、米国エネルギー省のオフィスの生物学・環境研究 (ゲノム科学プログラム)、移行 (ミント) 研究室研究開発の内細菌叢解析によって資金を供給されるパン オミックス プログラムによって支えられました。イニシアチブは、国家機関の健康国立環境衛生研究所 (R01 ES022190) と同様、太平洋の北西国立研究所で、NIH (P42 ES027704)。KEBJ は、R21 HD084788 新規マルチ弔抽出技術開発する金融支援を感謝したいです。この作品で、w. r. ワイリー環境分子科学研究所 (EMSL)、DOE 国立科学ユーザー施設で太平洋の北西国立研究所 (なり) を行った。なり、マルチ プログラム国立研究所契約 DE AC06 76RL01830 下 DOE のバテルが運営。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | Stored at -20°C !Caution chloroform has acute potential health effects, skin irritation and possible chemical burns, irritation to the respiratory system, may affect the kidneys, liver, heart. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Stored at -20°C !Caution Methanol may cause respiratory tract, skin and eye irritation, may damage the nerves, kidneys and liver. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Purified water from Millipore | Milli-Q | Water purification system. | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L6026 | !Caution SDS causes acute toxicity and is flammable. It is a skin, eye and airway irritant. Wear gloves and safety glasses. |
| Soil protein extraction kit | MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen | 30000-20 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| 1M Trizma HCL | Sigma-Aldrich | T2694 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T0699 | !Caution TCA is caustic, toxic and may cause skin burns. Wear gloves and safety glasses. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | Stored at -20°C !Caution Acetone may cause respiratory tract and skin and eye irritation. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses gloves and a lab coat, work in a fume hood. |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | !Caution Urea is an eye and skin irritant, use gloves and safety glasses |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830 | |
| Trypsin | Promega | V528A | 20µg vials |
| Bicinchoninic acid protein assay kit | Pierce | 23227 | |
| Ammonium Formate | Sigma-Aldrich | 09735 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | !Caution Acetonitrile is a skin and eye irritant. Highly flammable. Wear gloves and safety glasses. Work in a fume hood. |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | !Caution TFA is extremely hazardous in case of skin contact, eye contact, ingestion and inhalation. May produce tissue damage particularly on mucous membranes of eyes, mouth and respiratory tract. Skin contact may produce burns. Wear gloves, lab coat, safety glasses and work in a fume hood. |
| Methoxyamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 226904 | !Caution Methoxyamine hydrochloride causes severe burns and serious damage to eyes, may cause sensitization by skin contact. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | !Caution Pyridine can cause skin and eye irritation, central nervous system depression. Vapor may cause flash fire. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trimethylchlorosilane | Sigma-Aldrich | 69478 | !Caution MSTFA + 1% TMCS can cause skin corrosion, serious eye damage and specific target organ toxicity. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Milli-Q water purification system | Millipore | model MPGP04001 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Probe sonicator | FisherBrand | model FB505 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | model 5810R | |
| 50mL tube swinging bucket rotor | Eppendorf | A-4-44 | |
| 50mL fixed angle rotor | Eppendorf | FA-45-6-30 | |
| Balance | OHAUS | model V22PWE150IT | |
| Serological pipette controller | Eppendorf | 12-654-100 | |
| 10mL, 25mL glass serological pipettes | FisherBrand | 13-678-27F, 13-678-36D | |
| Thermomixer with Thermotop | Eppendorf | 5382000015, 5308000003 | |
| 0.9 – 2.0 mm blend stainless steel beads | NextAdvance | SSB14B | |
| 0.15 mm garnet beads | MoBio | 13122-500 | |
| Magnetic stir plate | FisherBrand | 11-100-16SH | |
| Magnetic stir bar | FisherBrand | 14512130 | |
| pH paper strips, pH range 0–14 | FisherBrand | M95903 | |
| 15mL, 50mL conical polypropylene centrifuge tube | Genesee Scientific | 21-103 21-108 | chloroform compatible |
| 50mL vortex attachment | MoBio | 13000-V1-50 | |
| Ice bucket | FisherBrand | 02-591-44 | |
| 27.25x70mm glass vials | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Breathe Easier plate membranes | Midwest Scientific | BERM-2000 | |
| Alcohol wipes | Diversified Biotech | BPWP-1000 | |
| Heater shaker incubator | Benchmark, Incu-Shaker Mini | ||
| Analog rotisserie tube rotator | SoCal BioMed, LLC | 82422001 | |
| Filter-Aided-Sample-Prep kit | FASP; Expedeon | 44250 | |
| Microplate reader | Biotek, EPOCH | ||
| -20 Degree Celsius Freezer | Fisher | 13986149 | |
| -80 Degree Celsius Freezer | Stirling Ultracold | SU78OUE | |
| Q-Exactive ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Agilent 7890A gas chromatograph coupled with a single quadrupole 5975C mass spectrometer | Agilent Technologies, Inc. | ||
| LTQ-Orbitrap Velo | Thermo Scientific | ||
| Waters NanoEquityTM UPLC system | Millford, MA | ||
| 250mL media bottle | FisherBrand | 1395-250 | |
| Waters vial | Waters | 186002805 | |
| Glass MS sample vial and inserts | MicroSolv | 9502S-WCV, 9502S-02ND | |
| Glass HPLC vial and snap caps | MicroSolv | 9512C-0DCV, 9502C-10C-B | |
| HPLC 96-well plate | Agilent | 5042-6454 | |
| Large glass vial 27.25x70mm | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Lyophilizer | Labconco | 7934021 | |
| Polished stainless steel flat head spatula | Spoonula; FisherBrand | 14-375-10 | |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 34721 | |
| XBridge C18, 250x4.6 mm, 5 μM with 4.6x20 mm guard column | Waters | 186003117, 186003064 | |
| Agilent 1100 series HPLC system | Agilent Technologies | G1380-90000 | |
| 1.7mL centrifuge tube | Sorenson | 11700 | |
| Hamilton Glass Syringes, 5mL, 50µL and 250µL | Hamilton | 81517, 80975, 81175 | |
| Pasteur Pipettes | FisherBrand | 13-678-20A | |
| Pasteur Pipette Bulbs | Sigma-Aldrich | Z111597 | |
| Bath Sonicator | Branson 1800 Ultrasonic Cleaner | ||
| Vacuum Centrifuge | Labconco Centrivap Acid-Resistant Concentrator System | ||
| MicroSpin Columns, C18 Silica | The Nest Group | SEM SS18V |
References
- Hultman, J., et al. Multi-omics of permafrost, active layer and thermokarst bog soil microbiomes. Nature. 521, 208-212 (2015).
- White, R. A. 3rd, et al. Moleculo long-read sequencing facilitates assembly and genomic binning from complex soil metagenomes. mSystems. 1, (2016).
- White, R. A., Callister, S. J., Moore, R. J., Baker, E. S., Jansson, J. K. The past, present and future of microbiome analyses. Nat Protoc. 11, 4-8 (2016).
- Ritchie, M. D., Holzinger, E. R., Li, R., Pendergrass, S. A., Kim, D. Methods of integrating data to uncover genotype-phenotype interactions. Nat Rev Genet. 16, 85-97 (2015).
- Jansson, J. K., Baker, E. S. A multi-omic future for microbiome studies. Nat Microbiol. 1, (2016).
- Domon, B., Aebersold, R. Options and considerations when selecting a quantitative proteomics strategy. Nat Biotechnol. 28, 710-721 (2010).
- Marx, V. Targeted proteomics. Nat Methods. 10, 19-22 (2013).
- Roberts, L. D., Souza, A. L., Gerszten, R. E., Clish, C. B. Targeted metabolomics. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 30, Unit 30 32 31-24 (2012).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226, 497-509 (1957).
- Nakayasu, E. S., et al. MPLEx: a Robust and Universal Protocol for Single-Sample Integrative Proteomic, Metabolomic, and Lipidomic Analyses. mSystems. 1, (2016).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Pomraning, K. R., et al. Multi-omics analysis reveals regulators of the response to nitrogen limitation in Yarrowia lipolytica. BMC Genomics. 17, 138 (2016).
- Tisoncik-Go, J., et al. Integrated Omics Analysis of Pathogenic Host Responses during Pandemic H1N1 Influenza Virus Infection: The Crucial Role of Lipid Metabolism. Cell Host Microbe. 19, 254-266 (2016).
- Kyle, J. E., et al. Uncovering biologically significant lipid isomers with liquid chromatography, ion mobility spectrometry and mass spectrometry. Analyst. 141, 1649-1659 (2016).
- Lovelace, E. S., et al. Silymarin Suppresses Cellular inflammation by inducing reparative stress signaling. J Nat Prod. 78, 1990-2000 (1990).
- Kim, Y. M., et al. Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms. Front Microbiol. 6, 209 (2015).
- Pomraning, K. R., et al. Comprehensive Metabolomic, Lipidomic and microscopic profiling of Yarrowia lipolytica during lipid accumulation identifies targets for increased lipogenesis. PLoS One. 10, e0123188 (2015).
- Huang, E. L., et al. The fungus gardens of leaf-cutter ants undergo a distinct physiological transition during biomass degradation. Environ Microbiol Rep. 6, 389-395 (2014).
- Deatherage Kaiser, B. L., et al. A Multi-Omic View of Host-Pathogen-Commensal Interplay in Salmonella-Mediated Intestinal Infection. PLoS One. 8, e67155 (2013).
- Kim, Y. M., et al. Salmonella modulates metabolism during growth under conditions that induce expression of virulence genes. Mol Biosyst. 9, 1522-1534 (2013).
- Ansong, C., et al. A multi-omic systems approach to elucidating Yersinia virulence mechanisms. Mol Biosyst. 9, 44-54 (2013).
- Bordbar, A., et al. Model-driven multi-omic data analysis elucidates metabolic immunomodulators of macrophage activation. Mol Syst Biol. 8, 558 (2012).
- Hu, Z. P., et al. Metabolomic response of human skin tissue to low dose ionizing radiation. Mol Biosyst. 8, 1979-1986 (2012).
- Perera, R., et al. Dengue virus infection perturbs lipid homeostasis in infected mosquito cells. PLoS Pathog. 8, e1002584 (2012).
- Gao, X., et al. A reversed-phase capillary ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) method for comprehensive top-down/bottom-up lipid profiling. Anal Bioanal Chem. 402, 2923-2933 (2012).
- Sorensen, C. M., et al. Perturbations in the lipid profile of individuals with newly diagnosed type 1 diabetes mellitus: Lipidomics analysis of a Diabetes Antibody Standardization Program sample subset. Clin Biochem. 43, 948-956 (2010).
- Diamond, D. L., et al. Temporal proteome and lipidome profiles reveal hepatitis C virus-associated reprogramming of hepatocellular metabolism and bioenergetics. PLoS Pathog. 6, e1000719 (2010).
- Alquier, T., et al. Deletion of GPR40 impairs glucose-induced insulin secretion in vivo in mice without affecting intracellular fuel metabolism in islets. Diabetes. 58, 2607-2615 (2009).
- Ding, J., et al. Application of the accurate mass and time tag approach in studies of the human blood lipidome. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 871, 243-252 (2008).
- Rasmussen, A. L., et al. Systems virology identifies a mitochondrial fatty acid oxidation enzyme, dodecenoyl coenzyme A delta isomerase, required for hepatitis C virus replication and likely pathogenesis. J Virol. 85, 11646-11654 (2011).
- Manza, L. L., Stamer, S. L., Ham, A. J., Codreanu, S. G., Liebler, D. C. Sample preparation and digestion for proteomic analyses using spin filters. Proteomics. 5, 1742-1745 (2005).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat Methods. 6, 359-362 (2009).
- Zhou, J. Y., et al. Simple sodium dodecyl sulfate-assisted sample preparation method for LC-MS-based proteomics applications. Anal Chem. 84, 2862-2867 (2012).
- Anderson, J. C., et al. Decreased abundance of type III secretion system-inducing signals in Arabidopsis mkp1 enhances resistance against Pseudomonas syringae. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 6846-6851 (2014).
- Chourey, K., et al. Direct cellular lysis/protein extraction protocol for soil metaproteomics. J Proteome Res. 9, 6615-6622 (2010).
- Kim, S., Gupta, N., Pevzner, P. A. Spectral probabilities and generating functions of tandem mass spectra: a strike against decoy databases. J Proteome Res. 7, 3354-3363 (2008).
- Kim, S., Pevzner, P. A. MS-GF+ makes progress towards a universal database search tool for proteomics. Nat Commun. 5, 5277 (2014).
- Cole, J. K., et al. Phototrophic biofilm assembly in microbial-mat-derived unicyanobacterial consortia: Model systems for the study of autotroph-heterotroph interactions. Front Microbiol. 5, (2014).
- Isaacson, T., et al. Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues. Nat Protoc. 1, 769-774 (2006).
