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Chemistry

मिट्टी के नमूनों के बहु-omic िरा के लिए MPLEx प्रोटोकॉल

Published: May 30, 2018 doi: 10.3791/57343
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory
* These authors contributed equally

Summary

एक प्रोटोकॉल एक ही मिट्टी के नमूने से चयापचयों, प्रोटीन, और लिपिड निकालने के लिए प्रस्तुत किया जाता है, कम नमूना तैयारी के समय की अनुमति और बहु omic जन स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण सीमित मात्रा के साथ नमूनों की.

Abstract

मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) आधारित एकीकृत metaproteomic, metabolomic, और lipidomic (मल्टी omic) अध्ययन हमारे समझने की क्षमता को बदलने और पर्यावरण और जैविक प्रणालियों में माइक्रोबियल समुदायों की विशेषताएं हैं । ये माप भी जटिल मिट्टी माइक्रोबियल समुदायों, जो सबसे जटिल माइक्रोबियल तिथि ज्ञात प्रणालियों रहे है की बढ़ाया विश्लेषण सक्षम कर रहे हैं । बहु-omic विश्लेषण, हालांकि, नमूना तैयारी चुनौतियों है, के बाद से अलग निकालने आम तौर पर प्रत्येक omic अध्ययन के लिए आवश्यक हैं, जिससे बहुत तैयारी समय और आवश्यक नमूना की राशि बढ़ाना. इस सीमा को संबोधित करने के लिए, एक ही मिट्टी के नमूने से चयापचयों, प्रोटीन, और लिपिड (MPLEx) के एक साथ निष्कर्षण के लिए एक 3-में-1 विधि एक विलायक आधारित दृष्टिकोण ढालने के द्वारा बनाया गया था । यह MPLEx प्रोटोकॉल जटिल मिट्टी के नमूनों की सीमित मात्रा के लिए उपयोग किया जाता है, यहां तक कि जब कई नमूना प्रकार के लिए दोनों सरल और मजबूत होने के लिए साबित कर दिया है. MPLEx विधि भी बहुत तेजी से बहु-omic प्रत्येक माइक्रोबियल समुदाय के सदस्यों की एक बेहतर समझ हासिल करने की जरूरत माप सक्षम है, जबकि जैविक और पर्यावरणीय perturbations पर जगह लेने के परिवर्तन का मूल्यांकन ।

Introduction

मिट्टी के माइक्रोबियल समुदायों के मूल्यांकन कार्बन साइकिल चालन और जलवायु परिवर्तन को समझने के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हैं । हाल के अध्ययनों से इस तरह के विभिंन प्रकार की मिट्टी में microbiota के लिए अनुक्रम जीनोम की कमी के रूप में कठिनाइयों पर प्रकाश डाला है, और पता चला प्रोटीन के कई की अज्ञात समारोह । इन चुनौतियों की वजह से सबसे जटिल माइक्रोबियल समुदाय1,2,3तारीख को जाना जाता है मिट्टी के कारण परिणाम । बहु omic विश्लेषण, जो metagenomic, metatranscriptomic, metaproteomic, metabolomic, और lipidomic अध्ययन से परिणाम गठबंधन, हाल ही में कई मृदा अध्ययन में लागू किया गया है रोगाणुओं वर्तमान में एक बड़ी समझ हासिल है, जबकि आणविक पर्यावरण perturbations1,4,5के कारण जगह ले परिवर्तन के बारे में व्यापक जानकारी प्राप्त करने । बहु के साथ एक चुनौती-omic अध्ययन है कि मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) आधारित metaproteomic, metabolomic, और lipidomic माप आम तौर पर प्रत्येक omic के लिए एक विशिष्ट निष्कर्षण प्रक्रिया की आवश्यकता होती है MS संगत6,7 , 8 , 9. ये सटीक प्रक्रिया उनके कार्यांवयन अत्यंत कठिन या असंभव जब केवल एक सीमित मात्रा में नमूना उपलब्ध है बनाते हैं । इन चुनौतियों का एक साथ metabolite, प्रोटीन की जांच करने के लिए हमें प्रेरित किया है, और लिपिड निष्कर्षण (MPLEx) विधि छोटे नमूना मात्रा या द्रव्यमान का उपयोग करने में सक्षम, सटीकता में सुधार, और सभी तीन विश्लेषणों के लिए तेजी से नमूना तैयारियां प्रदान 10. तिथि करने के लिए, वहां कोई वैकल्पिक मिट्टी निष्कर्षण प्रक्रियाओं है कि इन लक्ष्यों के सभी प्राप्त कर सकते हैं ।

एक एकल मिट्टी के नमूने के वैश्विक बहु-omic विश्लेषण को सक्षम करने के लिए, एक कार्बनिक विलायक निष्कर्षण प्रोटोकॉल क्लोरोफॉर्म, मेथनॉल पर आधारित है, और जल जुदाई10का उपयोग किया गया था । इस विधि मूल रूप से कुल लिपिड निकालने के लिए विकसित किया गया था9,11 और अधिक हाल ही में एक एकल नमूना12से चयापचयों, प्रोटीन, और लिपिड के एक साथ निष्कर्षण के लिए संशोधन किया गया था,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28,29,30, कम नमूना मात्रा को सक्षम करना और प्रायोगिक परिवर्तनशीलता10। MPLEx प्रोटोकॉल में, क्लोरोफॉर्म पानी के साथ मिश्रणीय नहीं है, जो विशिष्ट भागों में नमूना घटकों के triphasic रासायनिक जुदाई के लिए आधार प्रदान करता है । शीर्ष जलीय चरण इसलिए हाइड्रोफिलिक चयापचयों, एक प्रोटीन डिस्क के बाद, और फिर नीचे क्लोरोफॉर्म चरण में एक लिपिड परत (चित्रा 1) शामिल हैं । जब MPLEx सबसे मिट्टी के लिए लागू किया जाता है, मलबे कण नमूना ट्यूबों के बहुत नीचे जमा हो जाती है और सभी परतों एकत्र कर रहे है के बाद छोड़ दिया जा सकता है । प्रत्येक प्रकार की मिट्टी अलग हो सकता है, तथापि, और अत्यधिक कार्बनिक मिट्टी में ऐसे पीट के रूप में, मिट्टी के मलबे के बीच परत में रहता है और नमूना ट्यूब के नीचे करने के लिए गिर नहीं है । MPLEx ऐसे 1 के रूप में एक ही नमूना से कई अणु प्रकार अलग जब कई लाभ प्रदान करता है) छोटे नमूना मात्रा बहु omic विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, 2) एक ही नमूना कमी समग्र प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता से बहु omic निकालने, और 3) नमूनों की अधिक से अधिक संख्या उच्च प्रवाह अध्ययन के लिए बहुत तेजी से तैयार किया जा सकता है10. एक साथ इन लाभों मिट्टी के नमूनों और उनके जटिल माइक्रोबियल समुदायों के मूल्यांकन के लिए बेहतर माप क्षमताओं को उपलब्ध कराने के लिए महत्वपूर्ण हैं ।

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Protocol

नोट: बहुत गीली मिट्टी निष्कर्षण की प्रभावशीलता को हानि के बिना निष्कर्षण करने से पहले lyophilized जा सकता है । गीली मिट्टी भी इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन जब विशिष्ट अनुपात में एजेंट जोड़ने पर विचार किया जाना चाहिए ।

नोट: यह निष्कर्षण प्रति शुष्क मिट्टी के वजन के 20 ग्राम का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है, जो २ ५० मिलीलीटर ट्यूबों के बीच विभाजित किया जाना चाहिए (अधिकतम 10 ग्राम मिट्टी प्रति ५० मिलीलीटर ट्यूब) । उद्धरण ऊपर या नीचे उपलब्ध नमूना पर निर्भर किया जा सकता है ।

नोट: सूखी मिट्टी के नमूने एक 3 मिमी स्क्रीन के माध्यम से छलनी किया जा सकता है ताकि homogenize और छोटी जड़ों और चट्टानों को दूर । गीले मिट्टी के नमूनों को छलनी न करें, जैसा कि नमूना स्क्रीन में अटका मिलेगा ।

1. मृदा कोशिका Lysis और चयापचयों, प्रोटीन, और लिपिड का निष्कर्षण (समय ~ 1 डी)

  1. प्रति 20 ग्राम मिट्टी के नमूने, दो अलग ५० मिलीलीटर ट्यूबों है कि मेथनॉल/क्लोरोफॉर्म संगत में 10 ग्राम वजन । क्लोरोफॉर्म सबसे प्लास्टिक नमकीन पानी होगा, के रूप में चुना ट्यूबों के साथ बेहद सावधान रहना, नमूने दूषित । कांच या polytetrafluoroethylene (PTFE) से बने जब भी संभव हो या प्लास्टिक ट्यूब का प्रयोग करें ।
    नोट: बर्फ पर मिट्टी और प्रारंभिक वजन और homogenization कदम के दौरान संभव के रूप में के रूप में शांत रखें ।
  2. प्रत्येक ट्यूब के लिए क्लोरोफॉर्म-धोया स्टेनलेस स्टील और गार्नेट मोतियों की 10 मिलीलीटर जोड़ें । बर्फ पर, ठंड ultrapure पानी की 4 मिलीलीटर जोड़ें (शोधन प्रणाली के लिए सामग्री की तालिका देखें) प्रत्येक ट्यूब (एक नमूना दो ट्यूबों के बीच विभाजित) और एक बर्फ की बाल्टी में एक धुएं हुड में नमूनों हस्तांतरण ।
  3. एक 25 मिलीलीटर ग्लास सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करना, जल्दी से बर्फ के 20 मिलीलीटर-ठंड 2:1 क्लोरोफॉर्म जोड़ें: मेथनॉल (v/
    चेतावनी: क्लोरोफॉर्म: मेथनॉल तीव्र संभावित स्वास्थ्य प्रभाव है: त्वचा जलन, संभव रासायनिक जलता है, और श्वसन प्रणाली को जलन । यह गुर्दे, जिगर, और दिल को प्रभावित कर सकते हैं । उपयुक्त सुरक्षात्मक चश्मे, कपड़े, और दस्ताने पहनते हैं, और हमेशा एक धुएं डाकू में काम करते हैं ।
  4. ढक्कन और समाधान में भंवर कस । 2:1 choloroform: मेथनॉल prokaryotes की कोशिका दीवार को तोड़ने में मदद करता है और एंजाइमी गतिविधियों को भी निष्क्रिय कर देता है ।
  5. यदि संभव हो तो एक फ्रिज के अंदर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ५० मिलीलीटर ट्यूब भंवर संलग्नक और क्षैतिज भंवर के लिए ट्यूबों देते हैं । फिर, एक के अंदर नमूने प्लेस-८० ° c फ्रीजर ~ 15 मिनट के लिए उंहें शांत करने के लिए पूरी तरह से नीचे ।
  6. एक धुएं डाकू के अंदर एक जांच sonicator का उपयोग करना, एक 6 मिमी (1/4 ") के साथ प्रत्येक नमूने sonicate 30 के लिए ६०% आयाम पर जांच बर्फ पर प्रत्येक ।
    चेतावनी: यह sonicating जबकि एक ध्वनि थमी बाड़े और कान संरक्षण का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है । हाई वोल्टेज बिजली की आपूर्ति और उच्च आवृत्ति केबल में मौजूद है । एक सक्रिय जांच के साथ नमूना पोत के नीचे या किनारों को छूने से बचें; यह दरार या प्लास्टिक पिघला हो सकता है ।
  7. के लिए-८० ° c फ्रीजर में नमूनों प्लेस ~ 15 मिनट, के रूप में sonicating गर्मी का एक बहुत उत्पंन कर सकते हैं ।
  8. दोहराएँ चरण १.५-१.७.
    नोट: सुनिश्चित करें कि नमूने lysis प्रक्रिया भर में ठंडा रहने ।
  9. 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ४,००० x g पर नमूने केंद्रापसारक । इस बिंदु पर, नमूना ऊपरी metabolite परत में अलग हो जाएगा, प्रोटीन की परत, और कम लिपिड परत (और शेष मलबे गोली). चित्र 1देखें ।
  10. एक बर्फ बाल्टी में बर्फ पर नमूनों प्लेस और, एक धुएं हुड के अंदर और एक 10 मिलीलीटर ग्लास सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर, २ ५० मिलीलीटर ट्यूबों से ऊपरी metabolite परतों को एक बड़े गिलास शीशी में हटा दें ।
    नोट: पिपेट में प्रोटीन परत के किसी भी aspirating से बचें; यदि आवश्यक हो तो metabolite की एक छोटी सी परत छोड़ दें ।
  11. यह कम लिपिड परत पर तैर मुक्त है इतना है कि प्रोटीन की परत जारी करने के लिए थोड़ा ५० मिलीलीटर ट्यूब झुकाव । एक साफ स्टेनलेस स्टील फ्लैट सिर प्रयोगशाला रंग का उपयोग करना, ध्यान से प्रोटीन की परत के दोनों स्कूप और उंहें एक साथ जगह में एक नया ५० एमएल ट्यूब ।
  12. एक 25 मिलीलीटर ग्लास सीरम वैज्ञानिक पिपेट का प्रयोग, एक बड़े गिलास शीशी में कम लिपिड परतों को हटा दें ।
    नोट: आकांक्षी मिट्टी के कणों से बचने की कोशिश; हालांकि, कुछ मिट्टी के मलबे और लिपिड के साथ कामना की कणों को एक बाद में हटा दिया जाएगा ।
  13. metabolite और लिपिड कांच की शीशियों के शीर्ष पर सांस झिल्ली प्लेस और सूखापन (लिपिड ~ 4-5 एच, रात भर चयापचयों) जब तक एक वैक्यूम ध्यानी में सूखी ।
  14. प्रोटीन नमूना ट्यूब और शेष मलबे गोली ट्यूबों के लिए, प्रत्येक और भंवर के लिए बर्फ ठंड मेथनॉल के 20 मिलीलीटर जोड़ें । यह मलबे छर्रों के लिए किया जाता है के लिए रवाना होने से पहले मलबे से बाहर किसी भी संभव शेष प्रोटीन solubilize के प्रयास से पहले कुल्ला क्लोरोफॉर्म ।
  15. 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ४,००० x g पर मलबा छर्रों और प्रोटीन परत केंद्रापसारक, तो एक धुएं हुड के अंदर एक खतरनाक अपशिष्ट कंटेनर में मेथनॉल खिचड़ी भाषा ।
  16. तरल नाइट्रोजन में प्रोटीन और मलबे छर्रों फ्रीज और सूखी एक lyophilizer में (एक कलेक्टर तापमान में सक्षम-१०५ ° c-९८ डिग्री सेल्सियस के एक बहुत कम ठंड बिंदु होने मेथनॉल के कारण) ~ 2 घंटे के लिए ।
    नोट: नहीं खत्म-सूखी छर्रों, के रूप में वे और अधिक मुश्किल हो जाएगा करने के लिए solubilize.
  17. प्रोटीन solubilization बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें (4% एसडीएस, 100mM डीटीटी (डीएल-dithiothreitol) 50mM tris बफर में, पीएच ८.०; अनुपूरक एजेंट सेट-अपदेखें) के लिए प्रोटीन और 20 मिलीलीटर मलबे छर्रों में से प्रत्येक के लिए ।
    चेतावनी: एसडीएस तीव्र विषाक्तता का कारण बनता है और ज्वलनशील है । यह एक त्वचा, आंख, और airway अड़चन है । दस्ताने और सुरक्षा चश्मा पहनते हैं ।
  18. धुएं डाकू में, जांच 30 एस के लिए 20% आयाम पर नमूने sonicate उंहें समाधान में लाने के लिए । 2 मिनट के लिए भंवर ।
  19. प्रोटीन solubilize करने के लिए ३०० rpm, ५० डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक प्रयोगशाला ट्यूब रोटेटर में प्रोटीन परत नमूना रखें ।
  20. क्षैतिज एक अतिरिक्त 10 मिनट के लिए मलबे के नमूने के भंवर के लिए किसी भी शेष बरकरार कोशिकाओं लाइसे, तो शेष 20 मिनट के लिए प्रोटीन से ऊपर की परत के नमूने के साथ घुमाएं ।
  21. 10 मिनट, कमरे के तापमान (आरटी) के लिए ४,५०० x g पर नमूनों के सभी केंद्रापसारक, और २ ५० मिलीलीटर ट्यूबों में नमूना प्रति एक ट्यूब से supernatant इकट्ठा ।
  22. प्रोटीन परत गोली के लिए solubilization बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें, तो sonicate और भंवर समाधान में वापस और पहले के रूप में केंद्रापसारक ।
  23. २ ५० मिलीलीटर ट्यूबों में समान रूप से supernatants का मिश्रण है और 10 मिनट, 4 ° c, एक निश्चित कोण बाल्टी रोटर में के लिए ८,००० x g पर केंद्रापसारक ।
    नोट: एक अंतिम केंद्रापसारक को अत्यधिक दूषित humic पदार्थों को दूर करने के लिए आवश्यक है ।
  24. supernatants को २ ५० मिलीलीटर ट्यूबों में खिचड़ी भाषा में इतना है कि प्रत्येक में 30 मिलीलीटर है । फिर, एक 10 मिलीलीटर ग्लास सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर, प्रत्येक ट्यूब के लिए टीसीए (trichloroacetic एसिड) की ७.५ मिलीलीटर जोड़ें । समाधान में भंवर । यह प्रत्येक 30 मिलीलीटर नमूने में 20% टीसीए (तदनुसार समायोजित) बनाता है,
    चेतावनी: टीसीए कास्टिक, विषाक्त है और त्वचा जलता कारण हो सकता है । दस्ताने और सुरक्षा चश्मा पहनते हैं ।
  25. 2 घंटे के लिए रात भर के लिए एक-20 ° c फ्रीजर में नमूनों प्लेस ।
    नोट: प्रोटीन आमतौर पर 1 घंटे के भीतर तेज हो जाएगा, लेकिन रात भर छोड़ दिया जा सकता है (18 घंटे तक) ।
    नोट:-टीसीए निष्कर्षण को प्रोटीन के संभावित एसिड hydrolysis के कारण 18 h से अधिक समय तक न जाने दें । यदि नमूना जम जाता है तो उसे बर्फ पर गल; नमूना पिछले गल गर्म मत देना ।
  26. उपजी प्रोटीन गोली, 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस और अपशिष्ट में supernatant के लिए खिचड़ी भाषा के लिए ४,५०० x g पर नमूना केंद्रापसारक ।
  27. प्रत्येक प्रोटीन गोली, भंवर को १००% बर्फ ठंडा एसीटोन के 10 मिलीलीटर जोड़ें और एक ट्यूब में छर्रों की तरह गठबंधन ।
  28. संयुक्त गोली युक्त ट्यूब केंद्रापसारक (एक संतुलन का उपयोग), और फिर बेकार में supernatant की खिचड़ी भाषा ।
    चेतावनी: एसीटोन श्वसन तंत्र और त्वचा और आंखों में जलन का कारण हो सकता है, और एक ज्वलनशील तरल और भाप है । सुरक्षा चश्मा दस्ताने और एक प्रयोगशाला कोट, एक धुएं डाकू में काम पहनते हैं ।
  29. दो बार एसीटोन की 1.5 मिलीलीटर का उपयोग कर और अंत में 5 मिनट के लिए १०,००० x g पर अंतिम स्पिन के लिए एक 2 मिलीलीटर ट्यूब के लिए स्थानांतरित गोली धो लो ।
  30. बेकार में supernatant खिचड़ी भाषा और गोली के लिए एक धुएं डाकू में एक कागज पोंछ पर उल्टे करने के लिए अनुमति ~ 20 मिनट या एक नाइट्रोजन धारा के तहत जब तक गोली थोड़ा दरार करने के लिए शुरू होता है ।
  31. जोड़ें १००-२०० µ एल के प्रोटीन solubilization बफर, गोली के आकार पर निर्भर करता है ।
    नोट: solubilization बफ़र की मात्रा के रूप में संभव के रूप में कम नमूने के लिए जोड़ा रखें । अनुवर्ती फ़िल्टर सहायता प्राप्त नमूना तैयारी (FASP) केवल ५० μL प्रति स्तंभ solubilized नमूना का उपयोग कर सकते हैं; किसी भी अधिक एकाधिक FASP स्तंभों में विभाजित किया जाना चाहिए ।
  32. Sonicate और भंवर समाधान में गोली । नमूना है कि प्रोटीन के साथ humic पदार्थों के कारण चिपचिपा हो सकता है ध्यान दें, जो बाद के केंद्रापसारक के साथ हटा दिया जाएगा ।
  33. ३०० rpm, ४० डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक मशीनी/शेखर में नमूना शेक, समाधान में प्रोटीन solubilize और प्रोटीन पाचन के लिए आगे बढ़ना ।
  34. एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में प्रोटीन पाचन के लिए तैयार जब तक नमूना तरल नाइट्रोजन और स्टोर में जमा स्नैप ।

2. लिपिड तैयारी (समय ~ 20 मिनट)

  1. एक बार लिपिड नमूने शुष्क कर रहे हैं, 2:1 क्लोरोफॉर्म के २०० μL जोड़ें: शीशी, समाधान में भंवर और हस्तांतरण में एक १.५ एमएल के ट्यूब में मेथनॉल, एक अतिरिक्त २०० μL जोड़ने के लिए कांच की शीशी, भंवर और पिपेट शेष लिपिड और ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
  2. मलबे के बाहर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए १२,००० x g पर नमूने के केंद्रापसारक ।
  3. एक गिलास लिपिड शीशी में supernatant स्थानांतरण और-20 डिग्री सेल्सियस तक नियंत्रण रेखा-ms/एमएस विश्लेषण (नियंत्रण रेखा के लिए अतिरिक्त विवरण-ms/ अनुपूरक तरीकोंमें ms/
  4. तैयार करने के बाद तुरंत नमूनों का विश्लेषण नहीं किया जा सकता है, लिपिड ऑक्सीकरण और क्षरण को रोकने के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर विलायक में संग्रहीत करने की आवश्यकता है ।

3. Metabolite तैयारी और Derivatization (समय ~ 5 ज)

  1. दिन पर निष्कर्षण के बाद, गति Vac से metabolite नमूने निकालें और derivatization और GC पर विश्लेषण के लिए तैयार जब तक-20 ° c सूखी दुकान । अगर एक GC पर चयापचयों नहीं चल रहा है, तो उन्हें साधन के लिए उपयुक्त प्रोटोकॉल का उपयोग कर तैयार.
  2. GC पर विश्लेषण के लिए चयापचयों derivatizing से पहले तुरंत, मेथनॉल के २०० μL जोड़कर बड़े कांच शीशियों से उन्हें हस्तांतरण, भंवर और एक १.५ एमएल के लिए जोड़ ट्यूब. एक बार दोहराएं ।
  3. 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए १२,००० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक । छोटे गिलास शीशियों में supernatant स्थानांतरण, शीर्ष करने के लिए एक सांस झिल्ली जोड़ने के लिए, और एक गति Vac में पूरी तरह से शुष्क ।
  4. Derivatize मध्यम गति से एक भंवर पर 30 एस के लिए नमूना शीशी और भंवर के लिए methoxyamine समाधान के 20 µ एल जोड़कर चयापचयों ।
    चेतावनी: Methoxyamine हाइडरोक्लॉराइड गंभीर जलता है और आंखों को गंभीर नुकसान का कारण बनता है, त्वचा से संपर्क द्वारा संवेदीकरण हो सकता है । सुरक्षा चश्मा, दस्ताने और लैब कोट पहनते हैं, और एक धुएं डाकू में काम करते हैं ।
  5. नमूना पूरी तरह से भंग कर दिया है सुनिश्चित करने के लिए एक स्नान sonicator का प्रयोग करें ।
  6. के साथ एक मशीन में नमूना मशीन एक संघनित्र रोकथाम ढक्कन १,००० rpm मिलाते के साथ 1 एच 30 मिनट के लिए ३७ ° c पर बनाए रखा ।
  7. शीशी एक बार पलटना टोपी की सतह पर गाढ़ा बूंदों के साथ नमूनों मिश्रण करने के लिए । 1 मिनट, आरटी के लिए १,००० x g पर नमूना नीचे स्पिन
  8. 1% trimethylchlorosilane के साथ n-मिथाइल-n-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide के ८० µ l (एक सिरिंज का उपयोग करके) जोड़कर silylation निष्पादित करें । 10s के लिए भंवर ।
    चेतावनी: MSTFA + 1% TMCS त्वचा जंग, गंभीर नेत्र क्षति, और विशिष्ट लक्ष्य अंग विषाक्तता पैदा कर सकता है, और एक ज्वलनशील तरल और भाप है । सुरक्षा चश्मा, दस्ताने और लैब कोट पहनते हैं, और एक धुएं डाकू में काम करते हैं ।
  9. एक मशीन में एक संघनित्र रोकथाम ढक्कन १,००० rpm मिलाते के साथ 30 मिनट के लिए ३७ ° c पर बनाए रखा के साथ नमूना मशीन ।
  10. शीशी एक बार पलटना टोपी की सतह पर गाढ़ा बूंदों के साथ नमूनों मिश्रण करने के लिए ।
  11. २,००० x g, RT पर 5 मिनट के लिए नमूना नीचे स्पिन
  12. GC-MS विश्लेषण के लिए उपयुक्त शीशियों में प्रतिक्रिया व्यक्त समाधान स्थानांतरण.

4. प्रोटीन पाचन (समय ~ 1 डी)

  1. 5 मिनट, आर टी के लिए १५,००० x g पर नमूना केंद्रापसारक, किसी भी मलबे गोली ।
  2. प्रदर्शन फ़िल्टर-सहायता प्राप्त-नमूना तैयारी (FASP) FASP किट का उपयोग कर पाचन के लिए ( सामग्री की तालिकादेखें) निम्नलिखित संशोधित निर्माता के निर्देश31,३२:
    1. एक FASP कॉलम (५०० μL 30K MWCO स्पिन फिल्टर) में 8 मीटर यूरिया बफर के ४०० μL जोड़ें ।
    2. एक बार नमूना केंद्रापसारक समाप्त हो गया है, पिपेट बंद supernatant (गोली त्यागें) और ५० μL के लिए नमूने के कॉलम में 8 मीटर यूरिया के ४०० μL के लिए जोड़ें ।
      नोट: केवल ५० μL करने के लिए प्रति स्तंभ नमूना जोड़ें । यदि नमूना के ५० से अधिक μL है, तो एकाधिक स्तंभों का उपयोग करें और पाचन के बाद पेप्टाइड्स गठबंधन । यह सबसे अच्छा है के रूप में संभव के रूप में कम के रूप में इस मात्रा को छोड़ (30 µ एल आदर्श है) के लिए FASP कॉलम सुनिश्चित एसडीएस जो नाटकीय रूप से बड़े पैमाने पर कल्पना विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कर सकते है के सभी हटा देंगे ।
    3. शामिल १.५ मिलीलीटर ट्यूब में कॉलम प्लेस और 30 मिनट के लिए १४,००० x g पर नमूना केंद्रापसारक, आर टी ।
    4. कचरे में प्रवाह के माध्यम से निकालें और स्तंभ के लिए 8 मीटर यूरिया की ४०० μL जोड़ें और फिर से केंद्रापसारक ।
    5. पिछले चरण 3 यूरिया कुल्ला के एक कुल के लिए एक और समय दोहराएं ।
      नोट: सुनिश्चित करें कि नमूना कॉलम पर सूखापन के करीब चला जाता है, अगर वहां किसी भी अधिक से अधिक ~ 30 µ एल प्रत्येक स्पिन के बाद फिल्टर पर शेष है, केंद्रापसारक जारी है ।
    6. जोड़ें ४०० μL के ५० मिमी NH4HCO3 और 20 मिनट के लिए १४,००० x g पर केंद्रापसारक, अपशिष्ट त्यागें, और एक बार दोहराने ।
    7. एक साफ १.५ एमएल केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए कॉलम स्थानांतरण ।
    8. जोड़ें ७५ μL trypsin पाचन बफर के कॉलम और ३७ ° c के लिए एक मशीन में 3 घंटे के लिए मशीन में एक संघनित्र रोकथाम ढक्कन के साथ ७५० rpm पर ।
    9. जोड़ें ४० µ एल के ५० मिमी NH4HCO3 कॉलम करने के लिए ।
    10. 15 मिनट के लिए १४,००० x g पर नमूना केंद्रापसारक ट्यूब में पेप्टाइड्स इकट्ठा करने के लिए जबकि कॉलम के शीर्ष पर उच्च आणविक भार दूषित पदार्थों रखते हुए ।
    11. जोड़ें ४० μL के 50mM NH4HCO3 के लिए स्तंभ और केंद्रापसारक फिर से ।
  3. कॉलम त्यागें, एक स्पीड Vac में ट्यूब में पेप्टाइड्स नीचे सूखी ~ 30 µ एल, और बीसीए परख (Bicinchoninic एसिड प्रोटीन परख किट; सामग्री की तालिकादेखें) पेप्टाइड्स ।
  4. वैकल्पिक रूप से, एक क्लीन-अप चरण निष्पादित करें यदि एसडीएस दूषण संदिग्ध है (दृश्यमान बबल)३३। एक ठोस चरण निष्कर्षण बाद में किया जाना चाहिए अगर इस विकल्प का चयन । इस क्लीन-अप विधि के बारे में विस्तृत जानकारी अनुपूरक विधियोंमें उपलब्ध है ।
  5. एमएस विश्लेषण के लिए नमूना पतला या वैकल्पिक रूप से HPLC भिन्नीकरण करने के लिए आगे बढ़ना (अगले दो कदम).
  6. fractionate करने के लिए, 10 मिमी अमोनियम formation बफर (पीएच १०.०) के साथ ४०० µ एल की एक मात्रा के नमूनों को पतला ।
  7. एक C18 स्तंभ पर हल ( सामग्री की तालिकादेखें) ०.५ मिलीलीटर पर अलग करके) मोबाइल चरणों के साथ एक HPLC प्रणाली का उपयोग कर (एक) 10 मिमी अमोनियम formate, पीएच १०.० और (ख) 10 मिमी अमोनियम formation, ph 10.0/acetonitrile (10:90) ।
    1. से ढाल समायोजित करें १००% एक से ९५% पहले 10 मिनट, ९५% एक पर ६५% एक से अधिक मिनट के लिए 10 से ७०, ६५% a से 30% एक से अधिक मिनट ७० के लिए ८५, 30% से कम पर बनाए रखने के लिए ८५ ।
    2. पुनः १००% एक से अधिक मिनट ९५ १०५ के साथ equilibrate और १००% a पर पकड़ मिनट तक १२० ।
    3. हर १.२५ मिनट (पूरे ढाल पर ९६ भागों) इकट्ठा और अंत में 12 नमूनों या 24 नमूनों के लिए हर दूसरे पंक्ति की कुल के लिए हर पंक्ति गठबंधन (n के साथ प्रत्येक = 8 या n = 4 भागों परित) ।
  8. शूंय के तहत सभी भागों सूखी और ultrapure पानी की 15 µ एल पर भंडारण के लिए प्रत्येक को जोड़ने-20 ° c जब तक LC-ms/

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Representative Results

जब MPLEx प्रोटोकॉल कैनसस देशी prairie मिट्टी (एक Mollisol मिट्टी) से अणुओं को निकालने के लिए इस्तेमाल किया गया था, तपसिल विश्लेषण ३३७६ पेप्टाइड्स, १०५ लिपिड, और १०२ ध्रुवीय चयापचयों (सभी अद्वितीय पहचान) के लिए परिणाम प्रदान की है । जबकि MPLEx प्रोटोकॉल लिपिड और चयापचयों के सामान्य निष्कर्षण के लिए अच्छी तरह से स्थापित किया गया है12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21,22,23,24,25,26,27 ,28,29,30,३४, मिट्टी प्रोटीन निष्कर्षण किट जैसे माइक्रोबियल विश्लेषण के लिए आम मिट्टी प्रोटीन निष्कर्षण तरीकों से इसकी तुलना ( की तालिका देखें सामग्री) और एसडीएस (सोडियम dodecyl सल्फेट) निकालने३५, आगे यहां का मूल्यांकन किया है । इन तकनीकों का आकलन करने के लिए, कैनसस देशी prairie मिट्टी प्रोटीन प्रत्येक दृष्टिकोण के साथ निकाले गए थे और सीधे उलट-चरण नियंत्रण रेखा के साथ विश्लेषण-ms/एक UPLC एक संकर quadrupole के साथ युग्मित प्रणाली का उपयोग कर/Orbitrap जन स्पेक्ट्रोमीटर । विधि पैरामीटर्स के बारे में विस्तृत जानकारी अनुपूरक विधियोंमें उपलब्ध हैं । प्रत्येक निष्कर्षण दृष्टिकोण से परिणामी प्रयोगात्मक पेप्टाइड ms/एमएस स्पेक्ट्रा प्रतिनिधि कैनसस देशी prairie metagenome2 का उपयोग कर एक कड़े एमएस-GF + वर्णक्रम संभावना कटऑफ से अनुमानित पेप्टाइड अनुक्रम के साथ तुलना की गई 1x10 -10 ३६ , ३७ और 5 पीपीएम से कम की एक सामूहिक त्रुटि कटऑफ । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि MPLEx प्रोटोकॉल का उपयोग मिट्टी से निकाले analytes एमएस के लिए उपयुक्त है आधारित अध्ययन और अंय विश्लेषणात्मक तकनीक । जब शुरू में तुलना तीन MoBio और एसडीएस के ज्ञात तरीकों की प्रतिकृतियां, दो माइक्रोबियल समुदाय और अलग निष्कर्षण प्रभाव की जटिलता दिखा तकनीकों के बीच में छा पेप्टाइड का केवल 12% (चित्रा 2) । MoBio और एसडीएस निष्कर्षों के साथ MPLEx की तुलना पर, ~ MPLEx विधि का उपयोग कर मनाया पेप्टाइड्स का ३८% भी पता चला जब एसडीएस और/या MoBio निकालने का उपयोग कर रहे थे (चित्रा 2) । कैनसस मिट्टी बैक्टीरियल समुदाय और उसके metagenome2में प्रजातियों की संख्या को ध्यान में रखते हुए, पेप्टाइड की पहचान के ओवरलैप उचित और इसकी जटिलता के कारण है, दृष्टिकोण का संयोजन प्रत्येक अकेले से अधिक पेप्टाइड्स अर्क ३५. इसके अलावा, के बाद से इन नमूनों unfractionated थे और केवल 1 आयामी नियंत्रण रेखा से विश्लेषण-एमएस/एमएस, अत्यंत उच्च नमूना जटिलता संभवतः विभिंन पेप्टाइड प्रत्येक दृष्टिकोण द्वारा निकाली सांद्रता के कारण का पता लगाने में कुछ पूर्वाग्रह पैदा कर रहा था । MPLEx प्रोटोकॉल भी ऐसे permafrost और झीलों के रूप में अंय प्रकार की मिट्टी के लिए लागू किया गया है, और सभी मामलों में प्रारंभिक proteomic परिणाम इसी तरह की गुणवत्ता के है कि कैनसस देशी prairie मिट्टी यहां प्रस्तुत आंकड़ों के ।

MPLEx दृष्टिकोण की व्यापक प्रयोज्यता, पहले नमूनों की एक विविध सेट का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया है, archaeon Sulfolobus acidocaldarius, एक unicyanobacterial कंसोर्टियम३८, माउस मस्तिष्क प्रांतस्था ऊतक, मानव मूत्र सहित, और Arabidopsis थालियाना (चित्रा 2)10से पत्ते । ए. थालियानाको छोड़कर सभी नमूनों के लिए, यूरिया निकालने प्रोटीन निकालने के लिए सबसे आम तरीका है, इसलिए वे मूल्यांकन के लिए नियंत्रण दृष्टिकोण के रूप में इस्तेमाल किया गया । ए. थालियाना MPLEx परिणाम एक निष्कर्षण trichloroacetic एसिड (टीसीए) के साथ प्रदर्शन की तुलना में थे क्योंकि संयंत्र पत्ते phenolic यौगिकों कि जरूरत से पहले एमएस विश्लेषणों३९को हटाया जा करने के लिए अमीर हैं । सभी मामलों में, MPLEx विधि से मनाया प्रोटीन की संख्या के लिए समान था कि नियंत्रण10, कई विभिंन प्रकार के नमूने के लिए अपनी उपयोगिता का संकेत है । इसके अलावा, वहां कोई विशिष्ट प्रोटीन सभी नमूना प्रकार (मिट्टी सहित) में निकाले वर्गों के साथ जुड़े प्रवृत्तियों थे । इसलिए, कई जैविक और पर्यावरणीय प्रणालियों के लिए MPLEx की व्यापक प्रयोज्यता यह एक आशाजनक दृष्टिकोण बनाता है ।

Figure 1
चित्र 1. एक योजनाबद्ध MPLEx प्रक्रिया दिखा रहा है, जिसमें चयापचयों, प्रोटीन और लिपिड एक साथ एमएस विश्लेषण के लिए एक ही मिट्टी के नमूने से निकाले जाते हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. MPLEx और एक मानक यूरिया आधारित प्रोटीन निष्कर्षण विधि का उपयोग कर निकाले गए नमूनों की एक विविध सेट के लिए पेप्टाइड ओवरलैप illustrating वेन आरेख सामान्य रूप से प्रदर्शन किया । archaeon एस acidocaldariusके MPLEx निष्कर्षण से डेटा, unicyanobacterial कंसोर्टियम, मानव मूत्र, माउस मस्तिष्क प्रांतस्था, और ए. थालियाना संयंत्र पत्तियों Nakayasu से अनुकूलित, ई. एस. एट अल. २०१६10। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि नहीं सभी प्रयोगशालाओं एक ही उपलब्ध उपकरण तो कुछ तरीकों होगा, उदाहरण के लिए lysis कदम, अनुकूलित किया जा सकता है । यहाँ हम भंवर और sonicating का उपयोग करें, लेकिन एक बड़ी ५० मिलीलीटर मनका डिब्बा का उपयोग काम करेंगे. यदि एक कलेक्टर तापमान में सक्षम के साथ एक lyophilizer-१०५ ° c उपलब्ध नहीं है, तो नमूने एक नाइट्रोजन धारा के तहत सूख जा सकता है । इसके अलावा मिट्टी के प्रकार बहुत भिंनता है और रेत, गाद, क्ले, पीट, और दोमट (आदि), और वे भी पीएच, लवणता, और कार्बनिक पदार्थ समृद्धि के आधार पर भिंन हो सकते है शामिल हो सकते हैं । इन प्रसरणों में से प्रत्येक प्रोटोकॉल पर प्रभाव हो सकता है, इसलिए आवश्यक होने पर समायोजन करने के लिए लचीला होना महत्वपूर्ण है । यह महत्वपूर्ण है, तथापि, कि अनुपात और प्रतिशत एक ही रहते हैं ।

MPLEx प्रोटोकॉल कई जैविक और पर्यावरणीय प्रणालियों में आवेदन के लिए महान वादा और बहु मिट्टी माइक्रोबियल समुदायों के omic विश्लेषण को सक्षम करने की क्षमता से पता चलता है । विभिंन प्रणालियों के लिए अंय निष्कर्षण प्रोटोकॉल के लिए MPLEx की पिछली तुलना पेप्टाइड के एक उच्च डिग्री सचित्र10ओवरलैप । हालांकि, एक मनाया सीमा थी कि MPLEx रक्त प्लाज्मा प्रोटीन है कि जरूरत को समाप्त करने के लिए लागू नहीं किया गया था । इन मामलों में, उपजी प्रोटीन अच्छी तरह से immunodepletion प्लाज्मा proteome के व्यापक कवरेज के लिए आवश्यक कॉलम में एंटीबॉडी द्वारा मांयता प्राप्त नहीं थे । इसलिए, अधिक मानक निष्कर्षण approaches इन परिस्थितियों के अंतर्गत उपयोग किया जाना चाहिए । एक अतिरिक्त सीमा MPLex निष्कर्षण दृष्टिकोण के लिए उल्लेख किया है कि यह intracellular और extracellular प्रोटीन के बीच विचार नहीं करता है, लेकिन यह अंय सभी मिट्टी प्रोटीन निष्कर्षण प्रोटोकॉल के लिए सच के रूप में अच्छी तरह से है ।

इस पांडुलिपि में, MPLEx कैनसस देशी prairie मिट्टी में ३३७६ पेप्टाइड्स, १०५ लिपिड, और १०२ ध्रुवीय चयापचयों के लिए परिणाम प्रदान की निष्कर्षण और विश्लेषण प्रोटोकॉल अनुभाग में विस्तृत विधियों का उपयोग कर । बेहतर ओवरलैप नियंत्रण और MPLEx मिट्टी माइक्रोबियल समुदाय की तुलना में व्यक्तिगत प्रणालियों के दृष्टिकोण में निकाले गए पेप्टाइड्स के बीच मनाया गया था (चित्रा 2). यह एक सीमा नहीं है, लेकिन अत्यंत जटिल मिट्टी माइक्रोबियल समुदायों के साथ काम करने का एक परिणाम है । इन परिणामों को आगे एसडीएस और MoBio के अच्छी तरह से ज्ञात मिट्टी निष्कर्षण तकनीकों के रूप में उल्लेख कर रहे है अच्छी तरह से या तो महान विविधता और कठिनाइयों के कारण मिट्टी प्रोटीन को भी निकालने के लिए ओवरलैप नहीं किया । दिलचस्प है, MPLEx प्रोटोकॉल या तो एसडीएस या MoBio से अधिक कुल पेप्टाइड्स की पहचान की अनुमति दी और भी अतिरिक्त घटक या तो विश्लेषण में नहीं देखा पाया ।

इन टिप्पणियों MPLEx छोटे नमूनों के आकार के साथ काम करने के लिए एक बहुत आशाजनक तकनीक बनाने, समग्र बहु-omic प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को कम करने, और नमूना तैयारी समय को कम करने. MPLEx के साथ संभव लाभ बहु-omic क्षमताओं और विश्लेषण बड़े पैमाने पर माइक्रोबियल समुदाय के अध्ययन के लिए आवश्यक सक्षम करने के लिए देखो ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

आंकड़े तैयार करने में उनकी सहायता के लिए लेखक नाथन जॉनसन का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस शोध के द्वारा समर्थित किया गया पैन-ओमिक्स प्रोग्राम है कि अमेरिका के ऊर्जा विभाग द्वारा वित्त पोषित है जैविक और पर्यावरण अनुसंधान के कार्यालय (जीनोमिक विज्ञान कार्यक्रम), संक्रमण में Microbiomes (मिंट) प्रयोगशाला के अनुसंधान विकास का निर्देशन प्रशांत नॉर्थवेस्ट राष्ट्रीय प्रयोगशाला में पहल, साथ ही साथ स्वास्थ्य राष्ट्रीय पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान (R01 ES022190) और NIH (P42 ES027704) के राष्ट्रीय संस्थानों । KEBJ वित्तीय सहायता के लिए R21 HD084788 का विकास और उपंयास बहु omic निष्कर्षण तकनीकों को मांय करने के लिए धंयवाद देना चाहूंगा । यह काम डब्ल्यू आर विले पर्यावरण आणविक विज्ञान प्रयोगशाला (EMSL), प्रशांत नॉर्थवेस्ट राष्ट्रीय प्रयोगशाला (PNNL) में एक डो राष्ट्रीय वैज्ञानिक उपयोगकर्ता सुविधा में प्रदर्शन किया गया । PNNL एक बहु कार्यक्रम राष्ट्रीय प्रयोगशाला अनुबंध DE-AC06-76RL01830 के तहत डो के लिए बैटल द्वारा संचालित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform Sigma-Aldrich 650498 Stored at -20°C !Caution chloroform has acute potential health effects, skin irritation and possible chemical burns, irritation to the respiratory system, may affect the kidneys, liver, heart. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood.
Methanol Sigma-Aldrich 34860 Stored at -20°C !Caution Methanol may cause respiratory tract, skin and eye irritation, may damage the nerves, kidneys and liver. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood.
Purified water from Millipore Milli-Q Water purification system.
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L6026 !Caution SDS causes acute toxicity and is flammable. It is a skin, eye and airway irritant. Wear gloves and safety glasses.
Soil protein extraction kit MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen 30000-20
DL-dithiothreitol Sigma-Aldrich 43815
1M Trizma HCL Sigma-Aldrich T2694
Trichloroacetic acid Sigma-Aldrich T0699 !Caution TCA is caustic, toxic and may cause skin burns. Wear gloves and safety glasses.
Acetone Sigma-Aldrich 650501 Stored at -20°C !Caution Acetone may cause respiratory tract and skin and eye irritation. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses gloves and a lab coat, work in a fume hood.
Urea Sigma-Aldrich 208884 !Caution Urea is an eye and skin irritant, use gloves and safety glasses
Ammonium bicarbonate Fluka 09830
Trypsin Promega V528A 20µg vials
Bicinchoninic acid protein assay kit Pierce 23227
Ammonium Formate Sigma-Aldrich 09735
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34998 !Caution Acetonitrile is a skin and eye irritant. Highly flammable. Wear gloves and safety glasses. Work in a fume hood.
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508 !Caution TFA is extremely hazardous in case of skin contact, eye contact, ingestion and inhalation. May produce tissue damage particularly on mucous membranes of eyes, mouth and respiratory tract. Skin contact may produce burns. Wear gloves, lab coat, safety glasses and work in a fume hood.
Methoxyamine hydrochloride Sigma-Aldrich 226904 !Caution Methoxyamine hydrochloride causes severe burns and serious damage to eyes, may cause sensitization by skin contact. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood.
Pyridine Sigma-Aldrich 270970 !Caution Pyridine can cause skin and eye irritation, central nervous system depression. Vapor may cause flash fire. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood.
N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trimethylchlorosilane Sigma-Aldrich 69478 !Caution MSTFA + 1% TMCS can cause skin corrosion, serious eye damage and specific target organ toxicity. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood.
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Milli-Q water purification system Millipore model MPGP04001
Vortex Scientific Industries SI-0236 Vortex Genie 2
Probe sonicator FisherBrand model FB505
Refrigerated centrifuge Eppendorf model 5810R
50mL tube swinging bucket rotor Eppendorf A-4-44
50mL fixed angle rotor Eppendorf FA-45-6-30
Balance OHAUS model V22PWE150IT
Serological pipette controller Eppendorf 12-654-100
10mL, 25mL glass serological pipettes FisherBrand 13-678-27F, 13-678-36D
Thermomixer with Thermotop Eppendorf 5382000015, 5308000003
0.9 – 2.0 mm blend stainless steel beads NextAdvance SSB14B
0.15 mm garnet beads MoBio 13122-500
Magnetic stir plate FisherBrand 11-100-16SH
Magnetic stir bar FisherBrand 14512130
pH paper strips, pH range 0–14 FisherBrand M95903
15mL, 50mL conical polypropylene centrifuge tube Genesee Scientific 21-103 21-108 chloroform compatible
50mL vortex attachment MoBio 13000-V1-50
Ice bucket FisherBrand 02-591-44
27.25x70mm glass vials FisherBrand 03-339-22K
Breathe Easier plate membranes Midwest Scientific BERM-2000
Alcohol wipes Diversified Biotech BPWP-1000
Heater shaker incubator Benchmark, Incu-Shaker Mini
Analog rotisserie tube rotator SoCal BioMed, LLC 82422001
Filter-Aided-Sample-Prep kit FASP; Expedeon 44250
Microplate reader Biotek, EPOCH
-20 Degree Celsius Freezer Fisher 13986149
-80 Degree Celsius Freezer Stirling Ultracold SU78OUE
Q-Exactive ion trap mass spectrometer Thermo Scientific
Agilent 7890A gas chromatograph coupled with a single quadrupole 5975C mass spectrometer Agilent Technologies, Inc.
LTQ-Orbitrap Velo Thermo Scientific
Waters NanoEquityTM UPLC system Millford, MA
250mL media bottle FisherBrand 1395-250
Waters vial Waters 186002805
Glass MS sample vial and inserts MicroSolv 9502S-WCV, 9502S-02ND
Glass HPLC vial and snap caps MicroSolv 9512C-0DCV, 9502C-10C-B
HPLC 96-well plate Agilent 5042-6454
Large glass vial 27.25x70mm FisherBrand 03-339-22K
Lyophilizer Labconco 7934021
Polished stainless steel flat head spatula Spoonula; FisherBrand 14-375-10
Kim wipes Kimberly-Clark 34721
XBridge C18, 250x4.6 mm, 5 μM with 4.6x20 mm guard column Waters 186003117, 186003064
Agilent 1100 series HPLC system Agilent Technologies G1380-90000
1.7mL centrifuge tube Sorenson 11700
Hamilton Glass Syringes, 5mL, 50µL and 250µL Hamilton 81517, 80975, 81175
Pasteur Pipettes FisherBrand 13-678-20A
Pasteur Pipette Bulbs Sigma-Aldrich Z111597
Bath Sonicator Branson 1800 Ultrasonic Cleaner
Vacuum Centrifuge Labconco Centrivap Acid-Resistant Concentrator System
MicroSpin Columns, C18 Silica The Nest Group SEM SS18V

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रसायनशास्त्र अंक १३५ MPLEx Metaproteomics Lipidomics Metabolomics बहु-ओमिक्स मास स्पेक्ट्रोमेट्री
मिट्टी के नमूनों के बहु-omic िरा के लिए MPLEx प्रोटोकॉल
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Nicora, C. D., Burnum-Johnson, K.… More

Nicora, C. D., Burnum-Johnson, K. E., Nakayasu, E. S., Casey, C. P., White III, R. A., Roy Chowdhury, T., Kyle, J. E., Kim, Y. M., Smith, R. D., Metz, T. O., Jansson, J. K., Baker, E. S. The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples. J. Vis. Exp. (135), e57343, doi:10.3791/57343 (2018).

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