Summary
프로토콜은 동시에 하나의 토양 샘플에서 대사 산물, 단백질과 지질을 추출, 감소 샘플 준비 시간 허용 및 한정 된 수량으로 샘플의 멀티-omic 질량 분석 분석을 활성화에 대 한 제공 됩니다.
Abstract
질량 분석 (MS)-기반된 통합된 metaproteomic, metabolomic, 및 lipidomic (멀티-omic) 연구 우리의 능력을 이해 하 고 환경 및 생물 학적 시스템에서 미생물 지역 사회 특성을 변형 시키고 있다. 이러한 측정도 가장 복잡 한 토양 미생물 커뮤니티의 향상 된 분석 사용 하 고 있습니다 현재까지 알려진 복잡 한 미생물 시스템. 그러나 멀티-omic 분석,, 있다 샘플 준비 과제, 별도 기사는 일반적으로 매우 준비 시간과 필요한 샘플의 양을 증폭 각 omic 연구를 위해 필요 하기 때문. 이 한계를 해결 하기 위해 3-에서-1 방법 같은 토양 샘플에서 대사, 단백질, 지질 (MPLEx)의 동시 추출 용 매 기반 접근을 적응 하 여 만들었습니다. 이 MPLEx 프로토콜은 모두 간단 하 고 많은 샘플 유형에 대 한 강력한 복잡 한 토양 샘플의 한정 된 수량에 대 한 활용 하는 경우에 입증 되었습니다. MPLEx 메서드는 또한 크게 생물학과 환경 물결 따라 변화를 평가 하는 동안 각 미생물 커뮤니티의 구성원의 더 나은 이해를 얻기 위하여 필요한 급속 한 멀티-omic 측정을 사용할 수 있습니다.
Introduction
토양 미생물 지역 사회 평가 탄소 순환, 기후 변화를 이해 하기 위한 중요 한 의미를 갖는다. 그러나 최근 연구는 어려움을, 다양 한 토양 유형 microbiota에 대 한 시퀀스 게놈의 부족 및 감지 하는 단백질의 많은 것의 알 수 없는 기능 등을 강조 했다. 이러한 도전 결과1,,23현재까지 알려진 가장 복잡 한 미생물 지역 사회 토양 때문. 멀티-omic 분석, metagenomic, metatranscriptomic, metaproteomic, metabolomic, 및 lipidomic 연구에서 결과 결합 하는 최근 미생물 존재, 동안에 더 큰 이해를 얻기 위해 수많은 토양 연구에서 구현 되었습니다. 때문에 환경 섭1,,45분자 변화에 대 한 포괄적인 정보를 얻는. 멀티-omic 연구와 함께 한 가지 문제는 질량 분석 (MS)-기반으로 metaproteomic, metabolomic, 및 lipidomic 측정은 일반적으로 각 omic MS 호환6,7 에 대 한 특정 추출 과정 필요 , 8 , 9.이 정확한 절차 확인의 구현을 매우 어렵거나 불가능 한 때 샘플의 한정 된 수량만 사용할 수. 이러한 과제는 우리 동시 대사 산물, 단백질 및 지질 추출 (MPLEx) 방법 작은 샘플 볼륨 또는 대 중을 사용 하 여 정확도 개선 하 고 제공 하는 모든 3 개의 분석에 대 한 빠른 샘플 준비 조사를 자극합니다 10. 데이트 하 고, 이러한 목표를 모두 달성할 수 있는 대체 토양 추출 절차가 필요 하지 않습니다.
글로벌 멀티-omic 단일 토양 샘플의 분석을 사용 하려면 클로 프롬, 메탄올, 물 분판 기반으로 하는 유기 용 매 추출 프로토콜 사용된10이었다. 이 메서드는 원래 총 지질 기사9,11 에 대 한 개발 및 최근에 단일 샘플12,13 에서에서 대사 산물, 단백질과 지질 동시 추출에 대 한 개정 했다 14,15,16,17,18,19,20,,2122, 23,,2425,26,27,28,29,30, 적은 샘플 수량을 사용 하 고 실험적 변화10. MPLEx 프로토콜에서 클로 프롬은 별개 조각으로 샘플 성분의 triphasic 화학 별거를 위한 기초를 제공 하는 물과 혼합할 수 있는. 최고 수성 단계 따라서 친수성 대사, 단백질 디스크 그리고 지질 층 하단 클로 프롬 단계 (그림 1)에서 다음을 포함 합니다. MPLEx 대부분 토양에 적용 될 때 미 립 자 파편 샘플링 튜브의 맨 아래에 축적 하 고 모든 레이어는 수집 된 후 삭제 될 수 있습니다. 그러나 각 토양 유형 다를 수,, 및이 탄 등 높은 유기 토양, 토양 파편 중간 계층에 샘플링 튜브의 바닥에 떨어지지 않습니다. MPLEx 1) 작은 샘플 양이 멀티-omic 분석, 2) 멀티-omic 기사 같은 샘플 감소에서 사용 될 수 있습니다와 같은 동일한 샘플에서 유형 여러 분자를 분리 하면 몇 가지 장점이 제공 전반적인 실험 가변성, 그리고 샘플의 3) 큰 숫자 높은 처리량 연구10훨씬 더 빨리 준비 될 수 있습니다. 함께 이러한 혜택은 토양 샘플 및 그들의 복잡 한 미생물 지역 사회를 평가 하기 위한 더 나은 측정 기능을 제공 하기 위한 중요 합니다.
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Protocol
참고: 매우 젖은 토양 이전 효과에 손해 없이 추출 추출의 lyophilized 수 있습니다. 젖은 토양 또한 사용 될 수 있지만 특정 비율에 시 약을 추가할 때 고려해 야 합니다.
참고:이 좋습니다 추출, 두 50 mL 튜브 (최대 50 mL 튜브 당 10 g 토양) 사이 분할 한다 당 건조 한 토양 중량의 20 g을 사용 하 여. 추출 또는 사용 가능한 샘플에 따라 다름 아래로 확장할 수 있습니다.
참고: 건조 한 토양 샘플 균질 하 고 작은 뿌리와 바위를 제거 하기 위해 3 m m 스크린을 통해 sieved 될 수 있습니다. 샘플 화면에 붙어 얻을 것 이다 젖은 토양 샘플을 체질 하지 마십시오.
1. 토양 세포 세포의 용 해 및 대사, 단백질, 지질 (타이밍 ~ 1 d)의 추출
- 20 g 토양 샘플 당 메탄올/클로 프롬 호환 되는 두 개의 별도 50 mL 튜브에 10 g를 무게. 조심 선택, 튜브와 함께 클로 프롬 샘플 오염 대부분 플라스틱 거르는 것으로 합니다. 유리를 사용 하 여 언제 든 지 가능한 또는 플라스틱 튜브 폴 리 프로필 렌 또는 소계 (PTFE)에서 만든.
참고: 계속 멋진 얼음 토양 초기 무게 및 균질 단계 동안 가능한. - 각 튜브를 클로 프롬 씻어 스테인레스 스틸과 가닛 구슬의 10 mL를 추가 합니다. 얼음, 차가운 초순의 4 개 mL를 추가 물 (정화 시스템에 대 한 재료의 표 참조) 각 관 (2 개의 관 사이 한 샘플 분할)와 증기 두건으로 얼음 양동이에 샘플을 전송.
- 25 mL 유리 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 신속 하 게 얼음 처럼 차가운 2:1 클로 프롬: 메탄올 (v/v) 20 mL를 추가 합니다.
주의: 클로 프롬: 메탄올은 급성 잠재적 건강 영향: 피부 자극, 가능한 화학 화상, 및 호흡 체계에 자극. 그것은 신장, 간, 그리고 심 혼 영향을 미칠 수 있습니다. 적합 한 보호 안경, 의류, 장갑, 착용 하 고 항상 증기 두건에서 작동. - 솔루션으로 뚜껑과 소용돌이 조입니다. 2:1 choloroform:methanol 원핵생물의 세포 벽을 분해 하 고 또한 효소 활동은 합니다.
- 50 mL 튜브 소용돌이 첨부 파일 및 수평 냉장고 안에 4 ° C에서 10 분에 대 한 소용돌이를 가능 하면 튜브를 연결 합니다. 다음, 그들을 완전히 진정 위해 ~ 15 분-80 ° C 냉장고 내부 샘플 장소.
- 30에 대 한 진폭 60%에서 6 m m (1/4") 프로브 각 샘플을 sonicate 증기 두건 안쪽 프로브 sonicator를 사용 하 여 s 각 얼음에.
주의:이 좋습니다 sonicating 동안 인클로저 및 귀 보호를 감소 시키고 소리를 사용 하 여. 높은 전압은 전원 공급과 높은 주파수 케이블에. 액티브 프로브; 하단 또는 샘플 용기 측면을 만지지 마십시오 그것은 균열 또는 플라스틱을 녹여 수 있습니다. - 많은 열을 생성할 수 있습니다 sonicating 샘플 ~ 15 분,-80 ° C 냉장고에 놓습니다.
- 1.5-1.7 단계를 반복 합니다.
참고: 샘플 세포 절차 동안 차가운 체재 다는 것을 확인 하십시오. - 5 분, 4 ° c.에 대 한 4000 x g에서 샘플을 원심 이 시점에서, 샘플 위 대사 산물 레이어, 단백질 interlayer 낮은 지질 층 (및 나머지 파편 펠 릿)으로 구분 됩니다. 그림 1을 참조 하십시오.
- 샘플 얼음 양동이에 얼음에 놓고, 증기 두건 및 10 mL 유리 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 내부 레이어를 제거는 위 대사 산물 2 50 mL 튜브에서 하나의 큰 유리 유리병에.
참고: 피할 피 펫;으로 단백질 층의 발음 필요한 경우 대사 산물의 작은 레이어를 남겨 주세요. - 약간 틸트 되도록 낮은 지질 층에 무료 부동 단백질 interlayer 출시 50 mL 튜브. 특 종 단백질 interlayers의 둘 다 신중 하 게 깨끗 한 스테인리스 플랫 헤드 랩 주걱을 사용 하 고 하나의 새로운 50 mL 튜브에 함께 넣어.
- 25 mL 유리 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 하나의 대형 유리 유리병으로 낮은 지질 레이어를 제거 합니다.
참고: 주목 받는 토양 입자;을 피하려고합니다 그러나 일부 토양 파편 및 입자와 함께 갈망 하는, 지질 나중에 제거 됩니다. - 대사 산물 및 지질 위에 숨 막 유리 튜브와 건조까지 진공 집중 장치에 건조 장소 (지질 ~ 4-5 h metabolites 하룻밤).
- 단백질 샘플 튜브를 나머지 파편 펠 렛 튜브 각 얼음 메탄올과 소용돌이의 20 mL를 추가 합니다. 이것은 클로 프롬 그것을 던지기 전에 파편의 어떤 가능한 남은 단백질을 solubilize 하려고 하기 전에 씻어 하 파편 펠 릿에 이루어집니다.
- 원심 분리기 파편 펠 릿 및 단백질에 5 분, 4 ° C, 4000 x g interlayer 다음 증기 두건 안쪽 유해 폐기물 컨테이너에 메탄올을 가만히 따르다
- 액체 질소에 단백질 및 파편 펠 릿을 동결 하 고 (와 함께 수집가 온도-98 ° C의 매우 낮은 어는 점 데 메탄올 때문-105 ° C의) lyophilizer에서 건조 ~ 2 시간.
참고: 않습니다-건조 하지 펠 릿로 그들은 solubilize 더 어려울 것 이다. - 단백질 중간층 튜브 및 파편 펠 릿의 각각에 20 mL의 단백질 가용 화 버퍼 (4 %SDS, 50 mM tris 버퍼, pH 8.0에서에서 100 m m DTT (DL-dithiothreitol); 보십시오 보충 시 설정) 10 mL를 추가 합니다.
주의: SDS 급성 독성 원인과 가연성 이다. 그것은 피부, 눈, 그리고 기도 자극입니다. 장갑, 안전 안경 착용. - 증기 두건에서 프로브 sonicate 30 20% 진폭에서 샘플 솔루션에 그들을가지고 s. 2 분 동안 소용돌이입니다.
- 단백질 중간층 샘플을 solubilize 단백질을 300 rpm, 50 ° C에서 30 분 동안 실험실 관 회전에 넣으십시오.
- 가로로 소용돌이 추가 10 분 모든 나머지 그대로 세포를 lyse 파편 샘플 다음 회전 나머지 20 분 단백질 중간층 샘플.
- 10 분, 실 온 (RT), 4500 x g에서 샘플의 모든 원심 고 두 50 mL 튜브 각 튜브 샘플 당에서 상쾌한을 수집 합니다.
- 가용 화 10 mL 단백질 중간층 펠 릿에 버퍼 sonicate 그리고 소용돌이 이전과 솔루션 및 원심 분리기에 다시 추가 합니다.
- 똑같이 두 50 mL 튜브는 supernatants를 결합 하 고 8000 x g 10 분, 고정된 각도 양동이 터에 4 ° C에서 원심.
참고: 최종 원심 분리는 과도 한 오염 humic 물질을 제거 하는 데 필요한. - 각 30 mL 되도록 두 50 mL 튜브는 supernatants를 가만히 따르다. 그런 다음, 각 튜브를 TCA (trichloroacetic 산)의 7.5 mL를 추가 10 mL 유리 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여. 솔루션으로 소용돌이입니다. 이것은 20 %TCA 각 30ml 샘플에서 (조절),
주의: TCA는 부식성, 독성 및 5 월 피부 화상을 일으킬. 장갑, 안전 안경 착용. - 하룻밤에 2 h-20 ° C 냉동 실에 샘플을 놓습니다.
참고: 단백질 일반적으로 1 시간 이내 침전 됩니다 하지만 왼쪽 하룻밤 (18 h까지) 될 수 있습니다.
참고: TCA 추출 단백질의 가능한 산 성 가수분해 때문 18 h 이상가 게 하지 마십시오. 샘플을 동결 하는 경우 얼음;에 녹여 샘플을 thaw 과거 워밍업 하지 마십시오. - 침전 된 단백질 펠 렛, 원심 4500 x g 10 분, 4 ° C에서 샘플 하 고 폐기물에는 상쾌한 가만히 따르다.
- 1 개의 관으로 각 단백질 펠 릿, 소용돌이 및 펠 릿 처럼 조합 100% 얼음 아세톤 10 mL를 추가 합니다.
- 원심 관 (를 사용 하 여 균형), 결합 된 펠 릿을 포함 하 고 폐기물에는 상쾌한을 가만히 따르다.
주의: 아세톤 호흡기 및 피부와 눈 자극, 발생할 수 있습니다 고 인화성 액체와 증기 이다. 증기 두건에서 작동, 안전 안 경과 장갑과 실험실 외 투를 착용 하십시오. - 두 번 아세톤 2 mL 튜브 5 분 10000 x g에서 마지막 스핀에 대 한 마지막 전송의 1.5 mL를 사용 하 여 펠 릿을 세척.
- 폐기물에는 상쾌한 가만히 따르다 고 건조 펠 릿 거꾸로 연기 후드 ~ 20 분 또는 질소 스트림 아래에 종이 지우기에는 펠 릿 약간 균열 시작 될 때까지.
- 펠 릿의 크기에 따라 단백질 가용 화 버퍼의 100-200 µ L를 추가 합니다.
참고: 가능한 샘플에 추가 가용 화 버퍼의 볼륨을 유지. 이후 필터 지원 샘플 준비 (FASP) 열; 당 solubilized 샘플의 50 μ까지 사용할 수 있습니다. 어떤 더 분할할 여러 FASP 열 수 있어야 합니다. - Sonicate와 소용돌이 솔루션으로 펠 릿. 참고 샘플 humic 물질 후속 원심 분리와 제거 될 것 이다 단백질 함께 계기 인 점도 있을 수 있습니다.
- 솔루션으로 단백질을 solubilize 단백질 소화를 진행 하는 샘플 300 rpm, 40 ° C에서 30 분 동안 인큐베이터/셰이 커에 흔들어.
- 스냅은 단백질 소화에 대 한 준비까지 액체 질소와-80 ° C 냉동 고가 게에서 샘플을 동결.
2. 지질 준비 (타이밍 ~ 20 분)
- 지질 샘플 건조 되 면, 추가 솔루션으로 소용돌이 및 1.5 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 유리병을 2:1 클로 프롬: 메탄올의 200 μ 유리에 추가 200 μ 추가 유리병, 소용돌이 나머지 지질 플라스틱 튜브에 전송.
- 4 ° c.에서 5 분 동안 12000 x g에서 샘플에서 파편을 원심
- LC-MS/MS 분석 (LC-MS/MS 보충 방법에 대 한 추가 정보)까지 상쾌한 유리 지질 유리병-20 ° C에서 저장소로 전송 합니다.
- 샘플 준비 후 즉시 분석 될 수 없습니다, 경우 지질 산화와 저하를 방지 하기 위해-20 ° C에서 용 매에 저장 될 필요가 있다.
3. 대사 산물 준비 및 Derivatization (타이밍 ~ 5 h)
- 추출 다음 날 속도 Vac에서 대사 산물 샘플을 제거 하 고 derivatization 및 GC 분석에 대 한 준비까지-20 ° C에서 건조 저장 합니다. 그렇지 않다면 다음 악기에 대 한 적절 한 프로토콜을 사용 하 여 준비를 GC에는 대사 산물을 실행.
- GC 분석에 대 한 대사 산물을 derivatizing, 직전 양도할 대형 유리 튜브에서 메탄올, vortexing 및 1.5 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 추가 200 μ를 추가 하 여. 한 번 반복 합니다.
- 12000 x g 10 분, 4 ° c.에 관을 원심 작은 유리 튜브에는 상쾌한 전송, 추가 숨 막 상단에 속도 Vac에서 완전히 건조.
- 샘플 유리병 및 30에 대 한 소용돌이에 methoxyamine 솔루션의 20 µ L을 추가 하 여 metabolites derivatize 중간 속도로 vortexer에 s.
주의: Methoxyamine 염 심한 화상과 눈에 심각한 손상의 원인, 과민성 피부 접촉에 의해 발생할 수 있습니다. 안전 안경, 장갑, 실험실 외 투를 착용 하 고 증기 두건에서 작동. - 목욕 sonicator를 사용 하 여 샘플 완전히 용 해 되도록.
- 결로 예방 뚜껑 1000 rpm 떨고 1 h 30 분 동안 37 ° C에서 유지는 인큐베이터에서 샘플을 품 어.
- 반전 유리병 뚜껑 표면에 응축 된 방울과 샘플을 섞어 한 번. 1 분, 실시간 1000 x g에 아래로 샘플을 회전
- (주사기를 사용 하 여) 하는 80 µ L n 추가 하 여 수행 하는 silylation-메 틸-N-(trimethylsilyl) 1 %trimethylchlorosilane trifluoroacetamide. 10 초에 대 한 소용돌이입니다.
주의: MSTFA + 1 %TMCS 피부 부식, 심각한 눈 손상, 및 특정 표적 장기 독성을 일으킬 수 있습니다 고 인화성 액체와 증기 이다. 안전 안경, 장갑, 실험실 외 투를 착용 하 고 증기 두건에서 작동. - 30 분 동안 37 ° C에서 흔들어 1000 rpm 유지 응축 방지 뚜껑 인큐베이터에서 샘플을 품 어.
- 반전 유리병 뚜껑 표면에 응축 된 방울과 샘플을 섞어 한 번.
- 2000 x g, 실시간에 5 분 동안 아래로 샘플을 회전
- GC-MS 분석에 대 한 적절 한 튜브에 반작용된 솔루션을 전송 합니다.
4. 단백질 소화 (타이밍 ~ 1 d)
- 5 분, RT, 작은 어떤 파편 든 지를 위한 15000 x g에서 샘플 원심
- 필터 원조 샘플 준비 (FASP) 수행 FASP를 사용 하 여 소화 키트 ( 재료의 표참조) 다음 제조 업체의 지침31,32수정:
- 8 M 요소 버퍼의 400 μ FASP 열 (500 μ 30 K MWCO 스핀 필터)에 추가 합니다.
- 샘플 centrifuging 완료 되 면, 상쾌한 (삭제는 펠 릿)에서 플라스틱 고 8 M 요소는 열에서의 400 μ에 샘플의 최대 50 μ를 추가 합니다.
참고: 추가 열 당 샘플의 최대 50 μ. 50 μ 샘플의 경우 여러 열을 사용 하 고 소화 후에 펩 티 드 결합. 이 볼륨을 가능한 한 낮게 떠날 것이 좋습니다 (30 µ L 이상적 이다)는 FASP를 보장 하기 위해 열 것입니다 모두 제거 SDS 극적으로 질량 spec 분석을 방해할 수 있습니다. - 열 포함된 1.5 mL 튜브에 놓고 30 분, 실시간 14000 x g에서 샘플을 원심
- 낭비로 통해 흐름 제거 하 고 열에 8m 우 레 아의 400 μ를 추가 하 고 다시 원심.
- 한 번 더 3 요소 린스의 총에 대 한 이전 단계를 반복 합니다.
참고: 샘플은 열에 건조 가까이 있는지 확인 하십시오 어떤 경우 보다 더 ~ 각 스핀 후 필터에 남아 있는 30 µ L centrifuging 계속. - 20 분 14000 x g에서 50mm NH4HCO3 와 원심 분리기의 400 μ를 추가 하 고 폐기물을 버리고 한 번 반복.
- 깨끗 한 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 열을 전송.
- 트립 신 소화 버퍼의 75 μ는 열을 추가 하 고 750 rpm에서 결로 방지 뚜껑 인큐베이터에서 3 h 동안 37 ° C에서 품 어.
- 열에 50mm NH4HCO3 40 µ L를 추가 합니다.
- 14000 x g 15 분 열 위에 높은 분자량 오염 물질을 유지 하면서 튜브에는 펩 티 드를 수집에서 샘플 원심
- 열 및 원심 분리기를 50mm NH4HCO3 40 μ를 다시 추가 합니다.
- 열, 튜브 ~ 30 µ L, 및 BCA 분석 결과 (Bicinchoninic 산 성 단백질 분석 실험 키트, 참조 테이블의 자료) 속도 Vac에 펩 티 드 다운 건조는 펩 티 드.
- SDS 오염 (보이는 거품)33의심 되는 경우 필요에 따라 정리 단계를 수행 합니다. 고체 상 추출이이 옵션을 선택 하는 경우에 이후에 수행 되어야 합니다. 이 정리 방법에 대 한 자세한 내용은 보충 방법에서 이용하실 수 있습니다.
- MS 분석을 위한 샘플을 희석 하거나 선택적으로 HPLC 분류 (다음 두 단계)에.
- 충분치, 10 m m 염화 편대 버퍼 (pH 10.0) 400 µ L의 볼륨 샘플을 희석.
- C18 열에 해결 ( 재료의 표참조) 0.5 mL/min HPLC 시스템을 사용 하 여 모바일 단계 (A) 10 mM 암모늄 편대, pH 10.0와 (B)에서 10 m m 염화 편대, pH 10.0/이기 (10:90)을 구분 하 여.
- 최소 10 ~ 70, 65 %A 분 70 ~ 85, 30 %A 분 85 ~ 95 이상에서 유지 이상 30 %A 통해 100% A 95 %A 처음 10 분, 95 %A 65 %A 그라디언트를 조정 합니다.
- 다시 분 95 105 이상 100% A equilibrate 누르고 100 %A 120 분까지 있습니다.
- 분수 모든 1.25 분 (96 분수 전체 그라데이션 이상의)를 수집 하 고 마지막으로 12 샘플 또는 24 샘플에 대 한 다른 모든 행의 총에 대 한 모든 행을 결합 (각각 n = 8 또는 n = 4 분수 풀링된).
- 모든 분수 진공에서 건조 하 고 LC-MS/MS 분석까지-20 ° C에서 스토리지에 대 한 각 초순의 15 µ L를 추가 합니다.
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Representative Results
MPLEx 프로토콜은 캔자스 네이티브 대초원 토양 (Mollisol 토양)에서 분자를 추출 하는 데 사용 됩니다, triplicate 분석 3376 펩 티 드, 105 지질 및 102 극 대사 (모든 고유 식별)에 대 한 결과 제공. 반면 MPLEx 프로토콜 지질과 대사 산물12,13,14,15,,1617,18의 일반적인 추출 잘 설립 되었습니다 ,19,20,21,22,23,,2425,26,27 ,,2829,,3034, 토양 단백질 추출 키트 (참조 테이블의 같은 미생물 분석을 위한 일반적인 토양 단백질 추출 방법의 비교 재료) SDS (라우릴 황산 나트륨) 기사35, 여기 평가 추가 됩니다. 이러한 기술 평가, 캔자스 네이티브 대초원 토양 단백질 각 방식으로 추출 하 고 반전 단계 LC-MS/MS UPLC 시스템 하이브리드 4 중 극/Orbitrap 질량 분석기와 결합을 사용 하 여 직접 분석 했다. 메서드 매개 변수에 대 한 자세한 내용은 보충 방법에서 사용할 수 있습니다. 각 추출 방법에서 MS/MS 스펙트럼 예측된 펩 티 드와 비교 되었다 결과 실험 펩 티 드 대표에서 캔자스 네이티브 프레리 metagenome2 엄격한 MS를 사용 하 여 시퀀스-GF + 스펙트럼 확률 1 x 10의 컷오프 -10 36 , 37 그리고 5 ppm 미만의 대량 오류 컷오프. MPLEx 프로토콜을 사용 하 여 토양에서 추출한 analytes는 MS 기반 연구 및 기타 분석 기법에 대 한 적합을 주목 한다. 처음 3 비교 MoBio와 SDS의 알려진된 방법의 복제, 미생물 지역 사회와 다른 추출 효과 (그림 2)의 복잡성을 보여주는 두 기법 사이 펩 티 드의 12%만 겹쳐. MoBio 및 SDS 추출 물과 MPLEx의 비교, 시 MPLEx 메서드를 사용 하 여 관찰 하는 펩 티 드의 ~ 38 %SDS 또는 MoBio 기사 (그림 2)를 사용 하 여 때 또한 감지 했다. 캔자스에 있는 종의 수를 고려 하면 토양 세균 지역 사회와 그것의 metagenome2, 펩 티 드 신원의 오버랩은 합리적인 및 그것의 복잡으로 인해 접근의 조합 추출 각 혼자 보다 더 많은 펩 티 드 35. 또한,이 샘플은 unfractionated만 1 차원 LC-MS/MS 분석 이후 매우 높은 샘플 복잡성 가능성이 발생 했습니다 일부 바이어스 탐지 각 접근 방식에 의해 추출 하는 다른 펩 티 드 농도 때문에. MPLEx 프로토콜 또한 영구와 습지, 다른 토양 유형에 적용 되며 모든 경우에 예비 proteomic 결과 여기에 제시 된 캔자스 네이티브 대초원 토양 데이터의 유사한 품질의.
MPLEx 접근의 광범위 한 적용은 이전 평가 샘플, Sulfolobus acidocaldarius, unicyanobacterial 컨소시엄38, 마우스 뇌 피 질 조직, 인간 소변, archaeon 등의 다양 한 집합을 사용 하 고 애기 thaliana (그림 2)10에서 출발 한다. A.thaliana를 제외 하 고 모든 샘플에 대 한 요소 추출 그래서 그들은 평가 위한 제어 방법으로 이용 되었다 단백질, 추출 하는 가장 일반적인 방법은 있습니다. A. thaliana MPLEx 결과 추출 식물 잎 MS 분석39전에 제거 될 필요가 있는 페 놀 화합물에 풍부 하기 때문에 trichloroacetic 산 (TCA) 수행에 비교 되었다. 모든 경우에, MPLEx 방법에서 관찰 하는 단백질의 수는 컨트롤10, 나타내는 많은 다른 샘플 형식에 대 한 자사의 유틸리티에 대 한 유사 했다. 또한, 모든 샘플 형식 (토양 포함)에서 추출한 특정 단백질 클래스와 연결 된 아무 동향 했다. 따라서, 수많은 생물학과 환경 시스템에 MPLEx의 광범위 한 적용 하면 유망한 접근 있습니다.
그림 1입니다. 어떤 대사에서 MPLEx 프로세스를 보여주는 회로도 단백질과 지질 동시에 추출 됩니다 MS 분석에 대 한 동일한 토양 샘플에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 일반적으로 MPLEx 및 표준 요소 기반 단백질 추출 메서드를 사용 하 여 추출 하는 샘플의 다양 한 집합에 대 한 펩 티 드 오버랩을 보여주는 벤 다이어그램 수행. Archaeon S.acidocaldarius의 MPLEx 추출, unicyanobacterial 컨소시엄, 인간 소변, 마우스 뇌 피 질, 및 A.thaliana 공장에서 데이터 나뭇잎 나카 야 스, E. S. 외. 201610에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
그것은 특정 방법, 예를 들어 세포 단계, 적응 시킬 수 있다 그래서 모든 실험실 같은 사용 가능한 장비 해야한다 참고 해야 합니다. 그러나 여기 우리 사용 vortexing sonicating, 큰 50 mL 비드 때리는 사용 하 여 작동 합니다. Lyophilizer-105 ° C의 온도 수집기와 사용할 수 없는 경우 샘플 질소 스트림 아래 건조 수 있습니다. 또한 토양 유형을 크게 다르며 모래, 갯벌, 찰 흙,이 탄, 및 옥 토 (등), 포함 될 수 있습니다 그리고 그들은 또한 pH, 염 분, 유기 물 풍부에 따라 달라질 수 있습니다. 유연 하 고 필요할 때 조정 하는 것이 중요 하다 그래서 각 이러한 차이 프로토콜에 영향을 가질 수 있습니다. 그러나 그것은 중요 한,, 그 비율 및 백분율 동일 하 게 유지입니다.
MPLEx 프로토콜 수많은 생물 및 환경 시스템 및 토양 미생물 지역 사회의 멀티-omic 분석을 활성화 하는 기능에서 응용 프로그램에 대 한 큰 약속을 보여줍니다. 다양 한 시스템에 대 한 다른 추출 프로토콜에 MPLEx의 이전 비교 그림 펩 티 드 오버랩10의 높은 학위. 그러나, 하나는 제한 했다 MPLEx 고갈 될 필요가 있는 혈액 플라스마 단백질에 적용 했다 관찰 했다. 이러한 경우에 침전 된 단백질 잘 플라즈마 프로테옴의 광범위 한 범위에 필요한 immunodepletion 열에 항 체에 의해 인식 되지 않습니다 했다. 따라서, 더 표준 추출 접근은 이러한 상황에서 사용 되어야 한다. MPLex 추출 방법에 대 한 언급 한 추가 제한 인데 세포내와 세포 외 단백질 사이 분별 하지 않는 모든 다른 토양 단백질 추출 프로토콜도 마찬가지입니다.
이 원고에서는 MPLEx 3376 펩 티 드, 105 지질 및 프로토콜 섹션에 자세히 설명 되어 추출 및 분석 방법을 사용 하 여 캔자스 네이티브 대초원 토양 102 극 지 대사 산물에 대 한 결과 제공. 더 나은 겹치기 제어 및 토양 미생물 지역 사회 (그림 2)에 비해 개별 시스템의 MPLEx 접근에서 추출 하는 펩 티 드 사이 관찰 되었다. 이것은 제한, 하지만 매우 복잡 한 토양 미생물 지역 사회와 함께 작업 한 결과입니다. 이러한 결과 더 지적으로 SDS와 MoBio의 잘 알려진 토양 추출 기법 잘 덮지 않았다 큰 다양성 및 추출 하는 어려움 중 하나는 동등 하 게 단백질을 토양. 흥미롭게도, MPLEx 프로토콜 SDS 또는 MoBio 보다 더 많은 총 펩 티 드의 id를 허용 하 고 또한 어느 분석에서 볼 수 없는 추가 구성 요소를 감지.
이 관측에서 작은 샘플 크기를 사용, 전체 멀티-omic 실험적인 다양성을 감소 및 샘플 준비 시간을 단축 하는 매우 유망한 기술 MPLEx를 확인 합니다. MPLEx 가능한 장점 멀티-omic 기능 및 대규모 미생물 커뮤니티 연구에 필요한 분석을 보세요.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
작가 네이 선 존슨 수치 준비에 그의 원조에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 이 연구는 미국 에너지 부의 사무실의 생물학과 환경 연구 (게놈 과학 프로그램), 전환 (민트) 실험실 감독 연구 개발에 Microbiomes에 의해 투자 되는 팬-omics 프로그램에 의해 지원 되었다 퍼시픽 노스 웨스트 국립 연구소, 국가 연구소의 건강 국립 연구소의 환경 건강 과학 (R01 ES022190)에서 이니셔티브와 NIH (P42 ES027704). KEBJ는 R21 HD084788 개발 하 고 새로운 멀티-omic 추출 기법 검증 재정 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 이 작품에는 W. R. 윌 환경 분자 과학 실험실 (EMSL), 미상 국가 과학적인 사용자 시설 평화로운 북 서 국립 연구소 (PNNL)에서 수행 되었다. PNNL은 Battelle 계약 드-AC06-76RL01830에서 DOE에 대 한 운영 하는 멀티 프로그램 국립 연구소 이다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | Stored at -20°C !Caution chloroform has acute potential health effects, skin irritation and possible chemical burns, irritation to the respiratory system, may affect the kidneys, liver, heart. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Stored at -20°C !Caution Methanol may cause respiratory tract, skin and eye irritation, may damage the nerves, kidneys and liver. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Purified water from Millipore | Milli-Q | Water purification system. | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L6026 | !Caution SDS causes acute toxicity and is flammable. It is a skin, eye and airway irritant. Wear gloves and safety glasses. |
| Soil protein extraction kit | MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen | 30000-20 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| 1M Trizma HCL | Sigma-Aldrich | T2694 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T0699 | !Caution TCA is caustic, toxic and may cause skin burns. Wear gloves and safety glasses. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | Stored at -20°C !Caution Acetone may cause respiratory tract and skin and eye irritation. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses gloves and a lab coat, work in a fume hood. |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | !Caution Urea is an eye and skin irritant, use gloves and safety glasses |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830 | |
| Trypsin | Promega | V528A | 20µg vials |
| Bicinchoninic acid protein assay kit | Pierce | 23227 | |
| Ammonium Formate | Sigma-Aldrich | 09735 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | !Caution Acetonitrile is a skin and eye irritant. Highly flammable. Wear gloves and safety glasses. Work in a fume hood. |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | !Caution TFA is extremely hazardous in case of skin contact, eye contact, ingestion and inhalation. May produce tissue damage particularly on mucous membranes of eyes, mouth and respiratory tract. Skin contact may produce burns. Wear gloves, lab coat, safety glasses and work in a fume hood. |
| Methoxyamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 226904 | !Caution Methoxyamine hydrochloride causes severe burns and serious damage to eyes, may cause sensitization by skin contact. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | !Caution Pyridine can cause skin and eye irritation, central nervous system depression. Vapor may cause flash fire. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trimethylchlorosilane | Sigma-Aldrich | 69478 | !Caution MSTFA + 1% TMCS can cause skin corrosion, serious eye damage and specific target organ toxicity. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Milli-Q water purification system | Millipore | model MPGP04001 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Probe sonicator | FisherBrand | model FB505 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | model 5810R | |
| 50mL tube swinging bucket rotor | Eppendorf | A-4-44 | |
| 50mL fixed angle rotor | Eppendorf | FA-45-6-30 | |
| Balance | OHAUS | model V22PWE150IT | |
| Serological pipette controller | Eppendorf | 12-654-100 | |
| 10mL, 25mL glass serological pipettes | FisherBrand | 13-678-27F, 13-678-36D | |
| Thermomixer with Thermotop | Eppendorf | 5382000015, 5308000003 | |
| 0.9 – 2.0 mm blend stainless steel beads | NextAdvance | SSB14B | |
| 0.15 mm garnet beads | MoBio | 13122-500 | |
| Magnetic stir plate | FisherBrand | 11-100-16SH | |
| Magnetic stir bar | FisherBrand | 14512130 | |
| pH paper strips, pH range 0–14 | FisherBrand | M95903 | |
| 15mL, 50mL conical polypropylene centrifuge tube | Genesee Scientific | 21-103 21-108 | chloroform compatible |
| 50mL vortex attachment | MoBio | 13000-V1-50 | |
| Ice bucket | FisherBrand | 02-591-44 | |
| 27.25x70mm glass vials | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Breathe Easier plate membranes | Midwest Scientific | BERM-2000 | |
| Alcohol wipes | Diversified Biotech | BPWP-1000 | |
| Heater shaker incubator | Benchmark, Incu-Shaker Mini | ||
| Analog rotisserie tube rotator | SoCal BioMed, LLC | 82422001 | |
| Filter-Aided-Sample-Prep kit | FASP; Expedeon | 44250 | |
| Microplate reader | Biotek, EPOCH | ||
| -20 Degree Celsius Freezer | Fisher | 13986149 | |
| -80 Degree Celsius Freezer | Stirling Ultracold | SU78OUE | |
| Q-Exactive ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Agilent 7890A gas chromatograph coupled with a single quadrupole 5975C mass spectrometer | Agilent Technologies, Inc. | ||
| LTQ-Orbitrap Velo | Thermo Scientific | ||
| Waters NanoEquityTM UPLC system | Millford, MA | ||
| 250mL media bottle | FisherBrand | 1395-250 | |
| Waters vial | Waters | 186002805 | |
| Glass MS sample vial and inserts | MicroSolv | 9502S-WCV, 9502S-02ND | |
| Glass HPLC vial and snap caps | MicroSolv | 9512C-0DCV, 9502C-10C-B | |
| HPLC 96-well plate | Agilent | 5042-6454 | |
| Large glass vial 27.25x70mm | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Lyophilizer | Labconco | 7934021 | |
| Polished stainless steel flat head spatula | Spoonula; FisherBrand | 14-375-10 | |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 34721 | |
| XBridge C18, 250x4.6 mm, 5 μM with 4.6x20 mm guard column | Waters | 186003117, 186003064 | |
| Agilent 1100 series HPLC system | Agilent Technologies | G1380-90000 | |
| 1.7mL centrifuge tube | Sorenson | 11700 | |
| Hamilton Glass Syringes, 5mL, 50µL and 250µL | Hamilton | 81517, 80975, 81175 | |
| Pasteur Pipettes | FisherBrand | 13-678-20A | |
| Pasteur Pipette Bulbs | Sigma-Aldrich | Z111597 | |
| Bath Sonicator | Branson 1800 Ultrasonic Cleaner | ||
| Vacuum Centrifuge | Labconco Centrivap Acid-Resistant Concentrator System | ||
| MicroSpin Columns, C18 Silica | The Nest Group | SEM SS18V |
References
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