Summary
Un protocole est présenté pour simultanément extraction de métabolites, les protéines et les lipides provenant d’un échantillon de sol unique, ce qui permet des temps de préparation d’échantillon réduite et permettre multi-omic analyses de spectrométrie de masse des échantillons avec des quantités limitées.
Abstract
Spectrométrie de masse (MS)-fonction intégrée metaproteomic, métabolomique et études lipidomic (multi-omic) transforment notre capacité de comprendre et de caractériser des communautés microbiennes dans les systèmes biologiques et environnementales. Ces mesures permettent même des analyses améliorées des communautés microbiennes des sols complexes, qui sont les plus complexes systèmes microbiens connus à ce jour. Multi-omic analyses, cependant, ont défis d’échantillon de préparation, car séparé les extractions sont généralement nécessaires pour chaque étude omic, amplifiant ainsi considérablement le temps de préparation et de la quantité d’échantillon requis. Pour combler cette lacune, une méthode 3-en-1 pour l’extraction simultanée des métabolites, des protéines et des lipides (MPLEx), partir du même échantillon de sol a été créé en adaptant une approche à base de solvant. Ce protocole MPLEx s’est avéré pour être simple et robuste pour de nombreux types d’échantillons, même lorsqu’utilisé pour des quantités limitées d’échantillons de sol complexes. La méthode MPLEx activé aussi grandement les mesures rapide multi-omic nécessaires pour acquérir une meilleure compréhension des membres de chaque communauté microbienne, tout en évaluant les changements qui se produisent lors de perturbations biologiques et environnementale.
Introduction
Évaluation des communautés microbiennes du sol a des implications importantes pour la compréhension de carbone vélo et le changement climatique. Des études récentes ont cependant mis en évidence des difficultés, telles que l’absence de génomes séquencés pour microbiote dans divers types de sols et de la fonction inconnue de la plupart des protéines détectées. Résultat de ces défis en raison du sol étant la communauté microbienne plus complexe connue à ce jour1,2,3. Des analyses multi-omic qui combinent les résultats de la métagénomique, metatranscriptomic, metaproteomic, métabolomique et lipidomic études, ont récemment été mis en œuvre dans de nombreuses études de sol pour mieux connaître dans les microbes présents, tout en obtenir des informations complètes sur les changements moléculaires qui aura lieu en raison de perturbations de l’environnement1,4,5. Un défi avec multi-omic études est que la spectrométrie de masse (MS)-base de mesures metaproteomic, métabolomique et lipidomic exigent généralement un procédé d’extraction spécifique pour chaque omic MS compatible6,7 , 8 , 9. ces procédures précises font leur mise en œuvre extrêmement difficile, voire impossible lorsque seule une quantité limitée de l’échantillon est disponible. Ces défis nous ont incités à étudier une simultanée métabolite, protéines et lipides (MPLEx) méthode d’extraction capable d’utiliser des petits volumes d’échantillon ou de masses, améliorer la précision et fournissant des préparations plus rapides pour tous les trois analyses 10. a ce jour, il n’y a aucune procédure d’extraction de sol remplaçant qui peut atteindre tous ces objectifs.
Pour activer le multi-omic global analyse d’un échantillon de sol unique, un protocole d’extraction par solvant organique basé sur le chloroforme méthanol et séparations d’eau a été utilisé10. Cette méthode a été développée pour les extractions de lipides totaux9,11 et plus récemment a été modifiée pour l’extraction simultanée des métabolites, des protéines et des lipides d’un seul échantillon12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28,29,30, ce qui permet de la moindre quantité d’échantillon et 10de la variabilité expérimentale. Dans le protocole MPLEx, chloroforme n’est pas miscible avec l’eau, qui constitue la base de la triphasique la séparation chimique des constituants de l’échantillon en fractions distinctes. La phase aqueuse supérieure contient donc les métabolites hydrophiles, suivies d’un disque de protéine, puis une couche de lipides dans la phase chloroformique bas (Figure 1). Lorsque MPLEx est appliqué à la plupart des sols, débris particulaires s’accumule au bas des tubes d’échantillonnage et peuvent être ignorées après que tous les calques sont collectées. Chaque type de sol peut être différent, cependant et dans un sol très organique tels que de la tourbe, les débris du sol reste dans la couche intermédiaire et ne tombent pas au fond du tube d’échantillonnage. MPLEx offre plusieurs avantages lorsque isoler une molécule plusieurs types du même échantillon, tels que 1) plus petites quantités d’échantillon peuvent être utilisées pour les analyses multi-omic, les extractions de la même diminution de l’échantillon 2) multi-omic variabilité expérimentale dans l’ensemble, et 3) un plus grand nombre d’échantillons peut être préparé beaucoup plus vite pour un débit plus élevé studies10. Ensemble, ces avantages sont essentiels pour fournir de meilleures capacités de mesure permettant d’évaluer des échantillons de sol et de leurs communautés microbiennes complexes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTE : Sols très humides peuvent être lyophilisées avant extraction sans que cela nuise à l’efficacité de l’extraction. Humidité du sol peut également être utilisé, mais sont à considérer lors de l’ajout de réactifs à des rapports spécifiques.
Remarque : Il est recommandé d’utiliser 20 g de poids de sol sec par extraction, qui doit être partagée entre deux tubes de 50 mL (maximum de 10 g de sol par tube de 50 mL). Les extractions peuvent être redimensionnées, haut ou bas selon échantillon disponible.
Remarque : Les échantillons de sol sec peuvent être tamisés à travers un écran de 3 mm afin d’homogénéiser et d’enlever les roches et les petites racines. Tamis pas des échantillons de sol humide, car l’échantillon sera coincé à l’écran.
1. sur le sol la lyse cellulaire et l’Extraction des métabolites, des protéines et des lipides (Timing ~ 1 d)
- Par échantillon de 20 g de sol, peser 10 g dans deux tubes séparés de 50 mL qui sont compatible méthanol/chloroforme. Soyez vigilants avec les tubes choisis, comme le chloroforme lixiviation de la plupart des plastiques, contaminer les échantillons. Utiliser le verre chaque fois que possibles ou en plastique de tubes en polypropylène ou polytétrafluoroéthylène (PTFE).
NOTE : Gardez le sol sur la glace et aussi frais que possible pendant les étapes initiales de la pesée et l’homogénéisation. - Ajouter 10 mL de chloroforme lavé en acier inoxydable et de perles de grenat dans chaque tube. Sur la glace, ajouter 4 mL de froid ultrapure (voir Table des matières pour système de purification) d’eau dans chaque tube (un échantillon scission entre deux tubes) et transférer les échantillons dans un bac à glaçons dans une hotte aspirante.
- À l’aide d’une pipette sérologique de verre de 25 mL, rapidement ajouter 20 mL de chloroforme : méthanol de glacee 2:1 (v/v).
ATTENTION : Chloroforme : méthanol a effets aigus sur la santé : peau, irritation, brûlures chimiques possibles et une irritation du système respiratoire. Elle peut affecter les reins, le foie et le coeur. Porter des gants, des vêtements et des lunettes de protection adaptés et toujours travailler sous une hotte. - Visser les couvercles et les vortex en solution. choloroform:methanol 2:1 aide à briser le mur de cellules des procaryotes et désactive également les activités enzymatiques.
- Attachez les tubes de 50 mL tube vortex attaches et, horizontalement, Vortexer pendant 10 min à 4 ° C à l’intérieur d’un réfrigérateur si possible. Ensuite, placer les échantillons à l’intérieur d’un congélateur-80 ° C pendant environ 15 min afin de les refroidir complètement.
- En utilisant un sonicateur de sonde à l’intérieur d’une hotte aspirante, soniquer chaque échantillon avec une sonde de 6 mm (1/4") à amplitude 60 % pour 30 s de chaque sur la glace.
ATTENTION : Il est recommandé d’utiliser un son apaisement enceinte et oreille protection sonification. Haute tension est présente dans le câble d’alimentation et de haute fréquence. Évitez de toucher le fond et les bords du navire échantillon avec une sonde active ; Il peut casser ou faire fondre le plastique. - Placer les échantillons dans le congélateur-80 ° C pendant environ 15 min, sonification peut générer beaucoup de chaleur.
- Répétez les étapes 1,5 à 1,7.
Remarque : Assurez-vous que les échantillons restent froides durant toute la procédure de lyse. - Centrifuger les échantillons à 4 000 x g pendant 5 min, 4 ° C. À ce stade, l’échantillon sera séparé dans la couche supérieure de métabolite, l’intercalaire de protéine, la couche inférieure de lipides (et granule de débris restant). Voir la Figure 1.
- Placer les échantillons sur la glace dans un bac à glaçons et, à l’intérieur d’une hotte aspirante et à l’aide d’une pipette sérologique de verre de 10 mL, enlever les couches supérieures de métabolite provenant des deux tubes de 50 mL dans un grand verre flacon.
Remarque : Évitez d’aspiration de la couche de protéine dans la pipette ; laisser une petite couche de métabolite si nécessaire. - Inclinez légèrement le tube de 50 mL pour libérer l’intercalaire de protéine pour qu’il soit libre flottant sur la couche inférieure de lipides. En utilisant une spatule de tête plate lab nettoyer l’acier inoxydable, soigneusement ramasser tous les deux les intercalaires de protéine et placez-les ensemble dans un nouveau tube de 50 mL.
- À l’aide d’une pipette sérologique de verre de 25 mL, enlever les couches de lipides plus faibles dans un flacon de verre grand.
NOTE : Essayez d’éviter les particules du sol ; Cependant, quelques débris de sol et les particules aspiraient le long avec les lipides seront supprimés à une date ultérieure. - Place des membranes perméable à l’air sur le dessus du métabolite et lipides fioles en verre et sécher dans un concentrateur sous vide jusqu'à séchage (lipides ~ 4-5 h, métabolites du jour au lendemain).
- Le tube d’échantillon de protéine et les tubes de granules débris restants, ajouter 20 mL de méthanol glacée à chacun et vortex. Ceci est fait pour les pellets de débris rince chloroforme avant de tenter de solubiliser toute protéine restant possible hors les débris avant de jeter.
- Centrifuger les pastilles de débris et de protéines intercalaires à 4 000 x g pendant 5 min, 4 ° C, puis décanter le méthanol dans un conteneur de déchets dangereux à l’intérieur d’une hotte aspirante.
- Geler les pellets de protéine et de débris dans l’azote liquide et sécher dans un lyophilisateur (avec une température collecteur capable de-105 ° C en raison de méthanol ayant un très bas point de congélation de-98 ° C) pendant environ 2 heures.
Remarque : Ne pas trop sécher les pellets, car ils seront plus difficiles à solubiliser. - Ajouter 10 mL de tampon de solubilisation de protéine (4 % SDS, 100mM DTT (DL-dithiothréitol) dans un tampon tris 50mM, pH 8,0 ; voir Complémentaire réactif Set-up) pour le tube intercalaires de protéines et 20 mL de chacune des pastilles débris.
ATTENTION : SDS provoque une toxicité aiguë et est inflammable. C’est une peau, yeux et des voies respiratoires irritantes. Porter des gants et des lunettes de sécurité. - Sous la hotte, sonde soniquer les échantillons à amplitude de 20 % pendant 30 s pour les mettre en solution. Vortexer pendant 2 min.
- Placer l’échantillon intercouche de protéine dans une coiffe de tube de laboratoire pendant 30 min à 300 tr/min, 50 ° C, pour solubiliser les protéines.
- Horizontalement vortex les échantillons de débris pendant un 10 min supplémentaire à la lyse des cellules intactes restantes, puis faites tourner avec les échantillons intercouche de protéine pour les 20 minutes restantes.
- Tous les échantillons à 4 500 g pendant 10 min, température ambiante (RT), centrifuger et recueillir le surnageant de chaque éprouvette par échantillon dans deux tubes de 50 mL.
- Ajouter 10 mL de solubilisation tampon au culot intercouche protéine, puis laisser agir et vortex de nouveau dans la solution et centrifuger comme avant.
- Combinez les surnageants dans les deux tubes de 50 mL tout aussi et centrifuger à 8 000 x g pendant 10 min, 4 ° C, dans un seau rotor à angle fixe.
Remarque : Une centrifugation finale est nécessaire pour éliminer les substances humiques contaminantes excessives. - Décanter les surnageants dans deux tubes de 50 mL pour qu’il y a 30 mL chacune. Puis, à l’aide d’une pipette sérologique de verre de 10 mL, ajouter 7,5 mL de TCA (acide trichloracétique) dans chaque tube. Vortex solution. Cela fait 20 % TCA dans chaque échantillon de 30 mL (ajuster en conséquence),
ATTENTION : Le TCA est caustique, toxique et peut provoquer des brûlures de la peau. Porter des gants et des lunettes de sécurité. - Placer les échantillons dans un congélateur à-20 ° C pendant 2 h pour la nuit.
Remarque : Les protéines précipiteront typiquement moins de 1 h mais peuvent être laissé pour la nuit (jusqu'à 18 h).
Remarque : Ne laissez pas l’extraction de la TCA aller plus que 18 h en raison de la possible hydrolyse acide de la protéine. Si l’échantillon est congelé, décongelez-le sur glace ; ne pas laisser l’échantillon d’échauffement après le dégel. - Pour les protéines précipitées de granule, centrifuger l’échantillon à 4 500 g pendant 10 min, 4 ° C et décanter le liquide surnageant dans des déchets.
- Ajouter 10 mL d’acétone glacée 100 % à chaque granule de protéine, les vortex et les combiner comme boulettes dans un tube.
- Centrifuger le tube contenant le culot combiné (utilisation d’une balance) et puis décanter le liquide surnageant dans des déchets.
ATTENTION : L’acétone peut provoquer des voies respiratoires et irritation de la peau et des yeux et est un liquide et vapeurs inflammables. Porter des lunettes de protection gants et une blouse de laboratoire, travailler sous une hotte. - Laver le culot deux fois à l’aide de 1,5 mL d’acétone et enfin transvaser dans un tube de 2 mL pour l’essorage final à 10 000 g pendant 5 min.
- Décanter le liquide surnageant dans déchets et permettre le culot sécher inversé sur un chiffon de papier dans une hotte de laboratoire pendant environ 20 min ou sous un courant d’azote jusqu'à ce que la pastille légèrement commence à craquer.
- Ajouter 100 à 200 µL de l’amortisseur de solubilisation de protéine, selon la taille de la pastille.
NOTE : Gardez le volume de tampon de solubilisation ajouté à l’échantillon aussi bas que possible. Subséquentes filtre assistée par exemple préparation (FASP) ne peut utiliser jusqu'à 50 μL d’échantillon solubilisée par colonne ; tout doit être divisé en plusieurs colonnes FASP. - Soniquer et vortex le culot dans la solution. Notez que l’échantillon peut être visqueux en raison des substances humiques, précipitant ainsi que de la protéine, qui est enlevée avec une centrifugation ultérieure.
- Agiter l’échantillon dans un incubateur/agitateur pendant 30 min à 300 tr/min, 40 ° C, pour solubiliser les protéines en solution et procéder à la digestion des protéines.
- Composant logiciel enfichable geler l’échantillon dans l’azote liquide et ranger dans un congélateur à-80 ° C jusqu’au moment de la digestion des protéines.
2. lipides préparation (calendrier ~ 20 min)
- Une fois que les échantillons de lipides sont secs, ajouter 200 μl de chloroforme : méthanol de 2:1 dans le flacon, vortex solution et transvaser dans un tube en polypropylène de 1,5 mL, ajouter une supplémentaire de 200 μl au verre flacon, vortex et pipeter les lipides restants et transférer dans le tube.
- Centrifuger les débris de l’échantillon à 12 000 x g pendant 5 min à 4 ° C.
- Transvaser le surnageant dans un flacon en verre de lipides et les conserver à-20 ° C jusqu'à l’analyse LC-MS/MS (des détails supplémentaires pour LC-MS/MS en Méthodes complémentaires).
- Si les échantillons ne peuvent pas être analysés immédiatement après la préparation, les lipides doivent être stockés dans un solvant à-20 ° C pour éviter l’oxydation et dégradation.
3. métabolite préparation et dérivation (calendrier ~ 5 h)
- Le jour après une extraction, retirer les échantillons de métabolite de l’aspirateur de vitesse et stocker à sec à-20 ° C jusqu’au moment de dérivation et d’analyse sur le GC. Si ce n’est pas le cas, les métabolites en cours d’exécution sur un GC, puis préparer en utilisant le protocole approprié pour l’instrument.
- Immédiatement avant la dérivatisation les métabolites d’analyse sur la GC, transférez-les des flacons en verre grand en ajoutant 200 μl de méthanol, Vortex et l’ajout d’un tube en polypropylène de 1,5 mL. Répéter une fois.
- Centrifuger le tube à 12 000 x g pendant 10 min, 4 ° C. Transvaser le surnageant dans petits flacons en verre, ajoutez une membrane perméable à l’air vers le haut et complètement sec dans un aspirateur de vitesse.
- Derivatize les métabolites en ajoutant 20 µL de solution de méthoxyamine dans le flacon et vortexer pendant 30 s sur un vortexer à vitesse moyenne.
ATTENTION : Le chlorhydrate de méthoxyamine provoque des brûlures graves et lésions oculaires graves, peut entraîner une sensibilisation par contact avec la peau. Porter des lunettes de protection, des gants et blouse de laboratoire et travailler sous une hotte. - Utilisez un sonicateur bain pour s’assurer que l’échantillon est complètement dissous.
- Incuber l’échantillon dans un incubateur avec un couvercle de prévention condensation maintenu à 37 ° C pendant 1 h 30 min avec 1 000 tr/min secouant.
- Inverser le flacon une fois pour mélanger les échantillons avec des gouttes condensées à la surface du bouchon. Faire tourner l’échantillon vers le bas à 1 000 x g pendant 1 min, RT
- Effectuer la silylation en ajoutant 80 µL (à l’aide d’une seringue) de N-méthyl - N-(triméthylsilyl) trifluoroacétamide avec 1 % triméthylchlorosilane. Vortex pendant 10 secondes.
ATTENTION : MSTFA + 1 % TMCS peuvent causer la corrosion cutanée, lésions oculaires graves et toxicité pour certains organes cibles spécifiques et est un liquide et vapeurs inflammables. Porter des lunettes de protection, des gants et blouse de laboratoire et travailler sous une hotte. - Incuber l’échantillon dans un incubateur avec un couvercle de prévention condensation maintenu à 37 ° C pendant 30 min à 1 000 tr/min secouant.
- Inverser le flacon une fois pour mélanger les échantillons avec des gouttes condensées à la surface du bouchon.
- Faire tourner l’échantillon vers le bas pendant 5 min à 2 000 x g, RT
- Transvaser la solution réagie dans flacons appropriés pour l’analyse par CPG-SM.
4. protéine Digestion (calendrier ~ 1 d)
- Centrifuger l’échantillon à 15 000 x g pendant 5 min, RT, pour granuler les débris.
- Effectuer filtre-Aided--préparation des échantillons (FASP), car la digestion à l’aide de la FASP kits (voir Table des matières) qui suit modification instructions31,32 du fabricant:
- Ajouter 400 ml du tampon urée 8 M dans une colonne de la FASP (500 filtre μL 30K MWCO essorage).
- Une fois l’exemple terminé centrifugation, Pipeter hors le surnageant (jeter le culot) et ajouter 50 μl de l’échantillon à la 400 μL d’urée 8 M dans la colonne.
Remarque : Ajouter seulement jusqu'à 50 μL d’échantillon par colonne. Si il n’y a plus de 50 μL d’échantillon, utilisez plusieurs colonnes et combinez les peptides après digestion. Il est préférable de laisser ce volume aussi faible que possible (30 µL est idéal) afin d’assurer la FASP colonne supprimera tous le SDS qui peuvent gêner considérablement l’analyse masse spec. - Placer la colonne dans le tube inclus 1,5 mL et centrifuger l’échantillon à 14 000 x g pendant 30 min, RT
- Supprimer les intermédiaires avec les ordures et ajouter 400 ml d’urée 8 M à la colonne et centrifuger à nouveau.
- Répétez l’étape précédente une fois de plus pour un total de 3 rinçages d’urée.
Remarque : Assurez-vous que l’échantillon passe à proximité de la sécheresse sur la colonne, s’il y en a plus de ~ 30 µL restant sur le filtre après chaque tour, continuer la centrifugation. - Ajouter 400 ml de 50 mM NH4HCO3 et centrifuger à 14 000 x g pendant 20 min, jeter les déchets et répéter une fois.
- Transférer les colonnes dans un tube à centrifuger propre de 1,5 mL.
- Ajouter 75 μL de tampon de digestion de trypsine aux colonnes et incuber à 37 ° C pendant 3 h dans un incubateur avec un couvercle de prévention condensation à 750 tr/min.
- Ajouter 40 µL de 50 mM NH4HCO3 dans les colonnes.
- Centrifuger l’échantillon à 14 000 x g pendant 15 min récupérer les peptides dans le tube tout en gardant les contaminants de poids moléculaire élevé sur le dessus de la colonne.
- Ajouter 40 μL de 50mM NH4HCO3 dans la colonne et centrifuger à nouveau.
- Jeter la colonne, les peptides à sec vers le bas les peptides dans le tube dans un ACC de vitesse pour ~ 30 µL et le dosage de la BCA (kit de dosage de protéine acide Bicinchoninic ; voir Table des matières).
- Vous pouvez également exécuter une étape de nettoyage si l'on soupçonne une contamination de SDS (bulles visibles)33. Une extraction en phase solide doit se faire par la suite, si vous choisissez cette option. Des informations détaillées sur cette méthode de nettoyage sont disponibles dans les Méthodes complémentaires.
- Diluer l’échantillon pour analyse par SM ou éventuellement procéder à fractionnement HPLC (deux étapes).
- Pour fractionner, diluer les échantillons à un volume de 400 µL avec un tampon de formiate d’ammonium 10 mM (pH 10,0).
- Régler sur une colonne C18 (voir Table des matières) en séparant, à 0,5 mL/min en utilisant un système HPLC avec formiate d’ammonium de phases mobiles (A) 10 mM, pH 10,0 et (B), formiate d’ammonium du 10 mM, pH 10,0/acétonitrile (10 : 90).
- Régler le gradient d’à 100 % A 95 % A au cours des 10 première min, 95 % A 65 % A plus de min 10 à 70, A de 65 % à 30 % A plus de min 70 à 85, maintenir à 30 % A plus de min 85 à 95.
- Rééquilibrer avec 100 % A plus min 95 à 105 et tenir à 100 % A min 120.
- Recueillir des fractions chaque min 1,25 (96 fractions sur le gradient entier) et enfin de combiner tous les rangs pour un total de 12 échantillons ou tous les deux rangs pour 24 échantillons (chacune avec n = 8 ou n = 4 fractions mis en commun).
- Séchez toutes les fractions sous vide et ajouter 15 µL d’eau ultrapure à chacun pour le stockage à-20 ° C jusqu'à l’analyse de LC-MS/MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lorsque le protocole MPLEx servait à extraire les molécules du Kansas prairie indigène sol (un sol Mollisol), les analyses en triple a fourni des résultats pour les 3376 peptides, 105 lipides et 102 métabolites polaires (toutes les identifications uniques). Alors que le protocole MPLEx a été bien établi pour générale d’extraction des lipides et des métabolites12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21,22,23,24,25,26,27 ,28,29,30,34, sa comparaison avec les méthodes d’extraction de protéine sol commun pour les analyses microbiennes, tels que les kits d’extraction sol protéine (voir Table de Matériaux) et SDS (sodium dodécyl sulfate) extractions35, n’est plus évaluée ici. Pour évaluer ces techniques, protéines de sols de prairie indigène Kansas ont été extraites avec chacune de ces approches et analysés directement à phase renversée LC-MS/MS en utilisant un système UPLC couplé à un spectromètre de masse quadripolaire/Orbitrap valant hybride. Des informations détaillées sur les paramètres de méthode sont disponibles dans les Méthodes complémentaires. Le peptide expérimental qui en résulte spectres MS/MS de chaque approche d’extraction ont été comparés à peptide prédit séquences, par le représentant Kansas prairie indigène métagénome2 utilisant une rigoureuse MS-GF + seuil de probabilité spectrale de 1 x 10 -10 36 , 37 et un seuil d’erreur masse de moins de 5 ppm. Il est à noter que les analytes extraites du sol à l’aide du protocole MPLEx sont adaptés pour les études basées sur MS et autres techniques d’analyse. Lorsque initialement en comparant trois réplique des méthodes connues de MoBio et SDS, seulement 12 % des peptides qui se chevauchent entre les deux techniques montrant la complexité de la communauté microbienne et les effets d’extraction différente (Figure 2). Sur la comparaison du MPLEx avec extraits MoBio et SDS, ~ 38 % des peptides observées à l’aide de la méthode MPLEx ont été également détectés lorsque vous utilisez les extractions SDS et/ou MoBio (Figure 2). Compte tenu du nombre d’espèces dans le Kansas du sol des communautés bactériennes et son métagénome2, le chevauchement des identifications de peptide est raisonnable et en raison de sa complexité, la combinaison des approches extraits des peptides plus que chacun seul 35. également, étant donné que ces échantillons ont été fractionnées et analysés par seulement 1 dimension LC-MS/MS, la complexité de l’échantillon extrêmement élevée causait éventuellement certains biais en détection en raison des concentrations de peptides différents extraits de chaque approche. Le protocole MPLEx a également été appliqué à d’autres types de sols tels que le pergélisol et les zones humides, et dans tous les cas, les résultats préliminaires de protéomique sont de qualité similaire à celle des données du sol des prairies indigènes Kansas présentées ici.
La large applicabilité de l’approche MPLEx, a été précédemment évalué à l’aide d’un ensemble diversifié d’échantillons, y compris l’Archéen Sulfolobus acidocaldarius, un consortium d’unicyanobacterial38, tissu de cortex cérébral souris urine humaine, et feuilles de Arabidopsis thaliana (Figure 2)10. Pour tous les échantillons sauf A.thaliana, extractions de l’urée sont la façon la plus courante pour extraire des protéines, donc ils étaient utilisés comme l’approche du contrôle pour l’évaluation. A. thaliana MPLEx résultats ont été comparés à une extraction effectuée avec l’acide trichloracétique (TCA) parce que les feuilles de la plante sont riches en composés phénoliques qui doivent être enlevés avant MS analyses39. Dans tous les cas, le nombre de protéines observée à partir de la méthode MPLEx était semblable à celle pour les contrôles10, indiquant son utilité pour de nombreux types différents d’échantillon. En outre, il n’y a aucune tendance associés aux classes spécifiques de protéines extraites dans tous les types d’échantillon (y compris le sol). Par conséquent, la large applicabilité du MPLEx de nombreux systèmes biologiques et environnementaux rend une approche prometteuse.
Figure 1. Un schéma montrant le processus de MPLEx, les métabolites, les protéines et les lipides sont simultanément extraites de l’échantillon de sol même pour les analyses de MS. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Les diagrammes de Venn illustrant le chevauchement de peptide pour un ensemble diversifié d’échantillons extraits à l’aide de MPLEx et une méthode d’extraction de protéine de base d’urée standard normalement effectué. Données du MPLEx extraction de l’Archéen, S.acidocaldarius, unicyanobacterial consortium, l’urine humaine, cortex cérébral de souris et A.thaliana plante feuilles adaptées de ndiaye, E. S. al 201610. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il est important de noter que pas tous les laboratoires auront le même équipement disponible pour certaines méthodes, par exemple l’étape de lyse, peuvent être adaptés. Ici, nous utilisons vortex et la sonification, cependant l’utilisation d’un batteur de perle grand 50 mL fonctionnerait. Si un lyophilisateur avec une température collecteur capable de-105 ° C n’est pas disponible, les échantillons peuvent être séchés sous courant d’azote. Aussi les types de sol varient considérablement et peuvent inclure des sable, limon, argile, tourbe et terreau (etc.), et ils peuvent également varier selon le pH, la salinité et la richesse de la matière organique. Chacun de ces écarts peut avoir un impact sur le protocole, il est donc important d’être flexible et de faire des ajustements si nécessaire. Il est essentiel, cependant, que les rapports et les pourcentages restent les mêmes.
Le protocole MPLEx est très prometteur pour application dans nombreux systèmes biologiques et environnementaux et la possibilité d’activer les analyses multi-omic des communautés microbiennes du sol. Des comparaisons précédentes du MPLEx à d’autres protocoles d’extraction pour divers systèmes illustrent un degré élevé de peptide chevauchement10. Toutefois, un fait observer limitation est que MPLEx ne s’appliquait pas aux protéines de plasma sanguin nécessitant d’être épuisé. Dans ces cas, les protéines précipitées n’étaient pas bien reconnues par les anticorps dans les colonnes de protocole requis pour une couverture large du protéome plasmatique. Par conséquent, des approches plus standards d’extraction doivent servir dans ces circonstances. Une autre limite réputée pour l’approche d’extraction MPLex est qu’il ne discerne pas entre une protéine intracellulaire et extracellulaire, mais cela est vrai pour tous les autres sols protéine protocoles d’extraction aussi bien.
Dans ce manuscrit, MPLEx a fourni des résultats pour les 3376 peptides, 105 lipides et 102 métabolites polaires dans le sol de prairie indigène de Kansas en utilisant les méthodes d’extraction et l’analyse détaillées dans la section protocole. Meilleur chevauchement a été observée entre les peptides extraites dans le contrôle et les approches MPLEx de systèmes individuels par rapport à la communauté microbienne du sol (Figure 2). Ce n’est pas une limitation, mais une conséquence de travailler avec les communautés microbiennes du sol extrêmement compliquée. Ces résultats sont également notés que les techniques d’extraction de sol bien connu du SDS et MoBio se chevauchent pas bien soit en raison de la grande diversité et les difficultés d’extraction de protéines du sol également. Fait intéressant, le protocole MPLEx a permis d’identifier plusieurs peptides totales que SDS ou MoBio et également détecté des composants supplémentaires ne voit ne pas dans l’analyse.
Ces observations font MPLEx une technique très prometteuse pour travailler avec des tailles de petits échantillons, réduction globale multi-omic variabilité expérimentale et réduction du temps de préparation d’échantillon. Les avantages possibles avec MPLEx regarder pour activer les capacités multi-omic et les analyses nécessaires pour les études de la communauté microbienne à grande échelle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Nathan Johnson pour son aide dans la préparation des chiffres. Cette recherche a été soutenue par le programme Pan-omics qui est financé par le U.S. Department of Energy Office of Biological and Environmental Research (programme des sciences génomiques) les Microbiomes en Transition (MinT) laboratoire réalisé recherche développement Initiative à la Pacific Northwest National Laboratory, ainsi que le National instituts de santé National Institute de Environmental Health Sciences (R01 ES022190) et le NIH (P42 ES027704). KEBJ tiens à remercier R21 HD084788 pour un soutien financier élaborer et valider des techniques d’extraction de nouveaux multi-omic. Cette œuvre était jouée dans W. R. Wiley environnement moléculaire Sciences Laboratory (EMSL), une installation utilisateur scientifique national de DOE à la Pacific Northwest National Laboratory (PNNL). PPNL est un laboratoire national multi-programme exploité par Battelle pour l’entité opérationnelle désignée en vertu du contrat DE-AC06-76RL01830.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | Stored at -20°C !Caution chloroform has acute potential health effects, skin irritation and possible chemical burns, irritation to the respiratory system, may affect the kidneys, liver, heart. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Stored at -20°C !Caution Methanol may cause respiratory tract, skin and eye irritation, may damage the nerves, kidneys and liver. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Purified water from Millipore | Milli-Q | Water purification system. | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L6026 | !Caution SDS causes acute toxicity and is flammable. It is a skin, eye and airway irritant. Wear gloves and safety glasses. |
| Soil protein extraction kit | MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen | 30000-20 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| 1M Trizma HCL | Sigma-Aldrich | T2694 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T0699 | !Caution TCA is caustic, toxic and may cause skin burns. Wear gloves and safety glasses. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | Stored at -20°C !Caution Acetone may cause respiratory tract and skin and eye irritation. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses gloves and a lab coat, work in a fume hood. |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | !Caution Urea is an eye and skin irritant, use gloves and safety glasses |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830 | |
| Trypsin | Promega | V528A | 20µg vials |
| Bicinchoninic acid protein assay kit | Pierce | 23227 | |
| Ammonium Formate | Sigma-Aldrich | 09735 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | !Caution Acetonitrile is a skin and eye irritant. Highly flammable. Wear gloves and safety glasses. Work in a fume hood. |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | !Caution TFA is extremely hazardous in case of skin contact, eye contact, ingestion and inhalation. May produce tissue damage particularly on mucous membranes of eyes, mouth and respiratory tract. Skin contact may produce burns. Wear gloves, lab coat, safety glasses and work in a fume hood. |
| Methoxyamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 226904 | !Caution Methoxyamine hydrochloride causes severe burns and serious damage to eyes, may cause sensitization by skin contact. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | !Caution Pyridine can cause skin and eye irritation, central nervous system depression. Vapor may cause flash fire. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trimethylchlorosilane | Sigma-Aldrich | 69478 | !Caution MSTFA + 1% TMCS can cause skin corrosion, serious eye damage and specific target organ toxicity. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Milli-Q water purification system | Millipore | model MPGP04001 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Probe sonicator | FisherBrand | model FB505 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | model 5810R | |
| 50mL tube swinging bucket rotor | Eppendorf | A-4-44 | |
| 50mL fixed angle rotor | Eppendorf | FA-45-6-30 | |
| Balance | OHAUS | model V22PWE150IT | |
| Serological pipette controller | Eppendorf | 12-654-100 | |
| 10mL, 25mL glass serological pipettes | FisherBrand | 13-678-27F, 13-678-36D | |
| Thermomixer with Thermotop | Eppendorf | 5382000015, 5308000003 | |
| 0.9 – 2.0 mm blend stainless steel beads | NextAdvance | SSB14B | |
| 0.15 mm garnet beads | MoBio | 13122-500 | |
| Magnetic stir plate | FisherBrand | 11-100-16SH | |
| Magnetic stir bar | FisherBrand | 14512130 | |
| pH paper strips, pH range 0–14 | FisherBrand | M95903 | |
| 15mL, 50mL conical polypropylene centrifuge tube | Genesee Scientific | 21-103 21-108 | chloroform compatible |
| 50mL vortex attachment | MoBio | 13000-V1-50 | |
| Ice bucket | FisherBrand | 02-591-44 | |
| 27.25x70mm glass vials | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Breathe Easier plate membranes | Midwest Scientific | BERM-2000 | |
| Alcohol wipes | Diversified Biotech | BPWP-1000 | |
| Heater shaker incubator | Benchmark, Incu-Shaker Mini | ||
| Analog rotisserie tube rotator | SoCal BioMed, LLC | 82422001 | |
| Filter-Aided-Sample-Prep kit | FASP; Expedeon | 44250 | |
| Microplate reader | Biotek, EPOCH | ||
| -20 Degree Celsius Freezer | Fisher | 13986149 | |
| -80 Degree Celsius Freezer | Stirling Ultracold | SU78OUE | |
| Q-Exactive ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Agilent 7890A gas chromatograph coupled with a single quadrupole 5975C mass spectrometer | Agilent Technologies, Inc. | ||
| LTQ-Orbitrap Velo | Thermo Scientific | ||
| Waters NanoEquityTM UPLC system | Millford, MA | ||
| 250mL media bottle | FisherBrand | 1395-250 | |
| Waters vial | Waters | 186002805 | |
| Glass MS sample vial and inserts | MicroSolv | 9502S-WCV, 9502S-02ND | |
| Glass HPLC vial and snap caps | MicroSolv | 9512C-0DCV, 9502C-10C-B | |
| HPLC 96-well plate | Agilent | 5042-6454 | |
| Large glass vial 27.25x70mm | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Lyophilizer | Labconco | 7934021 | |
| Polished stainless steel flat head spatula | Spoonula; FisherBrand | 14-375-10 | |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 34721 | |
| XBridge C18, 250x4.6 mm, 5 μM with 4.6x20 mm guard column | Waters | 186003117, 186003064 | |
| Agilent 1100 series HPLC system | Agilent Technologies | G1380-90000 | |
| 1.7mL centrifuge tube | Sorenson | 11700 | |
| Hamilton Glass Syringes, 5mL, 50µL and 250µL | Hamilton | 81517, 80975, 81175 | |
| Pasteur Pipettes | FisherBrand | 13-678-20A | |
| Pasteur Pipette Bulbs | Sigma-Aldrich | Z111597 | |
| Bath Sonicator | Branson 1800 Ultrasonic Cleaner | ||
| Vacuum Centrifuge | Labconco Centrivap Acid-Resistant Concentrator System | ||
| MicroSpin Columns, C18 Silica | The Nest Group | SEM SS18V |
References
- Hultman, J., et al. Multi-omics of permafrost, active layer and thermokarst bog soil microbiomes. Nature. 521, 208-212 (2015).
- White, R. A. 3rd, et al. Moleculo long-read sequencing facilitates assembly and genomic binning from complex soil metagenomes. mSystems. 1, (2016).
- White, R. A., Callister, S. J., Moore, R. J., Baker, E. S., Jansson, J. K. The past, present and future of microbiome analyses. Nat Protoc. 11, 4-8 (2016).
- Ritchie, M. D., Holzinger, E. R., Li, R., Pendergrass, S. A., Kim, D. Methods of integrating data to uncover genotype-phenotype interactions. Nat Rev Genet. 16, 85-97 (2015).
- Jansson, J. K., Baker, E. S. A multi-omic future for microbiome studies. Nat Microbiol. 1, (2016).
- Domon, B., Aebersold, R. Options and considerations when selecting a quantitative proteomics strategy. Nat Biotechnol. 28, 710-721 (2010).
- Marx, V. Targeted proteomics. Nat Methods. 10, 19-22 (2013).
- Roberts, L. D., Souza, A. L., Gerszten, R. E., Clish, C. B. Targeted metabolomics. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 30, Unit 30 32 31-24 (2012).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226, 497-509 (1957).
- Nakayasu, E. S., et al. MPLEx: a Robust and Universal Protocol for Single-Sample Integrative Proteomic, Metabolomic, and Lipidomic Analyses. mSystems. 1, (2016).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Pomraning, K. R., et al. Multi-omics analysis reveals regulators of the response to nitrogen limitation in Yarrowia lipolytica. BMC Genomics. 17, 138 (2016).
- Tisoncik-Go, J., et al. Integrated Omics Analysis of Pathogenic Host Responses during Pandemic H1N1 Influenza Virus Infection: The Crucial Role of Lipid Metabolism. Cell Host Microbe. 19, 254-266 (2016).
- Kyle, J. E., et al. Uncovering biologically significant lipid isomers with liquid chromatography, ion mobility spectrometry and mass spectrometry. Analyst. 141, 1649-1659 (2016).
- Lovelace, E. S., et al. Silymarin Suppresses Cellular inflammation by inducing reparative stress signaling. J Nat Prod. 78, 1990-2000 (1990).
- Kim, Y. M., et al. Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms. Front Microbiol. 6, 209 (2015).
- Pomraning, K. R., et al. Comprehensive Metabolomic, Lipidomic and microscopic profiling of Yarrowia lipolytica during lipid accumulation identifies targets for increased lipogenesis. PLoS One. 10, e0123188 (2015).
- Huang, E. L., et al. The fungus gardens of leaf-cutter ants undergo a distinct physiological transition during biomass degradation. Environ Microbiol Rep. 6, 389-395 (2014).
- Deatherage Kaiser, B. L., et al. A Multi-Omic View of Host-Pathogen-Commensal Interplay in Salmonella-Mediated Intestinal Infection. PLoS One. 8, e67155 (2013).
- Kim, Y. M., et al. Salmonella modulates metabolism during growth under conditions that induce expression of virulence genes. Mol Biosyst. 9, 1522-1534 (2013).
- Ansong, C., et al. A multi-omic systems approach to elucidating Yersinia virulence mechanisms. Mol Biosyst. 9, 44-54 (2013).
- Bordbar, A., et al. Model-driven multi-omic data analysis elucidates metabolic immunomodulators of macrophage activation. Mol Syst Biol. 8, 558 (2012).
- Hu, Z. P., et al. Metabolomic response of human skin tissue to low dose ionizing radiation. Mol Biosyst. 8, 1979-1986 (2012).
- Perera, R., et al. Dengue virus infection perturbs lipid homeostasis in infected mosquito cells. PLoS Pathog. 8, e1002584 (2012).
- Gao, X., et al. A reversed-phase capillary ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) method for comprehensive top-down/bottom-up lipid profiling. Anal Bioanal Chem. 402, 2923-2933 (2012).
- Sorensen, C. M., et al. Perturbations in the lipid profile of individuals with newly diagnosed type 1 diabetes mellitus: Lipidomics analysis of a Diabetes Antibody Standardization Program sample subset. Clin Biochem. 43, 948-956 (2010).
- Diamond, D. L., et al. Temporal proteome and lipidome profiles reveal hepatitis C virus-associated reprogramming of hepatocellular metabolism and bioenergetics. PLoS Pathog. 6, e1000719 (2010).
- Alquier, T., et al. Deletion of GPR40 impairs glucose-induced insulin secretion in vivo in mice without affecting intracellular fuel metabolism in islets. Diabetes. 58, 2607-2615 (2009).
- Ding, J., et al. Application of the accurate mass and time tag approach in studies of the human blood lipidome. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 871, 243-252 (2008).
- Rasmussen, A. L., et al. Systems virology identifies a mitochondrial fatty acid oxidation enzyme, dodecenoyl coenzyme A delta isomerase, required for hepatitis C virus replication and likely pathogenesis. J Virol. 85, 11646-11654 (2011).
- Manza, L. L., Stamer, S. L., Ham, A. J., Codreanu, S. G., Liebler, D. C. Sample preparation and digestion for proteomic analyses using spin filters. Proteomics. 5, 1742-1745 (2005).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat Methods. 6, 359-362 (2009).
- Zhou, J. Y., et al. Simple sodium dodecyl sulfate-assisted sample preparation method for LC-MS-based proteomics applications. Anal Chem. 84, 2862-2867 (2012).
- Anderson, J. C., et al. Decreased abundance of type III secretion system-inducing signals in Arabidopsis mkp1 enhances resistance against Pseudomonas syringae. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 6846-6851 (2014).
- Chourey, K., et al. Direct cellular lysis/protein extraction protocol for soil metaproteomics. J Proteome Res. 9, 6615-6622 (2010).
- Kim, S., Gupta, N., Pevzner, P. A. Spectral probabilities and generating functions of tandem mass spectra: a strike against decoy databases. J Proteome Res. 7, 3354-3363 (2008).
- Kim, S., Pevzner, P. A. MS-GF+ makes progress towards a universal database search tool for proteomics. Nat Commun. 5, 5277 (2014).
- Cole, J. K., et al. Phototrophic biofilm assembly in microbial-mat-derived unicyanobacterial consortia: Model systems for the study of autotroph-heterotroph interactions. Front Microbiol. 5, (2014).
- Isaacson, T., et al. Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues. Nat Protoc. 1, 769-774 (2006).
