Summary
Протокол представляется одновременно извлечения метаболитов, белки и липиды из образца единого почвы, позволяя время приготовления сокращенной пробы и включение multi-omic масс-спектрометрии анализы образцов с ограниченных количествах.
Abstract
Масс-спектрометрия (МС)-на основе комплексной metaproteomic и Метаболомные исследования lipidomic (multi-omic) изменяют нашу способность понять и характеризуют микробных сообществ в экологических и биологических систем. Эти измерения даже включение расширенной анализ сложных почвенных микробов общин, которые являются наиболее сложных микробных систем, известных на сегодняшний день. Multi-omic анализов, однако, имеют проблемы подготовки образца, так как отдельных зубов обычно необходимы для каждого omic исследования, тем самым значительно усиливая время приготовления и количество образцов требуется. Чтобы устранить это ограничение, был создан метод 3-в-1 для одновременного извлечения метаболитов, белки и липиды (MPLEx) из той же пробы почвы путем адаптации подхода на основе растворителя. Этот протокол MPLEx оказалась простой и надежный для многих типов образцов, даже когда используются для ограниченных количеств сложных почвенных образцов. Метод MPLEx также значительно позволило быстрого multi-omic измерений, необходимых для лучшего понимания членов каждого микробной сообщества, при оценке изменений, происходящих на биологических и экологических возмущений.
Introduction
Оценка почвы микробных сообществ имеет важные последствия для понимания углерода Велоспорт и изменения климата. Однако, недавние исследования выявили трудности, такие как отсутствие последовательности геномов для микрофлору в различных типах почв и неизвестной функции многих белков, обнаруженных. Эти вызовы результат из-за почвы является наиболее сложных микробных сообщества, известных на сегодняшний день1,2,3. Multi-omic анализов, которые объединяют результаты от метагеномных, metatranscriptomic, metaproteomic, Метаболомные и lipidomic исследований, недавно были осуществлены многочисленные исследования почвы для получения более глубокого понимания в настоящее, а микробы получение всеобъемлющей информации о молекулярных изменений, происходящих из-за экологические пертурбации1,4,5. Одна проблема с multi-omic исследования в том, что масс-спектрометрия (МС)-на основе metaproteomic, Метаболомные и lipidomic измерения, как правило, требуют конкретных добыча процесса для каждого omic MS совместимы6,7 , 8 , 9. эти точные процедуры осуществления их крайне трудно или просто невозможно когда доступны только ограниченное количество образцов. Эти проблемы побудили нас расследовать одновременное метаболит, белков и липидов добыча (MPLEx) метод способен с помощью небольших образцов томов или массы, повышение точности и обеспечения быстрее Подготовка образца для всех трех анализов 10. на сегодняшний день, есть нет альтернативного почвы добыча процедур, которые можно достичь всех этих целей.
Чтобы включить глобальный multi-omic анализы почвы единого образца, органической экстракции протокол, основанный на хлороформ, метанола и воды цветоделение был использованы10. Этот метод был первоначально разработан для всего липидов извлечений9,11 и совсем недавно были внесены поправки для одновременного извлечения метаболитов, белки и липиды из одного образца12,13 ,14,,1516,,1718,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28,29,30, что позволяет меньше количество образцов и 10экспериментальных изменчивости. В MPLEx протоколе метилхлороформа не смешивается с водой, которая обеспечивает основу для трехфазных химического разделения составляющих выборки на различных фракций. Топ водной фазе поэтому содержит гидрофильные метаболитов, затем диск белка и липидного слоя в нижней фазе хлороформ (рис. 1). Когда MPLEx применяется в большинстве почв, частиц космического мусора накапливается в самом низу выборки трубок и может быть удален после того, как собраны все слои. Каждый тип почвы может быть различным, однако и в высоко органические почвы как торф, почвы мусор остается в среднем слое и не упасть на дно трубки выборки. MPLEx обеспечивает ряд преимуществ при изоляции несколько молекулы из того же образца такие типы как 1) меньшего количества образца могут быть использованы для мульти omic анализов, 2) multi-omic извлечений из же образца снижение общей экспериментальной изменчивости, и 3) большее количество образцов могут быть подготовлены намного быстрее для исследования выше пропускная способность10. Вместе эти преимущества имеют жизненно важное значение для обеспечения лучшей возможности измерения для оценки образцов почвы и их сложных микробных сообществ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Очень влажных почвах может быть лиофилизированный до извлечения без ущерба для эффективности добычи. Влажной почве также могут быть использованы, но должны учитываться при добавлении реагентов в определенных соотношениях.
Примечание: Рекомендуется использовать 20 g вес сухой почвы на добычу, которые должны быть разделены между двумя 50 мл трубки (максимум 10 g почвы за Тюбик 50 мл). Удаление зубов может масштабироваться вверх или вниз в зависимости от доступных образцов.
Примечание: Сухой почвы образцы могут быть просеивают через сито 3 мм для гомогенизации и снять небольшой корни и камни. Не сито образцы влажной почвы, как образец будет застревать на экране.
1. почвы Lysis клеток и экстракции метаболитов, белки и липиды (сроки ~ 1 d)
- За образец почвы 20 g вес 10 g в два отдельных 50 мл трубки, которые являются метанол/хлороформ совместимы. Будьте осторожны с трубками, выбрали, как хлороформ вымывалось большинство пластмасс, загрязнение образцов. Использование стекла, всякий раз, когда возможно или пластиковые трубы изготовлены из полипропилена или из политетрафторэтилена (ПТФЭ).
Примечание: Держать почву на льду и как здорово как можно во время первоначальные шаги весом и гомогенизации. - Добавьте 10 мл хлороформа мыть из нержавеющей стали и граната бусины в каждую пробирку. На льду, добавить 4 мл холодного ультрачистая вода (см. Таблицу материалы для очистки системы) для каждой трубы (один образец раскол между двумя трубами) и передачи образцов в ведёрке со льдом в зонта.
- С помощью Пипетки серологические стекла 25 мл, быстро добавьте 20 мл ледяной хлороформ: метанола 2:1 (v/v).
Предупреждение: Хлороформ: метанол имеет острый потенциальных последствий для здоровья: раздражение кожи, возможные химические ожоги и раздражение дыхательной системы. Это может повлиять на почки, печень и сердце. Носите подходящие защитные очки, Одежда и перчатки и всегда работает в зонта. - Завинтите крышки и вихревой в раствор. 2:1 choloroform:methanol помогает разрушить стены клетки прокариот и также инактивирует ферментативную деятельность.
- Придаем трубы 50 мл трубки вихревой вложения и горизонтально вихря за 10 мин при температуре 4 ° C внутри холодильник если возможно. Затем поместите образцы внутри морозильной камерой-80 ° C ~ 15 мин для того, чтобы охладить их полностью.
- С помощью зонда sonicator внутри Зонта, sonicate каждый образец с зондом 6 мм (1/4") в амплитуде 60% для 30 s на льду.
Внимание: Рекомендуется использовать звук ослабления защиты корпуса и уха во время sonicating. Высокое напряжение присутствует в шнур питания и высокой частоты. Не прикасайтесь к нижней или сторонах образца судна с активный зонд; Он может треснуть или расплавить пластик. - Поместите образцы в морозильной камере-80 ° C ~ 15 мин, как sonicating может генерировать большое количество тепла.
- Повторите шаги 1.5-1.7.
Примечание: Убедитесь, что образцы оставаться холодной на протяжении всей процедуры lysis. - Центрифугуйте образцы на 4000 x g за 5 мин., 4 ° C. На данный момент образца будут разделены на слой верхней метаболит, белка прослойку и нижний слой липидов (и оставшиеся Пелле мусора). Смотрите Рисунок 1.
- Поместите образцы на льду в ведёрке со льдом и внутри зонта и используя 10 мл стеклянные Серологические Пипетки, удалите верхний метаболит слои из двух трубок 50 мл в один большой стеклянный флакон.
Примечание: Избегайте аспирационных любого слоя белка в пипетку; Если необходимо Оставьте небольшой слой метаболита. - Слегка наклоните Тюбик 50 мл выпустить межслойной белка, так что это свободное плавание на нижний слой липидов. С помощью шпателя с плоской головкой лаборатории чистой нержавеющей стали, тщательно совок оба белка плёнки и поместить их вместе в один новый Тюбик 50 мл.
- С помощью Пипетки серологические стекла 25 мл, удалите нижние слои липидов в один большой стеклянный флакон.
Примечание: Старайтесь избегать стремящихся частицы почвы; Однако, некоторые почвы мусора и частицы стремятся вместе с липиды будут удалены в более позднее время. - Место дышащий мембраны поверх метаболита и липидов стеклянные флаконы и сушат в вакуумной концентратор до сухости (липиды ~ 4-5 ч, метаболитов на ночь).
- Трубка образца белка и оставшиеся трубы Пелле мусора добавьте 20 мл ледяной метанола для каждого и вихря. Это делается для мусора гранулы чтобы смыть хлороформ перед попыткой солюбилизировать последнего любой возможной оставшиеся белок из мусора перед бросил его.
- Центрифуга мусора окатышей и белка межслойную на 4000 x g за 5 мин., 4 ° C, затем декантируют метанола в контейнер опасных отходов внутри зонта.
- Заморозить белка и мусора гранул в жидком азоте и сушат в лиофилизатор (с температурой коллектор способны-105 ° C благодаря метанола с очень низкой температурой замерзания-98 ° c) ~ 2 часа.
Примечание: Не чрезмерно сухие гранулы, как они будут труднее солюбилизировать последнего. - Добавьте 10 мл буфера солюбилизация белка (4% SDS, 100 мм DTT (DL-Дитиотреитол) в буфер tris 50 мм, pH 8,0; см. Дополнительные настройки реагент) белка межслойной трубки и 20 мл каждого из мусора окатышей.
Предупреждение: SDS вызывает острую токсичность и является легковоспламеняемым. Это кожи, глаз и дыхательных путей раздражитель. Надевайте перчатки и защитные очки. - В Зонта, зонд sonicate образцы на 20% амплитуды для 30 s для приведения их в решение. Вихрь на 2 мин.
- Поместите межслойной образец протеина в лаборатории трубки ротатор для 30 мин при 300 об/мин, 50 ° C, чтобы солюбилизировать последнего белка.
- По горизонтали вихревой мусора образцы для дополнительных 10 мин до лизируют любых оставшихся нетронутыми клетки, затем повернуть с межслойной образцы протеина для оставшихся 20 мин.
- Центрифуга для всех образцов на 4500 x g за 10 мин, комнатной температуры (RT) и собирать супернатант от каждой трубы на сэмпл в две пробирки 50 мл.
- Добавьте 10 мл солюбилизация буфера межслойной Пелле белок, а затем sonicate и вихревой обратно в решение и центрифуги, как раньше.
- Объединить две трубы 50 мл supernatants одинаково и центрифуги на 8000 x g за 10 мин., 4 ° C, в фиксированный угол ведро ротора.
Примечание: Окончательный центрифугирования необходимо устранить чрезмерное загрязняющих гуминовых веществ. - Декант supernatants в две пробирки 50 мл, так что есть 30 мл в каждом. Затем используя 10 мл стеклянные Серологические Пипетки, добавьте 7,5 мл TCA (трихлоруксусная кислота) к каждой трубе. Вихрь в раствор. Это делает 20% ТСА в каждой пробе 30 мл (корректировать),
Предупреждение: ГТС является Каустик, токсичных и может привести к ожогу кожи. Надевайте перчатки и защитные очки. - Поместите образцы в морозильной камере-20 ° C на 2 ч для ночевки.
Примечание: Белки обычно будет выпадать в осадок в течение 1 ч, но может быть слева на ночь (до 18 ч).
Примечание: Не позволяйте TCA извлечения идти дольше, чем 18 h из-за возможных кислотного гидролиза белка. Если образец замораживается, оттепели на льду; не позволяйте образца теплый вверх мимо оттепели. - Пелле осажденный белки, Центрифугуйте образцы на 4500 x g за 10 мин., 4 ° C и сцеживаться супернатант в отходы.
- Добавьте 10 мл ацетона ледяной 100% для каждого белка Пелле, вихрь и объединить как гранулы в одну трубу.
- Центрифуга трубка, содержащая комбинированные таблетки (с использованием баланса), а затем декантируют супернатант в отходы.
Предупреждение: Ацетон может вызвать раздражение кожи и глаз и дыхательных путей и это легко воспламеняющаяся жидкость и пар. Надевайте защитные очки перчатки и лаборатории пальто, работы вытяжного шкафа. - Помойте лепешка, дважды с помощью 1,5 мл ацетона и наконец передачу в 2-мл пробирку для окончательного отжима на 10000 x g за 5 мин.
- Декант супернатант в отходы и позволяют Пелле высохнуть перевернутый на wipe бумаги в Зонта ~ 20 мин или под поток азота до тех пор, пока гранулы слегка начинает трещать.
- 100-200 мкл буфера солюбилизация белка, в зависимости от размера гранул.
Примечание: Сохраняйте объем буфера солюбилизация, добавлены в пример, как можно более низкой. Последующие фильтр автоматизированного образца подготовка (ОВПБ) можно использовать только до 50 мкл растворимых образца каждого столбца; любой более должна быть разделена на несколько столбцов ОВПБ. - Sonicate и вихревой Пелле в раствор. Обратите внимание, что образец может быть вязкой благодаря гуминовых веществ, проникающих вместе с белком, который будет удален с последующим центрифугированием.
- Встряхните образца в шейкер инкубатор, за 30 мин при 300 об/мин, 40 ° C, чтобы солюбилизировать последнего белка в решение и приступить к переваривание белков.
- Оснастки замораживания образца в жидком азоте и хранить в холодильнике-80 ° C до готовности для переваривания белка.
2. липидов подготовка (сроки ~ 20 мин)
- После того, как образцы липидов сухой, добавить 200 мкл хлороформ: метанола 2:1 флакон, вихря в раствор и передачи в 1,5 мл полипропиленовые трубы, добавить дополнительные 200 мкл на стекло флаконе, вихрь и Пипетка остальные липиды и передать трубку.
- Центрифуга для мусора из выборки в 12000 g x 5 мин при 4 ° C.
- Перенесите супернатант в стеклянный флакон липидов и хранить при температуре от-20 ° C до LC-MS/MS анализ (дополнительные детали для LC-MS/MS в Дополнительные методы).
- Если образцы не могут быть проанализированы сразу после приготовления, липиды должны храниться в растворитель при-20 ° C для предотвращения окисления и деградации.
3. метаболит подготовка и деривации (сроки ~ 5 h)
- На следующий день после извлечения удалить образцы метаболит из скорость Vac и хранения сухих в-20 ° C до готовности для деривации и анализа на GC. Если не работает метаболитов на GC, то готовить их, используя соответствующий протокол для инструмента.
- Непосредственно перед derivatizing метаболитов для анализа на GC, передайте их от больших стеклянных флаконов, добавив 200 мкл метанола, vortexing и добавление в 1,5 мл полипропиленовые трубы. Повторите один раз.
- Центрифуга для трубки на 12000 x g за 10 мин., 4 ° C. Перевести супернатант в небольших стеклянных флаконов, добавить дышащая мембрана в верхней и полностью сухой Vac скорость.
- Derivatize метаболитов, добавив 20 мкл раствора methoxyamine флакон образца и вихрь 30 s на Вортекс на средней скорости.
Предупреждение: Methoxyamine гидрохлорид вызывает сильные ожоги и серьезного повреждения глаз, может вызвать путем контакта с кожей. Надевайте защитные очки, перчатки и лаборатории пальто и работать в зонта. - Используйте Ванна sonicator чтобы убедиться, что образец полностью не растворится.
- Инкубируйте образец в инкубаторе с крышкой предотвращения конденсации поддерживается при 37 ° C в течение 1 ч 30 мин с 1000 rpm встряхивания.
- Инвертируйте флакона один раз смешивать образцы с сжатой капли на поверхности крышки. Спиновые образца вниз на 1000 x г за 1 мин, рт.
- Выполнить silylation, добавляя 80 мкл (с помощью шприца) N-метил - N-(триметилсилиловые) trifluoroacetamide с Триметилхлорсилан 1%. Вортекс для 10s.
Предупреждение: MSTFA + 1% TMCS может привести к коррозии кожи, повреждения серьезные глаз и поражающее орган и это легко воспламеняющаяся жидкость и пар. Надевайте защитные очки, перчатки и лаборатории пальто и работать в зонта. - Инкубируйте образец в инкубаторе с крышкой предотвращения конденсации поддерживается при 37 ° C за 30 мин с 1000 rpm встряхивания.
- Инвертируйте флакона один раз смешивать образцы с сжатой капли на поверхности крышки.
- Спиновые образца вниз за 5 мин на 2000 x g, рт.
- Перевести отреагировал решение на флаконы для анализа GC-MS.
4. белка пищеварение (сроки ~ 1 d)
- Центрифуга для образца на 15000 x g 5 мин, RT, чтобы гранулы любой мусор.
- Выполнение автоматизированного фильтр-Подготовка образца (ОВПБ) для пищеварения, используя ОВПБ комплекты (см. Таблицу материалы) следующие изменения производителя инструкции по31,32:
- Добавьте 400 мкл буфера 8 M мочевины в столбец ОВПБ (500 мкл 30K MWCO спина фильтр).
- По завершении центрифугирования образца Пипетка покинуть супернатант (отменить гранулы) и добавьте 50 мкл пример 400 мкл 8 M мочевины в столбце.
Примечание: Добавление только до 50 мкл пример каждого столбца. Если существует более чем 50 мкл пример, используйте несколько столбцов и объединить пептиды после переваривания. Это лучше оставить этот объем как можно ниже (30 мкл идеально) для того, чтобы обеспечить ОВПБ столбец приведет к удалению всех СДП, которая может резко вмешиваться массовых спектр анализа. - Место столбца в включены 1,5 мл трубку и центрифуги образца в 14.000 x г за 30 мин, рт.
- Удаление потока через в отходы и добавить 400 мкл 8 M мочевины в столбце и центрифуги снова.
- Повторите предыдущий шаг еще раз для в общей сложности 3 полоскание мочевина.
Примечание: Убедитесь, образец проходит недалеко от сухости в столбце, если есть более чем ~ 30 мкл, оставшиеся на фильтр после каждого спина, продолжать центрифугирования. - В 14.000 x g 20 мин добавить 400 мкл 50 мм NH4HCO3 и центрифуги, сбросить отходы и повторить один раз.
- Передать чистый 1,5 мл пластиковых пробирок столбцы.
- Добавление столбцов 75 мкл буфера Пищеварение трипсина и инкубировать при 37 ° C 3 h в инкубаторе с крышкой предотвращения конденсации на 750 об/мин.
- Мкл 40 50 мм NH4HCO3 столбцами.
- Центрифуга для образца в 14.000 x g 15 мин для сбора пептидов в трубку при сохранении высокой молекулярной массой загрязнений на колонне.
- Снова добавьте 40 мкл 50 мм NH4HCO3 столбца и центрифуги.
- Удалить столбец, сухой вниз пептидов в трубе в скорость Vac ~ 30 мкл и пробирного BCA (Bicinchoninic кислоты белка пробирного комплект; см. Таблицу материалы) пептидов.
- При необходимости выполните очистку шаг, если SDS загрязнение подозревается (видимые пузырьки)33. Извлечения твердой фазы должно быть сделано потом, если выбрать этот параметр. Подробная информация об этом методе очистки доступен в Дополнительных методов.
- Развести образцы для анализа MS или при необходимости приступить к фракционировки HPLC (два следующих шагов).
- Чтобы фракционировать, развести образцы объемом 400 мкл с 10 мм аммония формате буфера (рН 10,0).
- Разрешить на столбец C18 (см. Таблицу материалы), разделив на 0,5 мл/мин с помощью ВЭЖХ системы с подвижных фазах Формиат аммония (A) 10 мм, pH 10.0 и (B) 10 мм формате аммония, рН 10,0/Ацетонитрил (составлявшее).
- Настройте градиент от 100% A до 95% A за первые 10 минут, 95% A до 65% A над мин 10-70, А 65% до 30% A над 70-85, сохранить 30% A над мин 85-95 мин.
- Заново сбалансировать с 100% A над 95-105 мин и удерживайте на 100% A до 120 мин.
- Сбор фракций каждый 1,25 мин (96 фракций за весь градиент) и наконец объединить каждую строку в общей сложности 12 образцов или каждой строки для 24 пробы (каждый с n = 8 и n = 4 фракции объединяют).
- Химчистка всех фракций под вакуумом и 15 мкл ультрачистая вода для каждого для хранения при температуре-20 ° C до анализа LC-MS/MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Когда протокол MPLEx был использован для извлечения молекул из Канзас родной луговые почвы (Mollisol почвы), тройные анализы представили результаты 3376 пептиды, липиды 105 и 102 полярных метаболитов (все уникальные идентификаторы). Хотя протокол MPLEx уже устоявшихся общей экстракции липидов и метаболитов12,13,14,,1516,17,18 ,19,20,21,,2223,24,25,26,27 ,28,,2930,34, сравнение его методов извлечения белков общей почвы для микробиологических анализов, например почвы белка добычу комплекты (см. таблицы Материалы) и экстракции SDS (натрия лаурилсульфат)35, далее вычисляется здесь. Чтобы оценить эти методы, Канзас родной луговые почвы белки были извлечены с каждым подходом и проанализированы непосредственно с обратная фаза LC-MS/MS, с помощью UPLC системы, в сочетании с гибридной квадрупольного/Орбитрэп масс-спектрометр. Подробная информация о параметрах метода доступны в Дополнительные методы. Результате экспериментальных пептид, МС/МС спектры от каждого подхода добычи были по сравнению с прогнозируемым пептид последовательностей от представителя Канзас родной прерий metagenome2 с помощью строгих MS-GF + спектральных вероятность отсечки от 1 x 10 -10 36 , 37 и массовые ошибки обрезания менее 5 ppm. Следует отметить, что аналитов, извлеченные из почвы с помощью протокола MPLEx подходят для исследования на основе MS и других аналитических методов. Когда первоначально сравнивая три реплицирует известных методов MoBio и SDS, только 12% пептидов перекрываются между двумя методами, показаны сложности микробных и извлечения различных эффектов (рис. 2). После сравнения MPLEx с экстрактами MoBio и SDS ~ 38% пептидов, наблюдается с помощью метода MPLEx были также обнаружены при использовании SDS и/или MoBio экстракции (рис. 2). Учитывая количество видов в Канзас почвы бактериальное сообщество и ее metagenome2, перекрытие пептид идентификации является разумным и из-за его сложности, сочетание подходов извлекает больше пептиды чем каждый только 35. Кроме того, поскольку эти образцы были нефракционированного и анализируются только 1-мерных LC-MS/MS, чрезвычайно высокий образец сложности возможно вызывает некоторые смещения обнаружения за счет концентрации различных пептид, добытых каждого подхода. Протокол MPLEx также был применен к другим типам почв как вечной мерзлоты и водно-болотных угодий, и во всех случаях результаты предварительных proteomic же качества что и Канзас родной луговые почвы данные, представленные здесь.
Широкой применимости MPLEx подхода, ранее проводилась с использованием разнообразный набор образцов, включая archaeon Sulfolobus acidocaldarius, unicyanobacterial консорциума38, ткани коры мозга мыши, мочи человека, и листья от Arabidopsis thaliana (рис. 2)10. Для всех образцов, за исключением A.thalianaмочевина извлечений являются наиболее распространенным способом для извлечения белков, поэтому они были использованы в качестве контроля подход для оценки. A. thaliana MPLEx результаты были сопоставлены с выступал с трихлоруксусной кислоты (TCA), потому что завод листья богаты фенольных соединений, которые должны быть удалены до MS анализа39экстракции. Во всех случаях количество белков, наблюдаемого из метода MPLEx был аналогичен для управления10, указав его полезности для многих типов различных образцов. Кроме того были не тенденций, связанных с классами определенных белков, извлеченные во всех видах образца (включая почвы). Таким образом широкую применимость MPLEx многочисленных биологических и экологических систем делает его перспективным подходом.
Рисунок 1. Схема, показывающая MPLEx процесс, в котором метаболитов, белки и липиды одновременно извлекаются из той же пробы почвы для анализа MS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Венна, иллюстрирующие пептид совпадения для набора разнообразных образцов, извлечены с помощью MPLEx и метод извлечения стандарта на основе мочевины белка обычно выполняется. Данные от добычи MPLEx archaeon S.acidocaldarius, unicyanobacterial консорциум, мочи человека, коре мозга мыши и A.thaliana завод оставляет адаптирована из Nakayasu, E. S. et al. 201610. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Важно отметить, что не все лаборатории будет иметь же имеющееся оборудование, поэтому некоторые методы, например лизис шаг, может быть адаптирована. Здесь мы используем vortexing и sonicating, однако использование большой 50 мл било шарик будет работать. Если не доступен лиофилизатор с температурой коллектор, способный-105 ° C, затем образцы можно высушить под струей азота. Также типы почвы сильно различаются и могут включать песок, Ил, глина, торф и суглинок (и т.д.), и они могут также различаться в зависимости от рН, солености и богатство органического вещества. Каждый из этих отклонений может иметь влияние на протоколе, поэтому очень важно, чтобы быть гибкими и вносить изменения при необходимости. Важно, однако, что коэффициенты и показатели остаются теми же.
MPLEx протокол показывает большие перспективы для применения в многочисленных биологических и экологических систем и возможность включения multi-omic анализы почвы микробных сообществ. Предыдущие Сравнение MPLEx с другие протоколы извлечения для различных систем иллюстрированный высокую степень пептид перекрытия10. Однако один отметил, что ограничение было, что MPLEx не применима к белками плазмы крови, которые должны быть исчерпаны. В этих случаях осажденный белки не были хорошо признаны антител в immunodepletion столбцы, необходимые для широкого освещения плазмы протеома. Таким образом более стандартные подходы извлечения следует использовать в этих обстоятельствах. Одно дополнительное ограничение, отметил для извлечения подход MPLex является, что он не различать внутриклеточные и внеклеточных белков, однако это справедливо для всех других почвы белка протоколы извлечения также.
В этой рукописи MPLEx представили результаты 3376 пептиды, липиды 105 и 102 полярных метаболитов в Канзас родной луговые почвы с помощью извлечения и анализа методов, подробно описанные в разделе протокол. Лучше перекрытие было отмечено между пептидами, добывается в управления и MPLEx подходов отдельных систем, по сравнению с почвы микробной сообщества (рис. 2). Это не является ограничением, но одним из последствий работы с чрезвычайно сложной почвы микробных сообществ. Эти результаты являются отметил далее как методы извлечения известной почвы SDS и MoBio сделал не перекрываются хорошо, либо из-за большого разнообразия и трудности, извлечение грунта белки одинаково. Интересно, что протокол MPLEx позволило выявить более всего пептиды, чем SDS или MoBio и также обнаружены дополнительные компоненты, не видел в любой анализ.
Эти наблюдения сделать MPLEx весьма перспективной техники для работы с размеров малых выборок, сокращение общей multi-omic экспериментальной изменчивости и сократить время на подготовку образца. Преимущества можно с MPLEx смотреть для включения возможности multi-omic и анализа, необходимых для исследования крупномасштабных микробной сообщества.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Натан Джонсон за его помощь в подготовке цифры. Это исследование было поддержано Пан омику программы, которая финансируется Департаментом энергетики США бюро биологических и экологических исследований (геномной науки программа), Microbiomes в переход (мята) лаборатории направлены исследования развития Инициатива на Тихоокеанской северо-западной национальной лаборатории, а также национальных институтов здравоохранения Национального института окружающей среды медицинских наук (R01 ES022190) и низ (P42 ES027704). KEBJ хотел бы поблагодарить R21 HD084788 для финансовой поддержки для разработки и проверки методов извлечения Роман multi-omic. Эта работа была выполнена в W. р. Уили экологических молекулярных наук лаборатории (ЛСМЭ), механизм национальных научных пользователя DOE на Тихоокеанская северо-западная Национальная лаборатория (PNNL). PNNL является многопрограммного Национальная Лаборатория Battelle, выполняемых для Доу под контракт де-AC06-76RL01830.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | Stored at -20°C !Caution chloroform has acute potential health effects, skin irritation and possible chemical burns, irritation to the respiratory system, may affect the kidneys, liver, heart. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Stored at -20°C !Caution Methanol may cause respiratory tract, skin and eye irritation, may damage the nerves, kidneys and liver. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Purified water from Millipore | Milli-Q | Water purification system. | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L6026 | !Caution SDS causes acute toxicity and is flammable. It is a skin, eye and airway irritant. Wear gloves and safety glasses. |
| Soil protein extraction kit | MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen | 30000-20 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| 1M Trizma HCL | Sigma-Aldrich | T2694 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T0699 | !Caution TCA is caustic, toxic and may cause skin burns. Wear gloves and safety glasses. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | Stored at -20°C !Caution Acetone may cause respiratory tract and skin and eye irritation. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses gloves and a lab coat, work in a fume hood. |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | !Caution Urea is an eye and skin irritant, use gloves and safety glasses |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830 | |
| Trypsin | Promega | V528A | 20µg vials |
| Bicinchoninic acid protein assay kit | Pierce | 23227 | |
| Ammonium Formate | Sigma-Aldrich | 09735 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | !Caution Acetonitrile is a skin and eye irritant. Highly flammable. Wear gloves and safety glasses. Work in a fume hood. |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | !Caution TFA is extremely hazardous in case of skin contact, eye contact, ingestion and inhalation. May produce tissue damage particularly on mucous membranes of eyes, mouth and respiratory tract. Skin contact may produce burns. Wear gloves, lab coat, safety glasses and work in a fume hood. |
| Methoxyamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 226904 | !Caution Methoxyamine hydrochloride causes severe burns and serious damage to eyes, may cause sensitization by skin contact. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | !Caution Pyridine can cause skin and eye irritation, central nervous system depression. Vapor may cause flash fire. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trimethylchlorosilane | Sigma-Aldrich | 69478 | !Caution MSTFA + 1% TMCS can cause skin corrosion, serious eye damage and specific target organ toxicity. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Milli-Q water purification system | Millipore | model MPGP04001 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Probe sonicator | FisherBrand | model FB505 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | model 5810R | |
| 50mL tube swinging bucket rotor | Eppendorf | A-4-44 | |
| 50mL fixed angle rotor | Eppendorf | FA-45-6-30 | |
| Balance | OHAUS | model V22PWE150IT | |
| Serological pipette controller | Eppendorf | 12-654-100 | |
| 10mL, 25mL glass serological pipettes | FisherBrand | 13-678-27F, 13-678-36D | |
| Thermomixer with Thermotop | Eppendorf | 5382000015, 5308000003 | |
| 0.9 – 2.0 mm blend stainless steel beads | NextAdvance | SSB14B | |
| 0.15 mm garnet beads | MoBio | 13122-500 | |
| Magnetic stir plate | FisherBrand | 11-100-16SH | |
| Magnetic stir bar | FisherBrand | 14512130 | |
| pH paper strips, pH range 0–14 | FisherBrand | M95903 | |
| 15mL, 50mL conical polypropylene centrifuge tube | Genesee Scientific | 21-103 21-108 | chloroform compatible |
| 50mL vortex attachment | MoBio | 13000-V1-50 | |
| Ice bucket | FisherBrand | 02-591-44 | |
| 27.25x70mm glass vials | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Breathe Easier plate membranes | Midwest Scientific | BERM-2000 | |
| Alcohol wipes | Diversified Biotech | BPWP-1000 | |
| Heater shaker incubator | Benchmark, Incu-Shaker Mini | ||
| Analog rotisserie tube rotator | SoCal BioMed, LLC | 82422001 | |
| Filter-Aided-Sample-Prep kit | FASP; Expedeon | 44250 | |
| Microplate reader | Biotek, EPOCH | ||
| -20 Degree Celsius Freezer | Fisher | 13986149 | |
| -80 Degree Celsius Freezer | Stirling Ultracold | SU78OUE | |
| Q-Exactive ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Agilent 7890A gas chromatograph coupled with a single quadrupole 5975C mass spectrometer | Agilent Technologies, Inc. | ||
| LTQ-Orbitrap Velo | Thermo Scientific | ||
| Waters NanoEquityTM UPLC system | Millford, MA | ||
| 250mL media bottle | FisherBrand | 1395-250 | |
| Waters vial | Waters | 186002805 | |
| Glass MS sample vial and inserts | MicroSolv | 9502S-WCV, 9502S-02ND | |
| Glass HPLC vial and snap caps | MicroSolv | 9512C-0DCV, 9502C-10C-B | |
| HPLC 96-well plate | Agilent | 5042-6454 | |
| Large glass vial 27.25x70mm | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Lyophilizer | Labconco | 7934021 | |
| Polished stainless steel flat head spatula | Spoonula; FisherBrand | 14-375-10 | |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 34721 | |
| XBridge C18, 250x4.6 mm, 5 μM with 4.6x20 mm guard column | Waters | 186003117, 186003064 | |
| Agilent 1100 series HPLC system | Agilent Technologies | G1380-90000 | |
| 1.7mL centrifuge tube | Sorenson | 11700 | |
| Hamilton Glass Syringes, 5mL, 50µL and 250µL | Hamilton | 81517, 80975, 81175 | |
| Pasteur Pipettes | FisherBrand | 13-678-20A | |
| Pasteur Pipette Bulbs | Sigma-Aldrich | Z111597 | |
| Bath Sonicator | Branson 1800 Ultrasonic Cleaner | ||
| Vacuum Centrifuge | Labconco Centrivap Acid-Resistant Concentrator System | ||
| MicroSpin Columns, C18 Silica | The Nest Group | SEM SS18V |
References
- Hultman, J., et al. Multi-omics of permafrost, active layer and thermokarst bog soil microbiomes. Nature. 521, 208-212 (2015).
- White, R. A. 3rd, et al. Moleculo long-read sequencing facilitates assembly and genomic binning from complex soil metagenomes. mSystems. 1, (2016).
- White, R. A., Callister, S. J., Moore, R. J., Baker, E. S., Jansson, J. K. The past, present and future of microbiome analyses. Nat Protoc. 11, 4-8 (2016).
- Ritchie, M. D., Holzinger, E. R., Li, R., Pendergrass, S. A., Kim, D. Methods of integrating data to uncover genotype-phenotype interactions. Nat Rev Genet. 16, 85-97 (2015).
- Jansson, J. K., Baker, E. S. A multi-omic future for microbiome studies. Nat Microbiol. 1, (2016).
- Domon, B., Aebersold, R. Options and considerations when selecting a quantitative proteomics strategy. Nat Biotechnol. 28, 710-721 (2010).
- Marx, V. Targeted proteomics. Nat Methods. 10, 19-22 (2013).
- Roberts, L. D., Souza, A. L., Gerszten, R. E., Clish, C. B. Targeted metabolomics. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 30, Unit 30 32 31-24 (2012).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226, 497-509 (1957).
- Nakayasu, E. S., et al. MPLEx: a Robust and Universal Protocol for Single-Sample Integrative Proteomic, Metabolomic, and Lipidomic Analyses. mSystems. 1, (2016).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Pomraning, K. R., et al. Multi-omics analysis reveals regulators of the response to nitrogen limitation in Yarrowia lipolytica. BMC Genomics. 17, 138 (2016).
- Tisoncik-Go, J., et al. Integrated Omics Analysis of Pathogenic Host Responses during Pandemic H1N1 Influenza Virus Infection: The Crucial Role of Lipid Metabolism. Cell Host Microbe. 19, 254-266 (2016).
- Kyle, J. E., et al. Uncovering biologically significant lipid isomers with liquid chromatography, ion mobility spectrometry and mass spectrometry. Analyst. 141, 1649-1659 (2016).
- Lovelace, E. S., et al. Silymarin Suppresses Cellular inflammation by inducing reparative stress signaling. J Nat Prod. 78, 1990-2000 (1990).
- Kim, Y. M., et al. Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms. Front Microbiol. 6, 209 (2015).
- Pomraning, K. R., et al. Comprehensive Metabolomic, Lipidomic and microscopic profiling of Yarrowia lipolytica during lipid accumulation identifies targets for increased lipogenesis. PLoS One. 10, e0123188 (2015).
- Huang, E. L., et al. The fungus gardens of leaf-cutter ants undergo a distinct physiological transition during biomass degradation. Environ Microbiol Rep. 6, 389-395 (2014).
- Deatherage Kaiser, B. L., et al. A Multi-Omic View of Host-Pathogen-Commensal Interplay in Salmonella-Mediated Intestinal Infection. PLoS One. 8, e67155 (2013).
- Kim, Y. M., et al. Salmonella modulates metabolism during growth under conditions that induce expression of virulence genes. Mol Biosyst. 9, 1522-1534 (2013).
- Ansong, C., et al. A multi-omic systems approach to elucidating Yersinia virulence mechanisms. Mol Biosyst. 9, 44-54 (2013).
- Bordbar, A., et al. Model-driven multi-omic data analysis elucidates metabolic immunomodulators of macrophage activation. Mol Syst Biol. 8, 558 (2012).
- Hu, Z. P., et al. Metabolomic response of human skin tissue to low dose ionizing radiation. Mol Biosyst. 8, 1979-1986 (2012).
- Perera, R., et al. Dengue virus infection perturbs lipid homeostasis in infected mosquito cells. PLoS Pathog. 8, e1002584 (2012).
- Gao, X., et al. A reversed-phase capillary ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) method for comprehensive top-down/bottom-up lipid profiling. Anal Bioanal Chem. 402, 2923-2933 (2012).
- Sorensen, C. M., et al. Perturbations in the lipid profile of individuals with newly diagnosed type 1 diabetes mellitus: Lipidomics analysis of a Diabetes Antibody Standardization Program sample subset. Clin Biochem. 43, 948-956 (2010).
- Diamond, D. L., et al. Temporal proteome and lipidome profiles reveal hepatitis C virus-associated reprogramming of hepatocellular metabolism and bioenergetics. PLoS Pathog. 6, e1000719 (2010).
- Alquier, T., et al. Deletion of GPR40 impairs glucose-induced insulin secretion in vivo in mice without affecting intracellular fuel metabolism in islets. Diabetes. 58, 2607-2615 (2009).
- Ding, J., et al. Application of the accurate mass and time tag approach in studies of the human blood lipidome. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 871, 243-252 (2008).
- Rasmussen, A. L., et al. Systems virology identifies a mitochondrial fatty acid oxidation enzyme, dodecenoyl coenzyme A delta isomerase, required for hepatitis C virus replication and likely pathogenesis. J Virol. 85, 11646-11654 (2011).
- Manza, L. L., Stamer, S. L., Ham, A. J., Codreanu, S. G., Liebler, D. C. Sample preparation and digestion for proteomic analyses using spin filters. Proteomics. 5, 1742-1745 (2005).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat Methods. 6, 359-362 (2009).
- Zhou, J. Y., et al. Simple sodium dodecyl sulfate-assisted sample preparation method for LC-MS-based proteomics applications. Anal Chem. 84, 2862-2867 (2012).
- Anderson, J. C., et al. Decreased abundance of type III secretion system-inducing signals in Arabidopsis mkp1 enhances resistance against Pseudomonas syringae. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 6846-6851 (2014).
- Chourey, K., et al. Direct cellular lysis/protein extraction protocol for soil metaproteomics. J Proteome Res. 9, 6615-6622 (2010).
- Kim, S., Gupta, N., Pevzner, P. A. Spectral probabilities and generating functions of tandem mass spectra: a strike against decoy databases. J Proteome Res. 7, 3354-3363 (2008).
- Kim, S., Pevzner, P. A. MS-GF+ makes progress towards a universal database search tool for proteomics. Nat Commun. 5, 5277 (2014).
- Cole, J. K., et al. Phototrophic biofilm assembly in microbial-mat-derived unicyanobacterial consortia: Model systems for the study of autotroph-heterotroph interactions. Front Microbiol. 5, (2014).
- Isaacson, T., et al. Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues. Nat Protoc. 1, 769-774 (2006).
