Summary
En protokoll er presentert for samtidig trekke metabolitter, proteiner og lipider fra en enkelt jordprøve, slik at redusert eksempel Klargjøringstiden og aktivere multi-omic massespektrometri analyser av prøver med begrensede mengder.
Abstract
Massespektrometri (MS)-basert integrert metaproteomic, metabolomic og lipidomic (multi-omic) studier transformerer vår evne til å forstå og karakterisere mikrobielle samfunn i miljø og biologiske systemer. Disse målingene er selv muliggjør forbedret analyser av komplekse jord mikrobiell samfunn, som er de mest komplekse mikrobiell systemer kjent ennå. Multi-omic analyser, men har prøven forberedelse utfordringer, siden separat utdrag kreves vanligvis for hver omic studien, og dermed sterkt forsterke Forberedelsestid og mengde eksempel kreves. For å løse denne begrensningen, ble en 3-i-1-metoden for samtidig utvinning av metabolitter, proteiner og lipider (omfattende) fra den samme jordprøve opprettet ved å tilpasse en løsemiddelbasert tilnærming. Denne omfattende protokollen har vist seg for å være både enkel og robust for mange eksempel typer, selv når benyttes for begrensede mengder av komplekse jordprøver. Metoden omfattende aktivert også sterkt rask multi-omic målinger for å få en bedre forståelse av hvert mikrobielle samfunn, under evaluering av endringene som skjer på biologisk og miljømessig forstyrrelser.
Introduction
Evaluere jord mikrobielle samfunn har viktige implikasjoner for å forstå karbon sykling og klima endring. Nyere studier har imidlertid merket problemer, for eksempel mangel på sekvensert genomer for bakterieflora i ulike jord og ukjent funksjon mange av proteiner oppdaget. Disse utfordringene resultatet på grunn av jord blir mest komplekse mikrobiell samfunnet kjent hittil1,2,3. Multi-omic analyser, som kombinerer resultatene fra metagenomic, metatranscriptomic, metaproteomic, metabolomic og lipidomic studier, har nylig implementert i mange jord studier for å få større forståelse i mikrobene finnes, mens få omfattende informasjon om molekylære endringene som skjer på grunn av miljømessige forstyrrelser1,4,5. En utfordring med multi-omic studier er at massespektrometri (MS)-basert metaproteomic, metabolomic og lipidomic mål krever vanligvis en bestemt utpakkingen for hver omic skal MS kompatibel6,7 , 8 , 9. disse presis prosedyrer gjøre gjennomføringen svært vanskelig eller umulig når bare en begrenset mengde utvalg er tilgjengelig. Disse utfordringene har bedt oss å undersøke en samtidige metabolitten, protein og lipid utvinning (omfattende) metode kan bruke mindre utvalg volumer eller massene, forbedre nøyaktigheten og gi raskere utvalg forberedelser for alle tre analyser 10. dato det er ingen alternativ jord utvinning prosedyrer som kan oppnå alle disse målene.
Hvis du vil aktivere global multi-omic analyser av en enkelt jordprøve, var en organisk løsemiddel utvinning protokoll basert på kloroform, metanol og vann separasjoner utnyttet10. Denne metoden ble opprinnelig utviklet for totalt lipid utdrag9,11 og nylig endret for samtidig utvinning av metabolitter, proteiner og lipider fra en enkelt prøve12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28,29,30, slik at mindre utvalg antallet og eksperimentell variasjoner10. I den omfattende protokollen er kloroform ikke blandbar med vann, som danner grunnlaget for triphasic kjemisk separasjon av prøven bestanddeler i forskjellige fraksjoner. Den øverste vandige fasen inneholder derfor hydrofile metabolitter, etterfulgt av en protein-disk, og deretter et lipid lag i bunnen kloroform fase (figur 1). Når omfattende brukes på de fleste jord, partikler avfall akkumuleres på bunnen av prøvetaking rørene og kan bli forkastet etter at alle lagene er samlet. Hver jordtype kan være forskjellige, men, og svært organisk jord som torv, jord rusk opphold i midten laget og ikke faller til bunnen av prøvetaking røret. Omfattende gir flere fordeler når isolere flere molekyl skriver fra samme eksempel som 1) mindre utvalg mengder kan brukes for multi-omic analyser, 2) multi-omic utdrag fra samme eksempel nedgangen samlet eksperimentelle variasjon, og 3) større antall prøver kan tilberedes mye raskere for høyere gjennomstrømming studier10. Sammen disse fordelene er avgjørende for å gi bedre måling evner for å vurdere jordprøver og deres komplekse mikrobielle samfunn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Veldig våt jord kan være lyofiliserte før ekstraksjon uten skade for effektiviteten av utvinning. Våt jord kan også brukes, men bør vurderes når du legger til reagenser i spesifikke formater.
Merk: Det anbefales å bruke 20 g tørr jord vekten per avstamning, som må deles mellom to 50 mL rør (maksimalt 10 g jord per 50 mL tube). Utdrag kan skaleres opp eller ned avhengig av tilgjengelige utvalget.
Merk: Tørr jord prøvene kan være soldet gjennom en 3 mm skjermen for å homogenize og fjerne små røtter og steiner. Ikke sil våt jordprøver, som prøven sitter fast i skjermen.
1. jord celle Lysis og utvinning av metabolitter, proteiner og lipider (Timing ~ 1 d)
- Per 20 g jordprøve, vei 10 g i to separate 50 mL-rør som er metanol/kloroform kompatibel. Vær svært forsiktig med rør valgt, som kloroform vil lekke de fleste plaststoffer, forurensende prøvene. Bruke glass når mulig eller plast rør laget av polypropylen eller polytetrafluoroethylene (PTFE).
Merk: Holde jorda på is og så kul som mulig under de innledende veier og homogenisering skritt. - Legge til 10 mL av kloroform-vasket rustfritt stål og garnet perler i hver retning. Legg 4 mL kaldt ultrapure på is, vann (se Tabell for materiale for luftrensing system) til hver tube (ett utvalg delt mellom to rør) og overføre eksemplene i en isen bøtte i avtrekksvifte.
- Bruker en 25 mL glass serologisk pipette, raskt legge til 20 mL iskald 2:1 kloroform: metanol (v/v).
Forsiktig: Kloroform: metanol har akutt mulige helseeffekter: hud irritasjon, mulige kjemiske forbrenninger og irritasjon i luftveiene. Det kan påvirke den nyrer, lever og hjerte. Bruk egnet beskyttende briller, klær og hansker og alltid arbeide i avtrekksvifte. - Stram lokk og vortex løsning. 2:1 choloroform:methanol bidrar til å bryte ned cellen vegg av prokaryoter og også deaktiverer enzymatisk aktiviteter.
- Legge rør til 50 mL tube vortex vedlegg og vannrett vortex i 10 min på 4 ° C i kjøleskap hvis mulig. Deretter plassere prøvene inne en-80 ° C fryseren for ~ 15 minutter for å avkjøle dem ned helt.
- Bruke en sonde sonicator inne avtrekksvifte, sonicate hvert utvalg med en 6 mm (1/4") sonde på amplituden 60% for 30 s på is.
Forsiktig: Det anbefales å bruke en lyd avtakende kabinettet og øret beskyttelse mens sonicating. Høy spenning finnes i tilbud og høyfrekvent strømkabelen. Unngå å berøre bunnen eller sidene av prøven fartøyet med en aktiv sonde; det sprekk eller smelte plasten. - Sett prøvene i-80 ° C fryseren for ~ 15 min, sonicating kan generere mye varme.
- Gjenta 1.5-1.7.
Merk: Kontroller at prøvene opphold kald gjennom lysis prosedyren. - Sentrifuge prøvene 4000 x g i 5 min, 4 ° C. På dette punktet, vil prøven bli delt i øvre metabolitten laget, protein folien, og den nederste lipid laget (og gjenværende rusk pellet). Se figur 1.
- Sett prøvene på is i en isen bøtte og i avtrekksvifte og bruker en 10 mL glass serologisk pipette, fjerne øvre metabolitten lagene fra to 50 mL rør i en stor hetteglass.
Merk: Unngå aspirating noen av protein laget i pipette; La et lite lag med metabolitten hvis nødvendig. - Lett vippe 50 mL tube å løslate protein folien slik at det er gratis flytende på lavere lipid laget. Bruker en ren rustfritt stål flatskjerm-leder lab slikkepott, forsiktig scoop begge protein interlayers og plassere dem sammen i en ny 50 mL tube.
- Bruker en 25 mL glass serologisk pipette, fjerne lavere lipid lag i en stor hetteglass.
Merk: Prøv å unngå håper jordpartikler; men noen jord rusk og partikler håpet sammen med lipider fjernes senere. - Pustende membraner over toppen av metabolitten og lipid glass flasker og tørr i et vakuum konsentrator til tørrhet (lipider ~ 4-5 h, metabolitter over natten).
- Protein eksempel røret og gjenværende rusk pellet rør, legge til 20 mL iskald metanol hver og vortex. Dette er gjort til rusk pellets til skyll kloroform før du prøver å solubilize alle mulig resterende protein av rusk før du kaster det.
- Sentrifuger rusk pellets og protein interlayer 4000 x g i 5 min, 4 ° C, deretter Dekanter metanol i en farlig avfall beholder i avtrekksvifte.
- Fryse protein og rusk pellets i flytende nitrogen og tørr i en lyophilizer (med en samler temperatur kan-105 ° C på grunn av metanol har en svært lav frysepunktet-98 ° c) ~ 2 timer.
Merk: Ikke over tørr pellets, ettersom de vil være vanskeligere å solubilize. - Legg til 10 mL av protein solubilization buffer (4% SDS, 100mM DTT (DL-dithiothreitol) i 50mM tris buffer, pH 8.0, se Utfyllende reagens oppsett) protein interlayer rør og 20 mL til hver av rusk pellets.
Forsiktig: SDS fører Akutt toksisitet og er brannfarlig. Det er en hud, øyne og luftveier irriterende. Bruk vernehansker og vernebriller. - I avtrekksvifte, sonde sonicate samples ved 20% amplitude for 30 å bringe dem inn i løsningen. Vortex i 2 minutter.
- Plass protein interlayer prøven i et laboratorium tube rotator i 30 min på 300 rpm, 50 ° C, for å solubilize protein.
- Vannrett vortex rusk prøvene for en ekstra 10 min å lyse resterende intakt celler, da rotere med protein interlayer prøvene for de resterende 20 min.
- Sentrifuge alle prøvene 4500 x g for 10 min, romtemperatur (RT), og samle nedbryting fra hver tube per prøve i to 50 mL rør.
- Tilsett 10 mL av solubilization buffer til protein interlayer pellets, så sonicate og vortex tilbake og sentrifuger som før.
- Kombinere supernatants i to 50 mL rør like og sentrifuge 8000 x g for 10 min, 4 ° C, i en bestemt vinkel bøtte rotor.
Merk: En siste sentrifugering er nødvendig å fjerne overdreven forurensende humic stoffer. - Dekanter i supernatants i to 50 mL rør slik at det er 30 mL i hver. Deretter bruker en 10 mL glass serologisk pipette, legge 7,5 mL TCA (Trekloredikksyre) til hver rør. Vortex løsning. Dette gjør 20% TCA i hver 30 mL prøve (Juster tilsvarende),
Forsiktig: TCA er kaustisk, giftig og kan forårsake hud brannsår. Bruk vernehansker og vernebriller. - Sett prøvene i en 20 ° C fryseren for 2t overnight.
Merk: Proteiner vil vanligvis føre til innen 1 time, men kan være venstre over natten (opp til 18 h).
Merk: Ikke la TCA utvinning gå lenger enn 18t på grunn av mulig syre hydrolyse av protein. Hvis prøven er fryst, tine det på is; ikke la prøven varme opp forbi tine. - For å pellets utfelt protein, sentrifuge prøven 4500 x g for 10 min, 4 ° C og Dekanter nedbryting til avfall.
- Legge 10 mL av 100% iskald aceton til hver protein pellet, vortex og kombinere som pellets i en tube.
- Sentrifuge røret som inneholder den kombinerte pellet (med en balanse), og deretter Dekanter nedbryting til avfall.
Forsiktig: Aceton kan forårsake luftveissykdommer skrift og hud og øyne irritasjon, og er en brennbar væske og damp. Bruke vernebriller hansker og en labfrakk, arbeid i avtrekksvifte. - Vask pellet to ganger med 1,5 mL aceton eller endelig overføring til en 2 mL tube for den siste spinn på 10 000 x g i 5 min.
- Dekanter nedbryting i avfall og la pellet tørke invertert på en papir tørke i avtrekksvifte for ~ 20 min eller under en nitrogen strøm til pellet litt begynner å sprekke.
- Legge til 100-200 µL av protein solubilization bufferen, avhengig av pellet.
Merk: Holde volumet av solubilization buffer lagt til utvalget så lavt som mulig. Etterfølgende Filter hjulpet eksempel forberedelse (FASP) kan bare bruke opptil 50 μL av solubilized prøve per kolonne; noen må mer være delt inn i flere FASP kolonner. - Sonicate og vortex pellet løsning. Merk at prøven kan være tyktflytende på grunn av humic stoffer fremskynde sammen med protein, som vil bli fjernet med en påfølgende sentrifugering.
- Rist prøven i en inkubator/shaker i 30 min på 300 rpm, 40 ° C, for å solubilize proteinet i løsning og videre til protein fordøyelse.
- Fest fryse prøven i flytende nitrogen og store i-80 ° C fryser til klar for protein fordøyelse.
2. lipid forberedelse (Timing ~ 20 min)
- Når lipid prøvene er tørr, legge 200 μL av 2:1 kloroform: metanol til ampullen, vortex løsning og overføre til en 1,5 mL polypropylen tube, en ytterligere 200 μL til glasset medisinglass, vortex og Pipetter de gjenværende lipider og overføre til røret.
- Sentrifuge rusk av prøven på 12.000 x g i 5 min på 4 ° C.
- Overføre nedbryting i en lipid hetteglass og butikk på 20 ° C til LC--MS-/ MS analyse (flere detaljer for LC-MS/MS i Supplerende metoder).
- Hvis eksemplene ikke analyseres umiddelbart etter forberedelse, må lipider lagres i løsemiddel på 20 ° C å hindre oksidering og fornedrelse.
3. metabolitten forberedelse og Derivatization (Timing ~ 5 h)
- På dagen etter utvinning, fjerner metabolitten prøvene fra hastighet Vac og lagre tørr på 20 ° C til du er klar for derivatization og analyse på GC. Hvis ikke kjører metabolitter på en GC, deretter forberede dem ved hjelp av den riktige protokollen instrumentet.
- Umiddelbart før derivatizing overføre metabolitter for analyse på GC, dem fra de store hetteglassene ved å legge til 200 μL av metanol, vortexing og legge til en 1,5 mL polypropylen tube. Gjentas én gang.
- Sentrifuge røret på 12.000 x g for 10 min, 4 ° C. Overføre nedbryting til mindre hetteglass, Legg en pustende membran til toppen, og helt tørt i en fart Vac.
- Derivatize metabolitter ved å legge til 20 µL methoxyamine løsning eksempel medisinglass og vortex for 30 s på en vortexer på medium hastighet.
Forsiktig: Methoxyamine hydroklorid forårsaker alvorlige forbrenninger og alvorlig øyeskade, kan gi allergi ved hudkontakt. Bruk vernebriller, hansker og Laboratoriefrakk og arbeide i avtrekksvifte. - Bruk en bad sonicator for å sikre prøven er fullstendig oppløst.
- Inkuber eksemplet i en inkubator med kondens forebygging lokk opprettholdt på 37 ° C i 1 h 30 min med 1000 rpm risting.
- Snu ampullen en gang for å blande prøvene med kondensert dråper på cap overflaten. Nedspinning prøven 1000 x g for 1 min, RT.
- Utføre silylation ved å legge til 80 µL (med en sprøyte) n-metyl - N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide med 1% trimethylchlorosilane. Vortex for 10s.
Forsiktig: MSTFA + 1% TMCS kan forårsake hud korrosjon, alvorlig øyeskade og bestemt mål orgel-toksisitet, og er en brennbar væske og damp. Bruk vernebriller, hansker og Laboratoriefrakk og arbeide i avtrekksvifte. - Inkuber eksemplet i en inkubator med kondens forebygging lokk opprettholdt på 37 ° C i 30 min med 1000 rpm risting.
- Snu ampullen en gang for å blande prøvene med kondensert dråper på cap overflaten.
- Nedspinning prøven i 5 min 2000 x g, RT.
- Overføre reagert løsningen til ampuller passer for GC-MS analysen.
4. protein fordøyelse (Timing ~ 1 d)
- Sentrifuge prøven på 15.000 x g i 5 min, RT, til pellets alle partikler.
- Utføre Filter-hjulpet-Sample-forberedelse (FASP) for fordøyelsen bruker FASP kits (se Tabell for materiale) følgende endret produsentens instruksjoner31,32:
- Legge til 400 μL 8 M urea bufferen i en FASP kolonne (500 μL 30K MWCO spinn filter).
- Når prøven er ferdig sentrifugering, Pipetter av nedbryting (kast pellet) og legge til opptil 50 μL av utvalget av 400 μL 8 M urea i kolonnen.
Merk: Legg opptil 50 μL av prøve per kolonne. Hvis det er mer enn 50 μL av prøven, bruke flere kolonner og kombinere peptidene etter fordøyelsen. Det er best å la dette volumet så lavt som mulig (30 µL er ideelle) for å sikre FASP kolonnen vil fjerne alle SDS som kan dramatisk påvirke masse spec analyse. - Plasser kolonnen i inkludert 1,5 mL tube og sentrifuge prøven 14.000 x g i 30 min, RT.
- Fjern gjennomflytsenhet i avfall og legge til 400 μL 8 M urea i kolonnen og sentrifuge igjen.
- Gjenta forrige trinn én gang for totalt 3 urea skyller.
Merk: Kontroller at prøven går nær tørrhet på kolonnen hvis det er noen flere ~ 30 µL igjen på filter etter hvert spinn, fortsette sentrifugering. - Legger til 400 μL 50 mM NH4HCO3 og sentrifuger 14.000 x g for 20 min, kaste avfall, og gjentas én gang.
- Overføre kolonnene til en ren 1,5 mL sentrifuge rør.
- Legg til 75 μL trypsin fordøyelsen buffer til kolonnene og ruge på 37 ° C 3 h i en inkubator med kondens forebygging lokk på 750 rpm.
- Legge til 40 µL av 50 mM NH4HCO3 kolonner.
- Sentrifuge prøven 14.000 x g i 15 min samle peptidene inn i røret samtidig molekylvekt forurensninger på toppen av kolonnen.
- Legg til 40 μL 50mM NH4HCO3 kolonne og sentrifuger igjen.
- Forkaste kolonnen, tørke ned peptider i røret i en fart Vac ~ 30 µL og BCA analysen (Bicinchoninic acid protein analysen kit, se Tabellen for materiale) peptidene.
- Frivillig, utføre en rengjøring trinn hvis SDS forurensning er mistenkt (synlig bobler)33. En robust fase utvinning gjøres etterpå hvis du velger dette alternativet. Detaljert informasjon om denne oppryddingen metoden er tilgjengelig i Supplerende metoder.
- Fortynne utvalget for MS analyse eller eventuelt videre til HPLC fraksjoneres (to neste trinn).
- Å smuldre vekk, fortynne prøver til et volum på 400 µL med 10 mM ammonium formiat buffer (pH 10.0).
- Løse på en C18 kolonne (se Tabell for materiale) ved å skille på 0,5 mL/min med en såkalt HPLC-system med mobile phases (A) 10 mM ammonium formiat, pH 10.0 og (B) 10 mM ammonium formiat, pH 10.0/acetonitrile (10:90).
- Justere gradient fra 100% A 95% A over de første 10 min, 95% A til 65% A over min 10-70, 65% et 30% a over min 70 til 85, opprettholde på 30% A over min 85 til 95.
- Nytt equilibrate med 100% A over min 95 til 105 og holder på 100% A min 120.
- Samle fraksjoner hvert 1,25 min (96 fraksjoner over hele forløpningen) og til slutt sette sammen hver rad totalt 12 prøver eller annenhver rad for 24 prøver (hver med n = 8 eller n = 4 fraksjoner samlet).
- Tørk alle fraksjoner under vakuum og legge til 15 µL ultrapure vann hver for lagring på 20 ° C til LC--MS-/ MS analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når omfattende protokollen ble brukt til å hente molekyler fra Kansas innfødt prairie jord (en Mollisol jord), gitt tre eksemplarer analysene resultater for 3376 peptider, 105 lipider og 102 polar metabolitter (alle unike identifikasjoner). Mens omfattende protokollen er blitt godt etablert for generelle utvinning av lipider og metabolitter12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21,22,23,24,25,26,27 ,28,29,30,34, sammenligning til felles jord protein utvinning metoder for mikrobiell analyser, som jord protein utvinning kits (se tabell av Materialer) og SDS (natrium dodecyl sulfate) utdrag35, vurderes videre her. For å vurdere disse teknikkene, Kansas innfødt prairie jord proteiner utdraget med dem og analyseres direkte med reverseres-fase LC-MS/MS ved å bruke en UPLC kombinert med en hybrid quadrupole/Orbitrap masse spectrometer. Detaljert informasjon om metodeparameterne finnes i Supplerende metoder. Den resulterende eksperimentelle peptid MS-/ MS spectra hver utvinning tilnærming ble sammenlignet med forventet peptid sekvenser fra representant Kansas innfødt prairie metagenome2 bruke en strenge MS-spektrale sannsynlighet cutoff GF + 1 x 10 -10 36 , 37 og en masse feil cutoff av mindre enn 5 ppm. Det bør bemerkes at analytter Hentet fra jord ved hjelp av omfattende protokollen er egnet for baserte studier og andre analytiske teknikker. Når først sammenligne tre gjentak av kjente MoBio og SDS, bare 12% av peptider overlappet mellom de to teknikkene viser kompleksiteten av mikrobielle samfunn og ulike utvinning effekter (figur 2). Ved sammenligning av omfattende med MoBio og SDS ekstrakter oppdaget ~ 38% av peptider observert med metoden omfattende også ved SDS og/eller MoBio utdrag (figur 2). Vurderer hvor mange arter av Kansas jord bakterielle samfunnet og dets metagenome2, overlappingen av peptid-IDer er rimelig og på grunn av sin kompleksitet, kombinasjonen av tilnærminger ekstrakter mer peptider enn hver alene 35. også, siden disse prøvene var unfractionated og analyseres av bare 1-dimensjonal LC-MS-/ MS, ekstremt høy eksempel kompleksiteten muligens forårsaket noen skjevheter i gjenkjenning på grunn av ulike peptid konsentrasjoner utdraget av hver tilnærming. Omfattende protokollen brukes også på andre jord typer som permafrost og våtmarker, og i alle tilfeller foreløpige proteomic resultatene av samme kvalitet som i Kansas innfødt prairie jord dataene som presenteres her.
Bred anvendelse av den omfattende tilnærmingen, har vært tidligere vurdert med en variert utvalg, inkludert archaeon Sulfolobus acidocaldarius, en unicyanobacterial consortium38, musen hjernevev cortex, menneskelige urin, og blader fra Arabidopsis thaliana (figur 2)10. For alle prøver bortsett fra A.thalianaer urea utdrag den vanligste måten å pakke ut proteiner, så de ble brukt som kontroll tilnærming til evaluering. A. thaliana omfattende resultatene ble sammenlignet med et uttrekk utført med Trekloredikksyre (TCA) fordi anlegget bladene er rike på Fenoliske forbindelser som må fjernes før MS analyser39. I alle tilfeller var hvor mange proteiner fra metoden omfattende lik som for kontroller10, som angir dens nytte for mange forskjellige utvalg typer. Det var også noen trender forbundet med bestemt protein klassene trukket ut i alle prøve typer (inkludert jord). Derfor gjør bred anvendelse av omfattende rekke biologisk og miljømessig systemer det en lovende tilnærming.
Figur 1. En skjematisk viser omfattende prosessen, som metabolitter, proteiner og lipider samtidig trekkes ut fra den samme jordprøve for MS analyser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Venn-diagrammer som illustrerer peptid overlappingen for et mangfoldig sett av prøver utdraget benytter omfattende og en standard urea-basert protein utvinning metoden normalt utføres. Data fra omfattende utvinning av archaeon S.acidocaldarius, unicyanobacterial consortium, menneskelige urin, musen hjerne cortex og A.thaliana anlegget går tilpasset fra Nakayasu, E. S. et al. 201610. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er viktig å merke seg at ikke alle laboratorier vil ha samme tilgjengelig utstyr så bestemte metoder, for eksempel lysis trinnet, kan tilpasses. Her bruker vi vortexing og sonicating, men bruk av en stor 50 mL perle beater ville fungere. Hvis en lyophilizer med en samler temperatur kan-105 ° C ikke er tilgjengelig, og deretter prøver kan tørkes under en nitrogen strøm. Også jordsmonn variere og kan inkludere sand, silt, leire, torv og leirjord (osv), og de kan også variere avhengig av pH, saltholdighet og organisk materiale rikdom. Hver av disse avvik kan ha en innvirkning på protokollen, så det er viktig å være fleksibel og foreta justeringer når behøvde. Det er viktig, men at forholdstall og prosenter forblir den samme.
Omfattende protokollen viser store løftet for programmet i mange biologiske og miljø og muligheten til å aktivere multi-omic analyser av mikrobielle samfunn som jord. Tidligere sammenligninger av omfattende til andre utvinning protokoller for ulike systemer illustrert en høy grad av peptid overlapping10. Men, observerte en begrensning var at omfattende ikke var gjelder for blod plasma proteiner som trenger å bli tømt. I disse tilfellene var utfelt proteiner ikke godt gjenkjent av antistoffer i kolonnene immunodepletion nødvendig for bred dekning av plasma proteom. Mer standard utvinning tilnærminger bør derfor brukes under disse omstendighetene. En ekstra begrensning angitt for omfattende utvinning tilnærming er at det ikke skille mellom intracellulær og ekstracellulære protein, men dette gjelder for alle andre jord protein utvinning protokoller også.
I dette manuskriptet gitt omfattende resultater for 3376 peptider, 105 lipider og 102 polar metabolitter i Kansas innfødt prairie jord med utvinning og analyse metodene beskrevet i delen protokollen. Bedre overlapping ble observert mellom peptidene utvunnet i kontroll og omfattende tilnærminger av enkeltsystemer forhold til jord mikrobiell samfunnet (figur 2). Dette er ikke en begrensning, men en konsekvens av de svært komplisert jord mikrobiell lokalsamfunnet. Disse resultatene er mer kjent som kjente jord utvinning teknikker for SDS og MoBio ikke overlapper vel enten store mangfoldet og vanskeligheter utpakking jord proteiner like. Interessant, omfattende protokollen tillatt identifikasjon av flere totale peptider enn SDS eller MoBio og også oppdaget flere komponenter ikke sett i enten analyse.
Disse observasjonene gjøre omfattende en svært lovende teknikk for arbeide med små utvalg størrelser, redusere totale multi-omic eksperimentell variasjoner og redusere testtiden forberedelse. Fordelene mulig med omfattende se for å aktivere multi-omic evner og analysene som kreves for store mikrobielle samfunn studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Nathan Johnson for hans hjelp forberede tallene. Denne forskningen ble støttet av Pan-omics programmet er finansiert av US Department of Energy's Office av biologiske og Environmental Research (Genomic vitenskap Program), Microbiomes i overgang (MinT) Laboratory regissert forskning utvikling Initiativ i Pacific Northwest National Laboratory, så vel som nasjonale institutter av helse National Institute of Environmental Health Sciences (R01 ES022190) og NIH (P42 ES027704). KEBJ ønsker å takke R21 HD084788 for økonomisk støtte til utvikle og validere romanen multi-omic utvinning teknikker. Dette arbeidet ble utført i den W. R. Wiley miljømessige molekylær Sciences Laboratory (EMSL), en DOE nasjonale vitenskapelige bruker anlegg i Pacific Northwest National Laboratory (PNNL). PNNL er et multi programmet nasjonale laboratorium drives av Battelle for DOE under kontrakten DE-AC06-76RL01830.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | Stored at -20°C !Caution chloroform has acute potential health effects, skin irritation and possible chemical burns, irritation to the respiratory system, may affect the kidneys, liver, heart. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Stored at -20°C !Caution Methanol may cause respiratory tract, skin and eye irritation, may damage the nerves, kidneys and liver. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Purified water from Millipore | Milli-Q | Water purification system. | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L6026 | !Caution SDS causes acute toxicity and is flammable. It is a skin, eye and airway irritant. Wear gloves and safety glasses. |
| Soil protein extraction kit | MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen | 30000-20 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| 1M Trizma HCL | Sigma-Aldrich | T2694 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T0699 | !Caution TCA is caustic, toxic and may cause skin burns. Wear gloves and safety glasses. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | Stored at -20°C !Caution Acetone may cause respiratory tract and skin and eye irritation. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses gloves and a lab coat, work in a fume hood. |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | !Caution Urea is an eye and skin irritant, use gloves and safety glasses |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830 | |
| Trypsin | Promega | V528A | 20µg vials |
| Bicinchoninic acid protein assay kit | Pierce | 23227 | |
| Ammonium Formate | Sigma-Aldrich | 09735 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | !Caution Acetonitrile is a skin and eye irritant. Highly flammable. Wear gloves and safety glasses. Work in a fume hood. |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | !Caution TFA is extremely hazardous in case of skin contact, eye contact, ingestion and inhalation. May produce tissue damage particularly on mucous membranes of eyes, mouth and respiratory tract. Skin contact may produce burns. Wear gloves, lab coat, safety glasses and work in a fume hood. |
| Methoxyamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 226904 | !Caution Methoxyamine hydrochloride causes severe burns and serious damage to eyes, may cause sensitization by skin contact. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | !Caution Pyridine can cause skin and eye irritation, central nervous system depression. Vapor may cause flash fire. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trimethylchlorosilane | Sigma-Aldrich | 69478 | !Caution MSTFA + 1% TMCS can cause skin corrosion, serious eye damage and specific target organ toxicity. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Milli-Q water purification system | Millipore | model MPGP04001 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Probe sonicator | FisherBrand | model FB505 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | model 5810R | |
| 50mL tube swinging bucket rotor | Eppendorf | A-4-44 | |
| 50mL fixed angle rotor | Eppendorf | FA-45-6-30 | |
| Balance | OHAUS | model V22PWE150IT | |
| Serological pipette controller | Eppendorf | 12-654-100 | |
| 10mL, 25mL glass serological pipettes | FisherBrand | 13-678-27F, 13-678-36D | |
| Thermomixer with Thermotop | Eppendorf | 5382000015, 5308000003 | |
| 0.9 – 2.0 mm blend stainless steel beads | NextAdvance | SSB14B | |
| 0.15 mm garnet beads | MoBio | 13122-500 | |
| Magnetic stir plate | FisherBrand | 11-100-16SH | |
| Magnetic stir bar | FisherBrand | 14512130 | |
| pH paper strips, pH range 0–14 | FisherBrand | M95903 | |
| 15mL, 50mL conical polypropylene centrifuge tube | Genesee Scientific | 21-103 21-108 | chloroform compatible |
| 50mL vortex attachment | MoBio | 13000-V1-50 | |
| Ice bucket | FisherBrand | 02-591-44 | |
| 27.25x70mm glass vials | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Breathe Easier plate membranes | Midwest Scientific | BERM-2000 | |
| Alcohol wipes | Diversified Biotech | BPWP-1000 | |
| Heater shaker incubator | Benchmark, Incu-Shaker Mini | ||
| Analog rotisserie tube rotator | SoCal BioMed, LLC | 82422001 | |
| Filter-Aided-Sample-Prep kit | FASP; Expedeon | 44250 | |
| Microplate reader | Biotek, EPOCH | ||
| -20 Degree Celsius Freezer | Fisher | 13986149 | |
| -80 Degree Celsius Freezer | Stirling Ultracold | SU78OUE | |
| Q-Exactive ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Agilent 7890A gas chromatograph coupled with a single quadrupole 5975C mass spectrometer | Agilent Technologies, Inc. | ||
| LTQ-Orbitrap Velo | Thermo Scientific | ||
| Waters NanoEquityTM UPLC system | Millford, MA | ||
| 250mL media bottle | FisherBrand | 1395-250 | |
| Waters vial | Waters | 186002805 | |
| Glass MS sample vial and inserts | MicroSolv | 9502S-WCV, 9502S-02ND | |
| Glass HPLC vial and snap caps | MicroSolv | 9512C-0DCV, 9502C-10C-B | |
| HPLC 96-well plate | Agilent | 5042-6454 | |
| Large glass vial 27.25x70mm | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Lyophilizer | Labconco | 7934021 | |
| Polished stainless steel flat head spatula | Spoonula; FisherBrand | 14-375-10 | |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 34721 | |
| XBridge C18, 250x4.6 mm, 5 μM with 4.6x20 mm guard column | Waters | 186003117, 186003064 | |
| Agilent 1100 series HPLC system | Agilent Technologies | G1380-90000 | |
| 1.7mL centrifuge tube | Sorenson | 11700 | |
| Hamilton Glass Syringes, 5mL, 50µL and 250µL | Hamilton | 81517, 80975, 81175 | |
| Pasteur Pipettes | FisherBrand | 13-678-20A | |
| Pasteur Pipette Bulbs | Sigma-Aldrich | Z111597 | |
| Bath Sonicator | Branson 1800 Ultrasonic Cleaner | ||
| Vacuum Centrifuge | Labconco Centrivap Acid-Resistant Concentrator System | ||
| MicroSpin Columns, C18 Silica | The Nest Group | SEM SS18V |
References
- Hultman, J., et al. Multi-omics of permafrost, active layer and thermokarst bog soil microbiomes. Nature. 521, 208-212 (2015).
- White, R. A. 3rd, et al. Moleculo long-read sequencing facilitates assembly and genomic binning from complex soil metagenomes. mSystems. 1, (2016).
- White, R. A., Callister, S. J., Moore, R. J., Baker, E. S., Jansson, J. K. The past, present and future of microbiome analyses. Nat Protoc. 11, 4-8 (2016).
- Ritchie, M. D., Holzinger, E. R., Li, R., Pendergrass, S. A., Kim, D. Methods of integrating data to uncover genotype-phenotype interactions. Nat Rev Genet. 16, 85-97 (2015).
- Jansson, J. K., Baker, E. S. A multi-omic future for microbiome studies. Nat Microbiol. 1, (2016).
- Domon, B., Aebersold, R. Options and considerations when selecting a quantitative proteomics strategy. Nat Biotechnol. 28, 710-721 (2010).
- Marx, V. Targeted proteomics. Nat Methods. 10, 19-22 (2013).
- Roberts, L. D., Souza, A. L., Gerszten, R. E., Clish, C. B. Targeted metabolomics. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 30, Unit 30 32 31-24 (2012).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226, 497-509 (1957).
- Nakayasu, E. S., et al. MPLEx: a Robust and Universal Protocol for Single-Sample Integrative Proteomic, Metabolomic, and Lipidomic Analyses. mSystems. 1, (2016).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Pomraning, K. R., et al. Multi-omics analysis reveals regulators of the response to nitrogen limitation in Yarrowia lipolytica. BMC Genomics. 17, 138 (2016).
- Tisoncik-Go, J., et al. Integrated Omics Analysis of Pathogenic Host Responses during Pandemic H1N1 Influenza Virus Infection: The Crucial Role of Lipid Metabolism. Cell Host Microbe. 19, 254-266 (2016).
- Kyle, J. E., et al. Uncovering biologically significant lipid isomers with liquid chromatography, ion mobility spectrometry and mass spectrometry. Analyst. 141, 1649-1659 (2016).
- Lovelace, E. S., et al. Silymarin Suppresses Cellular inflammation by inducing reparative stress signaling. J Nat Prod. 78, 1990-2000 (1990).
- Kim, Y. M., et al. Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms. Front Microbiol. 6, 209 (2015).
- Pomraning, K. R., et al. Comprehensive Metabolomic, Lipidomic and microscopic profiling of Yarrowia lipolytica during lipid accumulation identifies targets for increased lipogenesis. PLoS One. 10, e0123188 (2015).
- Huang, E. L., et al. The fungus gardens of leaf-cutter ants undergo a distinct physiological transition during biomass degradation. Environ Microbiol Rep. 6, 389-395 (2014).
- Deatherage Kaiser, B. L., et al. A Multi-Omic View of Host-Pathogen-Commensal Interplay in Salmonella-Mediated Intestinal Infection. PLoS One. 8, e67155 (2013).
- Kim, Y. M., et al. Salmonella modulates metabolism during growth under conditions that induce expression of virulence genes. Mol Biosyst. 9, 1522-1534 (2013).
- Ansong, C., et al. A multi-omic systems approach to elucidating Yersinia virulence mechanisms. Mol Biosyst. 9, 44-54 (2013).
- Bordbar, A., et al. Model-driven multi-omic data analysis elucidates metabolic immunomodulators of macrophage activation. Mol Syst Biol. 8, 558 (2012).
- Hu, Z. P., et al. Metabolomic response of human skin tissue to low dose ionizing radiation. Mol Biosyst. 8, 1979-1986 (2012).
- Perera, R., et al. Dengue virus infection perturbs lipid homeostasis in infected mosquito cells. PLoS Pathog. 8, e1002584 (2012).
- Gao, X., et al. A reversed-phase capillary ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) method for comprehensive top-down/bottom-up lipid profiling. Anal Bioanal Chem. 402, 2923-2933 (2012).
- Sorensen, C. M., et al. Perturbations in the lipid profile of individuals with newly diagnosed type 1 diabetes mellitus: Lipidomics analysis of a Diabetes Antibody Standardization Program sample subset. Clin Biochem. 43, 948-956 (2010).
- Diamond, D. L., et al. Temporal proteome and lipidome profiles reveal hepatitis C virus-associated reprogramming of hepatocellular metabolism and bioenergetics. PLoS Pathog. 6, e1000719 (2010).
- Alquier, T., et al. Deletion of GPR40 impairs glucose-induced insulin secretion in vivo in mice without affecting intracellular fuel metabolism in islets. Diabetes. 58, 2607-2615 (2009).
- Ding, J., et al. Application of the accurate mass and time tag approach in studies of the human blood lipidome. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 871, 243-252 (2008).
- Rasmussen, A. L., et al. Systems virology identifies a mitochondrial fatty acid oxidation enzyme, dodecenoyl coenzyme A delta isomerase, required for hepatitis C virus replication and likely pathogenesis. J Virol. 85, 11646-11654 (2011).
- Manza, L. L., Stamer, S. L., Ham, A. J., Codreanu, S. G., Liebler, D. C. Sample preparation and digestion for proteomic analyses using spin filters. Proteomics. 5, 1742-1745 (2005).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat Methods. 6, 359-362 (2009).
- Zhou, J. Y., et al. Simple sodium dodecyl sulfate-assisted sample preparation method for LC-MS-based proteomics applications. Anal Chem. 84, 2862-2867 (2012).
- Anderson, J. C., et al. Decreased abundance of type III secretion system-inducing signals in Arabidopsis mkp1 enhances resistance against Pseudomonas syringae. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 6846-6851 (2014).
- Chourey, K., et al. Direct cellular lysis/protein extraction protocol for soil metaproteomics. J Proteome Res. 9, 6615-6622 (2010).
- Kim, S., Gupta, N., Pevzner, P. A. Spectral probabilities and generating functions of tandem mass spectra: a strike against decoy databases. J Proteome Res. 7, 3354-3363 (2008).
- Kim, S., Pevzner, P. A. MS-GF+ makes progress towards a universal database search tool for proteomics. Nat Commun. 5, 5277 (2014).
- Cole, J. K., et al. Phototrophic biofilm assembly in microbial-mat-derived unicyanobacterial consortia: Model systems for the study of autotroph-heterotroph interactions. Front Microbiol. 5, (2014).
- Isaacson, T., et al. Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues. Nat Protoc. 1, 769-774 (2006).
