Summary
Bir iletişim kuralı aynı anda metabolitleri, proteinler ve yağlar bir tek toprak örneğinden ayıklanması, azaltılmış örnek hazırlama kez izin ve multi-omic kütle spektrometresi analizleri ile sınırlı miktarda örnekleri etkinleştirme için sunulmaktadır.
Abstract
Kütle spektrometresi (MS)-tabanlı entegre metaproteomic, metabolomic ve lipidomic (multi-omic) çalışmaları bizim yetenek anlamak ve mikrobiyal topluluklar çevre ve biyolojik sistemleri karakterize dönüştürme. Bu ölçümler bile en karmaşık toprak mikrobiyal topluluklar, gelişmiş analizler etkinleştiriyorsanız bugüne kadar bilinen karmaşık mikrobiyal sistemleri. Ayrı çekimi genellikle gerekli örnek miktarı ve hazırlık zamanı böylece önemli ölçüde yükseltecek her omic çalışması için gerekli olan bu yana Multi-omic analizleri, ancak, örnek hazırlama zorluklar vardır. Bu sınırlama adrese, 3'ü 1 metodu metabolitleri, proteinler ve yağlar (karmaşık) eşzamanlı çekme--dan aynı toprak örneği için solvent bazli bir yaklaşım adapte tarafından oluşturulur. Bu karmaşık iletişim kuralı ne zaman bile sınırlı miktarlarda karmaşık toprak örnekleri için kullanılan basit ve pek çok örnek türü, sağlam olduğu ispatlanmıştır. Karmaşık yöntem da büyük ölçüde daha iyi bir mikrobiyal her topluluk üyeleri biyolojik ve çevresel tedirginlikler üzerine gerçekleşen değişiklikleri değerlendirme sırasında anlayış kazanmak için gerekli hızlı multi-omic ölçümleri etkin.
Introduction
Toprak mikrobiyal toplulukları değerlendirirken karbon Bisiklete binme ve iklim değişikliği anlamak için önemli sonuçları vardır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda ancak microbiota çeşitli toprak tipleri için sıralı genleri eksikliği ve birçok tespit proteinlerin bilinmeyen fonksiyon gibi zorluklar sermiştir. Bu zorluklar sonucu1,2,3bugüne kadar bilinen en karmaşık mikrobiyal topluluk olmak toprak nedeniyle. Birleştirme sonuçları metagenomic, metatranscriptomic, metaproteomic, metabolomic ve lipidomic çalışmaları, Multi-omic analizleri, son zamanlarda içine mikropların mevcut ise daha büyük bir anlayış kazanmak için çok sayıda toprak çalışmalarda hayata geçirdik çevre tedirginlikler1,4,5nedeniyle gerçekleşen moleküler değişiklikler hakkında kapsamlı bilgi edinme. Multi-omic çalışmaları ile bir meydan okuma kütle spektrometresi (MS) olduğunu-tabanlı metaproteomic, metabolomic ve lipidomic ölçümleri genellikle MS uyumlu6,7 olmak her omic için bir özel ayıklama işlemi gerektirir , 8 , 9. sınırlı bir miktar örneği yalnızca kesin bu yordamları bunların uygulanması çok güç veya imkansız ne zaman yapmak. Bu sorunlar bize bir eşzamanlı metaboliti, protein ve lipit ayıklama (karmaşık) yöntemi daha küçük örnek birimleri veya kitleler kullanarak, doğruluğu artırma ve daha hızlı örnek hazırlıklar tüm üç analizleri için sağlama yeteneğine sahip araştırmak için isteniyor 10. bugüne kadar tüm bu gol elde edebilirsiniz hiçbir alternatif toprak ayıklama yordamlar vardır.
Küresel multi-omic analizleri tek toprak örneği etkinleştirmek için kloroform, metanol ve su ayrımları dayalı bir organik solvent ekstraksiyon protokolü kullanıldığında10yaşındaydım. Bu yöntem was orijinal gelişmiş toplam lipid çekimi9,11 ve son zamanlarda bir tek örnek12,13 metabolitleri, proteinler ve yağlar ekstraksiyon eşzamanlı değiştirilmiştir ,14,15,16,17,18,19,20,21,22, daha az örnek miktar etkinleştirme 23,24,25,26,27,28,29,30, ve Deneysel değişkenlik10. Karmaşık iletişim kuralında kloroform örnek bileşenlerinin trifazik kimyasal ayırma içine ayrı kesirler için temel sağlar su ile karışan değil. En iyi sulu faz bu nedenle alt kloroform aşamasında (Şekil 1) ardından bir protein disk ve sonra bir lipit katmanı hidrofilik metabolitleri içerir. Karmaşık çoğu topraklar için uygulandığında, partikül enkaz örnekleme tüpler çok altında birikir ve tüm katmanları toplandıktan sonra iptal edilecek. Her toprak tipi-ebilmek var olmak farklı, ancak ve torf gibi son derece organik toprak, toprak enkaz Orta katmanda kalır ve örnekleme tüp altına girmemektedir. Karmaşık sağlar çeşitli yararları 1) küçük örnek miktarlarda multi-omic analizleri, aynı örnek azalma gelen 2) multi-omic çekimi için kullanılan gibi birden fazla molekül yalıtma aynı örnekten yazdığında genel olarak deneysel değişkenliği, ve 3) daha fazla sayıda örnekleri çok daha hızlı daha yüksek üretilen iş çalışmalar10için hazır olun. Birlikte bu faydalar toprak örnekleri ve karmaşık mikrobiyal topluluklar değerlendirmek için daha iyi ölçüm yeteneği sağlamak için hayati önem taşımaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Çok ıslak toprak çıkarma çıkarma önce zarar vermeden etkinliği için liyofilize. Islak toprak da kullanılabilir ancak reaktifler belirli oranlarıyla eklerken düşünülmelidir.
Not: Bu iki 50 mL tüpler (en fazla 50 mL tüp başına 10 g toprak) arasındaki ayırmalısınız ayıklama başına kuru toprak ağırlığının 20 g kullanmak için tavsiye edilir. Çekimi bağlıdır kullanılabilir örnek aşağı ve yukarı ölçeklendirilebilir.
Not: Kuru toprak örnekleri homojenize ve küçük kökler ve kayalar kaldırmak için 3 mm ekran üzerinden elenmiş. Örnek belgili tanımlık perde içinde sıkışmış almak gibi ıslak toprak örnekleri, elek değil.
1. hücre lizis ve metabolitleri, proteinler ve yağlar (zamanlama ~ 1 d) çıkarımı toprak
- 20 g toprak örneği 10 g metanol/kloroform uyumlu olan iki ayrı 50 mL tüpler içine tartın. Kloroform örnekleri kirletici çoğu plastik leach olarak seçilmiş, tüpleri ile son derece dikkatli olun. Her ne zaman mümkün veya plastik borular polipropilen ya da politetrafloroetilin (PTFE) yapılan cam kullanın.
Not: toprak buz ve serin tutmak ilk tartı ve homojenizasyon adımları sırasında mümkün olduğunca. - Paslanmaz çelik kloroform yıkanmış ve garnet boncuk 10 mL her tüp için ekleyin. Buz, soğuk ultrasaf 4 mL ekleyin ( Tablo malzemeleri arıtma sistemi için görmek) her tüp (iki tüp arasında bir örnek bölünmüş) su ve buz kovası örneklerinde duman kukuIeta aktarmak.
- 25 mL Cam serolojik pipet kullanarak, hızlı bir şekilde buz gibi 2:1 kloroform: metanol (v/v) 20 mL ekleyin.
Dikkat: Kloroform: metanol akut potansiyel sağlık etkileri vardır: cilt tahriş, olası kimyasal yanık ve solunum sistemini tahriş. Böbrekler, karaciğer ve kalp etkileyebilir. Uygun koruyucu gözlük, giyim ve eldiven giymek ve her zaman bir duman mahallede çalışır. - Kapakları ve girdap çözüm sıkın. 2:1 choloroform:methanol prokaryot hücre duvarı kırmak yardımcı olur ve aynı zamanda enzimatik faaliyetleri inaktive.
- Tüpler 50 mL tüp girdap ekler ve yatay olarak bir buzdolabı içinde 4 ° C'de 10 dakika için girdap mümkünse ekleyin. O zaman, onları tamamen soğuması için ~ 15 dk-80 ° C dondurucu içine örnekleri yerleştirin.
- Bir sonda sonicator bir duman başlık içinde kullanarak solüsyon içeren temizleyicide her örnek genlik %60 30 6 mm (1/4") prob ile her buz s.
Dikkat: Bu bir ses sonicating muhafaza ve kulak koruma azalmaya kullanmak için önerilir. Yüksek gerilim güç kaynağı ve yüksek frekans kabloyu mevcuttur. Alt veya örnek gemi kenarlarında ile etkin bir soruşturma dokunmaktan kaçının; çatlamak veya plastik erime olabilir. - Sonicating bir sürü ısı üretmek gibi örnekleri ~ 15 dk,-80 ° C dondurucuya koyun.
- 1.5-1.7 adımları yineleyin.
Not: örnekleri lizis yordam soğuk kalmak emin olun. - 4000 x g 5 min, 4 ° c için de örnekler santrifüj kapasitesi Bu noktada, örnek üst metaboliti katmanı, protein interlayer ve daha düşük lipit katmanı (ve kalan enkaz Pelet) ayrılacaktır. Bkz: Şekil 1.
- Buz buz kovası içinde örnekleri yerleştirin ve duman kukuIeta ve 10 mL Cam serolojik pipet kullanarak içinde üst metaboliti katmanları bir büyük cam şişe iki 50 mL tüpler kaldırın.
Not: herhangi bir protein tabakası pipet aspirating kaçının; metaboliti küçük tabakası bırakın. - Böylece ücretsiz düşük lipit katmanı üzerinde yüzen olduğunu protein interlayer serbest bırakmak için 50 mL tüp biraz eğ. Bir temiz paslanmaz çelik düz kafalı laboratuvar spatula kullanarak, dikkatli bir şekilde protein interlayers her iki kepçe ve birlikte bir yeni 50 mL tüp içine koyun.
- 25 mL Cam serolojik pipet kullanarak, alt lipid katmanları bir büyük cam şişe kaldırın.
Not: kalkınan toprak parçacıklar kaçınıyorum; Ancak, bazı toprak enkaz ve parçacıklar ile birlikte talip lipidler daha sonra kaldırılacak. - Metaboliti ve lipid tepesinden solunabilir membranlar cam şişeleri ve bir vakum yoğunlaştırıcı kuruluk kadar kuru bir yer (lipidler ~ 4-5 h, metabolitleri gecede).
- Protein örnek tüp ve kalan enkaz Pelet tüpler için her buz gibi metanol ve girdap 20 mL ekleyin. Bu enkaz dışında herhangi bir olası kalan protein savurma daha önce solubilize girişiminde bulunmadan önce kloroform durulama için enkaz parçaları için yapılır.
- Enkaz parçaları ve protein 4.000 x g 5 min, 4 ° C, için de interlayer sonra metanol tehlikeli atık konteyner içinde duman kukuIeta içine dikkatle boşaltmak santrifüj.
- Sıvı azot protein ve enkaz parçaları donma ve bir lyophilizer (bir toplayıcı sıcaklığı-105 ° C metanol-98 ° c çok düşük donma noktası olması nedeniyle yeteneğine ile) Kuru ~ 2 saat için.
Not: onlar daha solubilize zor olacak gibi granül, aşırı kuru değil. - Protein solubilization arabellek (%4 SDS, 100 mM DTT (DL-dithiothreitol) 50 mM tris tampon pH 8.0; bkz: Ek reaktif Set-up) 10 mL protein interlayer tüp ve 20 mL her enkaz parçaları ekleyin.
Dikkat: SDS akut toksisite neden olur ve yanıcı. Cilt, göz ve hava yolu tahriş edici olduğunu. Eldiven ve koruyucu gözlük giymek. - Duman başlık, sonda solüsyon içeren temizleyicide örnekleri için %30 20 genlik, onları çözümü haline getirmek için s. 2 min için girdap.
- Protein interlayer örnek protein solubilize için bir laboratuvar tüpü rotator 300 rpm, 50 ° C'de 30 dk için içine yerleştirin.
- Yatay olarak girdap enkaz örnekleri için kalan sağlam hücreler, koşullar için ek bir 10 dk sonra döndürün kalan 20 dk için protein interlayer örnekleri ile.
- Tüm örnekleri, 4500 x g 10 dk, oda sıcaklığında (RT), santrifüj kapasitesi ve süpernatant her tüpün örnek başına iki 50 mL tüpler içine toplamak.
- Solubilization 10 mL protein interlayer Pelet tampon, sonra da solüsyon içeren temizleyicide ve girdap geri çözüm ve santrifüj daha önce olduğu gibi ekleyin.
- Supernatants iki 50 mL tüpler içine eşit birleştirmek ve 8.000 x g 10 dk, sabit açılı kova Open End 4 ° C de santrifüj kapasitesi.
Not: Son Santrifüjü Aşırı bulaşıcı hümik maddelerin kaldırmak gereklidir. - Böylece her 30 mL her supernatants iki 50 mL tüpler içine dikkatle boşaltmak. Ardından, bir 10 mL Cam serolojik pipet kullanarak TCA (trichloroacetic asit) 7.5 mL her tüp için ekleyin. Girdap içine çözüm. Bu % 20 yapar TCA her 30 mL örnek (buna göre ayarlayın),
Dikkat: Bu TCA kostik, toksik ve Mayıs cilt yanıklara neden. Eldiven ve koruyucu gözlük giymek. - Örnekleri-20 ° C-dondurucu gece 2 h için yerleştirin.
Not: Proteinler genellikle içinde 1 h çökelti ama sol (en fazla 18 saat) gece olabilir.
Not: 18 h protein mümkün asit hidroliz nedeniyle daha uzun süre gitmek TCA ayıklama izin vermeyin. Örnek donmuş, buz çözme; tezcan ısınmak örnek izin vermeyin. - Çöktürülmüş protein cips için 4500 x g 10 dk, 4 ° C için de örnek santrifüj kapasitesi ve süpernatant içine atık dikkatle boşaltmak.
- 10 mL % 100 buz gibi soğuk aseton her protein Pelet, girdap ve birleştirme parçaları gibi bir tüpün içine ekleyin.
- (Bir denge kullanarak) kombine Pelet içeren tüp santrifüj kapasitesi ve sonra içine atık süpernatant dikkatle boşaltmak.
Dikkat: Aseton solunum yolu ve deri ve göz tahrişine neden olabilir ve bir yanıcı sıvı ve buhar. Koruyucu gözlük eldiven ve önlük giymek, duman mahallede çalışma. - İki kez 1.5 mL aseton ve son olarak 2 mL tüp 10.000 x g 5 min için de son tur için aktarılması kullanarak Pelet yıkayın.
- Süpernatant içine atık dikkatle boşaltmak ve Pelet biraz çatlamak başlayana kadar kurumaya Pelet ters bir duman başlıklı ~ 20 dakika veya azot akış altında kağıt mendil izin.
- 100-200 µL Pelet büyüklüğüne bağlı olarak protein solubilization arabellek ekleyin.
Not: solubilization arabellek mümkün olduğunca düşük örnek eklenen ses tutun. Sonraki filtre destekli örnek hazırlama (FASP) sadece 50 μL örnek sütun başına çözündürüldükten kadar kullanabilirsiniz; herhangi daha birden fazla FASP sütuna bölün olması gerekir. - Solüsyon içeren temizleyicide ve girdap Pelet çözüm içine. Not örnek viskoz hümik maddelerin bir sonraki Santrifüjü ile kaldırılacak protein birlikte presipite nedeniyle olabilir.
- Örnek protein çözüm solubilize ve protein sindirimi için devam etmek için bir kuluçka makinesi/Shaker 300 rpm, 40 ° C'de 30 dk için salla.
- Ek dondur örnek sıvı azot ve-80 ° C dondurucu store kadar protein sindirimi için hazır.
2. lipid hazırlık (~ 20 dk zamanlama)
- Lipid örnekleri kuru olduğunda, 2:1 kloroform: metanol için şişe, girdap içine çözüm ve transfer 1,5 mL polipropilen boru içine 200 μL ek bir 200 μL cam ekleyin şişe, girdap ve kalan lipidler pipette ve transfer tüp.
- Enkaz 12.000 x g 4 ° C'de 5 min için de örnek dışında santrifüj kapasitesi
- Süpernatant içine bir cam lipid flakon ve mağaza-20 ° C'de LC-MS/MS Analizi (daha fazla bilgi için Ek yöntemlerLC-MS/MS) kadar transfer.
- Örnekleri hemen hazırlık sonra analiz, lipitler solvent oksidasyon ve yıkımı önlemek için-20 ° C'de depolanması gerekir.
3. metaboliti hazırlık ve Derivatization (~ 5 h zamanlama)
- Çıkarma ertesi günü üzerinde hız Vac metaboliti örnekleri çıkarın ve hazır için derivatization ve GC analizine kadar-20 ° C'de kuru saklayın. Aksi takdirde bir GC metabolitleri çalıştıran sonra araç için uygun iletişim kuralını kullanarak hazırlamak.
- Hemen önce saptırma metabolitleri GC, çözümleme için transfer büyük cam şişeleri metanol, vortexing ve 1,5 mL polipropilen boru ekleme 200 μL ekleyerek. Bir kez yinelenir.
- 12.000 x g 10 dk, 4 ° c de tüp santrifüj kapasitesi Süpernatant daha küçük cam şişe aktarmak, top ve tamamen kuru bir hız Vac içinde nefes alabilen bir membran ekleyin.
- Örnek flakon ve 30 için girdap methoxyamine çözüm 20 µL ekleyerek metabolitleri derivatize orta hızda bir vortexer s.
Dikkat: Methoxyamine hidroklorid ciddi yanıklar ve gözleri ciddi hasara neden olur, sensitizasyon Ciltle temas tarafından neden olabilir. Koruyucu gözlük, eldiven ve önlük giymek ve duman mahallede iş. - Bir banyo sonicator örnek tamamen çözülmüş emin olmak için kullanın.
- 1000 sallayarak d / 1 saat 30 dk için 37 ° C'de tutulan bir yoğunlaşma önleme kapak ile örnek bir kuluçka kuluçkaya.
- Şişeyi kap yüzeyinde yoğun damla ile örnekleri karıştırmak için bir kez ters çevir. Örnek spin aşağı vasıl 1000 x g 1 dk, RT.
- Silylation (kullanarak) 80 µL n ekleyerek gerçekleştirmek-metil - N-(trimethylsilyl) % 1'i trimethylchlorosilane ile trifluoroacetamide. 10'lar için girdap.
Dikkat: MSTFA + %1 TMCS cilt korozyon, ciddi göz hasarı ve belirli hedef organ toksisite neden olabilir ve bir yanıcı sıvı ve buhar. Koruyucu gözlük, eldiven ve önlük giymek ve duman mahallede iş. - 1000 sallayarak d / 30 dk 37 ° C'de tutulan bir yoğunlaşma önleme kapak ile örnek bir kuluçka kuluçkaya.
- Şişeyi kap yüzeyinde yoğun damla ile örnekleri karıştırmak için bir kez ters çevir.
- Spin 2.000 x g, RT, 5 min için aşağı örnek
- Tepki çözüm şişeleri GC-MS analiz için uygun içine aktarın.
4. protein sindirimi (~ 1 d zamanlama)
- 15.000 x g 5 min, RT herhangi bir enkaz cips, için de örnek santrifüj kapasitesi.
- (Bkz. Tablo reçetesi) FASP kullanarak sindirim kitleri için filtre-destekli-örnek-hazırlık (FASP) gerçekleştirmek aşağıdaki değiştirilmiş üreticisinin yönergeleri31,32:
- 8 M üre arabelleği 400 μL FASP sütuna (500 μL 30 K MWCO spin filtre) ekleyin.
- Örnek centrifuging sona erdiğinde süpernatant (Pelet silmek) pipet ve en fazla 50 μL örnek 400 μL 8 M üre sütun ekleyin.
Not: yalnızca 50 μL örnek sütun başına ekleyin. 50'den fazla μL örnek ise, birden çok sütun kullan ve peptidler sindirim sonra birleştirir. Bu birimin mümkün olduğunca düşük bırakmak en iyisi (30 µL idealdir) FASP sağlamak için sütun tüm kitle spec analizi ile önemli ölçüde etkileyebilir SDS kaldırmak. - Sütun dahil 1.5 mL tüp içine yerleştirin ve 14.000 x g 30 dk, RT için de örnek santrifüj kapasitesi
- Akış yoluyla içine atık kaldırmak ve 8 M üre 400 μL sütununu ekleyin ve tekrar santrifüj kapasitesi.
- Önceki adımı 3 üre durular toplam için bir kez daha yineleyin.
Not: Eğer varsa örnek gider kuruluk yakın sütun, emin olun daha fazla ~ 30 µL filtre her spin sonra kalan devam centrifuging. - 14.000 x g 20 dk için 50 mM NH4HCO3 ve santrifüj 400 μL ekleyin, atık atmak ve bir kez yinelenir.
- Sütunları bir temiz 1.5 mL santrifüj tüpü aktarın.
- 75 μL tripsin sindirim arabelleği için sütunları ekleyin ve 750 rpm bir buğu önleme kapaklı bir kuluçka 3 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
- 50 mM NH4HCO3 40 µL için sütunları ekleyin.
- 14.000 x g yüksek molekül ağırlıklı kirletici sütun üzerine tutarken tüpün içine peptidler toplamak 15 dakika da örneğine santrifüj kapasitesi.
- 40 μL 50 mM NH4HCO3 sütun ve santrifüj yeniden ekleyin.
- Sütun atmak, peptidler hız Vac ~ 30 µL ve BCA tahlil (Bicinchoninic asit protein tahlil kiti; bkz: Malzemeler tablo) tüp içinde aşağı peptidler Makinası.
- SDS kirlenme (görünür kabarcıklar)33şüphesi varsa isteğe bağlı olarak, bir temizlik adımı gerçekleştirin. Katı faz ayıklama daha sonra bu seçeneği belirlemek Eğer yapmanız gerekir. Bu temizlik yöntemi hakkında ayrıntılı bilgi için Ek yöntemlerkullanılabilir.
- MS analizi için örnek seyreltik veya HPLC ayırma (sonraki iki adımı) isteğe bağlı olarak devam.
- Fractionate için örnekleri 10 mM amonyum Formiat arabelleği (pH 10.0) ile 400 µL hacmiyle oranında seyreltin.
- Bir C18 sütun çözümlemek ( Tablo malzemelerigörmek) 0.5 mL/dk bir HPLC sistemi kullanarak mobil aşamaları (A) 10 mM amonyum format, pH 10.0 ve (B) 10 mM amonyum format, pH 10.0/Asetonitril (10:90) ayıran tarafından.
- Min 10-70 %65 A % 30 a üzerinden en az 70 ila 85, % 30 A dk 85-95 üzerinden korumak üzerinde degradenin üzerinde ilk 10 dk, %95 A % 95'a e A % %100 65'a ayarlayın.
- Min 95 den 105 üzerinden %100 A ile yeniden equilibrate ve A % 100 dk 120 kadar tutun.
- Kesirler her 1,25 min (96 kesirler üzerinden tüm degrade) toplamak ve nihayet her satır için toplam 12 örnekleri veya her iki satırdan 24 örnekleri için birleştirmek (her biri n = 8 veya n 4 kesirler havuza alınmış =).
- Vakum altında tüm kesirler kuru ve LC-MS/MS Analizi kadar her depolama-20 ° C'de 15 µL ultrasaf su ekleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Molekülleri Kansas yerel kır topraktan (Mollisol toprak) ayıklamak için karmaşık iletişim kuralı kullanıldığında, ineklemek analizleri sonuçları 3376 peptidler, 105 lipidler ve 102 kutup metabolitleri (tüm benzersiz kimlikleri) için sağlanan. Süre karmaşık iletişim kuralı lipidler ve metabolitleri12,13,14,15,16,17,18 genel çıkarma için köklü olmuştur ,19,20,21,22,23,24,25,26,27 ,28,29,30,34, ortak toprak protein ayıklama yöntemleri gibi toprak protein ayıklama kitleri (bakınız tablo, mikrobiyal analizleri için onun karşılaştırma Malzemeler) ve SDS (Sodyum Lauryl Sülfat) çekimi35, daha fazla burada değerlendirilir. Bu teknikler değerlendirmek için Kansas yerel kır toprak proteinler her yaklaşım ile çıkarılan ve ters faz LC-MS/MS hibrid quadrupole/Orbitrap kütle spektrometre ile birleştiğinde bir UPLC sistemi kullanarak doğrudan ile analiz. Yöntem parametreleri hakkında ayrıntılı bilgi için Ek yöntemlerbulunmaktadır. MS/MS spectra her ayıklama yaklaşım ile öngörülen peptid karşılaştırıldığında elde edilen deneysel peptid dizileri temsilcisinden sıkı bir MS kullanarak Kansas yerel kır metagenome2 -spektral olasılık kesim GF + 1 x 10 -10 36 , 37 ve bir yığın hata kesim daha az 5 ppm. Bu karmaşık iletişim kuralını kullanarak topraktan çıkarılan analitler MS tabanlı çalışmalar ve analitik diğer teknikleri için uygun olması gerekmektedir. Ne zaman başlangıçta üç karşılaştırma MoBio ve SDS bilinen yöntemleri çoğaltır, peptidler sadece % 12'si mikrobiyal topluluk ve farklı ayıklama etkileri (Şekil 2) gösterilen iki teknik arasında üst üste. Karmaşık MoBio ve SDS özleri ile karşılaştırma karmaşık yöntem kullanarak gözlenen peptidler % ~ 38 de SDS ve/veya MoBio çekimi (Şekil 2) kullanırken tespit edildi. Kansas türlerinin sayısı göz önüne alındığında bakteriyel toplum ve onun metagenome2, peptid tanımlamaları çakışma makul toprak ve karmaşıklığı nedeniyle, kasanın yaklaşımlar her Yalnız olmaktansa daha fazla peptidler ayıklar. 35. Bu örnekler unfractionated ve sadece 1 boyutlu LC-MS/MS tarafından analiz beri Ayrıca, son derece yüksek örnek karmaşıklık muhtemelen bazı önyargı bulunması nedeniyle farklı peptid konsantrasyonları her yaklaşım tarafından çıkarılan neden oldu. Karmaşık iletişim kuralı da permafrost ve sulak alanlar gibi diğer toprak türleri uygulandı ve her durumda benzer kalite burada sunulan Kansas yerel kır toprak veri olan için ön proteomik sonuçlarıdır.
Karmaşık yaklaşım geniş uygulanabilirliği edilmiş daha önce değerlendirildi örnekleri, archaeon Sulfolobus acidocaldarius, bir unicyanobacterial Konsorsiyumu38, fare beyin korteksi doku, insan idrar, dahil olmak üzere çeşitli bir dizi kullanarak ve yaprakları Arabidopsis thaliana (Şekil 2)10. A.thalianadışında tüm örnekleri için üre çekimi değerlendirme için denetim yaklaştıkça flashbacklerinde proteinler, ayıklamak için en yaygın yolu vardır. A. thaliana karmaşık sonuçları bitki yaprakları MS analizleri39önce kaldırılması gerekir fenolik bileşikler bakımından zengin olduğundan trichloroacetic asit (TCA) ile gerçekleştirilen bir ayıklama için karşılaştırıldı. Her durumda, proteinler karmaşık yönteminden gözlenen sayısı buna benzer pek çok farklı örnek türü yararını gösteren denetimler10için. Ayrıca, (toprak dahil olmak üzere) tüm örnek türlerinde çıkarılan özel protein sınıflarla ilişkilendirilmiş hiçbir eğilimleri vardı. Bu nedenle, karmaşık geniş uygulanabilirliği çok sayıda biyolojik ve çevresel sistemler için umut verici bir yaklaşım olur.
Şekil 1. Karmaşık işlemi hangi metabolitleri gösteren bir şematik proteinler ve yağlar aynı anda MS analizleri için aynı toprak örnekten ayıklanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Normalde karmaşık ve standart üre tabanlı protein ayıklama yöntemi kullanarak elde örnekleri çeşitli bir dizi peptid örtüşme gösteren Venn diyagramları gerçekleştirilen. Verileri karmaşık çıkarma archaeon S.acidocaldarius, unicyanobacterial Konsorsiyumu, insan idrar, fare beyin korteksi ve A.thaliana bitki Nakayasu, E. S. vd. 201610adapte bırakır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Belirli yöntemleri, örneğin lizis adım, adapte edilebilir böylece tüm laboratuvarlar aynı kullanılabilir donanım olduğunu unutmamak gerekir. Burada kullanıyoruz vortexing ve sonicating, ancak bir büyük 50 mL boncuk çırpıcı kullanımı işe yarar. Bir toplayıcı sıcaklığı-105 ° C yetenekli bir lyophilizer yoksa, o zaman örnekleri bir azot akış altında kurutulmuş. Ayrıca toprak türleri çok çeşitli ve kum, silt, kil, torf ve kerpiç (vb) içerebilir ve onlar da pH, tuzluluk ve organik madde zenginlik göre değişebilir. Esnek olmak ve gerektiğinde ayarlamalar yapmak için önemlidir bu yüzden her biri bu farklarını protokolü üzerinde etkisi olabilir. Ancak, kritik, yüzdeler ve döner sermayeyle aynı kalır.
Karmaşık iletişim kuralı uygulama için büyük söz çok sayıda biyolojik ve çevresel sistemler ve multi-omic analizleri toprak mikrobiyal toplulukların etkinleştirmek için yeteneği gösterir. Peptid örtüşme10yüksek derecede karmaşık önceki karşılaştırmalar farklı sistemler için diğer çıkarma protokolleri için resimli. Ancak, bir sınırlama karmaşık tükenmiş gereken kan plazma proteinleri ilgili değildi görülmektedir. Bu gibi durumlarda, zarlarını proteinler de plazma Proteom geniş kapsama alanı için gerekli immunodepletion sütunlardaki antikorlar tarafından tanınmadı. Bu nedenle, daha fazla standart ayıklama yaklaşımlar bu şartlar altında kullanılmalıdır. Bu tüm diğer toprak protein ayıklama iletişim kuralları için de geçerlidir, ancak karmaşık ayıklama yaklaşım için kaydetti bir ek sınırlama hücre içi ve hücre dışı protein arasında ayırt değil dir.
Bu el yazması karmaşık sonuçları 3376 peptidler, 105 lipidler ve 102 kutup metabolitleri Kansas yerel kır toprak Protokolü bölümünde ayrıntılı ayıklama ve analiz yöntemlerini kullanarak verilen. Daha iyi örtüşme kontrolü ve karmaşık yaklaşımlar bireysel sistemleri toprak mikrobiyal topluma (Şekil 2) göre çıkarılan peptidler arasında gözlendi. Bu bir sınırlama, ama son derece karmaşık toprak mikrobiyal topluluklarla birlikte çalışıp bir sonucu değildir. SDS ve MoBio tanınmış toprak çıkarma teknikleri de örtüşme değil gibi bu sonuçlar daha da büyük çeşitlilik ve ayıklama zorluklar nedeniyle ya da aynı derecede protein toprak belirtilmiştir. İlginçtir, karmaşık iletişim kuralı SDS veya MoBio daha daha fazla toplam peptidler tanımlaması izin ve ayrıca ek bileşenler de analizde görmedim algılandı.
Bu gözlemler küçük örnekleri boyutları ile çalışma, genel multi-omic deneysel değişkenliği azaltmak ve örnek hazırlık süresini azaltmak için çok umut verici bir teknik karmaşık olun. Avantajları ile karmaşık mümkün olanaklı kılmak multi-omic yetenekleri ve büyük ölçekli mikrobiyal toplum çalışmaları için gerekli analizleri için sabırsızlanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Yazarlar Nathan Johnson rakamlar hazırlarken onun yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma ABD Enerji Bakanlığı'nın Office biyolojik ve çevresel araştırma (genom bilim programı), Microbiomes geçiş (nane) laboratuvar yönelik araştırma geliştirme tarafından finanse Pan-omics Program tarafından desteklenmiştir Pacific Northwest National Laboratory, hem de ulusal kurumları, Sağlık Ulusal Çevre Sağlık Bilimler Enstitüsü (R01 ES022190) girişimi ve NIH (P42 ES027704). KEBJ R21 HD084788 geliştirmek ve yeni multi-omic ayıklama teknikleri doğrulamak finansal destek için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser içinde W. R. Wiley çevre moleküler Bilimleri Laboratuvarı (EMSL), DOE Ulusal bilimsel Kullanıcı olanağı Pacific Northwest Ulusal Laboratuvarı (PNNL) adlı gerçekleştirildi. PNNL için sözleşme DE-AC06-76RL01830 altında DOE Battelle tarafından işletilen bir çok program Ulusal laboratuvardır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | Stored at -20°C !Caution chloroform has acute potential health effects, skin irritation and possible chemical burns, irritation to the respiratory system, may affect the kidneys, liver, heart. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Stored at -20°C !Caution Methanol may cause respiratory tract, skin and eye irritation, may damage the nerves, kidneys and liver. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Purified water from Millipore | Milli-Q | Water purification system. | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L6026 | !Caution SDS causes acute toxicity and is flammable. It is a skin, eye and airway irritant. Wear gloves and safety glasses. |
| Soil protein extraction kit | MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen | 30000-20 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| 1M Trizma HCL | Sigma-Aldrich | T2694 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T0699 | !Caution TCA is caustic, toxic and may cause skin burns. Wear gloves and safety glasses. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | Stored at -20°C !Caution Acetone may cause respiratory tract and skin and eye irritation. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses gloves and a lab coat, work in a fume hood. |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | !Caution Urea is an eye and skin irritant, use gloves and safety glasses |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830 | |
| Trypsin | Promega | V528A | 20µg vials |
| Bicinchoninic acid protein assay kit | Pierce | 23227 | |
| Ammonium Formate | Sigma-Aldrich | 09735 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | !Caution Acetonitrile is a skin and eye irritant. Highly flammable. Wear gloves and safety glasses. Work in a fume hood. |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | !Caution TFA is extremely hazardous in case of skin contact, eye contact, ingestion and inhalation. May produce tissue damage particularly on mucous membranes of eyes, mouth and respiratory tract. Skin contact may produce burns. Wear gloves, lab coat, safety glasses and work in a fume hood. |
| Methoxyamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 226904 | !Caution Methoxyamine hydrochloride causes severe burns and serious damage to eyes, may cause sensitization by skin contact. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | !Caution Pyridine can cause skin and eye irritation, central nervous system depression. Vapor may cause flash fire. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trimethylchlorosilane | Sigma-Aldrich | 69478 | !Caution MSTFA + 1% TMCS can cause skin corrosion, serious eye damage and specific target organ toxicity. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Milli-Q water purification system | Millipore | model MPGP04001 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Probe sonicator | FisherBrand | model FB505 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | model 5810R | |
| 50mL tube swinging bucket rotor | Eppendorf | A-4-44 | |
| 50mL fixed angle rotor | Eppendorf | FA-45-6-30 | |
| Balance | OHAUS | model V22PWE150IT | |
| Serological pipette controller | Eppendorf | 12-654-100 | |
| 10mL, 25mL glass serological pipettes | FisherBrand | 13-678-27F, 13-678-36D | |
| Thermomixer with Thermotop | Eppendorf | 5382000015, 5308000003 | |
| 0.9 – 2.0 mm blend stainless steel beads | NextAdvance | SSB14B | |
| 0.15 mm garnet beads | MoBio | 13122-500 | |
| Magnetic stir plate | FisherBrand | 11-100-16SH | |
| Magnetic stir bar | FisherBrand | 14512130 | |
| pH paper strips, pH range 0–14 | FisherBrand | M95903 | |
| 15mL, 50mL conical polypropylene centrifuge tube | Genesee Scientific | 21-103 21-108 | chloroform compatible |
| 50mL vortex attachment | MoBio | 13000-V1-50 | |
| Ice bucket | FisherBrand | 02-591-44 | |
| 27.25x70mm glass vials | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Breathe Easier plate membranes | Midwest Scientific | BERM-2000 | |
| Alcohol wipes | Diversified Biotech | BPWP-1000 | |
| Heater shaker incubator | Benchmark, Incu-Shaker Mini | ||
| Analog rotisserie tube rotator | SoCal BioMed, LLC | 82422001 | |
| Filter-Aided-Sample-Prep kit | FASP; Expedeon | 44250 | |
| Microplate reader | Biotek, EPOCH | ||
| -20 Degree Celsius Freezer | Fisher | 13986149 | |
| -80 Degree Celsius Freezer | Stirling Ultracold | SU78OUE | |
| Q-Exactive ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Agilent 7890A gas chromatograph coupled with a single quadrupole 5975C mass spectrometer | Agilent Technologies, Inc. | ||
| LTQ-Orbitrap Velo | Thermo Scientific | ||
| Waters NanoEquityTM UPLC system | Millford, MA | ||
| 250mL media bottle | FisherBrand | 1395-250 | |
| Waters vial | Waters | 186002805 | |
| Glass MS sample vial and inserts | MicroSolv | 9502S-WCV, 9502S-02ND | |
| Glass HPLC vial and snap caps | MicroSolv | 9512C-0DCV, 9502C-10C-B | |
| HPLC 96-well plate | Agilent | 5042-6454 | |
| Large glass vial 27.25x70mm | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Lyophilizer | Labconco | 7934021 | |
| Polished stainless steel flat head spatula | Spoonula; FisherBrand | 14-375-10 | |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 34721 | |
| XBridge C18, 250x4.6 mm, 5 μM with 4.6x20 mm guard column | Waters | 186003117, 186003064 | |
| Agilent 1100 series HPLC system | Agilent Technologies | G1380-90000 | |
| 1.7mL centrifuge tube | Sorenson | 11700 | |
| Hamilton Glass Syringes, 5mL, 50µL and 250µL | Hamilton | 81517, 80975, 81175 | |
| Pasteur Pipettes | FisherBrand | 13-678-20A | |
| Pasteur Pipette Bulbs | Sigma-Aldrich | Z111597 | |
| Bath Sonicator | Branson 1800 Ultrasonic Cleaner | ||
| Vacuum Centrifuge | Labconco Centrivap Acid-Resistant Concentrator System | ||
| MicroSpin Columns, C18 Silica | The Nest Group | SEM SS18V |
References
- Hultman, J., et al. Multi-omics of permafrost, active layer and thermokarst bog soil microbiomes. Nature. 521, 208-212 (2015).
- White, R. A. 3rd, et al. Moleculo long-read sequencing facilitates assembly and genomic binning from complex soil metagenomes. mSystems. 1, (2016).
- White, R. A., Callister, S. J., Moore, R. J., Baker, E. S., Jansson, J. K. The past, present and future of microbiome analyses. Nat Protoc. 11, 4-8 (2016).
- Ritchie, M. D., Holzinger, E. R., Li, R., Pendergrass, S. A., Kim, D. Methods of integrating data to uncover genotype-phenotype interactions. Nat Rev Genet. 16, 85-97 (2015).
- Jansson, J. K., Baker, E. S. A multi-omic future for microbiome studies. Nat Microbiol. 1, (2016).
- Domon, B., Aebersold, R. Options and considerations when selecting a quantitative proteomics strategy. Nat Biotechnol. 28, 710-721 (2010).
- Marx, V. Targeted proteomics. Nat Methods. 10, 19-22 (2013).
- Roberts, L. D., Souza, A. L., Gerszten, R. E., Clish, C. B. Targeted metabolomics. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 30, Unit 30 32 31-24 (2012).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226, 497-509 (1957).
- Nakayasu, E. S., et al. MPLEx: a Robust and Universal Protocol for Single-Sample Integrative Proteomic, Metabolomic, and Lipidomic Analyses. mSystems. 1, (2016).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Pomraning, K. R., et al. Multi-omics analysis reveals regulators of the response to nitrogen limitation in Yarrowia lipolytica. BMC Genomics. 17, 138 (2016).
- Tisoncik-Go, J., et al. Integrated Omics Analysis of Pathogenic Host Responses during Pandemic H1N1 Influenza Virus Infection: The Crucial Role of Lipid Metabolism. Cell Host Microbe. 19, 254-266 (2016).
- Kyle, J. E., et al. Uncovering biologically significant lipid isomers with liquid chromatography, ion mobility spectrometry and mass spectrometry. Analyst. 141, 1649-1659 (2016).
- Lovelace, E. S., et al. Silymarin Suppresses Cellular inflammation by inducing reparative stress signaling. J Nat Prod. 78, 1990-2000 (1990).
- Kim, Y. M., et al. Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms. Front Microbiol. 6, 209 (2015).
- Pomraning, K. R., et al. Comprehensive Metabolomic, Lipidomic and microscopic profiling of Yarrowia lipolytica during lipid accumulation identifies targets for increased lipogenesis. PLoS One. 10, e0123188 (2015).
- Huang, E. L., et al. The fungus gardens of leaf-cutter ants undergo a distinct physiological transition during biomass degradation. Environ Microbiol Rep. 6, 389-395 (2014).
- Deatherage Kaiser, B. L., et al. A Multi-Omic View of Host-Pathogen-Commensal Interplay in Salmonella-Mediated Intestinal Infection. PLoS One. 8, e67155 (2013).
- Kim, Y. M., et al. Salmonella modulates metabolism during growth under conditions that induce expression of virulence genes. Mol Biosyst. 9, 1522-1534 (2013).
- Ansong, C., et al. A multi-omic systems approach to elucidating Yersinia virulence mechanisms. Mol Biosyst. 9, 44-54 (2013).
- Bordbar, A., et al. Model-driven multi-omic data analysis elucidates metabolic immunomodulators of macrophage activation. Mol Syst Biol. 8, 558 (2012).
- Hu, Z. P., et al. Metabolomic response of human skin tissue to low dose ionizing radiation. Mol Biosyst. 8, 1979-1986 (2012).
- Perera, R., et al. Dengue virus infection perturbs lipid homeostasis in infected mosquito cells. PLoS Pathog. 8, e1002584 (2012).
- Gao, X., et al. A reversed-phase capillary ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) method for comprehensive top-down/bottom-up lipid profiling. Anal Bioanal Chem. 402, 2923-2933 (2012).
- Sorensen, C. M., et al. Perturbations in the lipid profile of individuals with newly diagnosed type 1 diabetes mellitus: Lipidomics analysis of a Diabetes Antibody Standardization Program sample subset. Clin Biochem. 43, 948-956 (2010).
- Diamond, D. L., et al. Temporal proteome and lipidome profiles reveal hepatitis C virus-associated reprogramming of hepatocellular metabolism and bioenergetics. PLoS Pathog. 6, e1000719 (2010).
- Alquier, T., et al. Deletion of GPR40 impairs glucose-induced insulin secretion in vivo in mice without affecting intracellular fuel metabolism in islets. Diabetes. 58, 2607-2615 (2009).
- Ding, J., et al. Application of the accurate mass and time tag approach in studies of the human blood lipidome. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 871, 243-252 (2008).
- Rasmussen, A. L., et al. Systems virology identifies a mitochondrial fatty acid oxidation enzyme, dodecenoyl coenzyme A delta isomerase, required for hepatitis C virus replication and likely pathogenesis. J Virol. 85, 11646-11654 (2011).
- Manza, L. L., Stamer, S. L., Ham, A. J., Codreanu, S. G., Liebler, D. C. Sample preparation and digestion for proteomic analyses using spin filters. Proteomics. 5, 1742-1745 (2005).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat Methods. 6, 359-362 (2009).
- Zhou, J. Y., et al. Simple sodium dodecyl sulfate-assisted sample preparation method for LC-MS-based proteomics applications. Anal Chem. 84, 2862-2867 (2012).
- Anderson, J. C., et al. Decreased abundance of type III secretion system-inducing signals in Arabidopsis mkp1 enhances resistance against Pseudomonas syringae. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 6846-6851 (2014).
- Chourey, K., et al. Direct cellular lysis/protein extraction protocol for soil metaproteomics. J Proteome Res. 9, 6615-6622 (2010).
- Kim, S., Gupta, N., Pevzner, P. A. Spectral probabilities and generating functions of tandem mass spectra: a strike against decoy databases. J Proteome Res. 7, 3354-3363 (2008).
- Kim, S., Pevzner, P. A. MS-GF+ makes progress towards a universal database search tool for proteomics. Nat Commun. 5, 5277 (2014).
- Cole, J. K., et al. Phototrophic biofilm assembly in microbial-mat-derived unicyanobacterial consortia: Model systems for the study of autotroph-heterotroph interactions. Front Microbiol. 5, (2014).
- Isaacson, T., et al. Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues. Nat Protoc. 1, 769-774 (2006).
