Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

MPLEx protokol for Multi-omic analyser af jordprøver

Published: May 30, 2018 doi: 10.3791/57343
* These authors contributed equally

Summary

En protokol, der er præsenteret for samtidig udskille metabolitter, proteiner og lipider fra en enkelt jordprøve, giver mulighed for reduceret proeve forberedelse gange og gør det muligt for multi-omic massespektrometri analyser af prøver med begrænsede mængder.

Abstract

Massespektrometri (MS)-baseret integreret metaproteomic, metabolomic og lipidomic (multi-omic) undersøgelser er ved at transformere vores evne til at forstå og karakterisere mikrobielle samfund i miljø og biologiske systemer. Disse målinger selv giver mulighed for udvidet analyser af komplekse jord mikrobielle samfund, som er den mest komplekse mikrobielle systemer kendt til dato. Multi-omic analyser, har dog prøve forberedelse udfordringer, da separat ekstraktioner er typisk behov for hver omic undersøgelse, derved høj grad forstærke den forberedelsestid og mængden af prøven kræves. For at løse denne begrænsning, blev en 3-i-1 metode til samtidige udvinding af metabolitter, proteiner og lipider (MPLEx) fra den samme jordprøve oprettet ved at tilpasse et opløsningsmiddel-baseret tilgang. Denne MPLEx protokol har vist sig for at være både enkel og robust for mange typer af prøven, selv når udnyttet for begrænsede mængder af komplekse jordprøver. Metoden MPLEx aktiveret også meget hurtig multi-omic målinger for at få en bedre forståelse af medlemmerne af hver mikrobielle samfund, mens evaluering af ændringerne finder sted ved biologiske og miljømæssige perturbationer.

Introduction

Evaluering af jordens mikrobielle samfund har stor betydning for at forstå carbon cykling og klima forandring. Nylige undersøgelser har imidlertid fremhævet vanskeligheder, som manglen sekventeret genomer for mikrobiota i forskellige jordtyper og funktionen ukendt af mange af de proteiner, der er opdaget. Disse udfordringer resultat på grund af jord er den mest komplekse mikrobielle samfund kendt til dato1,2,3. Multi-omic analyser, der kombinerer resultaterne fra metagenomic, metatranscriptomic, metaproteomic, metabolomic og lipidomic undersøgelser, er for nylig blevet gennemført i adskillige jorden undersøgelser at få en større indsigt i de mikrober til stede, mens at opnå omfattende information om de molekylære forandringer på grund af miljømæssige perturbationer1,4,5. En udfordring med multi-omic undersøgelser er der massespektrometri (MS)-baseret metaproteomic, metabolomic og lipidomic målinger kræver typisk en specifik udvinding proces for hver omic MS kompatibel6,7 , 8 , 9. disse præcise procedurer gør deres gennemførelse meget vanskeligt eller umuligt når kun en begrænset mængde af prøven er tilgængelig. Disse udfordringer har fået os til at undersøge en samtidige metabolit, proteiner og lipid udvinding (MPLEx) metode i stand til at bruge mindre prøve diskenheder eller masserne, forbedre nøjagtigheden, og giver hurtigere prøve forberedelserne til alle tre analyser 10. til dato, der er ingen alternative jord ekstraktion procedurer, der kan opnå alle disse mål.

Hvis du vil aktivere globale multi-omic analyser af en enkelt jordprøve, var en økologisk opløsningsmiddelekstraktion protokol baseret på chloroform, methanol og vand separationer udnyttede10. Denne metode blev oprindeligt udviklet til samlede lipid ekstraktioner9,11 og for nylig blev ændret til samtidige udvinding af metabolitter, proteiner og lipider fra en enkelt prøve12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28,29,30, aktivering mindre vareprøveantal og Eksperimentel variation10. Chloroform er i MPLEx protokol, ikke blandbar med vand, som danner grundlag for trifasisk kemiske adskillelse af prøven bestanddele i forskellige fraktioner. Den øverste vandige fase indeholder derfor de hydrofile metabolitter, efterfulgt af en protein disk, og derefter et lipid lag i bunden chloroform fase (figur 1). Når MPLEx anvendes på de fleste jordtyper, partikler snavs ophobes på bunden af prøveudtagning rør og kan kasseres efter alle lag er indsamlet. Hver jordtype kan være forskellige, dog, og i meget økologisk jord som tørv, jord snavs forbliver i det midterste lag og ikke falder til bunden af prøveudtagning tube. MPLEx giver flere fordele, når isolere flere molekyle typer fra samme prøve, såsom 1) mindre prøve mængder kan bruges til multi-omic analyser, 2) multi-omic ekstraktioner fra samme prøve faldet total eksperimentel variation, og 3) større antal prøver kan forberedes meget hurtigere for højere overførselshastighed undersøgelser10. Sammen disse fordele er afgørende for at give bedre måling kapaciteter til evaluering af jordprøver og deres komplekse mikrobielle samfund.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Meget våd jord kan blive frysetørret før udvinding uden skade for effektiviteten af udvinding. Våd jord kan også bruges, men bør overvejes, når du tilføjer reagenser på specifikke nøgletal.

Bemærk: Det anbefales at bruge 20 g af tør jord vægt pr. udtræk, som skal deles mellem to 50 mL rør (højst 10 g jord pr. 50 mL tube). Ekstraktioner kan skaleres op eller ned afhænger af tilgængelige prøve.

Bemærk: Tør jordprøver kan sigtes gennem en 3 mm skærm for at homogenisere og fjerne små rødder og klipper. Sigten ikke våd jordprøver, som prøven vil sidde fast i skærmen.

1. jord celle Lysis og udvinding af metabolitter, proteiner og lipider (Timing ~ 1 d)

  1. Per prøve på 20 g jord, 10 g afvejes i to separate 50 mL rør, der er methanol/chloroform kompatibel. Vær med rør valgt, yderst forsigtig, da chloroform vil sive ned de fleste plast, forurener prøverne. Bruge glas, når det er muligt eller plast rør fremstillet af polypropylen eller polytetrafluorethylen (PTFE).
    Bemærk: Hold jorden på isen og som cool som muligt under de indledende vejning og homogenisering trin.
  2. Der tilsættes 10 mL chloroform-vasket rustfrit stål og granat perler til hver tube. På is, tilsættes 4 mL af kolde ultrarent vand (Se Tabel af materialer til luftrensning system) til hvert rør (én prøve split mellem to rør) og overføre prøver i en isspand i et stinkskab.
  3. Bruger en 25 mL glas serologisk pipette, hurtigt tilsættes 20 mL iskold 2:1 chloroform: methanol (v/v).
    Forsigtig: Chloroform: methanol har akut potentielle sundhedsvirkninger: hud irritation, mulige kemiske forbrændinger og irritation af luftvejene. Det kan påvirke nyrerne, leveren og hjertet. Bære passende beskyttende briller, beklædning og handsker, og altid arbejde i et stinkskab.
  4. Stramme låg og vortex i løsning. 2:1 choloroform:methanol hjælper med at bryde ned cellevæggen af prokaryoter og også inaktiverer enzymaktiviteter.
  5. Vedhæfte rør til 50 mL tube vortex vedhæftede filer og vandret vortex i 10 min. ved 4 ° C inde i et køleskab om muligt. Placer derefter, prøverne inde i et-80 ° C fryser for ~ 15 min. for at køle dem helt.
  6. Ved hjælp af en sonde sonikator inde i et stinkskab, der sonikeres hver prøve med en 6 mm (1/4") sonde amplitude 60% for 30 s på is.
    Forsigtig: Det anbefales at bruge en lyd aftagende kabinet og øre beskyttelse, mens sonicating. Høj spænding er til stede i levering og høj frekvens-kablet. Undgå at røre bunden eller siderne af prøven fartøj med en aktiv sonde; Det kan knække eller smelte plasten.
  7. Placer prøverne i-80 ° C fryser for ~ 15 min, som sonicating kan generere en masse varme.
  8. Gentag trin 1,5-1,7.
    Bemærk: Sørg for prøverne bo koldt hele proceduren lysering.
  9. Centrifugeres prøver på 4.000 x g i 5 min, 4 ° C. Prøven vil på dette punkt opdeles i øvre metabolit lag, protein mellemlægget, og den lavere lipid lag (og resterende vragrester pellet). Se figur 1.
  10. Prøveemner på isen i en isspand, og inde i et stinkskab og ved hjælp af 10 mL glas serologisk pipette, fjerne de øverste metabolit lag fra de to 50 mL rør ind i et stort glas hætteglas.
    Bemærk: Undgå sugning af laget protein i pipette; forlade et lille lag af metabolit, hvis nødvendigt.
  11. Lidt vippe 50 mL tube for at frigive protein mellemlægget, således at det er frit flydende på den lavere lipid lag. Med en ren rustfri flad-head lab spatel, omhyggeligt scoop begge protein mellemlægget og placere dem sammen i ét nyt 50 mL tube.
  12. Bruger en 25 mL glas serologisk pipette, fjerne de lavere lipid lag i et stort glas hætteglas.
    Bemærk: Prøv at undgå håbefulde jordpartikler; men nogle jord snavs og partikler aspirerede langs med lipider fjernes på et senere tidspunkt.
  13. Sted åndbare membraner over toppen af metabolitten og lipid glas hætteglas og tørre i et vakuum koncentrator indtil tørhed (lipider ~ 4-5 h, metabolitter natten over).
  14. Prøveglas protein og de resterende vragrester pellet rør, der tilsættes 20 mL iskold methanol til hver og vortex. Dette er gjort til debris pellets til at skylle ud chloroform før du forsøger at solubilize enhver eventuel resterende protein ud af snavs før kastede det.
  15. Centrifuge vragrester pellets og protein interlayer på 4.000 x g i 5 min, 4 ° C, og derefter dekanteres methanol i et farligt affald beholder inde i et stinkskab.
  16. Fryse protein og debris pellets i flydende nitrogen og tørre i en lyophilizer (med en solfanger temperatur i stand til at-105 ° C på grund af methanol har et meget lavt frysepunkt på-98 ° C) til ~ 2 timer.
    Bemærk: Tør over ikke, at piller, som de vil være sværere at solubilize.
  17. Der tilsættes 10 mL af protein oploesning buffer (4% SDS, 100mM DTT (DL-dithiothreitol) i 50mM tris buffer, pH 8,0; Se Supplerende reagens Set-up) til protein farvningen tube og 20 mL til hver af vragrester pellets.
    Forsigtig: SDS forårsager akutte toksicitet og er brandfarligt. Det er en hud, øjne og luftveje lokalirriterende. Bære handsker og sikkerhedsbriller.
  18. I stinkskab, sonde sonikeres prøver på 20% amplitude til 30 s til at bringe dem i løsning. Vortex for 2 min.
  19. Protein farvningen prøven anbringes i et lab tube rotator i 30 min. ved 300 rpm, 50 ° C, for at solubilize protein.
  20. Vandret vortex vragrester prøver for en yderligere 10 min. til lyse enhver resterende intakt celler, derefter rotere med protein farvningen prøver for de resterende 20 min.
  21. Der centrifugeres alle prøver på 4.500 x g i 10 min, stuetemperatur (RT), og indsamle supernatanten fra hver tube per prøve i to 50 mL rør.
  22. Tilsæt 10 mL oploesning buffer til protein farvningen pellet, så Læg instrumenterne i ultralydsbad og vortex tilbage i løsning, og der centrifugeres som før.
  23. Kombinere analysere i to 50 mL rør lige så samles og centrifugeres ved 8.000 x g i 10 min., 4 ° C, i en fast vinkel spand rotor.
    Bemærk: En afsluttende centrifugering er nødvendigt at fjerne overdreven kontaminerende humusfraktionerne stoffer.
  24. Syren fradekanteres at analysere i to 50 mL rør, således at der er 30 mL i hver. Derefter, ved hjælp af 10 mL glas serologisk pipette, tilsættes 7,5 mL af TCA (trichloreddikesyre) til hver tube. Vortex i løsning. Dette gør 20% TCA i hver 30 mL prøve (justere i overensstemmelse hermed),
    Forsigtig: TCA er kaustisk, giftigt og kan forårsage forbrændinger af huden. Bære handsker og sikkerhedsbriller.
  25. Placer prøverne i en-20 ° C fryser for 2 h til natten.
    Bemærk: Proteiner vil typisk bundfald inden for 1 time, men kan være tilbage om natten (op til 18 h).
    Bemærk: Lad ikke TCA udvinding gå længere end 18 h på grund af mulige sur hydrolyse af protein. Hvis prøven er frosset, tø det på isen; Lad ikke varme op forbi tø prøven.
  26. For at pille de bundfaldne proteiner, prøve på 4.500 x g i 10 min., 4 ° C der centrifugeres og dekanteres i affald.
  27. Tilsættes 10 mL af 100% iskolde acetone til hvert protein pellet, vortex og kombinere som pellets ind i et rør.
  28. Centrifugeres rør indeholdende den kombinerede pellet (ved hjælp af en balance), og derefter dekanteres i affald.
    Forsigtig: Acetone kan forårsage luftveje og hud- og øjenirritation, og er en Brandfarlig væske og damp. Bære sikkerhedsbriller handsker og en laboratoriekittel, arbejde i et stinkskab.
  29. Vask pellet to gange med 1,5 mL acetone og endelig overførsel til en 2 mL tube for den endelige spin på 10.000 x g i 5 min.
  30. Dekanteres i affald og tillade pellet tørre omvendt på en papir serviet i et stinkskab for ~ 20 min eller under en nitrogen stream, indtil pelleten lidt begynder at knække.
  31. Tilføj 100-200 µL af protein oploesning buffer, afhængigt af størrelsen af toerstoffet.
    Bemærk: Hold mængden af oploesning buffer tilsættes prøven så lavt som muligt. Efterfølgende Filter hjulpet prøve forberedelse (FASP) kan kun bruge op til 50 μL af solubilized prøve pr. kolonne. nogen skal mere være delt i flere FASP kolonner.
  32. Der sonikeres og vortex pellet i løsning. Bemærk, at prøven kan være tyktflydende på grund af humusfraktionerne stoffer fældningen sammen med protein, som vil blive fjernet med en efterfølgende centrifugering.
  33. Ryst prøven i en inkubator/shaker i 30 min. ved 300 rpm, 40 ° C, for at solubilize protein i løsning og gå videre til protein fordøjelse.
  34. Snap fryse prøven i flydende nitrogen og opbevares i et-80 ° C fryser indtil klar til protein fordøjelse.

2. lipid forberedelse (Timing ~ 20 min)

  1. Når lipid prøver er tørre, tilføje 200 μl af 2:1 chloroform: methanol til hætteglas, vortex i løsning og overførsel til en 1,5 mL polypropylen tube, tilføje en ekstra 200 μl til glasset hætteglasset, vortex og tilsæt de resterende lipider og overføre til tube.
  2. Centrifugeres snavs ud af prøven på 12.000 x g i 5 min. ved 4 ° C.
  3. Overføre supernatanten til en lipid hætteglasset og opbevares ved-20 ° C indtil LC-MS/MS analyse (yderligere detaljer for LC-MS/MS i Supplerende metoder).
  4. Hvis prøverne ikke kan analyseres umiddelbart efter fremstillingen, skal lipider opbevares i opløsningsmiddel ved-20 ° C til at forhindre oxidation og nedbrydning.

3. metabolit forberedelse og forædling (Timing ~ 5 h)

  1. Dagen efter ekstraktion, fjerne metabolit prøver fra Speed Vac og opbevares tørt ved-20 ° C indtil klar til forædling og analysemetoder på GC. Hvis ikke kører metabolitter på en GC, derefter forberede dem ved hjælp af den relevante protokol til instrumentet.
  2. Umiddelbart før afledende metabolitter til analyse på GC, skal du overføre dem fra de store hætteglas ved at tilføje 200 μl af methanol, vortexing og tilføje til en 1,5 mL polypropylen tube. Gentag én gang.
  3. Centrifugeres tube på 12.000 x g i 10 min., 4 ° C. Overføre supernatanten til mindre hætteglas, tilføje en åndbar membran til toppen, og helt tørt i en Speed Vac.
  4. Derivatize metabolitter ved at tilføje 20 µL af methoxyamine løsning til prøven hætteglas og vortex for 30 s på en vortexer på medium hastighed.
    Forsigtig: Methoxyamine hydrochlorid forårsager alvorlige forbrændinger og alvorlige skader på øjne, kan give overfølsomhed ved kontakt med huden. Bære sikkerhedsbriller, handsker og laboratoriekittel, og arbejde i et stinkskab.
  5. Bruge et bad sonikator for at sikre, at prøven er helt opløst.
  6. Inkuber prøven i en inkubator med kondens forebyggelse låg vedligeholdes ved 37 ° C i 1 h 30 min med 1000 rpm ryster.
  7. Vend hætteglasset én gang for at blande prøverne med kondenserede dråber på fælles landbrugspolitik overflade. Spin prøven ned på 1.000 x g i 1 min., RT.
  8. Udføre silylering ved at tilføje 80 µL (ved hjælp af en sprøjte) af N-Methyl - N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide med 1% trimethylchlorsilan. Vortex for 10s.
    Forsigtig: MSTFA + 1% TMCS kan forårsage hud korrosion, alvorlige øjenskader, og specifikke mål orgel toksicitet, og er en Brandfarlig væske og damp. Bære sikkerhedsbriller, handsker og laboratoriekittel, og arbejde i et stinkskab.
  9. Inkuber prøven i en inkubator med kondens forebyggelse låg vedligeholdes ved 37 ° C i 30 min med 1000 rpm ryster.
  10. Vend hætteglasset én gang for at blande prøverne med kondenserede dråber på fælles landbrugspolitik overflade.
  11. Spin prøven ned i 5 min på 2.000 x g, RT.
  12. Monomers oploesningen til hætteglas passende for GC-MS analyse.

4. protein fordøjelse (Timing ~ 1 d)

  1. Der centrifugeres prøve på 15.000 x g i 5 min, RT, at sammenpresse snavs.
  2. Udføre Filter-hjulpet-prøve-forberedelse (FASP) for fordøjelsen ved hjælp af FASP kits (Se Tabel af materialer) følgende ændrede producentens instruktioner31,32:
    1. Tilsæt 400 μL af 8 M urinstof buffer i en FASP kolonne (500 μl 30K MWCO spin filteret).
    2. Når prøven er færdig, centrifugering, afpipetteres off supernatanten (kassere pellet) og tilføje op til 50 μL af prøven til 8 M urinstof i kolonnen 400 μL.
      Bemærk: Tilsæt kun op til 50 μL af prøven pr. kolonne. Hvis der er mere end 50 μL af prøven, bruge flere spalter og kombinere peptider efter fordøjelsen. Det er bedst at lade denne mængde så lave som muligt (30 µL er ideel) for at sikre FASP kolonne vil fjerne alle de SDS, som kan dramatisk forstyrre masse spec analyse.
    3. Placer kolonnen i inkluderet 1,5 mL tube og centrifugeres prøve på 14.000 x g i 30 min, RT.
    4. Fjern gennemstrømnings-i affald og tilføje 400 μL af 8 M urinstof til kolonnen og centrifugeres igen.
    5. Gentag forrige trin en gang mere for i alt 3 urinstof skylninger.
      Bemærk: Sørg for prøven går tæt på tørhed på kolonnen, hvis der er nogen mere end ~ 30 µL resterende på filteret efter hvert spin, fortsætte centrifugering.
    6. Tilføj 400 μL af 50 mM NH4HCO3 og centrifugeres ved 14.000 x g i 20 min., skille sig af med affaldet, og Gentag én gang.
    7. Overføre kolonnerne til en ren 1,5 mL centrifugeglas.
    8. Tilsættes 75 μl af trypsin fordøjelsen buffer til kolonnerne og inkuberes ved 37 ° C til 3 h i en inkubator med kondens forebyggelse låg på 750 rpm.
    9. Tilføje 40 µL af 50 mM NH4HCO3 til kolonnerne.
    10. Der centrifugeres prøve på 14.000 x g i 15 min. til at indsamle peptider ind i røret samtidig holde høj molekylvægt forurenende stoffer på toppen af kolonnen.
    11. Tilføje 40 μL af 50mM NH4HCO3 til kolonnen og centrifugeres igen.
  3. Kassér kolonnen, tør ned peptider i røret i en Speed Vac ~ 30 µL og BCA assay (Bicinchoninic syre protein assay kit; Se Tabel af materialer) peptider.
  4. Du kan eventuelt udføre en oprydning trin hvis SDS er mistanke om kontaminering (synlige bobler)33. En solid fase udvinding skal ske bagefter, hvis du vælger denne indstilling. Detaljerede oplysninger om denne oprydning metode er tilgængelig i de Supplerende metoder.
  5. Fortyndes prøven for MS analyse eller eventuelt videre til HPLC fraktionering (næste to trin).
  6. Fortynd prøver til en volumen på 400 µL med 10 mM ammonium formate buffer (pH 10,0) for at fractionate.
  7. Løse på en C18 kolonne (Se Tabel af materialer) ved at adskille 0,5 mL/min. ved hjælp af en HPLC system med mobile faser a 10 mM ammonium formate, pH 10,0 og B 10 mM ammonium formate, pH 10,0/acetonitril (10:90).
    1. Justere forløb fra på 100% A til 95% A over de første 10 min, 95% A til 65% A over min 10-70, 65% A 30% a over min 70-85, opretholde på 30% A over min 85-95.
    2. Re reagensglasset med 100% A over min 95-105 og holde på 100% A indtil min 120.
    3. Indsamle fraktioner hver 1,25 min (96 fraktioner over hele gradient) og endelig kombinere hver række i alt 12 prøver eller hver anden række for 24 prøver (hver med n = 8 eller n = 4 fraktioner samles).
  8. Tør alle fraktioner under vakuum og tilføje 15 µL ultrarent vand til hver til opbevaring ved-20 ° C indtil LC-MS/MS analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Når MPLEx protokol blev brugt til at udtrække molekyler fra Kansas indfødte prairie jord (en Mollisol jord), givet tredobbelt analyser resultater for 3376 peptider, 105 lipider og 102 polar metabolitter (alle entydige identifikationer). Mens MPLEx protokol har været veletablerede for generelle udvinding af lipider og metabolitter12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21,22,23,24,25,26,27 ,28,29,30,34, sin sammenligning til fælles jord protein udvindingsmetoder for mikrobiel analyse, såsom jord protein udvinding kits (Se tabel af Materialer) og SDS (sodium dodecyl sulfat) ekstraktioner35, vurderes yderligere her. For at vurdere disse teknikker, var Kansas indfødte prairie jord proteiner udvundet med hver tilgang og analyseret direkte med omvendt-fase LC-MS/MS ved hjælp af et UPLC system kombineret med en hybrid Quadrupol/Orbitrap massespektrometer. Detaljerede oplysninger om parametrene er tilgængelige i de Supplerende metoder. Den resulterende eksperimentelle peptid MS/MS-spektre fra hver udvinding tilgang blev sammenlignet med forudsagte peptid sekvenser fra repræsentant Kansas indfødte prairie metagenome2 ved hjælp af en strengere MS-spektral sandsynlighed cutoff GF + 1 x 10 -10 36 , 37 og en masse fejl cutoff på mindre end 5 ppm. Det skal bemærkes, at analysander udvindes fra jorden ved hjælp af MPLEx-protokollen er egnet til MS-baserede studier og andre analytiske teknikker. Når først sammenligne tre replikater af de kendte metoder til MoBio og SDS, kun 12% af peptider overlappet mellem de to teknikker, viser kompleksitet mikrobielle samfund og forskellige udvinding effekter (figur 2). Ved sammenligning af MPLEx med MoBio og SDS ekstrakter, blev ~ 38% af peptider observeret ved hjælp af metoden MPLEx også fundet ved brug af SDS og/eller MoBio ekstraktioner (figur 2). I betragtning af antallet af arter i Kansas jord bakterielle samfund og dets metagenome2, overlapning af peptid identifikationer er rimelig og på grund af dets kompleksitet, kombinationen af tilgange ekstrakter mere peptider end hver alene 35. også, da disse prøver blev ufraktionerede og analyseret af kun 1-dimensional LC-MS/MS, ekstremt høj sample kompleksitet var muligvis forårsager nogle bias i registrering på grund af forskellige peptid koncentrationer udvundet af hver enkelt tilgang. MPLEx protokol har også været anvendt på andre jordtyper som permafrost og vådområder, og i alle tilfælde foreløbigt proteom resultater er af samme kvalitet som i Kansas indfødte prairie jord data præsenteres her.

Bred anvendelighed af metoden MPLEx tidligere har vurderet ved hjælp af et mangfoldigt sæt af prøver, herunder archaeon Sulfolobus acidocaldarius, en unicyanobacterial consortium38, mus hjernevæv cortex, human urin, og blade fra Arabidopsis thaliana (figur 2)10. For alle prøver undtagen A.thalianaer urinstof ekstraktioner den mest almindelige måde at udtrække proteiner, så de blev brugt som kontrol metoden til evaluering. A. thaliana MPLEx resultater blev sammenlignet med et udtræk udføres ved hjælp af trichloreddikesyre (TCA) fordi plante blade er rig på phenolforbindelser, der skal fjernes før MS analyser39. I alle tilfælde var antallet af proteiner observeret fra metoden MPLEx ligner for kontrolelementer10, med angivelse af dens nytte for mange forskellige prøve typer. Også, der var ingen tendenser, der er forbundet med de specifikke protein klasser udvundet i alle prøve typer (herunder jord). Derfor, den brede anvendelse af MPLEx til mange biologiske og miljømæssige systemer gør det en lovende tilgang.

Figure 1
Figur 1. En skematisk viser MPLEx processen, i hvilken metabolitter, proteiner og lipider er samtidig udvundet fra den samme jordprøve for MS analyser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Venn-diagrammer illustrerer peptid overlapningen for et mangfoldigt sæt af prøver, der er udvundet ved hjælp af MPLEx og en standard urinstof-baseret protein ekstraktion metode normalt udført. Data fra MPLEx udvinding af archaeon S.acidocaldarius, unicyanobacterial consortium, human urin, mus hjernens cortex og A.thaliana plante blade tilpasset fra Nakayasu, E. S. et al. 201610. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det er vigtigt at bemærke, at ikke alle laboratorier vil have den samme udstyr til rådighed, så visse metoder, for eksempel lysis skridt, kan tilpasses. Her bruger vi vortexing og sonicating, men brugen af en stor 50 mL perle tæppebanker ville arbejde. Hvis der ikke findes en lyophilizer med en solfanger temperatur i stand til at-105 ° C, kan derefter prøver tørres under en nitrogen stream. Også jordtyper varierer meget og kan omfatte sand, silt, ler, tørv og lerjord (etc.), og de kan også variere afhængigt af pH, saltholdighed og organisk materiale rigdom. Hver af disse afvigelser kan have en indvirkning på protokollen, så det er vigtigt at være fleksible og foretage justeringer efter behov. Det er imidlertid afgørende, at nøgletal og procenter forbliver den samme.

MPLEx-protokollen viser meget lovende for programmet i mange biologiske og miljømæssige systemer og evnen til at aktivere multi-omic analyser af jordens mikrobielle samfund. Tidligere sammenligninger af MPLEx til andre udvinding protokoller for forskellige systemer illustreret en høj grad af peptid overlapning10. Imidlertid observeret en begrænsning var, at MPLEx ikke var gældende for blodplasma proteiner, der skal være udtømt. I disse tilfælde var de bundfaldne proteiner ikke godt anerkendt af antistoffer i kolonnerne immunodepletion behov for en bred dækning af plasma proteomet. Derfor, mere standard udvinding metoder bør anvendes under disse omstændigheder. En yderligere begrænsning kendt for MPLex udvinding tilgang er at det ikke skelne mellem intracellulære og ekstracellulære protein, men dette gælder for alle andre jord protein udvinding protokoller samt.

I dette manuskript forudsat MPLEx resultater for 3376 peptider, 105 lipider og 102 polar metabolitter i Kansas indfødte prairie jord ved hjælp af de udvinding og analysemetoder, som beskrevet i afsnittet protokol. Bedre overlapning blev observeret mellem peptider udvundet i kontrol og MPLEx tilgange til individuelle systemer i forhold til jordens mikrobielle samfund (figur 2). Dette er ikke en begrænsning, men en konsekvens af arbejdet med de yderst komplicerede jord mikrobielle samfund. Disse resultater er yderligere bemærket de velkendte jord udvinding teknikker til SDS og MoBio ikke overlappe hinanden godt enten på grund af stor mangfoldighed og vanskeligheder udvinding jord proteiner lige så. Interessant, MPLEx protokol tilladt identifikation af flere samlede peptider end enten SDS eller MoBio og også opdaget yderligere komponenter ikke set i enten analyse.

Disse observationer gør MPLEx en meget lovende teknik til at arbejde med små prøver størrelser, at reducere samlede multi-omic eksperimentel variation, og prøve præparationstiden. De fordele, der er muligt med MPLEx ser for at aktivere multi-omic kapaciteter og analyser, der kræves for storstilet mikrobielle samfund undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Nathan Johnson for hans bistand til forberedelse af tal. Denne forskning blev støttet af den Pan-omik Program, der er finansieret af det amerikanske Department of Energy's Office af biologiske og miljømæssige forskning (genomisk Science Program), Microbiomes i overgangen (mynte) laboratorium instrueret forskningsudvikling Initiativ på Pacific Northwest National Laboratory, såvel som nationale institutter for nationale Institut for miljømæssige sundhed Sundhedsvidenskab (R01 ES022190) og NIH (P42 ES027704). KEBJ vil gerne takke R21 HD084788 for finansiel støtte til at udvikle og validere nye multi-omic udvinding teknikker. Dette arbejde blev udført i den W. R. Wiley miljømæssige Molecular Sciences Laboratory (EMSL), en DOE nationale videnskabelige bruger facilitet på Pacific Northwest National Laboratory (PNNL). PNNL er en multi program nationale laboratorium drives af Battelle for DOE under kontrakt DE-AC06-76RL01830.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform Sigma-Aldrich 650498 Stored at -20°C !Caution chloroform has acute potential health effects, skin irritation and possible chemical burns, irritation to the respiratory system, may affect the kidneys, liver, heart. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood.
Methanol Sigma-Aldrich 34860 Stored at -20°C !Caution Methanol may cause respiratory tract, skin and eye irritation, may damage the nerves, kidneys and liver. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood.
Purified water from Millipore Milli-Q Water purification system.
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L6026 !Caution SDS causes acute toxicity and is flammable. It is a skin, eye and airway irritant. Wear gloves and safety glasses.
Soil protein extraction kit MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen 30000-20
DL-dithiothreitol Sigma-Aldrich 43815
1M Trizma HCL Sigma-Aldrich T2694
Trichloroacetic acid Sigma-Aldrich T0699 !Caution TCA is caustic, toxic and may cause skin burns. Wear gloves and safety glasses.
Acetone Sigma-Aldrich 650501 Stored at -20°C !Caution Acetone may cause respiratory tract and skin and eye irritation. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses gloves and a lab coat, work in a fume hood.
Urea Sigma-Aldrich 208884 !Caution Urea is an eye and skin irritant, use gloves and safety glasses
Ammonium bicarbonate Fluka 09830
Trypsin Promega V528A 20µg vials
Bicinchoninic acid protein assay kit Pierce 23227
Ammonium Formate Sigma-Aldrich 09735
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34998 !Caution Acetonitrile is a skin and eye irritant. Highly flammable. Wear gloves and safety glasses. Work in a fume hood.
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508 !Caution TFA is extremely hazardous in case of skin contact, eye contact, ingestion and inhalation. May produce tissue damage particularly on mucous membranes of eyes, mouth and respiratory tract. Skin contact may produce burns. Wear gloves, lab coat, safety glasses and work in a fume hood.
Methoxyamine hydrochloride Sigma-Aldrich 226904 !Caution Methoxyamine hydrochloride causes severe burns and serious damage to eyes, may cause sensitization by skin contact. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood.
Pyridine Sigma-Aldrich 270970 !Caution Pyridine can cause skin and eye irritation, central nervous system depression. Vapor may cause flash fire. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood.
N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trimethylchlorosilane Sigma-Aldrich 69478 !Caution MSTFA + 1% TMCS can cause skin corrosion, serious eye damage and specific target organ toxicity. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood.
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Milli-Q water purification system Millipore model MPGP04001
Vortex Scientific Industries SI-0236 Vortex Genie 2
Probe sonicator FisherBrand model FB505
Refrigerated centrifuge Eppendorf model 5810R
50mL tube swinging bucket rotor Eppendorf A-4-44
50mL fixed angle rotor Eppendorf FA-45-6-30
Balance OHAUS model V22PWE150IT
Serological pipette controller Eppendorf 12-654-100
10mL, 25mL glass serological pipettes FisherBrand 13-678-27F, 13-678-36D
Thermomixer with Thermotop Eppendorf 5382000015, 5308000003
0.9 – 2.0 mm blend stainless steel beads NextAdvance SSB14B
0.15 mm garnet beads MoBio 13122-500
Magnetic stir plate FisherBrand 11-100-16SH
Magnetic stir bar FisherBrand 14512130
pH paper strips, pH range 0–14 FisherBrand M95903
15mL, 50mL conical polypropylene centrifuge tube Genesee Scientific 21-103 21-108 chloroform compatible
50mL vortex attachment MoBio 13000-V1-50
Ice bucket FisherBrand 02-591-44
27.25x70mm glass vials FisherBrand 03-339-22K
Breathe Easier plate membranes Midwest Scientific BERM-2000
Alcohol wipes Diversified Biotech BPWP-1000
Heater shaker incubator Benchmark, Incu-Shaker Mini
Analog rotisserie tube rotator SoCal BioMed, LLC 82422001
Filter-Aided-Sample-Prep kit FASP; Expedeon 44250
Microplate reader Biotek, EPOCH
-20 Degree Celsius Freezer Fisher 13986149
-80 Degree Celsius Freezer Stirling Ultracold SU78OUE
Q-Exactive ion trap mass spectrometer Thermo Scientific
Agilent 7890A gas chromatograph coupled with a single quadrupole 5975C mass spectrometer Agilent Technologies, Inc.
LTQ-Orbitrap Velo Thermo Scientific
Waters NanoEquityTM UPLC system Millford, MA
250mL media bottle FisherBrand 1395-250
Waters vial Waters 186002805
Glass MS sample vial and inserts MicroSolv 9502S-WCV, 9502S-02ND
Glass HPLC vial and snap caps MicroSolv 9512C-0DCV, 9502C-10C-B
HPLC 96-well plate Agilent 5042-6454
Large glass vial 27.25x70mm FisherBrand 03-339-22K
Lyophilizer Labconco 7934021
Polished stainless steel flat head spatula Spoonula; FisherBrand 14-375-10
Kim wipes Kimberly-Clark 34721
XBridge C18, 250x4.6 mm, 5 μM with 4.6x20 mm guard column Waters 186003117, 186003064
Agilent 1100 series HPLC system Agilent Technologies G1380-90000
1.7mL centrifuge tube Sorenson 11700
Hamilton Glass Syringes, 5mL, 50µL and 250µL Hamilton 81517, 80975, 81175
Pasteur Pipettes FisherBrand 13-678-20A
Pasteur Pipette Bulbs Sigma-Aldrich Z111597
Bath Sonicator Branson 1800 Ultrasonic Cleaner
Vacuum Centrifuge Labconco Centrivap Acid-Resistant Concentrator System
MicroSpin Columns, C18 Silica The Nest Group SEM SS18V

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hultman, J., et al. Multi-omics of permafrost, active layer and thermokarst bog soil microbiomes. Nature. 521, 208-212 (2015).
  2. White, R. A. 3rd, et al. Moleculo long-read sequencing facilitates assembly and genomic binning from complex soil metagenomes. mSystems. 1, (2016).
  3. White, R. A., Callister, S. J., Moore, R. J., Baker, E. S., Jansson, J. K. The past, present and future of microbiome analyses. Nat Protoc. 11, 4-8 (2016).
  4. Ritchie, M. D., Holzinger, E. R., Li, R., Pendergrass, S. A., Kim, D. Methods of integrating data to uncover genotype-phenotype interactions. Nat Rev Genet. 16, 85-97 (2015).
  5. Jansson, J. K., Baker, E. S. A multi-omic future for microbiome studies. Nat Microbiol. 1, (2016).
  6. Domon, B., Aebersold, R. Options and considerations when selecting a quantitative proteomics strategy. Nat Biotechnol. 28, 710-721 (2010).
  7. Marx, V. Targeted proteomics. Nat Methods. 10, 19-22 (2013).
  8. Roberts, L. D., Souza, A. L., Gerszten, R. E., Clish, C. B. Targeted metabolomics. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 30, Unit 30 32 31-24 (2012).
  9. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226, 497-509 (1957).
  10. Nakayasu, E. S., et al. MPLEx: a Robust and Universal Protocol for Single-Sample Integrative Proteomic, Metabolomic, and Lipidomic Analyses. mSystems. 1, (2016).
  11. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
  12. Pomraning, K. R., et al. Multi-omics analysis reveals regulators of the response to nitrogen limitation in Yarrowia lipolytica. BMC Genomics. 17, 138 (2016).
  13. Tisoncik-Go, J., et al. Integrated Omics Analysis of Pathogenic Host Responses during Pandemic H1N1 Influenza Virus Infection: The Crucial Role of Lipid Metabolism. Cell Host Microbe. 19, 254-266 (2016).
  14. Kyle, J. E., et al. Uncovering biologically significant lipid isomers with liquid chromatography, ion mobility spectrometry and mass spectrometry. Analyst. 141, 1649-1659 (2016).
  15. Lovelace, E. S., et al. Silymarin Suppresses Cellular inflammation by inducing reparative stress signaling. J Nat Prod. 78, 1990-2000 (1990).
  16. Kim, Y. M., et al. Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms. Front Microbiol. 6, 209 (2015).
  17. Pomraning, K. R., et al. Comprehensive Metabolomic, Lipidomic and microscopic profiling of Yarrowia lipolytica during lipid accumulation identifies targets for increased lipogenesis. PLoS One. 10, e0123188 (2015).
  18. Huang, E. L., et al. The fungus gardens of leaf-cutter ants undergo a distinct physiological transition during biomass degradation. Environ Microbiol Rep. 6, 389-395 (2014).
  19. Deatherage Kaiser, B. L., et al. A Multi-Omic View of Host-Pathogen-Commensal Interplay in Salmonella-Mediated Intestinal Infection. PLoS One. 8, e67155 (2013).
  20. Kim, Y. M., et al. Salmonella modulates metabolism during growth under conditions that induce expression of virulence genes. Mol Biosyst. 9, 1522-1534 (2013).
  21. Ansong, C., et al. A multi-omic systems approach to elucidating Yersinia virulence mechanisms. Mol Biosyst. 9, 44-54 (2013).
  22. Bordbar, A., et al. Model-driven multi-omic data analysis elucidates metabolic immunomodulators of macrophage activation. Mol Syst Biol. 8, 558 (2012).
  23. Hu, Z. P., et al. Metabolomic response of human skin tissue to low dose ionizing radiation. Mol Biosyst. 8, 1979-1986 (2012).
  24. Perera, R., et al. Dengue virus infection perturbs lipid homeostasis in infected mosquito cells. PLoS Pathog. 8, e1002584 (2012).
  25. Gao, X., et al. A reversed-phase capillary ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) method for comprehensive top-down/bottom-up lipid profiling. Anal Bioanal Chem. 402, 2923-2933 (2012).
  26. Sorensen, C. M., et al. Perturbations in the lipid profile of individuals with newly diagnosed type 1 diabetes mellitus: Lipidomics analysis of a Diabetes Antibody Standardization Program sample subset. Clin Biochem. 43, 948-956 (2010).
  27. Diamond, D. L., et al. Temporal proteome and lipidome profiles reveal hepatitis C virus-associated reprogramming of hepatocellular metabolism and bioenergetics. PLoS Pathog. 6, e1000719 (2010).
  28. Alquier, T., et al. Deletion of GPR40 impairs glucose-induced insulin secretion in vivo in mice without affecting intracellular fuel metabolism in islets. Diabetes. 58, 2607-2615 (2009).
  29. Ding, J., et al. Application of the accurate mass and time tag approach in studies of the human blood lipidome. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 871, 243-252 (2008).
  30. Rasmussen, A. L., et al. Systems virology identifies a mitochondrial fatty acid oxidation enzyme, dodecenoyl coenzyme A delta isomerase, required for hepatitis C virus replication and likely pathogenesis. J Virol. 85, 11646-11654 (2011).
  31. Manza, L. L., Stamer, S. L., Ham, A. J., Codreanu, S. G., Liebler, D. C. Sample preparation and digestion for proteomic analyses using spin filters. Proteomics. 5, 1742-1745 (2005).
  32. Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat Methods. 6, 359-362 (2009).
  33. Zhou, J. Y., et al. Simple sodium dodecyl sulfate-assisted sample preparation method for LC-MS-based proteomics applications. Anal Chem. 84, 2862-2867 (2012).
  34. Anderson, J. C., et al. Decreased abundance of type III secretion system-inducing signals in Arabidopsis mkp1 enhances resistance against Pseudomonas syringae. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 6846-6851 (2014).
  35. Chourey, K., et al. Direct cellular lysis/protein extraction protocol for soil metaproteomics. J Proteome Res. 9, 6615-6622 (2010).
  36. Kim, S., Gupta, N., Pevzner, P. A. Spectral probabilities and generating functions of tandem mass spectra: a strike against decoy databases. J Proteome Res. 7, 3354-3363 (2008).
  37. Kim, S., Pevzner, P. A. MS-GF+ makes progress towards a universal database search tool for proteomics. Nat Commun. 5, 5277 (2014).
  38. Cole, J. K., et al. Phototrophic biofilm assembly in microbial-mat-derived unicyanobacterial consortia: Model systems for the study of autotroph-heterotroph interactions. Front Microbiol. 5, (2014).
  39. Isaacson, T., et al. Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues. Nat Protoc. 1, 769-774 (2006).

Tags

Kemi spørgsmålet 135 MPLEx Metaproteomics Lipidomics Metabolomics Multi-omik massespektrometri
MPLEx protokol for Multi-omic analyser af jordprøver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nicora, C. D., Burnum-Johnson, K.More

Nicora, C. D., Burnum-Johnson, K. E., Nakayasu, E. S., Casey, C. P., White III, R. A., Roy Chowdhury, T., Kyle, J. E., Kim, Y. M., Smith, R. D., Metz, T. O., Jansson, J. K., Baker, E. S. The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples. J. Vis. Exp. (135), e57343, doi:10.3791/57343 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter