Summary
Een protocol wordt gepresenteerd voor gelijktijdig metabolieten, eiwitten en lipiden extraheren uit een één bodemmonster, waardoor deelmonster bereidingstijden en multi-dienst spectrometrische analyse van monsters met een beperkte hoeveelheden inschakelen.
Abstract
De Spectrometrie van de massa (MS)-gebaseerde geïntegreerde metaproteomic, metabolomic en lipidomic (multi-dienst) studies zijn het omzetten van ons vermogen om te begrijpen en karakteriseren van microbiële gemeenschappen in milieu en biologische systemen. Deze metingen zijn zelfs inschakelen uitgebreide analyses van de microbiële gemeenschappen complexe bodem, dat de meest zijn complexe microbiële systemen bekend tot op heden. Multi-dienst analyses hebben echter monster voorbereiding uitdagingen, aangezien afzonderlijke extracties zijn meestal nodig voor elk onderzoek van de dienst, daardoor aanzienlijk versterken de voorbereidingstijd en de hoeveelheid monster nodig. Om deze beperking, is een 3-in-1-methode voor de gelijktijdige winning van metabolieten, eiwitten en lipiden (MPLEx) uit de dezelfde bodemmonster gemaakt door aanpassing van een aanpak op basis van oplosmiddel. Dit protocol MPLEx heeft bewezen om zowel eenvoudig en robuust voor vele types van de steekproef, zelfs wanneer gebruikt voor beperkte hoeveelheden van complexe bodemmonsters. De MPLEx methode ingeschakeld ook sterk de snelle multi-dienst metingen die nodig zijn voor een beter begrip van de leden van elke microbiële Gemeenschap, tijdens het evalueren van de veranderingen die plaatsvinden op biologische en ecologische verstoringen te krijgen.
Introduction
Evaluatie van bodem microbiële gemeenschappen heeft belangrijke implicaties voor het begrijpen van carbon fiets- en klimaat-verandering. Recente studies hebben echter gewezen op problemen, zoals het ontbreken van gesequenceerd genomen voor microbiota in verschillende bodemtypes en de onbekende functie van veel van de eiwitten opgespoord. Het resultaat van deze uitdagingen als gevolg van de bodem wordt van de meest complexe microbiële Gemeenschap bekend tot op heden1,2,3. Multi-dienst analyses, die resultaten van metagenomic, metatranscriptomic, metaproteomic, metabolomic en lipidomic studies combineren, werden onlangs geïmplementeerd in talrijke studies van de bodem een groter inzicht in de microben aanwezig, terwijl uitgebreide informatie over de moleculaire veranderingen die plaatsvinden als gevolg van milieu verstoringen1,4,5te verkrijgen. Een uitdaging met multi-dienst studies is dat de Spectrometrie van de massa (MS)-gebaseerde metaproteomic, metabolomic en lipidomic metingen vergen doorgaans een specifieke extractieproces voor elke dienst als MS compatibel6,7 , 8 , 9. deze precieze procedures maken de uitvoering ervan bijzonder moeilijk of niet onmogelijk wanneer slechts een beperkte hoeveelheid van het monster beschikbaar is. Deze uitdagingen hebben gevraagd ons te onderzoeken van een gelijktijdige metaboliet, eiwitten en lipiden (MPLEx) extractiemethode staat met behulp van kleinere steekproef volumes of massa's, verbetering van de nauwkeurigheid en snellere staalvoorbereiding voor alle drie analyses 10. tot op heden zijn er geen alternatieve bodem extractie procedures die al deze doelen kunnen bereiken.
Opdat de globale multi-dienst analyses van een één bodemmonster, was een organische oplosmiddelen extractie-protocol gebaseerd op chloroform, methanol en water scheidingen benutte10. Deze methode werd oorspronkelijk ontwikkeld voor totale lipide extracties9,11 en meer recentelijk is gewijzigd voor de gelijktijdige winning van metabolieten, eiwitten en lipiden uit een monster12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28,29,30, waardoor minder hoeveelheid monster en experimentele variabiliteit10. In het MPLEx protocol is chloroform niet mengbaar zijn met water, die de basis voor de triphasic chemische scheiding van monster bestanddelen in verschillende fracties vormt. De top van de waterige fase bevat daarom de hydrofiele metabolieten, gevolgd door een eiwit-schijf, waarna een lipide-laag in de bodem chloroformfase (Figuur 1). Wanneer MPLEx wordt toegepast op de meeste bodems, afvaldeeltjes hoopt zich aan de onderkant van de bemonstering buizen en kan worden verwijderd nadat alle lagen worden verzameld. Elk bodemtype kan verschillen, echter, en in zeer organische bodem zoals turf, het puin van de bodem blijft in de middenlaag en niet vallen aan de onderkant van de buis van de bemonstering. MPLEx biedt verschillende voordelen wanneer meerdere molecuul isoleren uit hetzelfde monster soorten zoals 1) kleinere hoeveelheden van het monster kunnen worden gebruikt voor multi-dienst analyses, 2) multi-dienst extracties uit de dezelfde daling van steekproef algemeen experimentele variabiliteit, en 3) grotere aantallen monsters kan veel sneller worden voorbereid voor hogere doorvoer studies10. Samen deze voordelen zijn van vitaal belang voor het verstrekken van betere meting vermogens voor de evaluatie van bodemmonsters en hun complexe microbiële gemeenschappen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Zeer natte bodems kunnen worden gelyofiliseerd voorafgaand aan de winning zonder nadeel voor de doeltreffendheid van de extractie. Natte bodem kan ook worden gebruikt maar moet worden overwogen bij toevoegen van reagentia op specifieke verhoudingen.
Opmerking: Het is aanbevolen om het gebruik van 20 g droge bodem gewicht per extractie, die moet worden verdeeld tussen twee buizen van 50 mL (maximaal 10 g bodemmonster per tube 50 mL). Extracties kunnen worden geschaald, omhoog of omlaag afhankelijk van beschikbare monster.
Opmerking: Droge bodemmonsters kunnen worden gezeefd door een 3 mm-scherm te homogeniseren en kleine wortels en stenen te verwijderen. Zeef natte bodemmonsters, niet als het monster blijven in het scherm steken zal.
1. de bodem van Lysis van de cel en extractie van metabolieten, eiwitten en lipiden (Timing ~ 1 d)
- Per 20 g bodemmonster, Weeg 10 g in twee aparte 50 mL-buizen die methanol/chloroform compatibel zijn. Worden uiterst voorzichtig zijn met de buizen gekozen, zoals chloroform meeste kunststoffen, verontreiniging van de monsters zal lekken. Gebruik glas wanneer mogelijk of plastic buizen vervaardigd uit polypropyleen of polytetrafluorethyleen (PTFE).
Opmerking: Houd de bodem op ijs en zo koel mogelijk tijdens de eerste weging en homogenisering stappen. - Voeg 10 mL chloroform-gewassen RVS en granaat kralen aan elke buis. Op het ijs, Voeg 4 mL koude ultrazuiver water (Zie Tabel van materialen voor zuivering systeem) aan elke buis (één monster split tussen twee buizen) en breng de monsters in een ijsemmer in een zuurkast.
- Met behulp van serologische Pipetteer 25 mL glas, snel toevoegen van 20 mL ijskoud 2:1 chloroform: methanol (v/v).
Let op: Chloroform: methanol heeft acute potentiële gezondheidseffecten: huid irritatie, mogelijk chemische brandwonden en irritatie voor de ademhalingswegen. Het kan van invloed zijn op de nieren, lever en hart. Draag geschikte beschermende bril, kleding en handschoenen, en altijd werken in een zuurkast. - Draai de deksels en vortex in oplossing. 2:1 choloroform:methanol helpt met het breken van de celwand van prokaryoten en ook inactiveert enzymatische activiteiten.
- Hechten indien mogelijk de buizen aan 50 mL tube vortex bijlagen en horizontaal vortex gedurende 10 minuten bij 4 ° C in een koelkast. Dan, plaats de monsters binnen een vriezer-80 ° C gedurende ~ 15 minuten om ze volledig afkoelen.
- Met behulp van een sonde ultrasoonapparaat in een zuurkast, bewerk, ultrasone de trillingen van elk monster met een 6 mm (1/4")-sonde op amplitude 60% voor 30 ten s elke op ijs.
Let op: Het is aanbevolen om een geluid af behuizing en oor bescherming tijdens het sonicating te gebruiken. Hoogspanning is aanwezig in de voedingskabel levering en hoge frequentie. Raak de zijden van de monsterruimte of onderzijde met een actieve sonde; het kan barsten of smelt het plastic. - Leg de monsters in de vriezer-80 ° C gedurende ~ 15 minuten, als sonicating kan een veel warmte genereren.
- Herhaal stap 1.5-1.7.
Opmerking: Zorg ervoor dat de monsters verblijf koud tijdens de lysis van de procedure. - Centrifugeer de monsters bij 4000 x g gedurende 5 min, 4 ° C. Op dit punt, zou het monster in de bovenste metaboliet laag, de tussenlaag van eiwit, en de onderste laag van het lipide (en resterende puin pellet) zal worden onderverdeeld. Zie Figuur 1.
- Leg de monsters op ijs in een ijsemmer en, in een zuurkast en met behulp van een 10 mL glazen serologische Pipet, verwijderen de metaboliet van de bovenste lagen van de twee buizen van 50 mL in een grote glazen ampul.
Opmerking: Voorkomen aspirating van om het even welk van de eiwit-laag in de pipet; laat een kleine laag van metaboliet indien nodig. - Lichtjes kantelen de tube 50 mL om los van de tussenlaag eiwit zodat er vrij zwevend op de onderste laag van de lipide. Met behulp van een schone RVS flat-hoofd lab spatel, zorgvuldig schep zowel van de eiwit-tussenlaag en plaats ze samen in één nieuwe tube van 50 mL.
- Met behulp van serologische Pipetteer 25 mL glas, verwijder de onderste lagen van de lipide in een grote glazen ampul.
Opmerking: Probeer te voorkomen dat aspirant gronddeeltjes; echter sommige bodem puin en deeltjes streefde samen met de lipiden zal worden verwijderd op een later tijdstip. - Plaats ademend membraan over de bovenkant van de metaboliet en lipide glazen flesjes en droog in een vacuüm concentrator tot droogte (lipiden ~ 4-5 h, metabolieten overnachting).
- Het monsterbuisje eiwit en de resterende puin pellet buizen, Voeg 20 mL ijskoud methanol aan elk en vortex. Dit wordt gedaan aan de puin pellets te spoelen uit chloroform voordat u probeert te solubilize alle mogelijke resterende eiwit uit het puin vóór het gooien.
- Centrifugeer het puin pellets en eiwit interlayer bij 4000 x g gedurende 5 min, 4 ° C, dan de methanol in een gevaarlijk afval container in een zuurkast decanteren.
- Bevriezen van de eiwitten en puin pellets in vloeibare stikstof en drogen in een lyophilizer (met een verzamelaar temperatuur staat-105 ° C als gevolg van methanol met een zeer laag vriespunt van-98 ° C) ~ 2 uren.
Opmerking: Niet overdreven droog op de pellets, als zij moeilijker zullen te solubilize. - Voeg 10 mL van eiwit solubilisatie buffer (4% SDS, 100mM DTT (DL-dithiothreitol) in 50mM tris buffer, pH 8.0; Zie Aanvullende reagens Set-up) naar de eiwit interlayer buis en 20 mL aan elk van de pellets puin.
Let op: SDS acute toxiciteit veroorzaakt en is licht ontvlambaar. Het is een huid, ogen en luchtwegen irriterend. Draag handschoenen en veiligheidsbril. - In de zuurkast, bewerk sonde zijn ultrasone trillingen ten de monsters bij 20% amplitude voor 30 s om hen te brengen in de oplossing. Vortex gedurende 2 minuten.
- Leg het eiwit interlayer monster in een lab buis rotator gedurende 30 minuten op 300 rpm, 50 ° C, om de solubilize van het eiwit.
- Horizontaal vortex de puin monsters voor een extra 10 min lyse van eventuele resterende intact cellen, vervolgens draaien met de interlayer EiwitSteekproeven voor de resterende 20 min.
- Centrifugeer alle van de monsters bij 4.500 x g gedurende 10 min, kamertemperatuur (RT), en het supernatant van elke buis per monster in twee 50 mL tubes verzamelen.
- Voeg 10 mL solubilisatie buffer naar de eiwit interlayer pellet, dan bewerk ultrasone trillingen ten en vortex terug in de oplossing en centrifuge als voorheen.
- Combineer het supernatant in de twee 50 mL tubes even samen en centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 10 min, 4 ° C, in een vaste hoek emmer rotor.
Opmerking: Een definitieve centrifugeren is noodzakelijk om buitensporige contaminerende humic stoffen. - Decanteren het supernatant in twee 50 mL buizen zodat er 30 mL in elk. Vervolgens met behulp van een 10 mL glazen serologische Pipet, 7,5 mL TCA (trichloorazijnzuur) toevoegen aan elke buis. Vortex in oplossing. Dit maakt 20% TCA in elk 30 mL monster (aanpassen),
Let op: TCA is giftig, bijtend en mei huid brandwonden veroorzaken. Draag handschoenen en veiligheidsbril. - Leg de monsters in een vriezer van-20 ° C gedurende 2 uur om te overnachten.
Opmerking: Eiwitten zal gewoonlijk neerslag binnen 1 uur maar kunnen links overnachting (tot 18u).
Opmerking: Laat niet de extractie van de TCA gaan langer dan 18 h als gevolg van eventuele zure hydrolyse van het eiwit. Indien het monster is bevroren, ontdooien het op het ijs; laat niet het monster opwarmen verleden dooi. - Om de pellet de neergeslagen eiwitten, Centrifugeer het monster bij 4.500 x g gedurende 10 min, 4 ° C en de bovendrijvende vloeistof decanteren in afval.
- Voeg 10 mL voor 100% ijskoude aceton aan elk eiwit pellet, vortex en combineren zoals pellets in één buis.
- Centrifugeer de buis met de gecombineerde pellet (met behulp van een evenwicht), en vervolgens de bovendrijvende vloeistof decanteren in afval.
Let op: Aceton kan luchtwegen en huid- en oogirritatie veroorzaken, en is een ontvlambare vloeistof en damp. Draag veiligheidsbril, handschoenen en een laboratoriumjas, werken in een zuurkast. - Wassen van de pellet tweemaal met 1,5 mL aceton en ten slotte over te dragen aan een 2 mL-buis voor de uiteindelijke spin bij 10.000 x g gedurende 5 min.
- De bovendrijvende vloeistof decanteren in afval en de pellet te drogen omgekeerde toestaan op een papieren doekje in een zuurkast voor ~ 20 min of onder een stikstof-stroom totdat de pellet iets begint te kraken.
- Voeg 100-200 µL van het eiwit solubilisatie buffer, afhankelijk van de grootte van de pellet.
Opmerking: Houd de omvang van de buffer van de solubilisatie toegevoegd aan het monster zo laag mogelijk. Latere Filter Aided Sample voorbereiding (FASP) kan alleen gebruik maken van maximaal 50 μl van ontbindend monster per kolom; een moet meer worden opgesplitst in meerdere FASP kolommen. - Bewerk ultrasone trillingen ten en vortex de pellet in oplossing. Merk op dat de steekproef kan worden viskeuze als gevolg van humic stoffen Precipiterend samen met het eiwit, dat zal worden verwijderd met een latere centrifugeren.
- Schud het monster in een broedstoof/shaker gedurende 30 minuten bij 300 omwentelingen per minuut, 40 ° C, om de solubilize van de proteïne in oplossing en gaat u verder met de vertering van de eiwitten.
- Module bevriezen het monster in vloeibare stikstof en winkel in een vriezer-80 ° C tot klaar voor de vertering van de eiwitten.
2. lipide voorbereiding (Timing ~ 20 min)
- Zodra de lipide monsters droog zijn, voeg 200 μL van 2:1 chloroform: methanol aan de flacon, vortex in oplossing en overdracht in een polypropyleen buis van 1,5 mL, voeg een extra 200 l aan het glas ampul, vortex en Pipetteer de resterende lipiden en overdracht aan de buis.
- Centrifugeer het puin uit het monster bij 12.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Breng de bovendrijvende substantie in een glazen lipide ampul en opslag bij-20 ° C tot LC-MS/MS analyse (extra details voor LC-MS/MS in Aanvullende methoden).
- Indien de monsters niet kunnen worden geanalyseerd onmiddellijk na de bereiding, de lipiden hoeven te worden opgeslagen in oplosmiddel bij-20 ° C om oxidatie en degradatie te voorkomen.
3. metaboliet voorbereiding en bewerking (Timing ~ 5 h)
- Op de dag na extractie, de metaboliet monsters uit de snelheid Vac verwijderen en bewaren van droge bij-20 ° C tot klaar voor bewerking en analyse op de GC. Zoniet wordt de metabolieten uitgevoerd op een GC, vervolgens bereiden ze met behulp van het juiste protocol voor het instrument.
- Onmiddellijk voorafgaand aan het Derivatiserings van de metabolieten voor analyse op de GC, overbrengt vanaf de grote glazen flesjes door 200 μL van methanol, vortexing en toe te voegen aan een polypropyleen tube van 1,5 mL toe te voegen. Eenmaal herhaald.
- Centrifugeer de buis bij 12.000 x g gedurende 10 min, 4 ° C. Breng het supernatant in kleine glazen flesjes, voeg een ademend membraan naar de top, en volledig droog in een snelheid-Vac.
- Derivatize van de metabolieten door 20 µL van methoxyamine oplossing toe te voegen aan de flacon van de steekproef en de vortex voor 30 s op een vortexer op middellange snelheid.
Let op: Methoxyamine hydrochloride veroorzaakt ernstige brandwonden en ernstige schade aan de ogen, kan overgevoeligheid veroorzaken bij contact met de huid. Draag veiligheidsbril, handschoenen en laboratoriumjas, en werken in een zuurkast. - Gebruik een ultrasoonapparaat bad om dat het monster volledig is opgelost.
- Incubeer het monster in een broedmachine met een condensatie preventie deksel onderhouden bij 37 ° C gedurende 1 h 30 min met 1000 rpm schudden.
- Omkeren van de flacon één keer te mengen van de monsters met verkorte druppels aan de oppervlakte van het GLB. Het monster naar beneden draaien op 1.000 x g voor 1 min, RT.
- Silyl uitvoeren door toevoeging van 80 µL (met behulp van een injectiespuit) van N-Methyl - N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide met 1% trimethylchlorosilane. Vortex voor 10s.
Let op: MSTFA + 1% industrie kunnen veroorzaken huidcorrosie, ernstige oogbeschadigingen en specifieke doelgroep orgaantoxiciteit, en is een ontvlambare vloeistof en damp. Draag veiligheidsbril, handschoenen en laboratoriumjas, en werken in een zuurkast. - Incubeer het monster in een broedmachine met een condensatie preventie deksel onderhouden bij 37 ° C gedurende 30 minuten met 1000 rpm schudden.
- Omkeren van de flacon één keer te mengen van de monsters met verkorte druppels aan de oppervlakte van het GLB.
- Het monster spin down voor 5 min op 2.000 x g, RT.
- Breng de gereageerde oplossing in flesjes geschikt is voor de GC-MS-analyse.
4. eiwitten spijsvertering (Timing ~ 1 d)
- Centrifugeer het monster bij 15.000 x g gedurende 5 min, RT, om puin pellet.
- Uitvoeren van Filter-Aided--bereiding van de monsters (FASP) voor de spijsvertering met behulp van FASP kits (Zie Tabel van materialen) volgende gewijzigd31,32van de instructies van de fabrikant:
- Voeg 400 μL van de 8 M ureum buffer in een FASP kolom (500 μL 30K MWCO spin filter).
- Zodra het monster klaar is met centrifugeren, Pipetteer af het supernatant (gooi de pellet) en maximaal 50 μl van het monster aan de 400 μL van 8 M ureum in de kolom toevoegen.
Opmerking: Voeg slechts maximaal 50 μl van monster per kolom. Als er meer dan 50 μl van monster, meerdere kolommen gebruiken en combineren de peptiden na vertering. Het is het beste te laten dit volume zo laag mogelijk (30 µL is ideaal) met het oog op de FASP kolom verwijdert alle van de SDO die dramatisch met massa spec analyse interfereren kan. - Plaats van de kolom in de opgenomen 1,5 mL-buis en Centrifugeer het monster bij 14.000 x g gedurende 30 min, RT.
- Verwijder de doorstroming in afval en 400 μL van 8 M ureum toevoegen aan de kolom en Centrifugeer nogmaals.
- Herhaal voorgaande stappen nog een keer voor een totaal van 3 ureum gespoeld.
Opmerking: Zorg ervoor dat het monster gaat dicht bij droogte op de kolom als er meer dan ~ 30 µL overblijft op het filter na elke spin, blijven centrifugeren. - Voeg 400 l 50 mM NH4HCO3 en centrifuge bij 14.000 x g gedurende 20 min, verwijderen de afvalstoffen en eenmaal herhaald.
- De kolommen overbrengen in een centrifugebuis schone 1,5 mL.
- Voeg 75 μL van trypsine spijsvertering buffer toe aan de kolommen en Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 uur in een broedmachine met een deksel preventie condensatie op 750 rpm.
- Voeg toe 40 µL van 50 mM NH4HCO3 aan de kolommen.
- Centrifugeer het monster bij 14.000 x g gedurende 15 minuten staan voor het verzamelen van de peptiden in de buis terwijl de ultrahoog moleculair gewicht verontreinigingen op de top van de kolom.
- 40 μL van 50mM NH4HCO3 aan de kolom en de centrifuge opnieuw toevoegen.
- Negeren van de kolom, droge beneden de peptiden in de buis in een snelheid Vac ~ 30 µL en BCA assay (Bicinchoninic zuur eiwit assay kit; Zie Tabel van materialen) de peptiden.
- Optioneel, voer een opschonen stap als SDS vermoed wordt (zichtbaar bubbels)33. Daarna moet een vaste fase extractie worden gedaan als u deze optie kiest. Gedetailleerde informatie over deze methode opruimen is beschikbaar in de Aanvullende methoden.
- Verdun het ingewogen analysemateriaal MS of eventueel doorgaan naar HPLC fractionering (volgende twee stappen).
- Als u wilt fractionate, Verdun monsters met een volume van 400 µL met 10 mM ammonium formate buffer (pH 10.0).
- Oplossen in een C18-kolom (Zie Tabel van materialen) door te scheiden op 0,5 mL/min met behulp van een HPLC-systeem met mobiele fasen (A) 10 mM ammonium formate, pH 10.0 en (B) 10 mM ammonium formate, pH 10.0/acetonitril (10:90).
- Pas de gradiënt van op 100% A naar 95% A over de eerste 10 min, 95% A naar 65% A over min 10 tot 70, 65% A 30% a over min 70 tot 85, zorg ervoor dat u 30% A over min 85 tot 95.
- Opnieuw equilibreer met 100% A over min 95 tot 105 en houd op 100% A tot 120 min.
- Verzamelen van breuken elke 1,25 min (96 fracties over het hele verloop) en ten slotte combineren elke rij voor een totaal van 12 monsters of elke andere rij voor 24 monsters (elk met n = 8 of n = 4 breuken gebundeld).
- Alle breuken onder vacuüm droog en 15 µL ultrazuiver water toevoegen aan elk voor opslag bij-20 ° C tot LC-MS/MS-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wanneer het MPLEx-protocol is gebruikt voor het extraheren van moleculen uit Kansas inheemse prairie bodem (een Mollisol-bodem), de drievoudige analyses resultaten opgeleverd voor 3376 peptiden, 105 lipiden en 102 polar metabolieten (alle unieke id's). Terwijl het MPLEx protocol gevestigde voor algemene extractie van lipiden en metabolieten12,13,14,15,16,17,18 geweest ,19,20,21,22,23,24,25,26,27 ,28,29,30,34, de vergelijking met gemeenschappelijk bodem eiwit extractiemethoden voor Microbiële analyses, zoals bodem eiwit extractie kits (Zie tabel van Materialen) en SDS (natrium dodecyl sulfaat) extracties35, is hier verder geëvalueerd. Om te beoordelen deze technieken, werden Kansas inheemse prairie bodem eiwitten geëxtraheerd met elke benadering en rechtstreeks met reversed-phase LC-MS/MS met behulp van een UPLC systeem in combinatie met een hybride vierpolige/Orbitrap massaspectrometer geanalyseerd. Gedetailleerde informatie over de methodeparameters zijn beschikbaar in de Aanvullende methoden. De resulterende experimentele peptide MS/MS spectra van elke extractie aanpak werden vergeleken met voorspelde peptide sequenties van de vertegenwoordiger Kansas inheemse prairie metagenome2 met behulp van een strenge MS-GF + kans op spectrale cutoff van 1 x 10 -10 36 , 37 en een massale fout cutoff van minder dan 5 ppm. Opgemerkt moet worden dat de analyten gewonnen uit de bodem met behulp van het protocol van MPLEx geschikt voor MS gebaseerde studies en andere analytische technieken zijn. Wanneer in eerste instantie vergelijken drie wordt gerepliceerd van de bekende MoBio en SDS, slechts 12% van de peptiden overlappen tussen de twee technieken tonen de complexiteit van de microbiële Gemeenschap en verschillende extractie effecten (Figuur 2). Bij vergelijking van MPLEx met MoBio en SDS extracten, werden ~ 38% van de peptiden waargenomen met behulp van de methode MPLEx ook ontdekt bij het gebruik van de SDS en/of MoBio extracties (Figuur 2). Gezien het aantal soorten in de Kansas bodem bacteriële Gemeenschap en zijn metagenome2, de overlapping van peptide identificaties is redelijk en als gevolg van de complexiteit, de combinatie van de benaderingen extracten meer peptiden dan elk alleen 35. ook, aangezien deze monsters waren unfractionated en geanalyseerd door slechts 1-dimensionale LC-MS/MS, de complexiteit van de extreem hoge monster werd mogelijk veroorzaakt sommige bias in detectie als gevolg van verschillende peptide concentraties geëxtraheerd door elke benadering. Het MPLEx-protocol ook op andere grondsoorten zoals permafrost en wetlands is toegepast, en in alle gevallen de voorlopige proteomic resultaten zijn van vergelijkbare kwaliteit met die van de Kansas inheemse prairie bodem hier gepresenteerde gegevens.
De brede toepasbaarheid van de benadering van de MPLEx, is eerder geëvalueerd met behulp van een gevarieerde set van monsters, met inbegrip van de archaeon Sulfolobus acidocaldarius, een unicyanobacterial consortium38, muis cortex hersenweefsel, menselijke urine, en bladeren van Arabidopsis thaliana (Figuur 2)10. Voor alle monsters behalve A.thalianazijn ureum extracties de meest voorkomende manier om uittreksel van eiwitten, zodat ze werden gebruikt als de controle-aanpak voor evaluatie. De A. thaliana MPLEx resultaten werden vergeleken met een extractie uitgevoerd met trichloorazijnzuur (TCA) omdat de plant bladeren zijn rijk aan fenolische verbindingen die moeten worden verwijderd voordat MS analyses39. In alle gevallen is het aantal eiwitten dat vanuit de MPLEx-methode wordt waargenomen was vergelijkbaar met dat voor de besturingselementen10, met vermelding van het nut ervan voor veel verschillende monster typen. Ook waren er geen trends die zijn gekoppeld aan de specifieke proteïne-klassen in de steekproef allerlei (inclusief grond) hebt uitgepakt. De brede toepasbaarheid van MPLEx tot talrijke biologische en ecologische systemen maakt het dus een veelbelovende aanpak.
Figuur 1. Een schema waarin het MPLEx-proces, in welke metabolieten, eiwitten en lipiden worden gelijktijdig uit de dezelfde bodemmonster geëxtraheerd voor MS analyses. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Venn-diagrammen illustreren de peptide overlapping voor een gevarieerde set van monsters geëxtraheerd met behulp van MPLEx en een standaard op basis van ureum eiwit-extractiemethode normaal uitgevoerd. Gegevens uit MPLEx extractie van de archaeon S.acidocaldarius, het unicyanobacterial consortium, menselijke urine, muis hersenen cortex en A.thaliana plant laat aangepast van Nakayasu, E. S. et al. 201610. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het is belangrijk op te merken dat niet alle laboratoria dezelfde beschikbare apparatuur hebben zal, zodat bepaalde methoden, bijvoorbeeld de lysis stap, kunnen worden aangepast. We gebruiken hier vortexing en sonicating, maar het gebruik van een groot 50 mL kraal beater zou werken. Als een lyophilizer met een verzamelaar temperatuur staat-105 ° C niet beschikbaar is, kunnen dan monsters worden gedroogd onder een stikstof-stream. Ook bodemtypes variëren sterk en zand, silt, klei, Veen en leem (enz.) kunnen opnemen, en zij kunnen ook variëren, afhankelijk van de pH, zoutgehalte en organisch materiaal rijkdom. Elk van deze afwijkingen kan gevolgen hebben voor het protocol, dus het is belangrijk om flexibel en aan te passen wanneer nodig. Het is echter cruciaal, dat de verhoudingen en percentages hetzelfde blijven.
Het MPLEx-protocol blijkt veelbelovend voor toepassing in talrijke biologische en ecologische systemen en de mogelijkheid om multi-dienst analyses van de bodem microbiële gemeenschappen. Vorige vergelijkingen van MPLEx aan andere protocollen van de extractie voor diverse systemen geïllustreerd een hoge mate van peptide overlapping10. Echter waargenomen een beperking was dat MPLEx niet die van toepassing zijn aan bloedplasma-eiwitten moeten worden uitgeput. In deze gevallen, waren de neergeslagen eiwitten niet goed herkend door de antistoffen in de kolommen van de immunodepletion die nodig zijn voor de brede dekking van het plasma Proteoom. Daarom moeten meer standaard extractie benaderingen worden gebruikt onder deze omstandigheden. Een extra beperking genoteerd voor de aanpak van de extractie van MPLex is dat het niet intracellulaire en extracellulaire proteïne onderscheiden doet, maar dit voor alle andere bodem EiwitProtocollen van de extractie ook geldt.
In dit manuscript, MPLEx resultaten opgeleverd voor 3376 peptiden, 105 lipiden en 102 polar metabolieten in Kansas inheemse prairie bodem met behulp van de methoden van het extractie en analyse beschreven in de sectie protocol. Betere overlapping werd waargenomen tussen de peptiden uitgepakt in de controle- en MPLEx benaderingen van individuele systemen in vergelijking met de bodem microbiële Gemeenschap (Figuur 2). Dit is niet een beperking, maar een gevolg van het werken met de uiterst ingewikkelde bodem microbiële gemeenschappen. Deze resultaten worden verder genoteerd, zoals de bekende bodem extractie technieken van SDS en MoBio deed niet goed overlappen bodem hetzij als gevolg van de grote diversiteit en moeilijkheden uitpakken eiwitten even. Interessant, het MPLEx-protocol toegestaan van de identificatie van meer totale peptiden dan SDS of MoBio en ook gedetecteerd extra onderdelen niet gezien in de analyse.
Deze opmerkingen maken MPLEx een veelbelovende techniek voor het werken met kleine steekproeven maten, vermindering van de totale multi-dienst experimentele variabiliteit en vermindering van de steekproef voorbereidingstijd. De voordelen mogelijk met MPLEx kijken zodat de mogelijkheden van de multi-dienst en voor grootschalige microbiële Gemeenschap studies voorgeschreven analyses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
De auteurs bedank Nathan Johnson voor zijn hulp bij de voorbereiding van de cijfers. Dit onderzoek werd gesteund door de Pan-omics-programma dat wordt gefinancierd door het Amerikaanse Department of Energy Office van biologische en milieuonderzoek (Genomic Science Program), de Microbiomes in overgang (MinT) laboratorium gericht onderzoek ontwikkeling Initiatief op de Pacific Northwest National Laboratory, evenals de nationale instituten van gezondheid National Institute of Environmental Health Sciences (R01 ES022190) en NIH (P42 ES027704). KEBJ bedank R21 HD084788 voor financiële steun aan de ontwikkeling en validering van nieuwe multi-dienst extractie technieken. Dit werk werd uitgevoerd in de W. R. Wiley milieu Molecular Sciences Laboratory (EMSL), een faciliteit nationale wetenschappelijke gebruiker DOE op de Pacific Northwest National Laboratory (PNNL). PNNL is een multi programma nationaal laboratorium Exploitatiedoor Battelle voor het DOE onder Contract DE-AC06-76RL01830.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | Stored at -20°C !Caution chloroform has acute potential health effects, skin irritation and possible chemical burns, irritation to the respiratory system, may affect the kidneys, liver, heart. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Stored at -20°C !Caution Methanol may cause respiratory tract, skin and eye irritation, may damage the nerves, kidneys and liver. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Purified water from Millipore | Milli-Q | Water purification system. | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L6026 | !Caution SDS causes acute toxicity and is flammable. It is a skin, eye and airway irritant. Wear gloves and safety glasses. |
| Soil protein extraction kit | MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen | 30000-20 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| 1M Trizma HCL | Sigma-Aldrich | T2694 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T0699 | !Caution TCA is caustic, toxic and may cause skin burns. Wear gloves and safety glasses. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | Stored at -20°C !Caution Acetone may cause respiratory tract and skin and eye irritation. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses gloves and a lab coat, work in a fume hood. |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | !Caution Urea is an eye and skin irritant, use gloves and safety glasses |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830 | |
| Trypsin | Promega | V528A | 20µg vials |
| Bicinchoninic acid protein assay kit | Pierce | 23227 | |
| Ammonium Formate | Sigma-Aldrich | 09735 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | !Caution Acetonitrile is a skin and eye irritant. Highly flammable. Wear gloves and safety glasses. Work in a fume hood. |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | !Caution TFA is extremely hazardous in case of skin contact, eye contact, ingestion and inhalation. May produce tissue damage particularly on mucous membranes of eyes, mouth and respiratory tract. Skin contact may produce burns. Wear gloves, lab coat, safety glasses and work in a fume hood. |
| Methoxyamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 226904 | !Caution Methoxyamine hydrochloride causes severe burns and serious damage to eyes, may cause sensitization by skin contact. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | !Caution Pyridine can cause skin and eye irritation, central nervous system depression. Vapor may cause flash fire. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trimethylchlorosilane | Sigma-Aldrich | 69478 | !Caution MSTFA + 1% TMCS can cause skin corrosion, serious eye damage and specific target organ toxicity. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Milli-Q water purification system | Millipore | model MPGP04001 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Probe sonicator | FisherBrand | model FB505 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | model 5810R | |
| 50mL tube swinging bucket rotor | Eppendorf | A-4-44 | |
| 50mL fixed angle rotor | Eppendorf | FA-45-6-30 | |
| Balance | OHAUS | model V22PWE150IT | |
| Serological pipette controller | Eppendorf | 12-654-100 | |
| 10mL, 25mL glass serological pipettes | FisherBrand | 13-678-27F, 13-678-36D | |
| Thermomixer with Thermotop | Eppendorf | 5382000015, 5308000003 | |
| 0.9 – 2.0 mm blend stainless steel beads | NextAdvance | SSB14B | |
| 0.15 mm garnet beads | MoBio | 13122-500 | |
| Magnetic stir plate | FisherBrand | 11-100-16SH | |
| Magnetic stir bar | FisherBrand | 14512130 | |
| pH paper strips, pH range 0–14 | FisherBrand | M95903 | |
| 15mL, 50mL conical polypropylene centrifuge tube | Genesee Scientific | 21-103 21-108 | chloroform compatible |
| 50mL vortex attachment | MoBio | 13000-V1-50 | |
| Ice bucket | FisherBrand | 02-591-44 | |
| 27.25x70mm glass vials | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Breathe Easier plate membranes | Midwest Scientific | BERM-2000 | |
| Alcohol wipes | Diversified Biotech | BPWP-1000 | |
| Heater shaker incubator | Benchmark, Incu-Shaker Mini | ||
| Analog rotisserie tube rotator | SoCal BioMed, LLC | 82422001 | |
| Filter-Aided-Sample-Prep kit | FASP; Expedeon | 44250 | |
| Microplate reader | Biotek, EPOCH | ||
| -20 Degree Celsius Freezer | Fisher | 13986149 | |
| -80 Degree Celsius Freezer | Stirling Ultracold | SU78OUE | |
| Q-Exactive ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Agilent 7890A gas chromatograph coupled with a single quadrupole 5975C mass spectrometer | Agilent Technologies, Inc. | ||
| LTQ-Orbitrap Velo | Thermo Scientific | ||
| Waters NanoEquityTM UPLC system | Millford, MA | ||
| 250mL media bottle | FisherBrand | 1395-250 | |
| Waters vial | Waters | 186002805 | |
| Glass MS sample vial and inserts | MicroSolv | 9502S-WCV, 9502S-02ND | |
| Glass HPLC vial and snap caps | MicroSolv | 9512C-0DCV, 9502C-10C-B | |
| HPLC 96-well plate | Agilent | 5042-6454 | |
| Large glass vial 27.25x70mm | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Lyophilizer | Labconco | 7934021 | |
| Polished stainless steel flat head spatula | Spoonula; FisherBrand | 14-375-10 | |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 34721 | |
| XBridge C18, 250x4.6 mm, 5 μM with 4.6x20 mm guard column | Waters | 186003117, 186003064 | |
| Agilent 1100 series HPLC system | Agilent Technologies | G1380-90000 | |
| 1.7mL centrifuge tube | Sorenson | 11700 | |
| Hamilton Glass Syringes, 5mL, 50µL and 250µL | Hamilton | 81517, 80975, 81175 | |
| Pasteur Pipettes | FisherBrand | 13-678-20A | |
| Pasteur Pipette Bulbs | Sigma-Aldrich | Z111597 | |
| Bath Sonicator | Branson 1800 Ultrasonic Cleaner | ||
| Vacuum Centrifuge | Labconco Centrivap Acid-Resistant Concentrator System | ||
| MicroSpin Columns, C18 Silica | The Nest Group | SEM SS18V |
References
- Hultman, J., et al. Multi-omics of permafrost, active layer and thermokarst bog soil microbiomes. Nature. 521, 208-212 (2015).
- White, R. A. 3rd, et al. Moleculo long-read sequencing facilitates assembly and genomic binning from complex soil metagenomes. mSystems. 1, (2016).
- White, R. A., Callister, S. J., Moore, R. J., Baker, E. S., Jansson, J. K. The past, present and future of microbiome analyses. Nat Protoc. 11, 4-8 (2016).
- Ritchie, M. D., Holzinger, E. R., Li, R., Pendergrass, S. A., Kim, D. Methods of integrating data to uncover genotype-phenotype interactions. Nat Rev Genet. 16, 85-97 (2015).
- Jansson, J. K., Baker, E. S. A multi-omic future for microbiome studies. Nat Microbiol. 1, (2016).
- Domon, B., Aebersold, R. Options and considerations when selecting a quantitative proteomics strategy. Nat Biotechnol. 28, 710-721 (2010).
- Marx, V. Targeted proteomics. Nat Methods. 10, 19-22 (2013).
- Roberts, L. D., Souza, A. L., Gerszten, R. E., Clish, C. B. Targeted metabolomics. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 30, Unit 30 32 31-24 (2012).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226, 497-509 (1957).
- Nakayasu, E. S., et al. MPLEx: a Robust and Universal Protocol for Single-Sample Integrative Proteomic, Metabolomic, and Lipidomic Analyses. mSystems. 1, (2016).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Pomraning, K. R., et al. Multi-omics analysis reveals regulators of the response to nitrogen limitation in Yarrowia lipolytica. BMC Genomics. 17, 138 (2016).
- Tisoncik-Go, J., et al. Integrated Omics Analysis of Pathogenic Host Responses during Pandemic H1N1 Influenza Virus Infection: The Crucial Role of Lipid Metabolism. Cell Host Microbe. 19, 254-266 (2016).
- Kyle, J. E., et al. Uncovering biologically significant lipid isomers with liquid chromatography, ion mobility spectrometry and mass spectrometry. Analyst. 141, 1649-1659 (2016).
- Lovelace, E. S., et al. Silymarin Suppresses Cellular inflammation by inducing reparative stress signaling. J Nat Prod. 78, 1990-2000 (1990).
- Kim, Y. M., et al. Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms. Front Microbiol. 6, 209 (2015).
- Pomraning, K. R., et al. Comprehensive Metabolomic, Lipidomic and microscopic profiling of Yarrowia lipolytica during lipid accumulation identifies targets for increased lipogenesis. PLoS One. 10, e0123188 (2015).
- Huang, E. L., et al. The fungus gardens of leaf-cutter ants undergo a distinct physiological transition during biomass degradation. Environ Microbiol Rep. 6, 389-395 (2014).
- Deatherage Kaiser, B. L., et al. A Multi-Omic View of Host-Pathogen-Commensal Interplay in Salmonella-Mediated Intestinal Infection. PLoS One. 8, e67155 (2013).
- Kim, Y. M., et al. Salmonella modulates metabolism during growth under conditions that induce expression of virulence genes. Mol Biosyst. 9, 1522-1534 (2013).
- Ansong, C., et al. A multi-omic systems approach to elucidating Yersinia virulence mechanisms. Mol Biosyst. 9, 44-54 (2013).
- Bordbar, A., et al. Model-driven multi-omic data analysis elucidates metabolic immunomodulators of macrophage activation. Mol Syst Biol. 8, 558 (2012).
- Hu, Z. P., et al. Metabolomic response of human skin tissue to low dose ionizing radiation. Mol Biosyst. 8, 1979-1986 (2012).
- Perera, R., et al. Dengue virus infection perturbs lipid homeostasis in infected mosquito cells. PLoS Pathog. 8, e1002584 (2012).
- Gao, X., et al. A reversed-phase capillary ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) method for comprehensive top-down/bottom-up lipid profiling. Anal Bioanal Chem. 402, 2923-2933 (2012).
- Sorensen, C. M., et al. Perturbations in the lipid profile of individuals with newly diagnosed type 1 diabetes mellitus: Lipidomics analysis of a Diabetes Antibody Standardization Program sample subset. Clin Biochem. 43, 948-956 (2010).
- Diamond, D. L., et al. Temporal proteome and lipidome profiles reveal hepatitis C virus-associated reprogramming of hepatocellular metabolism and bioenergetics. PLoS Pathog. 6, e1000719 (2010).
- Alquier, T., et al. Deletion of GPR40 impairs glucose-induced insulin secretion in vivo in mice without affecting intracellular fuel metabolism in islets. Diabetes. 58, 2607-2615 (2009).
- Ding, J., et al. Application of the accurate mass and time tag approach in studies of the human blood lipidome. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 871, 243-252 (2008).
- Rasmussen, A. L., et al. Systems virology identifies a mitochondrial fatty acid oxidation enzyme, dodecenoyl coenzyme A delta isomerase, required for hepatitis C virus replication and likely pathogenesis. J Virol. 85, 11646-11654 (2011).
- Manza, L. L., Stamer, S. L., Ham, A. J., Codreanu, S. G., Liebler, D. C. Sample preparation and digestion for proteomic analyses using spin filters. Proteomics. 5, 1742-1745 (2005).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat Methods. 6, 359-362 (2009).
- Zhou, J. Y., et al. Simple sodium dodecyl sulfate-assisted sample preparation method for LC-MS-based proteomics applications. Anal Chem. 84, 2862-2867 (2012).
- Anderson, J. C., et al. Decreased abundance of type III secretion system-inducing signals in Arabidopsis mkp1 enhances resistance against Pseudomonas syringae. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 6846-6851 (2014).
- Chourey, K., et al. Direct cellular lysis/protein extraction protocol for soil metaproteomics. J Proteome Res. 9, 6615-6622 (2010).
- Kim, S., Gupta, N., Pevzner, P. A. Spectral probabilities and generating functions of tandem mass spectra: a strike against decoy databases. J Proteome Res. 7, 3354-3363 (2008).
- Kim, S., Pevzner, P. A. MS-GF+ makes progress towards a universal database search tool for proteomics. Nat Commun. 5, 5277 (2014).
- Cole, J. K., et al. Phototrophic biofilm assembly in microbial-mat-derived unicyanobacterial consortia: Model systems for the study of autotroph-heterotroph interactions. Front Microbiol. 5, (2014).
- Isaacson, T., et al. Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues. Nat Protoc. 1, 769-774 (2006).
