Summary
Um protocolo é apresentado para simultaneamente extraindo metabolitos, proteínas e lipídios de uma amostra de solo único, permitindo tempos de preparação de amostra reduzida e multi-omic análises de espectrometria de massa das amostras com quantidades limitadas.
Abstract
Espectrometria de massa (MS)-com base metaproteomic integrado, metabolómica e estudos lipidomic (multi-omic) estão transformando nossa capacidade de compreender e caracterizar as comunidades microbianas em sistemas ambientais e biológicos. Estas medições são mesmo permitindo análises reforçadas das comunidades microbianas complexo solo, que são os mais complexos sistemas microbianos conhecidos até à data. Multi-omic análises, no entanto, têm desafios de preparação de amostra, desde extrações separadas são normalmente necessários para cada estudo omic, amplificando assim consideravelmente o tempo de preparação e a quantidade de amostra necessária. Para resolver essa limitação, um método de 3-em-1 para a extração simultânea de metabolitos, proteínas e lipídios (mplexas) da mesma amostra de solo foi criado através da adaptação de uma abordagem baseada em solvente. Este protocolo de mplexas tem provado para ser simples e robusto para muitos tipos de amostra, mesmo quando utilizado para quantidades limitadas de amostras complexas. O método mplexas habilitado também extremamente rápida multi-omic medições necessárias para obter uma melhor compreensão dos membros de cada comunidade microbiana, ao avaliar as mudanças que ocorrem após perturbações biológicas e ambientais.
Introduction
Avaliar as comunidades microbianas do solo tem implicações importantes para a compreensão de carbono ciclismo e mudança climática. Estudos recentes no entanto evidenciaram dificuldades, como a falta de genomas sequenciadas para microbiota em vários tipos de solo e a função desconhecida de muitas das proteínas detectadas. Estes resultam de desafios devido ao solo, sendo a mais complexa comunidade microbiana conhecida até à data de1,2,3. Análises multi-omic, que combinam os resultados de estudos de lipidomic, metatranscriptomic, metaproteomic, metabolómica e metagenomic, recentemente têm sido implementadas em numerosos estudos de solo, para uma maior compreensão os micróbios presentes, enquanto obter informações completas sobre as alterações moleculares que ocorrem devido a perturbações ambientais1,4,5. Um desafio com multi-omic estudos que é a espectrometria de massa (MS)-medições com base de metaproteomic, lipidomic e metabolómica normalmente requerem um processo de extração específico para cada omic ser MS compatível6,7 , 8 , 9. estes procedimentos precisos fazem sua implementação extremamente difícil ou impossível quando somente uma quantidade limitada de amostra está disponível. Esses desafios têm nos levou a investigar uma simultânea metabólito, proteínas e lipídios (mplexas) método da extração capaz de usando pequenos volumes de amostra ou massas, melhorar a precisão e a realização de preparações de amostra mais rápidas para todos os três análises 10. até à data, não existem procedimentos alternativos solo extração que podem atingir todos esses objetivos.
Para habilitar o multi-omic global análises de uma amostra de solo único, um protocolo de extração com solvente orgânico baseado em clorofórmio, metanol e água separações foi utilizado10. Este método foi originalmente desenvolvido para extrações de lipídios totais9,11 e mais recentemente foi alterado para a extração simultânea de metabolitos, proteínas e lipídios de uma única amostra12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,,27,28,29,30, permitindo menos quantidade de amostra e variabilidade experimental10. No protocolo de mplexas, o clorofórmio não é miscível com a água, que fornece a base para a trifásico de separação química dos constituintes da amostra em fracções distintas. A fase aquosa superior, portanto, contém os metabolitos hidrofílicos, seguidos por um disco de proteínas e em seguida uma camada lipídica na fase de clorofórmio inferior (Figura 1). Quando mplexas é aplicada a maioria dos solos, detritos de partículas acumula-se na parte inferior dos tubos de amostragem e podem ser descartado após a coleta todas as camadas. Cada tipo de solo pode ser diferente, no entanto e em solos altamente orgânicos tais como turfa, os detritos do solo permanece na camada média e não cair no fundo do tubo de amostragem. Mplexas oferece várias vantagens ao isolar a molécula vários tipos da mesma amostra como 1) pequenas quantidades de amostra podem ser usadas para análises de multi-omic, 2) multi-omic extrações da mesma amostra diminuição geral experimental variabilidade, e 3) o maior número de amostras pode ser preparado muito mais rápido para maior taxa de transferência de estudos10. Juntos, esses benefícios são vitais para fornecer melhores recursos de medição para avaliar amostras de solo e suas comunidades microbianas complexas.
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Protocol
Nota: Os solos muito molhados podem ser liofilizados antes da extracção sem detrimento para a eficácia da extração. Solo úmido também pode ser usado mas deve ser considerado ao adicionar os reagentes em proporções específicas.
Nota: É recomendável usar 20g de peso do solo seco por extração, que deve ser dividido entre dois tubos de 50 mL (máximo de solo de 10 g por tubo de 50 mL). As extrações podem ser escaladas cima ou para baixo depende do amostra disponível.
Nota: As amostras de solo seco podem ser peneiradas através de uma tela de 3 mm para homogeneizar e remover pedras e pequenas raízes. Não peneira de amostras de solo úmido, como a amostra vai ficar preso na tela.
1. solo lysis da pilha e extração de metabólitos, proteínas e lipídios (sincronismo ~ 1 d)
- Por amostra de solo de 20 g, pese 10 g em dois tubos de 50ml separadas que são metanol/clorofórmio compatível. Ser extremamente cuidadoso com os tubos escolhidos, como clorofórmio lixiviará maioria dos plásticos, contaminando as amostras. Use o vidro sempre que possível ou plásticos tubos feitos de polipropileno ou politetrafluoretileno (PTFE).
Nota: Manter o solo no gelo e tão legal quanto possível durante os passos iniciais de pesagem e homogeneização. - Adicione 10 mL de clorofórmio-lavado inox e grânulos de Granada para cada tubo. No gelo, adicionar 4 mL de frio ultrapura água (consulte Tabela de materiais para sistema de purificação) para cada tubo (uma amostra dividida entre dois tubos) e transferir as amostras em um balde de gelo em uma coifa.
- Rapidamente usando uma pipeta sorológica de vidro 25 mL, adicione 20 mL de clorofórmio: metanol de 2:1 gelada (v/v).
Cuidado: Clorofórmio: metanol tem efeitos agudos de saúde potenciais: a pele de irritações, queimaduras químicas possíveis e irritação do sistema respiratório. Pode afetar os rins, fígado e coração. Usar luvas, roupas e óculos de proteção adequados e sempre trabalhar em uma coifa. - Aperte as tampas e o vórtice na solução. 2:1 choloroform:methanol ajuda a quebrar a parede celular de procariontes e inactivates também actividades enzimáticas.
- Anexe os tubos para anexos de vórtice de tubo de 50 mL e horizontalmente vórtice por 10 min a 4 ° C dentro de uma geladeira, se possível. Em seguida, coloca as amostras dentro de um freezer-80 ° C para ~ 15 min para esfriar completamente.
- Usando um sonicador de ponta de prova no interior de uma coifa, proceda à sonicação cada amostra com uma sonda de 6 mm (1/4") a amplitude 60% para 30 s cada no gelo.
Atenção: É recomendável usar um som diminuir o cerco e orelha proteção enquanto sonicating. Alta tensão está presente no cabo de alimentação e de alta frequência. Evite tocar a parte inferior ou os lados do navio amostra com uma sonda ativa; pode rachar ou derreter o plástico. - Coloca as amostras no congelador-80 ° C para ~ 15 min, como sonicating pode gerar muito calor.
- Repita as etapas de 1.5-1.7.
Nota: Certifique-se de que as amostras fiquem frias durante todo o processo de Lise. - Centrifugar as amostras a 4.000 x g por 5 min, 4 ° C. Neste ponto, a amostra será separada para a camada superior do metabólito, intercalar de proteína e a mais baixa camada lipídica (e remanescente de detritos). Veja a Figura 1.
- Colocar as amostras no gelo em um balde de gelo e, dentro de uma coifa e usando uma pipeta sorológica de vidro de 10 mL, remova as camadas superiores do metabólito dos dois tubos de 50 mL em um frasco grande.
Nota: Evite aspirar qualquer camada de proteína para a pipeta; Deixe uma pequena camada de metabólito se necessário. - Incline ligeiramente o tubo de 50 mL para versão intercalar de proteína, que é gratuito flutuando sobre a camada inferior de lipídios. Usando uma espátula de laboratório de cabeça chata inox limpo, cuidadosamente colher ambos as proteína intercalares e colocá-los juntos em um novo tubo de 50 mL.
- Usando uma pipeta sorológica de vidro 25 mL, remova as camadas inferiores de lipídios dentro de um frasco de vidro grande.
Nota: Tente evitar aspirantes partículas do solo; no entanto, alguns restos de solo e partículas aspiravam junto com os lipídios serão removidos em um momento posterior. - Lugar de membranas respiráveis por cima do metabólito e lipídios frascos de vidro e seque em um concentrador a vácuo até secura (lipídios ~ 4-5h, metabolitos durante a noite).
- Para o tubo de amostra de proteína e os restantes tubos de pelota de detritos, adicione 20 mL de metanol gelada a cada um e o vórtice. Isso é feito para as pelotas de detritos para enxaguar o clorofórmio antes de tentar solubilizar proteínas restantes possível fora os detritos antes de jogá-la.
- Centrifugar as pelotas de detritos e proteínas do interlayer a 4.000 x g por 5 min, 4 ° C, em seguida, decantar o metanol em um recipiente de resíduos perigosos no interior de uma coifa.
- Congelar as pelotas de proteína e detritos em nitrogênio líquido e seque em um Liofilizador (com uma temperatura do coletor capaz de-105 ° C devido a metanol, ponto de congelamento muito baixo de-98 ° C) por ~ 2 horas.
Nota: Não seque em demasiado os pellets, como eles serão mais difíceis de se solubilizar. - Adicione 10 mL de tampão de solubilização de proteína (4% SDS, 100mM DTT (DL-ditiotreitol) em tampão tris de 50mM, pH 8.0; ver Complementar reagente set-up) para o tubo do interlayer de proteína e 20 mL de cada uma das pelotas de detritos.
Cuidado: SDS provoca toxicidade aguda e é inflamável. É uma pele, olhos e vias respiratórias irritantes. Use luvas e óculos de segurança. - Na coifa, sonda proceda à sonicação das amostras em amplitude de 20% para 30 s para trazê-los para a solução. Vórtice por 2 min.
- Coloque a amostra do interlayer da proteína em um rotador de tubo de laboratório por 30 min a 300 rpm, 50 ° C, para solubilizar a proteína.
- Horizontalmente vórtice as amostras de detritos para um adicional 10 min para lyse quaisquer células intactas remanescentes, em seguida, gire com as amostras do interlayer da proteína para o restante 20 min.
- Todas as amostras a 4.500 x g durante 10 min, temperatura ambiente (RT), centrifugar e recolher o sobrenadante de cada tubo por amostra para dois tubos de 50 mL.
- Adicione 10 mL de solubilização do buffer para a pelota do interlayer da proteína e, em seguida, proceda à sonicação e vórtice em solução e centrifugar como antes.
- Combinar os sobrenadantes para os dois tubos de 50 mL, igualmente e centrifugar a 8.000 x g por 10 min, 4 ° C, em um rotor de balde de ângulo fixo.
Nota: Uma centrifugação final é necessária remover substâncias húmicas contaminantes excessivas. - Decante os sobrenadantes para dois tubos de 50 mL, para que haja 30 mL em cada um. Em seguida, usando uma pipeta sorológica de vidro de 10 mL, adicione 7,5 mL de TCA (ácido tricloroacético) para cada tubo. Vórtice em solução. Isso faz com que 20% TCA em cada amostra de 30 mL (ajustar em conformidade),
Atenção: O TCA é cáustica, tóxica e pode causar queimaduras na pele. Use luvas e óculos de segurança. - Coloca as amostras no congelador-20 ° C por 2 h durante a noite.
Nota: As proteínas normalmente irão precipitar dentro de 1h mas podem ser esquerda durante a noite (até 18 h).
Nota: Não deixe que a extração de TCA ir mais de 18 h devido à possível hidrólise ácida da proteína. Se a amostra é congelada, derretê-lo no gelo; Não deixe aquecer após descongelar a amostra. - Para a proteína precipitada de Pelotas, centrifugar a amostra a 4.500 x g por 10 min, 4 ° C e decantar o líquido sobrenadante para resíduos.
- Adicione 10 mL de acetona gelada de 100% para cada pellet de proteína, vórtice e combinar como pelotas em um tubo.
- Centrifugar o tubo contendo a pelota combinada (utilizando uma balança) e em seguida decante o sobrenadante no lixo.
Cuidado: Acetona pode causar do trato respiratório e irritação cutânea e ocular e é um líquido inflamável e vapor. Usar luvas de segurança óculos e um jaleco, trabalho em uma coifa. - Lave o pellet duas vezes usando 1,5 mL de acetona e finalmente transferir para um tubo de 2 mL para a centrifugação final a 10.000 x g por 5 min.
- Decantar o líquido sobrenadante para resíduos e permitir a pelota secar invertido em uma limpeza de papel em uma coifa para ~ 20 min ou sob um fluxo de nitrogênio até a pelota ligeiramente começa a rachar.
- Adicione 100-200 µ l de buffer de solubilização de proteína, dependendo do tamanho da pelota.
Nota: Mantenha o volume de tampão de solubilização adicionado à amostra tão baixa quanto possível. Subsequente filtro auxiliado por amostra preparação (FASP) só pode usar até 50 μL de amostra solubilizada por coluna; nada mais deve ser dividida em várias colunas FASP. - Proceda à sonicação e vortex a pelota em solução. Note que a amostra pode ser viscosa devido às substâncias húmicas precipitando juntamente com a proteína, que será removida com uma subsequente centrifugação.
- Agite a amostra em um incubadora/agitador por 30 min a 300 rpm, 40 ° C, para solubilizar as proteínas em solução e proceder à digestão de proteínas.
- Snap congelar a amostra em nitrogênio líquido e guarde no congelador a-80 ° C até que esteja pronto para a digestão de proteínas.
2. lipid preparação (sincronismo ~ 20 min)
- Uma vez que as amostras de lipídios estão secas, adicionar 200 μL de clorofórmio: metanol de 2:1 para o frasco, vórtice em solução e transferir para um tubo de polipropileno de 1,5 mL, adicionar um adicional de 200 μL ao vidro frasco, vórtice e pipetar os lipídios restantes e transferir para o tubo.
- Centrifugue os restos fora a amostra a 12.000 x g por 5 min a 4 ° C.
- Transferi o sobrenadante para um frasco de vidro lipídico e loja a-20 ° C até análise de LC-MS/MS (detalhes adicionais de LC-MS/MS em Métodos complementares).
- Se as amostras não podem ser analisadas imediatamente após o preparo, os lipídios precisam ser armazenadas em solvente a-20 ° C para evitar oxidação e degradação.
3. o metabólito preparação e derivatização (sincronismo h ~ 5)
- No dia seguinte a extração, remover as amostras de metabólito de velocidade Vac e armazenar seco a-20 ° C até que esteja pronto para derivatização e análise sobre o GC. Se não os metabolitos em execução em um GC, então prepare-se-los usando o protocolo apropriado para o instrumento.
- Imediatamente antes de derivatizing os metabólitos para análise sobre o GC, transferi-los dos frascos de vidro grande, adicionando 200 μL de metanol, num Vortex e adicionando a um tubo de polipropileno de 1,5 mL. Repeti uma vez.
- Centrifugar o tubo a 12.000 x g por 10 min, 4 ° C. Transferir o sobrenadante para pequenos frascos de vidro, adicionar uma membrana respirável para o topo e completamente seca em um Speed-Vac.
- Derivatize os metabolitos adicionando 20 µ l de solução de methoxyamine para o frasco de amostra e vórtice por 30 s em um reaccional em velocidade média.
Cuidado: O cloridrato de Methoxyamine causa queimaduras graves e sérios danos aos olhos, pode causar sensibilização por contacto com a pele. Usar óculos de segurança, luvas e avental e em uma coifa. - Use um sonicador de banho para garantir que a amostra é dissolvida completamente.
- Incube a amostra em uma incubadora com uma tampa de prevenção de condensação mantida a 37 ° C por 1 h 30 min com 1.000 rpm a tremer.
- Inverta o frasco uma vez para misturar as amostras com gotas de condensado na superfície da tampa. Girar a amostra para baixo a 1.000 x g por 1 min, RT
- Executar sililação adicionando 80 µ l (usando uma seringa) de N-metil - N-(trimetilsilil) trifluoroacetamide com trimetilclorosilano de 1%. Vórtice por 10s.
Atenção: MSTFA + 1% TMCS pode causar corrosão da pele, lesões oculares graves e toxicidade de órgão alvo específico e é um líquido inflamável e vapor. Usar óculos de segurança, luvas e avental e em uma coifa. - Incube a amostra em uma incubadora com uma tampa de prevenção de condensação mantida a 37 ° C por 30 min com 1.000 rpm a tremer.
- Inverta o frasco uma vez para misturar as amostras com gotas de condensado na superfície da tampa.
- Girar a amostra para baixo por 5 min a 2.000 x g, RT
- Transferi a solução reagiram em frascos apropriados para a análise de GC-MS.
4. proteína digestão (sincronismo ~ 1 d)
- Centrifugar a amostra a 15.000 x g por 5 min, RT, para todos os restos de Pelotas.
- Executar o filtro-Aided--preparação da amostra (FASP) para a digestão usando FASP kits (ver Tabela de materiais) seguinte modificado instruções31,32 do fabricante:
- Adicione 400 μL de tampão, ureia a 8 M em uma coluna FASP (500 μL 30K MWCO rotação filtro).
- Quando a amostra tiver terminado de centrifugação, pipetar fora o sobrenadante (descarte a pelota) e adicionar 50 μL da amostra para o 400 μL de ureia 8m na coluna.
Nota: Adicione somente até 50 μL de amostra por coluna. Se houver mais de 50 μL de amostra, use várias colunas e combinar os peptídeos após a digestão. É melhor deixar este volume mais baixo possível (30 µ l é ideal) para assegurar a FASP coluna removerá todos os SDS que pode interferir drasticamente com massa a análise. - Coloque a coluna no tubo incluído 1,5 mL e centrifugar a amostra a 14.000 x g por 30 min, RT
- Remover o escoamento no lixo e adicionar 400 μL de ureia 8m à coluna e centrifugar novamente.
- Repita a etapa anterior mais uma vez para um total de 3 lavagens de ureia.
Nota: Certifique-se que a amostra vai perto secura na coluna, se houver mais de ~ 30 µ l, permanecendo o filtro após cada rodada, continuar a centrifugação. - Adicionar 400 μL de 50mm NH4HCO3 e centrifugação a 14.000 x g por 20 min, descarte de resíduos e repetir uma vez.
- Transferi as colunas para um tubo de centrifugação de limpeza de 1,5 mL.
- Adicione 75 μL de tampão de digestão de tripsina nas colunas e incubar a 37 ° C por 3 h na incubadora com uma tampa de prevenção de condensação a 750 rpm.
- Adicione 40 µ l de 50mm NH4HCO3 para as colunas.
- Centrifugar a amostra a 14.000 x g durante 15 min coletar os peptídeos dentro do tubo, mantendo os contaminantes de alto peso molecular em cima da coluna.
- Adicione 40 μL de 50mm NH4HCO3 para a coluna e centrifugar novamente.
- Descartar a coluna, seque abaixo os peptídeos no tubo em uma velocidade Vac ~ 30 µ l, e ensaio BCA (kit de ensaio de proteína ácido Bicinchoninic; ver Tabela de materiais), os peptídeos.
- Opcionalmente, execute uma etapa de limpeza se houver suspeita de contaminação de SDS (bolhas visíveis)33. Uma extração em fase sólida deve ser feita depois de se escolher esta opção. Informações detalhadas sobre este método de limpeza estão disponíveis nos Métodos complementares.
- Diluir a amostra para análise de MS ou, opcionalmente, prossiga para fracionamento de HPLC (duas próximas etapas).
- Para fracionar, diluir as amostras a um volume de 400 µ l com 10 mM de tampão de formiato de amônio (pH 10,0).
- Deliberar sobre uma coluna C18 (ver Tabela de materiais), separando a 0,5 mL/min, usando um sistema HPLC com formiato de amônio fases móveis (A) 10 mM, pH 10,0 e (B) formiato de amônio 10 mM, pH 10,0/acetonitrilo (10:90).
- Ajuste o gradiente de em 100% A de 95% A durante o primeiro 10 min, 95% À 65% A mais de min 10 a 70, A 65% para 30% A mais de min 70 a 85, manter-se em 30% A mais de min 85 a 95.
- Re-equilibrar com 100% A mais de min 95 a 105 e mantenha em 100% A até 120 de min.
- Coletar frações cada 1,25 min (96 fracções ao longo do gradiente inteiro) e finalmente combinar cada linha para um total de 12 amostras ou todas as outras linhas para 24 amostras (cada um com n = 8 ou n = 4 fracções em pool).
- Todas as frações sob vácuo a seco e adicionar 15 µ l de água ultrapura para cada uma para o armazenamento a-20 º C até análise de LC-MS/MS.
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Representative Results
Quando o protocolo de mplexas foi usado para extrair as moléculas do solo de pradaria nativa de Kansas (um solo Mollisol), as análises de três vias previstas resultados 3376 peptídeos, 105 lipídios e 102 metabólitos polares (todas as identificações exclusivas). Enquanto o protocolo de mplexas tem sido bem estabelecido para geral extração de lipídios e metabolitos12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21,22,23,24,25,26,27 ,28,29,30,34, sua comparação de métodos de extração de proteínas solo comum para análises microbianas, tais como kits de extração de proteína de solo (ver tabela de de Materiais) e SDS (Dodecil sulfato de sódio) extrações35, mais é avaliada aqui. Para avaliar estas técnicas, proteínas do solo nativo pradaria Kansas foram extraídas com cada abordagem e analisadas diretamente com fase reversa LC-MS/MS, usando um sistema UPLC juntamente com um espectrômetro de massa quadrupolo/Orbitrap híbrido. Informações detalhadas sobre os parâmetros de método estão disponíveis nos Métodos complementares. O peptídeo experimental resultante espectros de MS/MS de cada abordagem de extração foram comparados com peptídeo previsto sequências do representante do Kansas pradaria nativa metagenome2 usando uma rigorosa MS-GF + corte probabilidade espectral de 1 x 10 -10 36 , 37 e um limite de massa erro de menos de 5 ppm. Deve notar-se que os analitos extraídos do solo usando o protocolo de mplexas são apropriados para estudos baseados em MS e outras técnicas analíticas. Quando inicialmente comparar três repetições dos métodos conhecidos de MoBio e SDS, apenas 12% dos peptides em compromisso entre as duas técnicas, mostrando a complexidade da comunidade microbiana e efeitos diferentes de extração (Figura 2). Sobre a comparação de mplexas com extratos MoBio e SDS, ~ 38% dos peptides observados usando o método de mplexas também foram detectados ao usar os SDS e/ou MoBio extrações (Figura 2). Considerando o número de espécies no Kansas solo comunidade bacteriana e sua metagenome2, a sobreposição das identificações de peptídeo é razoável e devido à sua complexidade, a combinação das abordagens extrai peptídeos mais do que cada um sozinho 35. também, desde que estas amostras foram fluidas e analisadas por apenas 1-dimensional LC-MS/MS, a complexidade da amostra extremamente alta foi possivelmente causando algum viés na deteção devido a concentrações de peptídeo diferentes extraídos por cada abordagem. O protocolo de mplexas também tem sido aplicado a outros tipos de solo como permafrost e zonas húmidas, e em todos os casos, os resultados preliminares proteomic são de qualidade semelhante dos dados de solo de pradaria nativa do Kansas aqui apresentados.
A ampla aplicabilidade da abordagem mplexas, foi previamente avaliado usando um conjunto diversificado de amostras, incluindo o archaeon Sulfolobus acidocaldarius, um consórcio de unicyanobacterial38, tecido de córtex cerebral do rato, urina humana, e folhas de Arabidopsis thaliana (Figura 2)10. Para todas as amostras, exceto A.thaliana, extrações de ureia são a maneira mais comum para extrair proteínas, então eles foram usados como a abordagem de controle para avaliação. Os resultados de mplexas da. thaliana foram comparados com uma extração realizada com ácido tricloroacético (TCA) porque folhas da planta são ricas em compostos fenólicos que precisam ser removidas antes da MS análises39. Em todos os casos, o número de proteínas observada a partir do método mplexas foi semelhante para os controles10, indicando sua utilidade para muitos tipos de amostras diferentes. Além disso, não houve nenhum tendências associadas com as classes de proteínas específicas extraídas em todos os tipos de amostra (incluindo o solo). Portanto, a ampla aplicabilidade da mplexas de numerosos sistemas biológicos e ambientais torna uma abordagem promissora.
Figura 1. Um esquema mostrando o processo de mplexas, em quais metabólitos, proteínas e lipídios são simultaneamente extraídos a mesma amostra de solo para análises de MS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Diagramas de Venn ilustrando a sobreposição do peptide para um conjunto diversificado de amostras extraídas usando mplexas e um método de extração de proteínas à base de ureia padrão normalmente executada. Dados de extração mplexas do archaeon S.acidocaldarius, o consórcio unicyanobacterial, urina humana, córtex cerebral de rato e A.thaliana planta Nakayasu, E. S. et al . 201610folhas adaptados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
É importante notar que nem todos os laboratórios terão o mesmo equipamento disponível para que certos métodos, por exemplo, a etapa de Lise, podem ser adaptados. Aqui usamos num Vortex e sonicating, no entanto, o uso de um batedor de grânulo grande 50ml funcionaria. Se não houver um Liofilizador com uma temperatura do coletor capaz de-105 º C, as amostras podem ser secos sob uma corrente de azoto. Também os tipos de solo variam muito e podem incluir areia, silte, argila, turfa e barro (etc), e também pode variar com base na riqueza de matéria orgânica, salinidade e pH. Cada um destes desvios pode ter um impacto sobre o protocolo, por isso é importante para ser flexível e fazer ajustes quando necessário. É fundamental, no entanto, que os rácios e percentagens permanecem as mesmas.
O protocolo de mplexas mostra uma grande promessa para aplicação em numerosos sistemas biológicos e ambientais e a capacidade de habilitar multi-omic análises de comunidades microbianas de solo. Comparações anteriores de mplexas para outros protocolos de extração para diversos sistemas ilustrado um elevado grau de peptídeo sobreposição10. No entanto, um observada limitação que mplexas não era aplicável às proteínas do plasma sanguíneo que precisam estar esgotado. Nestes casos, as proteínas precipitadas não foram bem reconhecidas pelos anticorpos nas colunas de immunodepletion necessário para cobertura ampla de proteome o plasma. Portanto, abordagens mais padrão de extração devem ser usadas nestas circunstâncias. Uma limitação adicional notada para a abordagem de extração de mplexas é que ele não discernir entre proteínas intracelulares e extracelulares, porém este é verdadeiro para todos os outros solo extração protocolos da proteína também.
Neste manuscrito, mplexas forneceu resultados para 3376 peptídeos, 105 lipídios e 102 metabólitos polares no solo de pradaria nativa de Kansas usando os métodos de extração e análise detalhados na seção de protocolo. Observou-se a melhor sobreposição entre os peptídeos extraídos no controle e mplexas abordagens de sistemas individuais, em comparação com a comunidade microbiana do solo (Figura 2). Isto não é uma limitação, mas uma consequência do trabalho com as comunidades microbianas do solo extremamente complicado. Estes resultados são ainda de notar como as técnicas de extração de solo bem conhecido de SDS e MoBio não se sobreponham bem também devido à grande diversidade e dificuldades de extração do solo igualmente proteínas. Curiosamente, o protocolo de mplexas permitiu a identificação de peptídeos totais mais do que o SDS ou MoBio e também detectados componentes adicionais não vistos em qualquer análise.
Estas observações fazem mplexas uma técnica muito promissor para trabalhar com tamanhos de pequenas amostras, reduzindo a variabilidade experimental de global multi-omic e reduzindo o tempo de preparação da amostra. As vantagens possíveis com mplexas Olhem para habilitar os recursos de multi-omic e análises necessárias para estudos de comunidade microbiana em grande escala.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Os autores gostaria de agradecer Nathan Johnson por sua assistência na elaboração de figuras. Esta pesquisa foi apoiada pelo programa Pan-omics que é financiado pelo departamento de energia dos Estados Unidos escritório de biológicos e pesquisa ambiental (programa de ciência genômica), o Microbiomes no desenvolvimento de pesquisas dirigido laboratório de transição (menta) Iniciativa no Pacific Northwest National Laboratory, bem como o nacional institutos de saúde nacionais Instituto de Ciências de saúde ambiental (R01 ES022190) e NIH (P42 ES027704). KEBJ gostaria de agradecer HD084788 R21 apoio financeiro desenvolver e validar as técnicas de extração multi-omic romance. Este trabalho foi realizado na W. R. Wiley ambiental Molecular Sciences Laboratory (EMSL), uma instalação de usuário científico nacional DOE no laboratório nacional Noroeste Pacífico (PNNL). PNNL é um programa multi laborátório operado pela Battelle para o DOE sob contrato DE-AC06-76RL01830.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | Stored at -20°C !Caution chloroform has acute potential health effects, skin irritation and possible chemical burns, irritation to the respiratory system, may affect the kidneys, liver, heart. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Stored at -20°C !Caution Methanol may cause respiratory tract, skin and eye irritation, may damage the nerves, kidneys and liver. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Purified water from Millipore | Milli-Q | Water purification system. | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L6026 | !Caution SDS causes acute toxicity and is flammable. It is a skin, eye and airway irritant. Wear gloves and safety glasses. |
| Soil protein extraction kit | MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen | 30000-20 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| 1M Trizma HCL | Sigma-Aldrich | T2694 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T0699 | !Caution TCA is caustic, toxic and may cause skin burns. Wear gloves and safety glasses. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | Stored at -20°C !Caution Acetone may cause respiratory tract and skin and eye irritation. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses gloves and a lab coat, work in a fume hood. |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | !Caution Urea is an eye and skin irritant, use gloves and safety glasses |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830 | |
| Trypsin | Promega | V528A | 20µg vials |
| Bicinchoninic acid protein assay kit | Pierce | 23227 | |
| Ammonium Formate | Sigma-Aldrich | 09735 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | !Caution Acetonitrile is a skin and eye irritant. Highly flammable. Wear gloves and safety glasses. Work in a fume hood. |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | !Caution TFA is extremely hazardous in case of skin contact, eye contact, ingestion and inhalation. May produce tissue damage particularly on mucous membranes of eyes, mouth and respiratory tract. Skin contact may produce burns. Wear gloves, lab coat, safety glasses and work in a fume hood. |
| Methoxyamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 226904 | !Caution Methoxyamine hydrochloride causes severe burns and serious damage to eyes, may cause sensitization by skin contact. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | !Caution Pyridine can cause skin and eye irritation, central nervous system depression. Vapor may cause flash fire. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trimethylchlorosilane | Sigma-Aldrich | 69478 | !Caution MSTFA + 1% TMCS can cause skin corrosion, serious eye damage and specific target organ toxicity. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Milli-Q water purification system | Millipore | model MPGP04001 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Probe sonicator | FisherBrand | model FB505 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | model 5810R | |
| 50mL tube swinging bucket rotor | Eppendorf | A-4-44 | |
| 50mL fixed angle rotor | Eppendorf | FA-45-6-30 | |
| Balance | OHAUS | model V22PWE150IT | |
| Serological pipette controller | Eppendorf | 12-654-100 | |
| 10mL, 25mL glass serological pipettes | FisherBrand | 13-678-27F, 13-678-36D | |
| Thermomixer with Thermotop | Eppendorf | 5382000015, 5308000003 | |
| 0.9 – 2.0 mm blend stainless steel beads | NextAdvance | SSB14B | |
| 0.15 mm garnet beads | MoBio | 13122-500 | |
| Magnetic stir plate | FisherBrand | 11-100-16SH | |
| Magnetic stir bar | FisherBrand | 14512130 | |
| pH paper strips, pH range 0–14 | FisherBrand | M95903 | |
| 15mL, 50mL conical polypropylene centrifuge tube | Genesee Scientific | 21-103 21-108 | chloroform compatible |
| 50mL vortex attachment | MoBio | 13000-V1-50 | |
| Ice bucket | FisherBrand | 02-591-44 | |
| 27.25x70mm glass vials | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Breathe Easier plate membranes | Midwest Scientific | BERM-2000 | |
| Alcohol wipes | Diversified Biotech | BPWP-1000 | |
| Heater shaker incubator | Benchmark, Incu-Shaker Mini | ||
| Analog rotisserie tube rotator | SoCal BioMed, LLC | 82422001 | |
| Filter-Aided-Sample-Prep kit | FASP; Expedeon | 44250 | |
| Microplate reader | Biotek, EPOCH | ||
| -20 Degree Celsius Freezer | Fisher | 13986149 | |
| -80 Degree Celsius Freezer | Stirling Ultracold | SU78OUE | |
| Q-Exactive ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Agilent 7890A gas chromatograph coupled with a single quadrupole 5975C mass spectrometer | Agilent Technologies, Inc. | ||
| LTQ-Orbitrap Velo | Thermo Scientific | ||
| Waters NanoEquityTM UPLC system | Millford, MA | ||
| 250mL media bottle | FisherBrand | 1395-250 | |
| Waters vial | Waters | 186002805 | |
| Glass MS sample vial and inserts | MicroSolv | 9502S-WCV, 9502S-02ND | |
| Glass HPLC vial and snap caps | MicroSolv | 9512C-0DCV, 9502C-10C-B | |
| HPLC 96-well plate | Agilent | 5042-6454 | |
| Large glass vial 27.25x70mm | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Lyophilizer | Labconco | 7934021 | |
| Polished stainless steel flat head spatula | Spoonula; FisherBrand | 14-375-10 | |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 34721 | |
| XBridge C18, 250x4.6 mm, 5 μM with 4.6x20 mm guard column | Waters | 186003117, 186003064 | |
| Agilent 1100 series HPLC system | Agilent Technologies | G1380-90000 | |
| 1.7mL centrifuge tube | Sorenson | 11700 | |
| Hamilton Glass Syringes, 5mL, 50µL and 250µL | Hamilton | 81517, 80975, 81175 | |
| Pasteur Pipettes | FisherBrand | 13-678-20A | |
| Pasteur Pipette Bulbs | Sigma-Aldrich | Z111597 | |
| Bath Sonicator | Branson 1800 Ultrasonic Cleaner | ||
| Vacuum Centrifuge | Labconco Centrivap Acid-Resistant Concentrator System | ||
| MicroSpin Columns, C18 Silica | The Nest Group | SEM SS18V |
References
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