Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Met behulp van Terminal Transferase-gemedieerde dUTP testen Nick einde-etikettering (TUNEL) en Caspase-3/7 aan maatregel epidermale celdood in kikkers met Chytridiomycosis

Published: May 16, 2018 doi: 10.3791/57345
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1One Health Research Group, College of Public Health, Medical and Veterinary Sciences, James Cook University, 2Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh

Summary

We kwantificeren epidermale celdood in kikkers met chytridiomycosis met twee methoden. Ten eerste, we gebruiken terminal transferase-gemedieerde dUTP nick einde-etikettering (TUNEL) in situ histologie om verschillen tussen klinisch besmette en niet-geïnfecteerde dieren te bepalen. Ten tweede, wij voeren een tijdreeksanalyse van apoptosis over infectie met behulp van een caspase-3/7 eiwit analyse.

Abstract

Amfibieën ondervinden een groot verlies aan biodiversiteit wereldwijd en een van de belangrijkste oorzaken is de chytridiomycosis van infectieziekten. Deze ziekte wordt veroorzaakt door de schimmel pathogeen Batrachothrychium dendrobatidis (Bd), die infecteert en verstoort kikker epidermis; echter, pathologische veranderingen hebben niet expliciet gekenmerkt. Apoptose (geprogrammeerde celdood) kan kan worden gebruikt door ziekteverwekkers te beschadigen gastheer weefsel, maar ook een mechanisme van de gastheer van ziekteresistentie voor pathogen verwijdering. In deze studie, kwantificeren we epidermale celdood van besmette en niet-geïnfecteerde dieren met behulp van twee verschillende testen: terminal transferase-gemedieerde dUTP nick einde-etikettering (TUNEL) en caspase-3/7. Gebruik van ventrale, dorsal, en dij huidweefsel in de TUNEL assay, we observeren cel dood in de epidermale cellen in situ van klinisch besmette dieren en celdood vergelijken met niet geïnfecteerde dieren met behulp van fluorescentie microscopie. Om te bepalen hoe apoptosis niveaus in de epidermis veranderen in de loop van infectie we Verwijder teen-tip monsters twee weken over een 8-weekse periode en gebruik een caspase-3/7-assay met uitgepakte eiwitten te kwantificeren activiteit binnen de monsters. Wij vervolgens correleren caspase-3/7 activiteit met infectie belasting. De TUNEL assay is handig voor lokalisatie van cel dood in situ, maar is duur en tijd intensieve per monster. Het caspase-3/7-assay is efficiënt voor grote steekproeven en tijd cursus experimenten. Omdat kikker teen tip biopsieën klein zijn echter er beperkt extract beschikbaar voor monster normalisatie via eiwit kwantificering methoden, zoals de analyse van Bradford. Daarom is het raadzaam het schatten van de totale oppervlakte van de huid door middel van fotografische analyse van Teen biopsieën om extracten te consumeren tijdens monster normalisatie.

Introduction

Amfibieën zijn momenteel een de grootste verlies van mondiale biodiversiteit van alle gewervelde taxa1. Een belangrijke oorzaak van deze daling is de fatale huid ziekte chytridiomycosis, veroorzaakt door de schimmel pathogeen Batrachothrychium dendrobatidis, Bd2. Het pathogene agens oppervlakkig infecteert de epidermis, die kan leiden tot verstoring van de functie van de huid leidt tot ernstige elektrolyt verlies, hartstilstand en overlijden3. Verschillende potentiële gastheer immuun mechanismen tegen Bd worden momenteel bestudeerd, zoals antimicrobiële peptiden4,5, cutane bacteriële flora6, immuun cel receptoren7,8, en lymfocyt activiteit9,10. Echter onderzoeken weinig studies of epidermale apoptosis en cel dood een immuun mechanisme tegen dit dodelijke pathogenen is.

Celdood, apoptosis (geprogrammeerde celdood) of necrose (unprogrammed dood), in de epidermis mogelijk een pathologie van Bd infectie. Vorige onderzoek suggereert dat Bd infectie apoptosis veroorzaken kan, omdat verstoring van de intracellulaire kruispunten wordt waargenomen wanneer huid explantaten zijn blootgesteld aan Zoöspore supernatant in vitro11. Bovendien, degeneratieve epidermale veranderingen in Bd-besmette kikkers zijn waargenomen met behulp van elektronenmicroscopie12,13. Transcriptomic analyses geven aan dat apoptosis trajecten upregulated in geïnfecteerde huid14 zijn, en wormsalamanders splenocytes ondergaan apoptosis wanneer ze worden blootgesteld aan Bd supernatant in vitro15. Ondanks de groeiende hoeveelheid bewijs suggereert dat Bd kan veroorzaken cel apoptosis en de gastheer dood in vitro, in vivo studies die onderzoeken of het kwantificeren van apoptosis mechanismen door de progressie van de infectie ontbreken. Het is verder onbekend, gebruikt de host dit apoptosis als een defensieve immuun strategie ter bestrijding van Bd infectie of apoptosis is een pathologie van ziekte.

In deze studie, we gericht op het detecteren van epidermale celdood en apoptosis in besmette dieren in vivo met behulp van twee methoden: caspase-3/7 eiwit assay en terminal transferase-gemedieerde dUTP nick einde-etikettering (TUNEL) in situ assay. Zoals elke bepaling verschillende aspecten van cel dood16 detecteert, samen deze methoden geven een volledig inzicht in de mechanismen die betrokken zijn bij de dood van de cel en zorgen voor een nauwkeurige meting van het effect. Het caspase-3/7-assay kwantificeert de activiteit van effector caspases 3 en 7, waarmee kwantificering van zowel de intrinsieke en extrinsieke apoptosis trajecten. In tegenstelling, detecteert de TUNEL assay fragmentatie van DNA, die wordt veroorzaakt door cel dood mechanismen, met inbegrip van apoptosis, necrose en pyroptosis17. We gebruiken de TUNEL bepaling te onderzoeken van de locatie van de dood van de cel binnen de epidermis van zowel klinisch besmette en niet-geïnfecteerde dieren met behulp van drie verschillende huid secties: het dorsum, de venter en de dij van Pseudophryne corroboree. Deze methode geeft de anatomische site van celdood, evenals de locatie binnen specifieke epidermale lagen onderscheid te maken. Vervolgens gebruiken we de caspase-3/7-bepaling uit te voeren een tijd serie kwantificering van apoptosis in een 8-weekse infectie in Litoria verreauxii alpina. We nemen teen tip monsters twee weken uit dezelfde dieren en zijn in staat om pathogenen infectie belasting correleren met caspase-3/7 activiteit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

James Cook University goedgekeurd dierenethiek toepassingen A1875 in P. corroboree en A1897 en A2171 voor L. v. alpina.

1. de veehouderij en het toezicht op

  1. Huis dieren individueel, in een omgeving die geschikt is voor de soort, met een passende water, voeden en reinigen van de planning. Dieren dagelijks controleren.
    1. Volwassen individuen van de bedreigde Pseudophryne corroboree gebruiken (voor de TUNEL Assay, punt 4) en het bedreigde Litoria verreauxii alpina (voor de Caspase-3/7 assay, afdeling 5), geschonken uit gevangenschap fokken van voorzieningen. Onderhouden van de dieren bij 15-18 ° C, op een mos en substraat grind, mist ze dagelijks met omgekeerde osmosewater en voeden van 3 keer per week met gut geladen krekels.
  2. Gegevens verzamelen over elke afzonderlijke eenmaal per week. Swab het individuen voor Bd zoals beschreven in stap 2.1. Wegen van elk dier op neared 0,1 g nauwkeurig af met behulp van een schaal, en meet hun snuit om te ventileren (SVL) lengte tot de dichtstbijzijnde 0,01 mm met behulp van dial remklauwen.
  3. Controleer na inoculatie (zoals beschreven in sectie 3), dieren dagelijks voor klinische tekenen van infectie (onregelmatige huid slough, eetlustgebrek, been roodheid, lethargie of vertraagde restarmen reflex) met inachtneming van dierenethiek richtsnoeren. Euthanaseren dieren als klinische symptomen en morbiditeit aanwezig zijn.
    1. Euthanaseren met een overdosis van tricaïne methanesulfonate (MS222) (0,1% w/v MS222 pH 6-7 met natriumbicarbonaat in leeftijd leidingwater). Dieren in de MS222 houden, want 10 minuten beweging immers ophoudt en zij geen reactie op prikkels tonen.

2. testen voor Bd -infectie

  1. Zwabberen voor Bd
    1. Elk dier wisser met een nieuwe steriele rayon doekje (één staafje per dier). Gebruik de volgende swabbing methode: vijfmaal de venter, vijfmaal over elke dij, kant en ledematen. Dit is een totaal van 45 slagen.
    2. Tijdens en tussen de lijnen om effectieve opname van DNA het staafje voorzichtig draaien. De swab tip afbreken in 1,5 mL microcentrifuge buizen en bewaren bij-20 ° C tot extractie.
  2. DNA-extractie en kwantitatieve analyse van qPCR
    1. Het uittreksel van genomic DNA van de swabs door toevoeging van 50 µL van een commercieel beschikbare DNA-extractie reagens met 30-40 mg van 0.5 mm silica parels. Kraal verslaan de monsters in een kraal klopper cel ontregelt op maximale snelheid gedurende 2 minuten. Centrifugeer na de kraal klopper stap, de monsters bij 2.000 x g gedurende 1 minuut.
    2. Incubeer de monsters bij 100 ° C gedurende 10 minuten en laat afkoelen. Centrifugeren van de monsters bij 5.000 x g gedurende 3 min, en vervolgens het supernatant overbrengen in individuele 1,5 mL micro centrifuge buizen en bewaren bij-20 ° C tot qPCR.
    3. Gebruik van kwantitatieve PCR (qPCR) na Boyle et al. 200418 voor het analyseren van de infectie laden. Gebruik de volgende wijzigingen:
      1. DNA-extractie monsters 6:100 met dubbele gedeïoniseerd water verdunnen. Voeg 0,7 µL van bovien serumalbumine (BSA) aan elk putje om te voorkomen dat PCR remming. Elk monster wordt in singlicate uitgevoerd. Op elke plaat gebruik een negatieve (geen sjabloon) controle en een positieve controle met een reeks verdunning normen Zoöspore (infectie) belasting.

3. enten

  1. Cultuur Bd
    1. Bereiden cultuur Bouillon door 16 g trypton, gelatine hydrolysaat 2 g en 4 g van lactose (TGHL) tot 1 L gedeïoniseerd water toe te voegen. Autoclaaf (121 ° C gedurende 40 min.) en laat de Bouillon te koelen.
    2. Inoculeer Bd isolaat (in dit geval, geïsoleerd van New South Wales isoleren, AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1, Passage nummer 11) in een TGHL Bouillon en groeien voor 7 d bij 23 ° C, dan de Bouillon cultuur naar TGHL agar platen.
    3. Om platen, voegt u 16 g trypton, gelatine hydrolysaat 2 g, 4 g van lactose (TGHL) en 10 g bacteriologische agar aan 1 L van gedeïoniseerd water en autoclaaf (121 ° C gedurende 40 minuten). Zodra het mengsel is koel genoeg om te raken, maar voordat het stolt, giet de TGHL agar in 92 mm diameter cultuur platen zodat ze 1/4 tot 1/3 volledig, in een klasse II biologische veiligheidskast.
    4. Wanneer de agar is verhard en volledig is afgekoeld, Inoculeer elke plaat met 0,5 mL van Bd van de vloeibare Bouillon en gelijkmatig. Laat Bd Bouillon mengsel droog op de plaat gedurende ongeveer 1 uur en dan zegel platen met kunststof paraffine film. Incubeer de platen agar kant neer bij 23 ° C gedurende 5-7 d.
  2. Platen worden zondvloed voor Zoöspore inoculatie oplossing
    1. Controleer Zoöspore motiliteit onder een omgekeerde lichte Microscoop te zorgen dagelijks voor inoculatie levensvatbaarheid. Wanneer Zoöspore release hoog, met veel zoospores zwemmen buiten de Sporangium is, is de cultuur klaar voor de inenting.
    2. Overgiet elke plaat met 3 mL leeftijd leidingwater of kunstmatige vijverwater, door het water te gieten in de plaat en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten om de zoospores in het water. Na de incubatieperiode, de Zoöspore schorsing te decanteren in een nieuwe steriele container.
    3. Schatting Zoöspore concentratie volgens de instructies van de fabrikant van met behulp van een haemocytometer. Zodra de concentratie van de Zoöspore schorsing is bekend, Verdun de schorsing tot een concentratie van 1 x 106 zoospores per 3 mL met leeftijd leidingwater.
  3. Inoculeer dieren
    1. Inoculeer elke dier door gieten 3 mL van het mengsel van de entmateriaal over haar venter19 in individuele 50 mL verpakkingen. Toestaan dat overtollige entmateriaal om te verzamelen in de base van de inoculatie container. Laat ieder dier in individuele inoculatie container voor 24u om infectie en na de inoculatie van de 24 h, keren elk individu naar een ontsmet terrarium.
      1. Desinfecteren terraria met behulp van een 13% volume/volume (v/v) commerciële bleekwater oplossing20, ten minste tweemaal spoelen met water en laten drogen gedurende niet minder dan 24 uur.
    2. Voor Bd-negatieve controles, mock enten van de dieren met behulp van dezelfde methoden zoals in 3.2-3.3, maar overstromingen van Bd-gratis agar platen met 5 mL leeftijd leidingwater in plaats daarvan van Bd geïnoculeerd agar platen.

4. TUNEL Assay

  1. Euthanaseren van dieren die klinische symptomen van chytridiomycosis, vertonen, zoals beschreven in stap 1.3.1, en een gelijk aantal Bd-negatieve controledieren.
  2. Ontleden van de huid (dorsale, ventrale en dij) monsters van elk dier. Corrigeer de huid monsters gedurende 2 uur in 4% v/v fosfaatgebufferde formaldehyde. De korte- en consistente vaststelling van tijd kunnen de weefsels vast te stellen ten volle, maar ook zorgt voor de doeltreffende en accurate immunohistochemistry kleuring. Vervolgens transfer naar 80% ethanol tot insluiten voor segmenteren.
  3. Huid in paraffine voor histologisch preparaat na standaardmethoden21insluiten. Kortom, het protocol is als volgt:
    1. Uitdrogen van weefsels in een gesorteerde reeks van ethanol, en schakel de ethanol met xyleen. Het weefsel inbedden in paraffine, en leg alle drie huid monsters voor elk individu in een paraffine blok.
  4. Sectie huid gebruikend microtome standaard histologisch preparaat21na. Afdeling van het weefsel serieel op 5 µm en vervolgens brengt op hydrofiele glas dia's. Plaats vier seriële histosections per huidtype per dia. Drie dia's per persoon met seriële huid secties maken, bedenk dan dat elke dia heeft vier secties van elk weefsel aangebracht.
  5. Vlekken van de dia's in de volgende volgorde:
    1. De eerste dia vlek met haematoxyline gevolgd door eosine counterstaining (H & E). Deze dia is het visualiseren van de locatie van Bd Sporangium binnen de huid.
    2. Vlekken van de tweede dia die volgt op een commercieel beschikbare TUNEL assay voor histologisch preparaat en volg de instructies van de fabrikant, die hieronder worden beschreven.
      1. Eerst de weefselsecties in een coplin pot deparaffinize door het wassen van de dia's met drie wijzigingen van xyleen voor 5 min per wasbeurt, en volgen met twee wijzigingen van 100% ethanol voor 5 min elke wassen. Volg met een wash van 95% ethanol voor 3 min en vervolgens 70% ethanol voor 3 min. afwerking met een wash van PBS voor 5 min.
      2. Voorbehandeling van het weefsel met vers verdunde eiwit verteren enzym (proteïnase K bij een concentratie van 20 μg/mL verdund in PBS) en rechtstreeks aan de dia toevoegen. Laat Incubeer gedurende 15 min. Wash met twee wijzigingen van PBS in een pot van de coplin voor elke 2 min.
      3. Onttrekt uit de overmaat vloeistof en doven in 3,0% waterstofperoxide in PBS in een coplin pot voor 2 min op kamer temp. Spoel tweemaal met PBS, vijf minuten elke wassen.
      4. Onttrekt uit de overmaat vloeistof, dan 75 µL/5 cm2 van de buffer evenwicht rechtstreeks op het weefsel op de dia toepast. Incubeer gedurende 10 s. kraan uit de overtollige vloeistof rond de sectie en 55 µL/5 cm2 terminal deoxynucleotidyl tranferase (TdT) enzym te werken toe te passen. Incubeer in een bevochtigde kamer voor 1 uur bij 37 ° C.
      5. Na de incubatie TdT, zet de dia in een coplin pot van werkende kracht stop/was buffer, doorroeren voor 15 s en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Wassen van de dia met drie wijzigingen van PBS voor 1 min per wasbeurt. Onttrekt uit de overmaat vloeistof.
      6. Anti-heksenkruid geconjugeerde (rhodamine), dat is zijn opgewarmd tot kamertemperatuur aan het weefsel, 65 µL/5 cm2van toepassing. Broeden in een bevochtigde kamer gedurende 30 minuten op kamer temp en Vermijd blootstelling aan licht. Wassen met vier wijzigingen van PBS gedurende 2 minuten per wasbeurt. Onttrekt uit de overmaat vloeistof.
      7. Voltooien door toe te voegen 15 µL van 0,5 - 1 µg/mL DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) in de dia, die als een teller vlek fungeert medium dia montage. Vervolgens dek af met een cover slip en verzegel met nagellak of rubber-cement. Laat dia's te drogen in het donker als de bepaling lichtgevoelig is.
    3. Vlek de derde dia is gekleurd met de TUNEL assay en DAPI counterstain, maar als een positieve en negatieve controle gebruiken voor elk monster.
      Opmerking: De 4 histosections op de controle-dia's, de eerste 2 zijn positieve controle wordt gerepliceerd en de laatste 2 zijn negatieve controle wordt gerepliceerd.
      1. Voor de positieve controles, in plaats van stap 4.5.2.2, vooraf behandelen het weefsel met DN buffer (30mM trizma basis, pH 7,2, 4mM MgCl2, 0.1 mM DDT) en laat gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur incuberen. Los vervolgens Dnase ik bij DN buffer voor een eindconcentratie van 0.1ug / mL, en direct toepassen op de dia. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.  Vervolgens wassen de dia met 5 wash van dH2O gedurende 3 minuten elke wassen. Vlek uit de overtollige vloeistof. Vervolgens weer TUNEL assay zoals aangegeven in sectie 4.5.2.3.
      2. Voor de negatieve controles, Voeg geen het terminal deoxynucleotidyl tranferase (TdT) enzym aan deze monsters (zoals beschreven in sectie 4.5.2.4).
  6. Observeren TUNEL dia's onmiddellijk na voltooiing van de test.
    1. Neem foto's willekeurig regelmaat langs elke sectie van de huid bij 200 X met behulp van een fluorescente microscoop, met behulp van filters voor zowel de rhodamine vlek, die onthult de apoptotic cellen en verschijnt rood en DAPI die onthult alle kernen en wordt blauw weergegeven, zodat een overlay van cellen kunnen worden gegenereerd. Zorgen voor ten minste 100 cellen per huid sectie per monster zijn gefotografeerd. De dia's opslaan in een donkere Microscoop vak bij-20 ° C.
    2. Cellen (blauwe DAPI gekleurd) tellen per beeld. Zorgen voor ten minste 100 cellen per huid sectie zijn geteld. Om te bereiken 100 cellen, alle cellen binnen het besturingselement image te tellen. Als minder dan 100 cellen in één beeld aanwezig zijn, tellen een ander beeld tot ten minste 100 cellen worden bereikt per huid sectie per dier.
    3. Vervolgens tellen het aantal TUNEL positieve cellen in dezelfde afbeeldingen (rode rhodamine gekleurd). TUNEL positieve cellen, die duiden op een apoptosis en niet necrose of achtergrond, zijn afzonderlijke cellen met randen van de cel wissen (membranen zijn met geen lysis intact). De cellen kleiner soms formulier apoptotic organen.
    4. Zoek de gebieden geteld in de TUNEL assay en analyseren van de desbetreffende regio's op de H & E gekleurd histosections. Bevestigen dat de H & E gekleurd secties correspondeert met sites van Bd infectie, die zorgt voor Bd-besmette sites worden gebruikt bij het tellen van apoptotic cellen in de TUNEL assay.

5. Caspase 3/7 Assay

  1. Teen tips verzamelen van elk dier ( Bd- blootgesteld en Bd- negatieve) eenmaal per week door de week 3 post inoculatie, en twee weken tot het einde van het experiment, tot 8 tenen per individu.
    1. Snijd de tip teen op de tweede falanx met een vlam-gesteriliseerde schaar, en plaatst in een 1,5 mL microtube en onmiddellijk bevriezen bij-80 ° C.
  2. Haal eiwitten uit bevroren teen monster.
    1. Leg monsters in 100 µL van monster buffer (25 mM HEPES pH = 7, 5 mM MgCl2) met twee RVS kralen (3.2 mm) in een 1,5 mL schroefdop microtube. Lyse monsters door 4 cycli van 1 min parel verslaan op maximale snelheid (in de dezelfde kraal klopper als gebruikt in stap 1.2.1) gevolgd door 3 min op ijs. Centrifugeer na lysis, monsters van 12.000 x g en 4 ° C gedurende 5 min. verzamelen supernatant in de test wilt gebruiken.
  3. Eiwitconcentratie per monster met behulp van de analyse van Bradford te kwantificeren.
    1. In een 384 goed plaat, meng 10 µL van eiwit extract met 10 µL van Bradford reagens en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Uitvoeren van elk monster in tweevoud, samen met een reeks van 5 vouw BSA verdunning normen. Lees de absorptie bij 595 nm op een extinctie-afleesapparaat.
  4. Als alternatief, als de teen tip monsters te klein (de eiwitconcentratie is in de buurt van de laagste standaard bepaald op basis van de analyse van Bradford in stap 4.3.1 of zo de kikkers die zijn bemonsterd zijn onder 3 g totale gewicht), standaardiseren monsters door te schatten huidoppervlak gebied met behulp van foto's, in plaats van de analyse van Bradford.
    1. Voor het uitpakken van fotograferen de eiwitten uit het monster voor de caspase-assay, elke teen op 40 X vergroting met behulp van een omgekeerde licht microscope.
    2. Het analyseren van de teen monster met behulp van een computer beeldbewerkingssoftware, door het schatten van de ruimte van de teen. Dit doen door een streep rond de rand van de clip van de teen, en hebben het imaginggebied van de schatting software binnen de vorm. Dan dat gebied te vermenigvuldigen met pi (3.14), die zal bij benadering van de oppervlakte van het monster van de huid 3-dimensioneel (lengte x doorsnede (pi x diameter) geeft de buitenste oppervlakte van een buis).
  5. De caspase-3/7-bepaling uit te voeren.
    1. Voeg in een 384 goed luminescentie plaat, 10 µL van verkrijgbare caspase-3/7 reagens en 10 µL van eiwit extract. Elk monster in drievoud worden uitgevoerd.
    2. Meng de reagentia door schudden van de plaat langzaam voor 15 s. Incubate de plaat weg van licht gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Meten met behulp van een verlichte afleesapparaat luminescentie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TUNEL Assay

Er waren meer TUNEL positieve cellen in de besmette dieren dan in de niet-geïnfecteerde controledieren. De locatie in situ van TUNEL positieve cellen verschilden besmet en controledieren. In controledieren was er een gelijkmatige verdeling van TUNEL positieve cellen gedurende de dermale en epidermale huid lagen op een laag niveau (Zie figuur 1A), maar in de geïnfecteerde dieren, de TUNEL positieve cellen werden vaker voor in de opperhuid (figuur 1b). de sites van de infectie (zoals waargenomen op de H & E gekleurd dia's) werden waargenomen zoals samengeklonterd Bd Sporangium verspreid door de dijbeen- en buikvinnen huid secties met niemand in het dorsum secties. Terwijl de TUNEL positieve cellen waren sterker geconcentreerd op en direct grenzend aan sites van geïnfecteerde cellen (Figuur 1 c), er was ook meer wijdverspreide TUNEL positieve cellen via de opperhuid en in de epidermale lagen die dieper dan waar zijn Bd woont. In Bd besmette dieren er waren meer TUNEL positieve cellen in alle drie huidtypes geanalyseerd, maar een bijzonder hoog niveau in de dij en venter huid (12.01 maal hoger (95% CI: 4,92-26.30) in de huid van de dij en 22.31 maal hoger (95% CI 5,25-94.82) in de Venter huid) (Figuur 2).

Caspase-3/7 Assay

In de loop van de infectie was er een verschil in caspase-activiteit. In Bd besmette dieren, was infectie-intensiteit positief gecorreleerd met caspase-3/7 activity (Figuur 3). Ook was er een verschil tussen besmette en niet-geïnfecteerde dieren door de tijd, post inoculatie. Caspase-3/7 activiteit daalde in de eerste paar weken na inoculatie (met 48.36% minder activiteit in besmette dieren), en steeg vervolgens tegen het einde van week 7 (Figuur 4) in Bd besmette dieren, maar bleef constant in niet-geïnfecteerde individuen.

Figure 1
Figuur 1: Terminal transferase-gemedieerde dUTP nick einde-etikettering (TUNEL) in situ assay van geïnfecteerd en niet-geïnfecteerde dieren. A) Bd- huid sectie van de dij van de controle van Pseudophryne corroboree, en B) Bd+ dij huid sectie van P. corroboree gekleurd door in situ TUNEL assay. Het blauw is DAPI kleuring met vermelding van de kernen van de cellen, en de rode is de vlek rhodamine, waarin DNA fragmentatie typisch veroorzaakt door apoptosis. De gele pijl geeft de positie van de Bd -cluster gezien in deelvenster C. C) P. corroboree sectie van dij huid gekleurd met H & E. De sectie H & E is seriële naar paneel B. Er is een cluster van lege Bd Sporangium (pijl) en een paar donkere onvolwassen Sporangium in de buurt van het huidoppervlak. Alle drie panelen is de epidermis aan de bovenkant van de foto. Het vergelijken van panelen B en C blijkt dat de rhodamine gekleurd epidermale cellen zijn geconcentreerd rond en onder de cluster van Bd en waar huid schade is zichtbaar, zoals micro-vesikel vorming tussen de basale epidermale cellen. 400 X vergroting en de schaal-balk geeft aan 0.03 mm. aangepast uit Figuur 2 in Brannelly et al. 2017 Peer J22. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: het aandeel van TUNEL positieve (TUNEL +) cellen per huidtype. Het aandeel van TUNEL positieve apoptotic cellen per huidtype in P. corroboree, met besmette dieren, met vermelding van de dieren die aan ziekte bezweken (n = 9) en niet-geïnfecteerde controledieren (n = 10). Foutbalken geven 95%-betrouwbaarheidsintervallen van een deel en * geeft aan dat een aanzienlijke toename van de TUNEL + cel verhoudingen. In de dorsale huid, hadden de besmette dieren 14.38 (95% CI 3.32-62.24) keer meer TUNEL positieve cellen dan controledieren (Odds Ratio: Z 3.57, p = < 0,01). In de huid van de dij, besmette dieren had 12.01 (95% CI: 4,92-26.30; Odds Ratio: Z 5.46, p = < 0.01) keer meer TUNEL positieve cellen dan controledieren (Pearson's Chi kwadraat: χ21 = 44.30, p < 0,01). In de huid van de venter, besmette dieren had 22.31 (95% CI 5,25-94.82) keer meer TUNEL positieve cellen dan controledieren (Odds Ratio: Z = 4.21, p < 0,01). Aangepast uit Figuur 3 in Brannelly et al. 2017 Peer J22. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: De correlatie tussen de intensiteit van de infectie, Log10(Zoöspore equivalenten) en caspase-3/7, Log10(Caspase) van geïnoculeerd Litoria verreauxii alpina in de loop van het experiment. De correlatie tussen de intensiteit van de infectie en caspase activiteit is 0.463 en de trendlijn is een vergelijking van y = (0.229) x + 0.939. Uit Figuur 4 in Brannelly et al.aangepast. 2017 peer J22. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Caspase-3/7 activiteiten door de week 7 voor elke groep van Litoria verreauxii alpina: Bd-besmette dieren die aan ziekte bezweken (n = 4) en niet-geïnfecteerde besturingselementen (n = 8). Caspase activiteit wordt gedefinieerd als de luminescentie lezen waarover voor eiwitconcentratie per monster en meld u vervolgens grondtal 10 omgezet. Het caspase-activiteit (Log10 getransformeerd) voor elke groep per week. Foutbalken geven de standaardfout. * geeft aan dat de geïnfecteerde dieren van de virusvrije controles op die week verschilde. (Lineaire gemengde effecten model: week, F4 = 11.974, p < 0,01; week * status, F8 = 2.139, p = 0.037; Week 3 ANOVA, F2,18 = 5.512, p = 0.014), aangepast van Figuur 5 in Brannelly et al. 2017 Peer J22. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Verkenden we epidermale apoptosis en dood van de cel als een potentiële mechanisme van de pathologie van de dodelijke ziekte chytridiomycosis of een mechanisme van ziekteresistentie bij Bd vatbare soorten. We gebruikten twee methoden voor de beoordeling van de dood van de cel in de opperhuid, TUNEL assay voor in situ epidermale cell death analyse en caspase-3/7 assay voor het toezicht op de epidermale celdood tijdens de voortgang van de infectie. Wij vonden dat celdood en apoptosis worden gecorreleerd met infectie lading en celdood aanzienlijk hoger op de plaats van de infectie is. In de vroege besmetting van b, er is een afname van de apoptosis in de epidermis, maar apoptosis verhoogt als pathogeen belasting verhogingen binnen de geïnfecteerde weefsel.

Apoptosis in cellen kan worden getest met behulp van talrijke verschillende benaderingen, elk met voordelen en beperkingen. Het is belangrijk om te studeren van apoptosis en cel dood met behulp van meerdere tests ter bevestiging van de bevindingen. In deze studie verkenden we twee verschillende testen om te onderzoeken epidermale celdood en apoptosis in kikkers met chytridiomycosis. Ten eerste, we uitgeprobeerd door de TUNEL assay om te beoordelen van cel dood in situ. Deze test is tijdrovend en duur per monster, en dia's moeten onmiddellijk worden gelezen, zoals het fluorescent signaal snel verdwijnt. Ondanks deze beperkingen zijn de resultaten van dit experiment in situ belangrijk voor het verder inzicht in de mechanismen van de gastheer-pathogeen interacties. Informatie over lokalisatie kan worden bepaald met behulp van deze methode, en in onze studie apoptosis was aanwezig in hoge mate op de site van schimmelinfectie, en meer diffuus op andere sites. Bovendien moet worden opgemerkt dat de TUNEL assay DNA schade, die kan worden veroorzaakt door een aantal verschillende cel dood mechanismen maatregelen, met inbegrip van apoptosis, necrose en pyroptosis17. Hoewel er handtekeningen van apoptosis-geassocieerde celdood (zoals afzonderlijke cellen met membranen nog intact, protocol lijn 4.6.3 ziet, de indeling is gebaseerd op de interpretatie van de onderzoeker. Omdat het mechanisme van celdood wordt niet bepaald door de TUNEL assay, is het mogelijk dat een ander niet-apoptosis cel dood traject kan hebben veroorzaakt de toename in TUNEL positieve cellen op morbiditeit van besmette dieren. Het verschil in welke elke assay maatregelen zou kunnen patroon verschillen in de twee verklaren testen trialled hier.

De assay caspase-3/7 inzetbaar te kwantificeren van het effect van infectie door de tijd. Echter, zoals kikker teen monsters klein zijn, er is beperkte monster voor analyse en normalisatie. Een gemeenschappelijke methode voor standaardisatie van de steekproef is het bepalen van de totale eiwitconcentratie van elk uittreksel. Als de analyse van Bradford eiwit kwantificering monster verbruikt, is het niet een effectieve methode voor kleine extracten. Daarnaast vonden we dat de pigmenten binnen de kikker huid uitgesloten analyse door nano UV-Vis spectrometrie. Kleine steekproeven voorkomen ook normalisatie door drooggewicht. Het is raadzaam om de schatten van de totale oppervlakte van de huid van de teen met behulp van fotografie, zoals de teen tip monsters (deze kikkers waren minder dan 3 g in lichaamsgrootte) waren te klein om te laten testen voor eiwitconcentratie zowel caspase-concentratie. We vonden dat de tenen fotograferen en het gebruik van een schatting van de oppervlakte huid zo effectief als traditionele eiwit concentratie analyses is.

In deze studie, twee standaardtechnieken voor quantifying celdood en apoptosis gebruikten we, maar de methoden voor amfibieën en kleine weefselsteekproeven aangepast. Voor de TUNEL assay euthanized we het dier om genoeg weefsel beschikbaar was voor de bepaling, en toegestaan voor het vergelijken van verschillende huid locaties te waarborgen. Het is mogelijk om deze methode aan kleinere weefselsteekproeven, zoals een teen singelband biopsie, waarvoor euthanasie van het dier niet zou passen. Afhankelijk van de grootte van het dier, biopten kunnen leiden tot een serie testen vergelijkbaar met onze aanpak voor de caspase-3/7-assay.

In de toekomst studies, suggereren we het gebruik van extra tests voor het verkennen van celdood en apoptosis in de loop van chytridiomycosis infectie omdat er nog veel te leren van de causale mechanismen van chytridiomycosis pathogenese. Deze resultaten suggereren dat apoptosis en epidermale celdood kunnen belangrijk zijn in de pathogenese van Bd; meer onderzoek is echter nodig om te bepalen van de invloed van apoptosis op ziekte resultaten, met name in de hosts die niet voor de infectie. bezwijken

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Wij danken de volgende mensen die met veeteelt en gegevensverzameling geholpen: D. Tegtmeier, C. De Jong, J. Hawkes, K. Fossen, S. Percival, M. McWilliams, L. Bertola, M. Stewart, N. Harney en T. Knavel; en M. Merces voor hulp bij dissecties. Wij zouden ook willen bedanken M. McFadden, P. Harlow en Taronga Zoo voor het aantrekken van de L. v. alpinaen G. Marantelli voor het aantrekken van de P. corroboree. Wij danken F. Pasmans, A. Martel voor advies over apoptosis testen, C. Constantine, A. Kladnik en R. Webb voor hulp bij TUNEL assay, en T. Emeto en W. Weßels voor hulp bij protocol en kit voor caspase-3/7 assay. Dit manuscript en het protocol is aangepast van Brannelly et al. 2017 Peer J22.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
POLARstar Omega BMG Labtech Luminescent plate reader
384 well flat clear bottom plate Corning 3707
384 well low flange white flat bottom plate Corning 3570
Agar Bacteriological (Oxoid) Fisher OXLP0011B
Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin Fisher 6764254
Lactose Broth (Oxoid) Fisher OXCM0137B
Sodium Bicarbonate Fisher BP328-500
Tricane-S (MS-222) Fisher NC0872873
Tryptone Fisher BP1421-500
Bovine Serum Albumin Invitrogen 15561020
Sterile rayon swab Medical Wire & Equipment MW-113
ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit Merck Millipore S7165
Coomassie Bradford reagent Pierce 23200
Caspase Glo  3/7 Promega G8090
HEPES buffer Sigma Aldrich H0887-20ML
Magnesium chloride Sigma Aldrich 1374248-1G
Gelatin hydrolysate Enzymatic Sigma-Aldrich G0262
PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X) Thermo/Life 20-012-043
Prepman Thermo/Life 4318930
TaqMan Fast Advanced Master Mix ThermoFisher 4444556
Parafilm Bemis PM996
Clorox bleach Clorox
Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade Fisher BP2818500
ZEISS Axio Scan florescent miscroscope Carl Zeiss Florescent microscope
3.2mm stainless steel beads BioSpec 11079132SS
Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGAT
ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′)		 Taqman Individual design for primers and probe
Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTT
CTCTAGGCAACAGTTT-3′)		 Taqman Individual design for primers and probe
Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′) Taqman Individual design for primers and probe
Rotor-Gene qPCR Instruments Qiagen qPCR machine
Microcentrifuge tubes 1.5ml Fisher 02-681-372
Cell culture petri plates Nunc 263991
Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm BioSpec 11079105Z

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
  2. Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
  3. Voyles, J., et al. Pathogenesis of chytridiomycosis, a cause of catastrophic amphibian declines. Science. 326 (5952), 582-585 (2009).
  4. Woodhams, D. C., et al. Population trends associated with skin peptide defenses against chytridiomycosis in Australian frogs. Oecologia. 146 (4), 531-540 (2006).
  5. Woodhams, D. C., Voyles, J., Lips, K. R., Carey, C., Rollins-Smith, L. A. Predicted disease susceptibility in a Panamanian amphibian assemblage based on skin peptide defenses. Journal of Wildlife Diseases. 42 (2), 207-218 (2006).
  6. Woodhams, D. C., Rollins-Smith, L. A., Alford, R. A., Simon, M. A., Harris, R. N. Innate immune defenses of amphibian skin: antimicrobial peptides and more. Animal Conservation. 10, 425-428 (2007).
  7. Savage, A. E., Zamudio, K. R. MHC genotypes associate with resistance to a frog-killing fungus. PNAS. 108 (40), 16705-16710 (2011).
  8. Bataille, A., et al. Susceptibility of amphibians to chytridiomycosis is associated with MHC class II conformation. Proceeding of the Royal Society B. 282, 20143127 (2015).
  9. Fites, J. S., Reinert, L. K., Chappell, T. M., Rollins-Smith, L. A. Inhibition of local immune responses by the frog-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Infection and Immunity. 82 (11), 4698-4706 (2014).
  10. Brannelly, L. A., Webb, R. J., Skerratt, L. F., Berger, L. Effects of chytridiomycosis on hematopoietic tissue in the spleen, kidney and bone marrow in three diverse amphibian species. Pathogens and Disease. 74 (7), ftw069 (2016).
  11. Brutyn, M., et al. Batrachochytrium dendrobatidis zoospore secretions rapidly disturb intercellular junctions in frog skin. Fungal Genetics and Biology. 49 (10), 830-837 (2012).
  12. Berger, L., Hyatt, A. D., Speare, R., Longcore, J. E. Life cycle stages of the amphibian chytrid Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 68 (1), 51-63 (2005).
  13. Pasmans, F., et al. Chytridiomycosis related mortality in a midwife toad (Alytes obstetricans) in Belgium. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. 79 (6), 460-462 (2010).
  14. Ellison, A. R., et al. More than skin deep: Functional genomic basis for resistance to amphibian chytridiomycosis. Genome Biology and Evolution. 7 (1), 286-298 (2014).
  15. Fites, J. S., et al. The invasive chytrid fungus of amphibians paralyzes lymphocyte responses. Science. 342 (6156), 366-369 (2013).
  16. Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
  17. Kelly, K. J., Sandoval, R. M., Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. A novel method to determine specificity and sensitivity of the TUNEL reaction in the quantitation of apoptosis. American Journal of Cell Physiology. 284 (5), C1309-C1318 (2003).
  18. Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Diseases of Aquatic Organisms. 60 (2), 141-148 (2004).
  19. Brannelly, L. A., Webb, R., Skerratt, L. F., Berger, L. Amphibians with infectious disease increase their reproductive effort: evidence for the terminal investment hypothesis. Open Biology. 6 (6), 1-24 (2016).
  20. Webb, R., Mendez, D., Berger, L., Speare, R. Additional disinfectants effective against the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 74 (1), 13-16 (2007).
  21. Woods, A., Ellis, R. Laboratory Histopathology: A Complete Reference. , Churchill Livingstone: Edinburgh. (1994).
  22. Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis. PeerJ. 5, e2925 (2017).

Tags

Immunologie en infectie uitgeven 135 Apoptosis Caspase histologie pathologie TUNEL Wildlife Disease
Met behulp van Terminal Transferase-gemedieerde dUTP testen Nick einde-etikettering (TUNEL) en Caspase-3/7 aan maatregel epidermale celdood in kikkers met Chytridiomycosis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brannelly, L. A., Roberts, A. A.,… More

Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis. J. Vis. Exp. (135), e57345, doi:10.3791/57345 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter