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Immunology and Infection

À l’aide de Terminal Transferase-mediated dUTP Nick fin-étiquetage (TUNEL) et la Caspase 3/7 Assays à mesure la mort cellulaire épidermique chez les grenouilles avec chytridiomycose

Published: May 16, 2018 doi: 10.3791/57345
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1One Health Research Group, College of Public Health, Medical and Veterinary Sciences, James Cook University, 2Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh

Summary

Nous quantifions la mort cellulaire épidermique chez les grenouilles avec chytridiomycose en utilisant deux méthodes. Tout d’abord, nous utilisons terminal transférase-mediated dUTP nick fin-étiquetage (TUNEL) in situ histologie pour déterminer les différences entre animaux infectés et cliniquement. En second lieu, nous effectuons une analyse des séries chronologiques de l’apoptose au cours de l’infection en utilisant une analyse de protéine caspase 3/7.

Abstract

Amphibiens subissent une grande perte de la biodiversité à l’échelle mondiale et une des principales causes est la chytridiomycose de maladies infectieuses. Cette maladie est causée par le champignon pathogène Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), qui infecte et perturbe l’épiderme de la grenouille ; Cependant, des changements pathologiques n’ont pas été explicitement caractérisés. L’apoptose (mort cellulaire programmée) peut être utilisé par des agents pathogènes pour endommager les tissus de l’hôte, mais peut aussi être un mécanisme de l’hôte de la résistance aux maladies pour éliminer les agents pathogènes. Dans cette étude, Nous quantifions la mort des cellules épidermiques des animaux infectés et, à l’aide de deux dosages différents : terminal transférase-mediated dUTP nick fin-étiquetage (TUNEL) et la caspase 3/7. Utilisant ventrale, dorsale et les tissus de la peau de la cuisse dans l’essai TUNEL, on observe la mort dans les cellules épidermiques in situ d’animaux infectés des cellules et comparer la mort cellulaire avec des animaux non infectés à l’aide de la microscopie de fluorescence. Afin de déterminer comment les niveaux de l’apoptose dans l’épiderme changent au cours de l’infection, nous retirer échantillons d’orteil-pointe toutes les deux semaines sur une période de 8 semaines et utiliser une analyse du caspase 3/7 avec des protéines extraites pour quantifier l’activité au sein des échantillons. Ensuite, nous corrélons activité de la caspase 3/7 avec la charge de l’infection. L’essai TUNEL est utile pour la localisation des cellules mort sur place, mais il est coûteux et temps intensif par échantillon. L’analyse du caspase 3/7 est efficace pour les vastes échantillons et l’heure du cours des expériences. Cependant, parce que grenouille orteil pointe des biopsies sont de petite taille il est extrait limité disponible de normalisation échantillon via des méthodes de quantification des protéines, tels que l’essai de Bradford. Nous proposons donc, estimation de la superficie de la peau grâce à l’analyse photographique des biopsies de l’orteil pour éviter de consommer des extraits au cours de la normalisation de l’échantillon.

Introduction

Amphibiens connaissent actuellement une les plus lourdes pertes de la biodiversité mondiale de n’importe quel taxons vertébrés1. Des principales causes de ce déclin sont la chytridiomycose maladie fatale de la peau, causée par le champignon pathogène Batrachochytrium dendrobatidis, Bd2. L’agent pathogène infecte superficiellement l’épiderme, ce qui peut conduire à la perturbation de la fonction de la peau entraînant une perte d’électrolytes sévère, un arrêt cardiaque et mort3. Divers mécanismes immunitaires hôte potentiel contre Bd sont actuellement à l’étude, tels que des peptides antimicrobiens4,5,6de la flore bactérienne cutanée, récepteurs de cellules immunitaires7,8, et lymphocytes activité9,10. Cependant, peu d’études explore si épidermique l’apoptose et la mort cellulaire est un mécanisme immunitaire contre ce pathogène mortel.

Mort cellulaire par apoptose (mort cellulaire programmée) ou de la nécrose (mort non programmée), dans l’épiderme peut être une pathologie de l’infection de la Bd . Des recherches antérieures suggèrent que l’infection Bd peut induire l’apoptose parce que la perturbation des jonctions intracellulaires est observée lorsque des explants de peau sont exposés au surnageants in vitrode la zoospore11. En outre, des modifications dégénératives épidermiques en Bd-grenouilles infectées sont observés à l’aide de la microscopie électronique12,13. Des analyses transcriptomiques indiquent que les voies de l’apoptose sont surexprimés dans la peau infectée14, et gymnophiones splénocytes apoptose lorsqu’elles sont exposées à la Bd surnageants in vitro15. Malgré l’augmentation du volume des éléments de preuve suggérant que la Bd peut induire l’apoptose et hôte cellulaire mort in vitro, études in vivo qui explorent ou mesurer l’apoptosis manquent de mécanismes par le biais de la progression de l’infection. En outre, on ne sait pas si l’hôte utilise l’apoptose comme une stratégie défensive de système immunitaire à combattre l’infection de la Bd , ou si l’apoptose est une pathologie de la maladie.

Dans cette étude, nous avons cherché à détecter la mort des cellules épidermiques et l’apoptose dans des animaux infectés in vivo à l’aide de deux méthodes : l’analyse du protéine caspase 3/7 et terminal transférase-mediated dUTP nick fin-étiquetage (TUNEL) essai in situ avec. Comme chaque test détecte les différents aspects de la cellule mort16, ensemble ces méthodes fournissent une pleine compréhension des mécanismes impliqués dans la mort cellulaire et assurer une mesure précise de l’effet. L’analyse du caspase 3/7 quantifie l’activité d’effecteur caspases 3 et 7, qui permet la quantification des deux voies intrinsèque et extrinsèque de l’apoptose. En revanche, l’essai TUNEL détecte de fragmentation de l’ADN, qui est causée par des mécanismes de mort cellulaire dont l’apoptose, nécrose et pyroptosis17. Nous utilisons l’essai TUNEL pour étudier l’emplacement de la mort cellulaire dans l’épiderme des animaux cliniquement infectés et non infectés à l’aide de trois sections différentes de la peau : la face dorsale, la Virginie et la cuisse de corroboree de Pseudophryne. Cette méthode identifie le site anatomique de la mort cellulaire, mais aussi distinguer son emplacement dans les couches épidermiques spécifiques. Nous utilisons ensuite l’analyse du caspase 3/7 pour réaliser une quantification de série de temps de l’apoptose dans une infection de 8 semaines en Litoria verreauxii alpina. Nous prenons orteil pointe échantillons tous les quinze jours de ces mêmes animaux et sont en mesure de la charge de l’infection pathogène en corrélation avec l’activité de la caspase 3/7.

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Protocol

James Cook University a approuvé l’éthique animale dans les applications A1875 pour P. corroboree et A1897 et A2171 pour L. c. alpina.

1. l’élevage et le suivi

  1. Maison des animaux individuellement, dans un environnement approprié pour les espèces, avec une eau appropriée, alimentation et calendrier de nettoyage. Vérifier quotidiennement les animaux.
    1. Utiliser des individus adultes de la critique d’extinction corroboree de Pseudophryne (pour l’essai TUNEL, Section 4) et menace Litoria verreauxii alpina (pour l’essai de Caspase 3/7, Section 5), a fait don de captifs, installations de reproduction. Maintenir les animaux à 15-18 ° C, sur une mousse et substrat de gravier, brume eux quotidiennement avec l’eau osmosée et nourrir 3 fois par semaine avec grillons gut chargé.
  2. Recueillir des données sur chaque fois individuelle par semaine. Tamponner les individus pour Bd comme décrit au point 2.1. Peser chaque animal à le glise 0,1 g à l’aide d’une échelle et de mesurer leur museau pour évacuer la longueur (SVL) 0,01 mm près à l’aide d’étriers de cadran.
  3. Après l’inoculation (comme décrit à la Section 3), vérifier les animaux tous les jours pour les signes cliniques d’infection (slough peau irrégulière, inappétence, rougeur de la jambe, léthargie ou réflexe de redressement retardée) conformément aux directives d’éthique animale. Euthanasier les animaux si la morbidité et les signes cliniques sont présents.
    1. Euthanasier avec une surdose de méthanesulfonate de tricaïne (MS222) (0,1 % p/v MS222 à pH 6-7 avec le bicarbonate de sodium dans l’eau du robinet âgé). Garder les animaux en MS222 10 min après tout mouvement cesse et ils ne montrent aucune réponse aux stimuli.

2. contrôle de l’Infection de la Bd

  1. Pistonnage pour Bd
    1. Tamponner chaque animal avec un nouveau tampon de rayonne stérile (un écouvillon par animal). Utilisez la méthode suivante de pistonnage : cinq fois sur la Virginie, cinq fois sur chaque cuisse, côté et branche. Il s’agit d’un total de 45 coups.
    2. Tourner doucement l’écouvillon pendant et entre les traits à assurer l’intégration efficace de l’ADN. Casser l’embout de l’écouvillon dans des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL et conserver à-20 ° C jusqu'à l’extraction.
  2. Extraction d’ADN et test de qPCR
    1. Extrait l’ADN génomique les écouvillons en ajoutant 50 µL de réactif d’extraction ADN disponible dans le commerce avec 30-40 mg de perles de silice de 0,5 mm. Perle a battu les échantillons dans un disrupteur de cellule perle batteur à la vitesse maximale pendant 2 minutes. Après l’étape de batteur de perle, centrifuger les échantillons à 2 000 x g pendant 1 min.
    2. Incuber les échantillons à 100 ° C pendant 10 min et laisser pour refroidir. Centrifuger les échantillons à 5 000 x g pendant 3 min, puis transférer le surnageant à tubes à centrifuger micro bouteille de 1,5 mL et conserver à-20 ° C jusqu'à qPCR.
    3. Utilisation de la PCR quantitative (qPCR) suite de Boyle et al. 200418 pour analyser la charge de l’infection. Utiliser les modifications suivantes :
      1. Diluer l’ADN extraction des échantillons 6:100 avec de l’eau désionisée double. Ajouter 0,7 µL d’albumine sérique bovine (BSA) dans chaque puits pour aider à prévenir l’inhibition de la PCR. Exécuter chaque échantillon dans singlicate. Sur chaque plaque d’utiliser un contrôle négatif (pas de modèle) et un témoin positif avec une série de normes de dilution pour estimer la charge de la zoospore (infection).

3. inoculation

  1. Culture Bd
    1. Préparer la culture bouillon en ajoutant 16 g de tryptone, 2 g d’hydrolysat de gélatine et 4 g de lactose (TGHL) à 1 L d’eau déionisée. Autoclave (121 ° C pendant 40 min) et laisser le bouillon refroidir.
    2. Inoculer Bd isolat (dans ce cas, isolé de New South Wales isolat, AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1, Passage numéro 11) dans un bouillon TGHL et se développer pendant 7 jours à 23 ° C, puis transférer le bouillon de culture sur plaques de gélose TGHL.
    3. Pour rendre les plaques, ajouter 16 g de tryptone, 2 g d’hydrolysat de gélatine, 4 g de lactose (TGHL) et 10 g d’agar bactériologique à 1 L d’eau déionisée et autoclave (121 ° C pendant 40 min). Une fois que le mélange est assez froid au toucher, mais avant elle se solidifie, verser l’agar TGHL 92 mm plaques de culture de diamètre et sont donc 1/4 à 1/3 plein, dans une armoire de sécurité biologique classe II.
    4. Quand l’agar a solidifié et refroidi complètement, inoculer chaque plaque avec 0,5 mL de Bd du bouillon liquid et répartir uniformément. Laissez le mélange de bouillon de Bd à sécher sur une plaque pendant environ 1 h et puis sceller les plaques avec film plastique paraffine. Incuber les plaques agar vers le bas à 23 ° C pendant 5 à 7 jours.
  2. Plaques pour la solution de l’inoculation de zoospores des inondations
    1. Vérifier la motilité de la zoospore sous un microscope inversé léger pour assurer la viabilité quotidiennement avant l’inoculation. Lorsque le communiqué de la zoospore est élevé, avec nombreux zoospores nager dehors les sporanges, la culture est prête pour l’inoculation.
    2. Inonder chaque assiette avec 3 mL d’ans l’eau du robinet ou l’eau d’étang artificiel, en versant l’eau dans la plaque et en incubation à température ambiante pendant 10 min permettre les zoospores de libérer dans l’eau. Après la période d’incubation, décanter la suspension de zoospores dans un nouveau récipient stérile.
    3. Estimer la concentration de zoospores suivant les instructions du fabricant à l’aide d’un hémocytomètre. Une fois connue la concentration de la suspension de zoospores, diluer la suspension à une concentration de 1 x 106 zoospores par 3 mL avec de l’eau du robinet.
  3. Inoculer les animaux
    1. Inoculer chaque animal en verser 3 mL de mélange d’inoculum au-dessus de sa Virginie19 dans des contenants individuels de 50 mL. Permettre aux excès inoculum à recueillir dans la base du contenant l’inoculation. Laissez chaque animal en conteneur individuel inoculation pendant 24 heures afin de s’assurer que l’infection et après l’inoculation de 24h, retourner chaque individu à un terrarium désinfecté.
      1. Désinfection des terrariums en utilisant un volume/volume (v/v) de 13 % eau de Javel commerciale solution20, rincer au moins deux fois avec de l’eau, puis laisser pour sécher pendant pas moins de 24 h.
    2. Pour le Bd-négatif des contrôles, mock inoculer les animaux en utilisant les mêmes méthodes qu’en 3.2-3.3, mais flood Bd-géloses gratuit avec 5 mL d’ans l’eau du robinet à la place de Bd inoculés géloses.

4. essai TUNEL

  1. Euthanasier les animaux qui présentent des signes cliniques de la chytridiomycose, tel que décrit à l’étape 1.3.1 et un nombre égal de Bd-négatif des animaux témoins.
  2. Disséquer la peau (dorsale, ventrale et cuisse) des échantillons de chaque animal. Fixer les échantillons de peau pendant 2 h à 4 % v/v tamponnée au phosphate de formaldéhyde. Le court et le temps de fixation compatible permettent les tissus entièrement fixée, mais permet aussi de coloration immunohistochimique efficace et précis. Puis transfert à l’éthanol à 80 % jusqu'à incorporation pour le sectionnement.
  3. Incorporer la peau en cire de paraffine pour préparation histologique suivant des méthodes standard21. En bref, le protocole est le suivant :
    1. Déshydrater les tissus dans une série graduée de l’éthanol, puis désactivez l’éthanol avec xylène. Incorporer le tissu en cire de paraffine et placer tous les échantillons de peau trois pour chaque individu dans le bloc d’une paraffine.
  4. Peau de section à l’aide d’un microtome après préparation histologique standard21. Article le tissu en série à 5 µm et ensuite apposer sur lames de verre hydrophile. Placez quatre histosections séries par type de peau par diapositive. Faire trois diapositives par personne avec des sections de série de la peau, n’oubliez pas que chaque diapositive comporte quatre sections de chaque tissu apposée.
  5. Tacher les diapositives dans l’ordre suivant :
    1. Tache la première diapositive avec l’hématoxyline suivie d’éosine contre-coloration (H & E). Ce toboggan est de visualiser l’emplacement des sporanges de Bd dans la peau.
    2. Détachant la deuxième diapositive après un essai TUNEL disponible dans le commerce pour préparation histologique et suivez les instructions du fabricant, qui sont décrites ci-dessous.
      1. Tout d’abord, Déparaffiner les sections de tissu dans une coloration en lavant les diapositives avec trois changements de xylène pendant 5 min / cycle de lavage et suivre avec deux changements d’éthanol à 100 % pendant 5 min à chaque lavage. Faire suivre par un lavage de l’éthanol à 95 % pendant 3 min, puis 70 % éthanol pendant 3 min. terminer avec un lavage de PBS pendant 5 min.
      2. Prétraitez le tissu avec la protéine fraîchement diluée digestion enzymatique (protéinase K à une concentration de 20 μg/mL dilué dans du PBS) et directement dans la diapositive. Laisser pour incuber pendant 15 min. laver avec deux changements de PBS dans une coloration de 2 min chacun.
      3. Touchez le liquide excédentaire et étancher à 3,0 % de peroxyde d’hydrogène dans du PBS dans une coloration pendant 2 min à température ambiante. Rincer deux fois avec du PBS, pendant cinq minutes à chaque lavage.
      4. Touchez le liquide excédentaire, puis appliquez 75 µL/5 cm2 de la mémoire tampon d’équilibre directement sur le tissu sur la diapositive. Incuber 10 tapoter s. pour enlever l’excès de liquide autour de la section et appliquez 55 µL/5 cm2 de travail enzymatique tranferase (TdT) terminale de deoxynucleotidyl. Incuber dans une chambre humide pendant 1 h à 37 ° C.
      5. Après l’incubation de TdT, mettre la diapositive dans une coloration de tampon de butée/lavage travail force, agiter pendant 15 s et incuber pendant 10 min à température ambiante. Laver la lame avec trois changements de PBS pendant 1 min / cycle de lavage. Touchez le liquide excédentaire.
      6. Appliquer conjugué anti-digoxigénine (rhodamine) qui a été chauffé à la température ambiante au tissu, 65 µL/5 cm2. Incuber dans une chambre humidifiée pendant 30 min à température ambiante et éviter l’exposition à la lumière. Laver avec quatre changements de PBS pendant 2 min / cycle de lavage. Touchez le liquide excédentaire.
      7. Terminez en ajoutant 15 µL de 0,5 - 1 µg/mL DAPI (4', 6-diamidino-2-phénylindole) dans le milieu de montage de diapositives à la diapositive, qui agit comme une tache de compteur. Puis recouvrir d’une lamelle couvre-objet et sceller avec du vernis à ongles ou de la colle de caoutchouc. Laisser les lames sécher dans l’obscurité que le test est sensible à la lumière.
    3. Tache la troisième lame est tachée à l’aide de l’essai TUNEL et contre-colorant DAPI, mais utiliser comme contrôle positif et négatif pour chaque échantillon.
      Remarque : Des 4 histosections sur les voies de guidage, les 2 premiers sont réplicats de contrôle positif et les 2 dernières sont des répliques de contrôle négatif.
      1. Pour les contrôles positifs, au lieu d’étape 4.5.2.2, pré-traiter le tissu avec un tampon DN (30mM trizma base, pH 7,2, 4mM MgCl2, 0,1 mM DDT) et laisser incuber à température ambiante pendant 5 minutes. Dissoudre ensuite la Dnase I en DN tampon pour une concentration finale de 0.1ug / mL et l’appliquer directement sur la diapositive. Incuber pendant 15 minutes à température ambiante.  Ensuite, laver la lame avec 5 lavage de dH2O 3 minutes chaque lavage. Épongez le liquide excédentaire. Puis reprendre l’essai TUNEL tel qu’indiqué dans la section 4.5.2.3.
      2. Pour les témoins négatifs, n’ajoutez pas l’enzyme tranferase (TdT) de terminale de deoxynucleotidyl à ces échantillons (tel que décrit dans la section 4.5.2.4).
  6. Observer le TUNEL diapositives dès l’achèvement de l’essai.
    1. Prendre photos au hasard le long de chaque section de la peau à 200 X à l’aide d’un microscope à fluorescence, l’utilisation de filtres pour les deux la tache de rhodamine, qui révèle les cellules apoptotiques et apparaît rouge et DAPI qui révèle tous les noyaux et apparaît bleu, afin qu’une superposition de les cellules peuvent être générées. S’assurer au moins 100 cellules sont photographiés par section de peau par exemple. Stocker les lames dans une boîte sombre microscope à-20 ° C.
    2. Compter les cellules (DAPI bleu teinté) par image. S’assurer au moins 100 cellules sont comptées par la section de la peau. Pour arriver à 100 cellules, compter toutes les cellules dans le contrôle image. Si moins de 100 cellules sont présentes dans une seule image, compte une autre image, jusqu'à ce qu’au moins 100 cellules sont atteints par la section de la peau par animal.
    3. Ensuite, comptez le nombre de cellules positives TUNEL dans les mêmes images (rhodamine rouge colorée). Cellules TUNEL, qui indiquent l’apoptose et nécrose ni ne fond, sont des cellules individuelles avec des bords de cellules claires (les membranes sont intactes avec aucune lyse). Parfois, les cellules se réduire à corps apoptotiques de forme.
    4. Localiser les zones comptés dans l’essai TUNEL et analyser les régions correspondantes sur le H & E teinté histosections. Confirmer que le H & E coupes colorées correspondent aux sites d’infection de Bd , qui assure la Bd-sites infectés sont utilisés lors du comptage des cellules apoptotic dans l’essai TUNEL.

5. l’analyse du Caspase 3/7

  1. Ramassez les pourboires de l’orteil de chaque animal ( Bd- exposés et Bd- négatif) une fois par semaine par semaine 3 après l’inoculation et toutes les deux semaines jusqu'à la fin de l’expérience, jusqu'à 8 pieds par personne.
    1. Couper l’extrémité de l’orteil à la deuxième phalange avec des ciseaux stérilisés en flamme et placer dans un microtube 1,5 mL et congeler immédiatement à-80 ° C.
  2. Extrait de protéines d’échantillon orteil gelé.
    1. Placer les échantillons dans 100 µL de solution tampon (pH de HEPES à 25 mM 7, 5 mM MgCl2) avec deux perles d’acier inoxydable (3,2 mm) dans un microtube de 1,5 mL bouchon à vis. Lyse des échantillons de 4 cycles de 1 min perle battre à vitesse maximale (dans le même batteur perle comme utilisé dans étape 1.2.1) suivie de 3 min sur la glace. Après la lyse, centrifuger les échantillons à 12 000 x g et 4 ° C pendant 5 min. de surnageant virés à utiliser lors de l’essai.
  3. Quantifier la concentration de protéines par exemple à l’aide de l’analyse de Bradford.
    1. Dans une plaque 384 puits, mélanger 10 µL de protéine extrait avec 10 µL de réactif de Bradford et incuber pendant 2 min à température ambiante. Effectuer chaque échantillon en deux exemplaires, accompagnés d’une série de 5 fold normes de dilution de BSA. Lire l’absorbance à 595 nm sur un lecteur de plaque d’absorbance.
  4. Par ailleurs, si les échantillons de pointe orteil sont trop petits (le taux protéique est près de la norme la plus basse, tel que déterminé par l’analyse de Bradford en étape 4.3.1 ou si les grenouilles qui sont échantillonnées sont moins de 3 g de poids total), normaliser les échantillons en estimant la surface de la peau zone à l’aide de photographies, au lieu de l’analyse de Bradford.
    1. Avant d’extraire les protéines de l’échantillon pour l’analyse du caspase, photographier chaque orteil grossissement de 40 X à l’aide d’un microscope inversé de lumière.
    2. Analyser l’échantillon de l’orteil à l’aide d’un ordinateur, logiciels d’imagerie, en estimant la zone de l’orteil. Faites-le en traçant une ligne sur le pourtour de l’attache et avoir la zone d’estimation logiciel d’imagerie dans la forme. Puis multiplier cette zone par pi (3.14), qui sera près de la surface de l’échantillon de peau de 3 Dimensions (longueur x transversale (pi x diamètre) donne la surface externe d’un tube).
  5. Effectuer l’analyse du caspase 3/7.
    1. Dans une plaque 384 puits luminescence, ajouter 10 µL de réactif disponible commercialement caspase 3/7 et 10 µL de l’extrait de protéine. Exécuter chaque échantillon en triple exemplaire.
    2. Mélanger les réactifs en agitant la plaque lentement pendant 15 s. Incuber la plaque abri de la lumière pendant 30 min à température ambiante. Luminescence de mesure en utilisant un lecteur de plaque vissée.

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Representative Results

Essai TUNEL

Il y avait plus de cellules positives TUNEL chez les animaux infectés que chez les animaux témoins non infectés. L’emplacement in situ du TUNEL positif cellules diffèrent dans infectés et des animaux témoins. Chez les animaux témoins, il y avait une répartition égale du TUNEL positive cellules tout au long de la dermiques et épidermiques de la peau couches faibles (voir Figure 1 a), mais chez les animaux infectés, les cellules positives TUNEL étaient plus fréquentes dans l’épiderme (Figure 1 b). les sites d’infection (tel qu’observé sur le H & E teinté diapositives) ont été observés comme agglutiné Bd sporanges disséminées dans la cuisse et la peau ventrale avec aucun dans les sections de la face dorsale. Tandis que le TUNEL cellules positives étaient plus concentrés à et directement adjacentes aux sites des cellules infectées (Figure 1), il y avait aussi des cellules positives plus répandues de TUNEL sur l’épiderme et dans les couches épidermiques qui étaient plus profonds qu’où les Bd résidait. En Bd les animaux il y avait plus de cellules positives TUNEL dans tous les types de peau trois analysés, mais un niveau particulièrement élevé dans la peau de la cuisse et venter infectés (12.01 fois plus élevé (IC à 95 % : 4,92-26.30) dans la peau de la cuisse et 22,31 fois plus élevé (IC à 95 % 5,25-94,82) dans le peau de Vivier) (Figure 2).

Analyse du caspase 3/7

Au cours de l’infection, il y avait une différence dans l’activité de la caspase. Chez les animaux Bd infectés, intensité de l’infection était positivement corrélée avec l’activité de la caspase 3/7 (Figure 3). Il y avait aussi une différence entre animaux infectés et à travers le temps, après l’inoculation. Activité de la caspase 3/7 a diminué dans les premières semaines après l’inoculation (avec 48,36 % moins d’activité chez les animaux infectés) et ensuite augmenté vers la fin de la semaine 7 (Figure 4) dans la Bd animaux infectés, mais resté constant non infectées personnes.

Figure 1
Figure 1 : Terminal transférase-mediated dUTP nick fin-étiquetage (TUNEL) in situ dosage des infectés et non infectés des animaux. Un) Bd- contrôle cuisse peau article de corroboree de Pseudophryne et B) Bd+ cuisse peau article de P. corroboree colorées par in situ l’essai TUNEL. Le bleu est DAPI coloration indiquant des noyaux des cellules, et le rouge est la tache de rhodamine, qui indique la fragmentation de l’ADN typiquement causée par apoptose. La flèche jaune indique la position du pôle Bd vu dans Panneau de C. C) P. corroboree section de peau de la cuisse coloration H & E. La section H & E est série au tableau B. Il y a un amas de sporanges vides de Bd (flèche) et quelques sporanges immatures sombres près de la surface de la peau. Pour tous les trois panneaux, l’épiderme est en haut de la photo. En comparant des groupes B et C montrent que la rhodamine teintée de cellules épidermiques sont concentrée autour et en dessous de la grappe de Bd et où la peau des dommages n’est visible, comme la formation de micro-vésicules entre les cellules basales épidermiques. Grossissement de X 400 et la barre d’échelle indique 0,03 mm. adapté de la Figure 2 dans Brannelly al 2017 Peer J22. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : la proportion de TUNEL positif (TUNEL +) cellules par type de peau. La proportion de cellules apoptotiques positive TUNEL par type de peau en P. corroboree, avec des animaux infectés, ce qui indique des animaux qui ont succombé à la maladie (n = 9) et des animaux témoins sains (n = 10). Barres d’erreur indiquent les intervalles de confiance de 95 % d’une part et * indique une augmentation significative de TUNEL + cellule proportions. Dans la peau du dos, les animaux infectés avaient 14.38 (IC95 : 3.32-62,24) fois plus TUNEL de cellules positives que les animaux témoins (Odds Ratio : Z = 3,57, p < 0,01). Dans la peau de la cuisse, les animaux infectés avaient 12.01 (95 % CI : 4,92-26.30 ; Odds Ratio : Z = 5.46, p < 0,01) fois plus de cellules positives TUNEL que les animaux témoins (Chi carré de Pearson : χ21 = 44,30, p < 0,01). Dans la peau de Virginie, des animaux infectés avaient 22.31 (IC à 95 % 5,25-94,82) fois plus TUNEL de cellules positives que les animaux témoins (Odds Ratio : Z = 4.21, p < 0,01). Adapté de la Figure 3 dans Brannelly al 2017 Peer J22. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : La corrélation entre l’intensité de l’infection, Log10(équivalents de la zoospore) et caspase 3/7, Log10(Caspase) d’inoculés Litoria verreauxii alpina au cours de l’expérience. La corrélation entre l’intensité de l’infection et l’activité de la caspase est 0,463, et la ligne de tendance a une équation de y = x (0,229) + 0,939. Adapté de la Figure 4 dans Brannelly et al. 2017 peer J22. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Activité de Caspase 3/7 par semaine 7 pour chaque groupe de Litoria verreauxii alpina: Bd-infectés des animaux qui ont succombé à la maladie (n = 4) et non infectés de contrôles (n = 8). Activité de la caspase est définie comme la luminescence lecture limitée par la concentration de protéines par échantillon et puis ouvrez une nouvelle base 10 transformé. L’activité de la caspase (Log10 transformé) pour chaque groupe par semaine. Barres d’erreur indiquent erreur standard. * indique que les animaux infectés différaient des contrôles sains à cette semaine. (Modèle linéaire mixte effets : semaine, F4 = 11.974, p < 0,01 ; semaine * statut, F8 = 2.139, p = 0,037 ; Semaine 3 ANOVA, F2,18 = 5.512, p = 0,014), adapté de la Figure 5 dans Brannelly al 2017 Peer J22. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Nous avons exploré l’apoptose épidermique et la mort cellulaire comme un mécanisme potentiel de pathologie de la maladie mortelle de chytridiomycose ou un mécanisme de résistance aux maladies chez les espèces sensibles de Bd . Nous avons utilisé deux méthodes d’évaluation de la mort cellulaire dans l’épiderme, essai TUNEL pour in situ l’analyse de mort de cellules épidermiques et l’analyse du caspase 3/7 pour le suivi de la mort des cellules épidermiques tout au long de la progression de l’infection. Nous avons trouvé que l’apoptose et la mort cellulaire est en corrélation avec la charge de l’infection et la mort cellulaire est significativement plus élevée sur le site de l’infection. Dans l’infection au début, il y a une diminution de l’apoptose dans l’épiderme, mais l’apoptose augmente avec charge pathogène dans les tissus infectés.

L’apoptose des cellules peut être testés à l’aide de nombreuses approches différentes, chacune avec les avantages et les limites. Il est important d’étudier l’apoptose et la mort cellulaire à l’aide de plusieurs tests afin de confirmer les résultats. Dans cette étude, nous avons exploré deux dosages différents pour enquêter sur la mort des cellules épidermiques et l’apoptose chez les grenouilles avec chytridiomycose. Tout d’abord, nous avons testé le TUNEL de dosage pour évaluer cell death in situ. Ce test est fastidieux et coûteux par échantillon et diapositives doivent être lu immédiatement comme le signal fluorescent s’estompe rapidement. Malgré ces limites, les résultats de cette expérience in situ sont importantes pour plus de compréhension des mécanismes d’interactions hôte-pathogène. Informations concernant la localisation peuvent être déterminées à l’aide de cette méthode, et dans notre étude, l’apoptose est présent dans des concentrations élevées sur le site de l’infection fongique et plus diffusément sur d’autres sites. De plus il est à noter que l’essai TUNEL mesure des lésions de l’ADN, qui peuvent être causée par un certain nombre de mécanismes de mort cellulaire différente dont l’apoptose, nécrose et pyroptosis17. Bien qu’il existe des signatures de la mort des cellules associées à l’apoptose (telles que des cellules individuelles avec membranes toujours intact, voir ligne protocole 4.6.3, la classification s’appuie sur l’interprétation du chercheur. Parce que le mécanisme de mort cellulaire n’est pas déterminé par l’essai TUNEL, il est possible qu’une autre voie de mort non-apoptose cellulaires ont pu l’augmentation dans les cellules positives TUNEL à la morbidité des animaux infectés. La différence de chaque quelles mesures de dosage pourraient expliquer les différences de modèle dans les deux dosages testés ici.

L’analyse du caspase 3/7 peut être utilisé pour quantifier l’effet de l’infection à travers le temps. Cependant, comme grenouille orteil échantillons sont petits, il est limitée de l’échantillon pour l’analyse et la normalisation. Une méthode commune de normalisation de l’échantillon est de déterminer la concentration des protéines totales de chaque extrait. Comme l’analyse de quantification de protéine de Bradford consomme d’échantillon, il n’est pas une méthode efficace pour les petits extraits. En outre, nous avons constaté que les pigments dans la grenouille peau exclut de l’analyse par spectrométrie UV-Vis de nano. Petite taille des échantillons a également empêché normalisation du poids sec. Nous vous suggérons d’estimation aire de surface de la peau de l’orteil à l’aide de la photographie, comme les échantillons de pointe orteil (ces grenouilles ont moins de 3 g en taille corporelle) étaient trop petits pour permettre des essais pour la concentration de protéines et caspase concentration. Nous avons trouvé que photographier les orteils et en utilisant une estimation d’aire de la surface de la peau sont aussi efficace que les analyses de concentration protéique traditionnels.

Dans cette étude, nous avons utilisé deux techniques standards pour quantifier la mort cellulaire et l’apoptose, mais adapté les méthodes pour les amphibiens et les échantillons de tissus petit. Pour l’essai TUNEL, nous avons euthanasié l’animal afin d’assurer suffisamment de tissu était disponible pour le dosage et autorisé pour la comparaison des emplacements de peau différente. Il est possible d’adapter cette méthode pour les plus petits échantillons de tissu, comme une biopsie de sangle orteil, qui ne nécessiterait pas l’euthanasie de l’animal. Selon la taille de l’animal, les biopsies pourraient permettre pour un temps série test similaire à notre approche pour l’analyse du caspase 3/7.

À l’avenir des études, nous suggérons l’utilisation de tests supplémentaires pour explorer la mort cellulaire et l’apoptose au cours de l’infection de la chytridiomycose, parce qu’il n’y a encore beaucoup à apprendre des mécanismes causals de la pathogenèse de la chytridiomycose. Ces résultats suggèrent que l’apoptose et la mort cellulaire épidermique peuvent être importants dans la pathogenèse de la Bd; Toutefois, des recherches supplémentaires sont nécessaires afin de déterminer l’influence de l’apoptose sur les issues des maladies, en particulier chez les hôtes qui ne succombent pas aux infections.

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Disclosures

Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Nous remercions les personnes suivantes qui ont contribué à la collecte de données et de l’élevage : D. Thom, C. De Jong, J. Hawkes, K. Fossen, S. Percival, M. McWilliams, L. Bertola, M. Stewart, Harney N. et T. Knavel ; et M. Merces d’assistance avec les dissections. Nous tenons également à remercier M. McFadden, P. Harlow et Taronga Zoo afin de déclencher le L. c. alpinaet G. Marantelli pour élever le corroboree P.. Nous remercions F. pierrat, A. Martel pour obtenir des conseils sur les dosages de l’apoptose, C. Constantine, A. Kladnik et R. Webb pour assistance avec essai TUNEL, et T. émético et W. Weßels pour aident avec le protocole et kit pour l’analyse du caspase 3/7. Ce manuscrit et le protocole est adaptée de Brannelly et coll. 2017 Peer J22.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
POLARstar Omega BMG Labtech Luminescent plate reader
384 well flat clear bottom plate Corning 3707
384 well low flange white flat bottom plate Corning 3570
Agar Bacteriological (Oxoid) Fisher OXLP0011B
Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin Fisher 6764254
Lactose Broth (Oxoid) Fisher OXCM0137B
Sodium Bicarbonate Fisher BP328-500
Tricane-S (MS-222) Fisher NC0872873
Tryptone Fisher BP1421-500
Bovine Serum Albumin Invitrogen 15561020
Sterile rayon swab Medical Wire & Equipment MW-113
ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit Merck Millipore S7165
Coomassie Bradford reagent Pierce 23200
Caspase Glo  3/7 Promega G8090
HEPES buffer Sigma Aldrich H0887-20ML
Magnesium chloride Sigma Aldrich 1374248-1G
Gelatin hydrolysate Enzymatic Sigma-Aldrich G0262
PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X) Thermo/Life 20-012-043
Prepman Thermo/Life 4318930
TaqMan Fast Advanced Master Mix ThermoFisher 4444556
Parafilm Bemis PM996
Clorox bleach Clorox
Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade Fisher BP2818500
ZEISS Axio Scan florescent miscroscope Carl Zeiss Florescent microscope
3.2mm stainless steel beads BioSpec 11079132SS
Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGAT
ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′)		 Taqman Individual design for primers and probe
Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTT
CTCTAGGCAACAGTTT-3′)		 Taqman Individual design for primers and probe
Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′) Taqman Individual design for primers and probe
Rotor-Gene qPCR Instruments Qiagen qPCR machine
Microcentrifuge tubes 1.5ml Fisher 02-681-372
Cell culture petri plates Nunc 263991
Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm BioSpec 11079105Z

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References

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Tags

Immunologie et Infection numéro 135 apoptose Caspase histologie pathologie TUNEL maladies de la faune
À l’aide de Terminal Transferase-mediated dUTP Nick fin-étiquetage (TUNEL) et la Caspase 3/7 Assays à mesure la mort cellulaire épidermique chez les grenouilles avec chytridiomycose
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Brannelly, L. A., Roberts, A. A.,… More

Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis. J. Vis. Exp. (135), e57345, doi:10.3791/57345 (2018).

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