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Immunology and Infection

Mit Terminal-Transferase-vermittelten dUTP Assays Nick Ende-Kennzeichnung (TUNEL) und Caspase 3/7 Maßnahme epidermalen Zelltod in Frösche mit Chytridiomykose

Published: May 16, 2018 doi: 10.3791/57345
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1One Health Research Group, College of Public Health, Medical and Veterinary Sciences, James Cook University, 2Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh

Summary

Wir quantifizieren epidermalen Zelltod in Frösche mit Chytridiomykose mit zwei Methoden. Erstens verwenden wir terminal Transferase-vermittelten dUTP Nick Ende-Kennzeichnung (TUNEL) in Situ Histologie Unterschiede zwischen klinisch infizierten und nicht infizierten Tieren feststellen. Zweitens führen wir eine Zeitreihenanalyse der Apoptose über Infektion mit einem Caspase 3/7-Protein-Analyse.

Abstract

Amphibien sind weltweit einen großen Verlust an biologischer Vielfalt erleben und eine der Hauptursachen ist der ansteckenden Krankheit Chytridiomycosis. Diese Krankheit wird verursacht durch pilzliche Erreger Batrachochytrium Dendrobatidis (Bd), infiziert und stört die Frosch Epidermis; krankhafte Veränderungen waren jedoch nicht explizit gekennzeichnet. Apoptose (programmierter Zelltod) kann kann durch Krankheitserreger verwendet werden, um Schäden Wirtsgewebe, jedoch auch eine Host-Mechanismus der Resistenz gegen Krankheiten Erreger entfernen. In dieser Studie quantifizieren wir epidermalen Zelltod von infizierten und nicht infizierten Tieren mit zwei verschiedenen Assays: terminal Transferase-vermittelten dUTP nick Ende-Kennzeichnung (TUNEL) und Caspase 3/7. Mit Ventral, dorsal, und Oberschenkel Hautgewebe in der TUNEL-Test, wir beobachten Zelltod in der Epidermiszellen in Situ klinisch infizierter Tiere und Zelltod mit nicht infizierten Tieren mit Fluoreszenz-Mikroskopie zu vergleichen. Um festzustellen, wie Apoptose Ebenen in der Epidermis verändern im Laufe der Infektion wir Fußspitze Proben vierzehntägig über einen Zeitraum von 8 Wochen zu entfernen, und mit einem Caspase 3/7-Assay mit extrahierten Proteine um Aktivität innerhalb der Proben zu quantifizieren. Mit Infektion Last korrelieren wir dann Caspase 3/7-Aktivität. Der TUNEL-Test eignet sich für die Lokalisierung der Zelle Tod in Situ, aber ist teuer und zeitintensiv pro Probe. Die Caspase 3/7-Assay ist effizient für große Stichproben und Zeit natürlich Experimente. Allerdings da Frosch Zehe Tipp Biopsien klein sind gibt es begrenzte Extrakt für Probe Standardisierung über Protein Quantifizierungsmethoden, wie der Bradford-Test zur Verfügung. Wir empfehlen daher, Schätzung Hautfläche durch fotografische Analyse der Zehe Biopsien zu vermeiden die Einnahme von Extrakten während der Probe Standardisierung.

Introduction

Amphibien erleben derzeit eine der größten Verluste der globalen Biodiversität irgendein Wirbeltier Taxa1. Eine wesentliche Ursache für diesen Rückgang ist die tödliche Haut Krankheit Chytridiomycosis, verursacht durch den Pilz-Erreger Batrachochytrium Dendrobatidis, Bd2. Der Erreger infiziert oberflächlich die Epidermis, die zu einer Störung der Funktion der Haut, was zu schweren Elektrolytverlust, Herzstillstand und Tod3führen kann. Verschiedenen potentiellen Wirt Abwehrmechanismen gegen Bd werden derzeit geprüft, wie antimikrobielle Peptide4,5, kutane Bakterienflora6, Immunzelle Rezeptoren7,8, und Lymphozyten Aktivität9,10. Jedoch untersuchen nur wenige Studien, ob epidermalen Apoptosis und Zelle Tod einen Immunmechanismus gegen diese tödliche Erreger ist.

Zelltod durch Apoptose (programmierter Zelltod) oder Nekrose (unprogrammed Tod), in der Epidermis kann eine Pathologie des Bd -Infektion sein. Bisherige Untersuchungen zeigen, dass Bd -Infektion Apoptose induzieren kann, weil Störungen der intrazellulären Kreuzungen beobachtet wird als Haut Explantaten Zoospore Überstände in-vitro-11. ausgesetzt sind Darüber hinaus degenerative epidermalen Veränderungen im Bd-infizierten Frösche sind mit Elektronenmikroskopie12,13beobachtet. Transkriptomischen Analysen deuten darauf hin, dass Apoptose Wege hochreguliert in infizierten Haut14 sindund Amphibien splenocyten Apoptose Wenn sie Bd Überstände in-vitro-15ausgesetzt sind. Trotz des wachsenden Geschäftsvolumens Anhaltspunkte dafür, dass Bd induzieren können Zelle Apoptosis und Host Tod in Vitro, in Vivo -Studien, die zu erkunden oder Apoptose, die Mechanismen durch das Fortschreiten der Infektion fehlen zu quantifizieren. Darüber hinaus ist unbekannt, wenn der Host Apoptose als defensive immun Strategie verwendet, um Bd Infektion zu bekämpfen oder Apoptose eine Pathologie der Krankheit ist.

In dieser Studie sollen wir epidermalen Zelltod und Apoptose in infizierten Tieren in Vivo mit zwei Methoden zu erkennen: Caspase 3/7 Protein Assay und terminal Transferase-vermittelten dUTP nick Ende-Kennzeichnung (TUNEL) in Situ Assay. Wie jedes Assay unterschiedliche Aspekte der Zelle Tod16erkennt, gemeinsam diese Methoden bieten ein umfassendes Verständnis der Mechanismen Zelltod beteiligt und gewährleisten ein exaktes Maß für die Wirkung. Die Caspase 3/7-Assay quantifiziert die Aktivität der Effektor Caspasen 3 und 7, die Quantifizierung der intrinsische und extrinsische Apoptosis Bahnen ermöglicht. Im Gegensatz dazu erkennt der TUNEL-Test DNA-Fragmentierung, hervorgerufen durch Tod Zellmechanismen einschließlich Pyroptosis, Apoptose und Nekrose17. Wir verwenden den TUNEL-Test, um die Lage des Zelltods innerhalb der Epidermis von klinisch infizierten und nicht infizierten Tieren mit drei verschiedenen Hautpartien zu untersuchen: der Rücken, die Venter und den Oberschenkel des Pseudophryne Corroboree. Diese Methode gibt die Lokalisation der Zelltod, sowie seiner Lage innerhalb bestimmten epidermalen Schichten zu unterscheiden. Dann benutzen wir die Caspase 3/7-Assay, eine Zeit-Serie Quantifizierung der Apoptose in eine 8-Wochen-Infektion im Litoria Verreauxii Alpinadurchzuführen. Wir nehmen Zehe Spitze Proben vierzehntägig von den gleichen Tieren und sind in der Lage, Krankheitserreger Infektion Last mit Caspase 3/7 Aktivität korrelieren.

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Protocol

James Cook University genehmigt Tierethik in A1875 Anwendungen für p. Corroboree und A1897 und A2171 für L. v. Alpina.

1. Tierhaltung und Überwachung

  1. Haus Tiere einzeln, in einer Umgebung, die für die Art, mit einem entsprechenden Wasser, Fütterung und Reinigungsplan. Kontrollieren Sie Tiere täglich.
    1. Erwachsene Individuen von den vom Aussterben bedrohten Pseudophryne Corroboree (zum TUNEL Test, Abschnitt 4) zu verwenden und die bedrohten Litoria Verreauxii Alpina (für die Caspase 3/7 Test, Abschnitt 5), gespendet von Gefangenen Zucht Einrichtungen. Erhalten die Tiere bei 15-18 ° C, auf Moos und Kies Substrat, besprühen sie täglich mit Umkehr-Osmose-Wasser und füttern 3 mal wöchentlich mit Darm geladen Grillen.
  2. Sammeln Sie Daten über jeden einzelnen einmal wöchentlich. Wischen Sie die Individuen für Bd wie in Schritt 2.1 beschrieben. Wiegen Sie jedes Tier beinahe mit Hilfe einer Skala 0,1 g und Messen Sie ihre Schnauze zur Länge (KRL) zum nächsten 0,01 mm mit Zifferblatt Bremssättel entlüften.
  3. Überprüfen Sie nach der Inokulation (wie in Abschnitt 3 beschrieben) Tiere täglich auf klinische Anzeichen einer Infektion (unregelmäßige Haut Slough, Appetitlosigkeit, Bein Rötung, Lethargie oder verzögerte aufrichtenden Reflex) in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Tierethik. Einschläfern Sie Tiere, wenn klinische Anzeichen und Morbidität vorhanden sind.
    1. Mit einer Überdosis von Tricaine Methanesulfonate (MS222) einschläfern (0,1 % w/V MS222 pH 6-7 mit Natriumbicarbonat in Alter Leitungswasser). Halten Sie Tiere in MS222 für 10 min Bewegung schließlich aufhört und sie keine Reaktion auf Reize zeigen.

(2) Tests für Bd -Infektion

  1. Für Bd schrubben
    1. Wischen Sie jedes Tier mit einem neuen sterilen Rayon Tupfer (ein Tupfer pro Tier). Verwenden Sie die folgende abtupfen Methode: fünfmal auf die Venter, fünf Mal auf jeder Seite, Leib und der Oberschenkel. Dies sind insgesamt 45 Schläge.
    2. Drehen Sie den Tupfer sanft, während und zwischen den Strichen um effektive Erfassung von DNA zu gewährleisten. Brechen Sie den Tupfer Tipp in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und bei-20 ° C bis zur Extraktion lagern.
  2. DNA-Extraktion und qPCR-assay
    1. Die Tupfer entziehen Sie genomischen DNA durch Zugabe von 50 µL eines im Handel erhältlichen DNA Extraktion Reagenzes mit 30-40 mg 0,5 mm Kieselsäure Perlen. Wulst schlagen die Proben in einem Wulst Schläger Zelle Disruptor mit maximaler Geschwindigkeit für 2 min. Zentrifugieren Sie nach dem Wulst Schläger Schritt die Proben bei 2.000 x g für 1 min.
    2. Inkubieren Sie die Proben bei 100 ° C für 10 min, und abkühlen lassen. Zentrifugieren Sie die Proben bei 5.000 x g für 3 min und dann überstand auf einzelne 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhren übertragen und speichern bei-20 ° C bis qPCR.
    3. Verwenden Sie quantitative PCR (qPCR) nach Boyle Et al. Laden Sie 200418 , die Infektion zu analysieren. Verwenden Sie die folgenden Änderungen:
      1. Verdünnen Sie DNA-Extraktion Proben 6: 100 mit doppelten deionisiertes Wasser. Fügen Sie 0,7 µL Rinderserumalbumin (BSA) in jede Vertiefung zur Vermeidung von PCR-Hemmung. Führen Sie jede Probe in Singlicate. Verwenden Sie auf jeder Platte ein negativ (keine Vorlage)-Steuerelement und eine Positivkontrolle mit einer Reihe von Verdünnung Normen, um Zoospore (Infektion) Last zu schätzen.

3. Impfung

  1. Kultur- Bd
    1. Bereiten Sie Kultur Brühe 1 L entionisiertem Wasser 16 g Tryptone, 2 g Gelatine Hydrolysat und 4 g Laktose (TGHL) hinzufügen. Autoklaven (121 ° C für 40 min.) und Brühe abkühlen lassen.
    2. Impfen Bd Isolat (in diesem Fall, isoliert von New-South.Wales isolieren, AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1, durchgangsnummer 11) in einer TGHL Brühe und wachsen für die 7D bei 23 ° C, dann die Brühe Kultur zu TGHL Agarplatten übertragen.
    3. Um Platten zu machen, fügen Sie 16 g Tryptone, 2 g Gelatine Hydrolysat, 4 g Laktose (TGHL) und 10 g des bakteriologischen Agar 1 L deionisiertes Wasser und Autoklaven (121 ° C für 40 min. hinzu). Sobald die Mischung kühl genug zum Anfassen ist, aber bevor es erstarrt, TGHL Agar in Gießen 92 mm Durchmesser-Kultur-Platten sind 1/4 bis 1/3 voll, in einer biologischen Sicherheitswerkbank Klasse II.
    4. Wenn Agar hat verfestigt und vollständig abgekühlt, jede Platte mit 0,5 mL Bd aus der flüssige Brühe zu impfen, und gleichmäßig verteilt. Bd -Brühe-Gemisch auf Platte für ca. 1 h Trocknen und dann versiegeln Platten mit Kunststoff Paraffin-Film zu ermöglichen. Inkubieren Sie Platten Agar Seite nach unten bei 23 ° C für 5-7 d.
  2. Flut-Platten für Zoospore Inokulation Lösung
    1. Überprüfen Sie die Zoospore Motilität unter einem invertierten Lichtmikroskop Lebensfähigkeit täglich vor Impfung gewährleistet. Wenn Zoospore Version mit vielen Zoosporen Schwimmen außerhalb der Sporangien hoch ist, kann die Kultur zum animpfen.
    2. Überfluten Sie jede Platte mit 3 mL Alter Leitungswasser oder künstlichen Teichwasser, gießt das Wasser in die Platte und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min um die Zoosporen freizugebende ins Wasser zu ermöglichen. Dekantieren Sie nach der Inkubationszeit die Zoospore Suspension in einen neuen sterilen Behälter.
    3. Zoospore Konzentration nach Angaben des Herstellers mit einem Zählkammern zu schätzen. Sobald die Konzentration der Zoospore Suspension bekannt ist, verdünnen Sie die Aussetzung zu einer Konzentration von 1 x 106 Zoosporen pro 3 mL mit Alter Leitungswasser.
  3. Tiere zu impfen
    1. Impfen Sie jedes Tier durch Gießen 3 mL Inokulum Mischung über die Venter19 in individuelle 50 mL Behälter. Lassen Sie überschüssige Inokulum, in den Boden des Behälters Impfung zu sammeln. Lassen Sie jedes Tier in einzelnen Impfung Behälter für 24 h um Infektion zu gewährleisten, und nach der Inokulation 24 h wieder jeder einzelne desinfizierten Terrarium.
      1. Terrarien mit 13 % Volumen/Volumen (V/V) kommerzielle Bleichmittel-Lösung20zu desinfizieren, mindestens zweimal mit Wasser abspülen, dann nicht weniger als 24 h trocknen lassen.
    2. Für Bd-negative Kontrollen, mock impfen der Tiere mit den gleichen Methoden wie in 3.2-3.3, aber Flut Bd-kostenlose Agarplatten mit 5 mL Alter Leitungswasser statt BD geimpft Agarplatten.

4. TUNEL-Test

  1. Tiere, die klinischen einer Chytridiomykose Anzeichen, einschläfern, wie unter Schritt 1.3.1 und eine gleiche Anzahl von Bd-negative Kontrolltieren.
  2. Sezieren Haut (dorsal, Ventral und Oberschenkel) Proben von jedem Tier. Die Hautproben für 2 h in 4 % V/V Phosphat gepufferte Formaldehyd zu beheben. Die kurze und einheitliche Festsetzung Zeit ermöglicht das Gewebe vollständig repariert werden, sondern ermöglicht auch für effektive und genaue immunhistochemische Färbung. Anschliessend transfer zum 80 % Ethanol bis zum Einbetten für schneiden.
  3. Betten Sie Haut in Paraffinwachs für histologische Vorbereitung nach Standardmethoden21 ein. Kurz gesagt, ist das Protokoll wie folgt:
    1. Entwässern Sie Gewebe in einer abgestuften Reihe von Ethanol zu, und deaktivieren Sie das Ethanol mit Xylol. Betten Sie des Gewebes in Paraffin Wachs ein, und legen Sie alle drei Hautproben für jeden einzelnen in einem paraffinblock.
  4. Abschnitt Haut mit einem Mikrotom nach standard histologischen Vorbereitung21. Abschnitt des Gewebes seriell auf 5 µm und dann befestigen an hydrophilen Objektträger. Legen Sie vier serielle Histosections pro Hauttyp pro Folie. Drei Folien pro Person mit seriellen Hautpartien zu machen, denken Sie daran, dass jede Folie hat vier Sektionen der einzelnen Gewebe angebracht.
  5. Färben Sie die Folien in der folgenden Reihenfolge:
    1. Färben Sie die erste Folie mit Hämatoxylin-Eosin (H & E) gegenfärbung gefolgt. Diese Folie ist die Lage des Bd Sporangien innerhalb der Haut zu visualisieren.
    2. Flecken auf der zweiten Folie, die nach einem handelsüblichen TUNEL Assay für histologische Vorbereitung und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, die nachfolgend beschrieben werden.
      1. Zuerst deparaffinize die Gewebeschnitte in einem Coplin Glas durch die Folien mit drei Änderungen von Xylol für 5 min pro Waschgang waschen, und folgen Sie mit zwei Änderungen von 100 % Ethanol für 5 min jedem Waschgang. Folgen Sie mit einem Waschen von 95 % Ethanol für 3 min und dann 70 % Ethanol für 3 min. Finish mit einem Waschen der PBS für 5 min.
      2. Vorbehandeln Sie des Gewebes mit frisch verdünnten Protein verdauen Enzym (Proteinase K in einer Konzentration von 20 μg/mL verdünnt mit PBS-Puffer), und direkt zur Folie hinzufügen. Lassen Sie für 15 min. Waschen mit zwei Änderungen des PBS in einem Coplin Glas für 2 min inkubieren.
      3. Tippen Sie die überschüssige Flüssigkeit und stillen in 3,0 % Wasserstoffperoxid mit PBS-Puffer in einem Coplin Glas für 2 min bei Raumtemperatur. Zweimal mit PBS, fünf Minuten spülen Sie jedem Waschgang.
      4. Tippen Sie die überschüssige Flüssigkeit, dann 75 µL/5 cm2 des Puffers Gleichgewicht direkt auf das Gewebe auf der Folie. 10 S. Hahn die überschüssige Flüssigkeit um den Abschnitt inkubieren Sie und gelten Sie 55 µL/5 cm2 terminal Deoxynucleotidyl Tranferase (TdT) Enzym zu arbeiten. In eine Feuchte Kammer für 1 h bei 37 ° c inkubieren
      5. Nach der Inkubation TdT, setzen Sie die Folie in einem Marmeladenglas Coplin Arbeit Kraft Stop/Waschpuffer, agitieren für 15 s und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Folie mit drei Änderungen der PBS für 1 min pro Waschgang. Tippen Sie die überschüssige Flüssigkeit.
      6. Gelten Sie Anti-Digoxigenin-Konjugat (Rhodamin), die Raumtemperatur des Gewebes, 65 µL/5 cm2erwärmt wurde. In eine Feuchte Kammer für 30 min bei Raumtemperatur inkubieren und Lichteinwirkung zu vermeiden. Mit vier Änderungen der PBS für 2 min pro Waschgang waschen. Tippen Sie die überschüssige Flüssigkeit.
      7. Abgang durch Hinzufügen von 15 µL 0,5 - 1 µg/mL DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole) in Folie Eindeckmittel zur Folie, fungiert als ein Zähler Fleck. Dann mit einem Deckglas abdecken und seal mit Nagellack oder Gummilösung. Lassen Sie Dias im Dunkeln zu trocknen, da die Assay lichtempfindlich ist.
    3. Fleck der dritten Folie ist mit dem TUNEL-Assay und DAPI gegenfärbung gefärbt, aber als eine positive und eine negative Kontrolle für jede Probe verwenden.
      Hinweis: Von den 4 Histosections auf den Steuerelement-Folien, die ersten 2 sind Positivkontrolle repliziert und die letzten 2 sind Negativkontrolle repliziert.
      1. Für die Positivkontrollen statt Schritt 4.5.2.2 behandeln Sie des Gewebes mit DN Puffer (30mM Trizma Basis, pH 7,2, 4mM MgCl2, 0, 1 mM DDT vor) und lassen Sie für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Dann auflösen Dnase I in DN-für eine Endkonzentration von 0.1ug Puffer / mL, und wenden Sie es direkt auf der Folie. 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.  Dann waschen der Folie mit 5 Waschen von dH2O 3 Minuten jedem Waschgang. Tupfen Sie die überschüssige Flüssigkeit. Fortsetzen Sie TUNEL-Test wie in Abschnitt 4.5.2.3 gerichtet.
      2. Fügen Sie für den Negativkontrollen das terminal Deoxynucleotidyl Tranferase (TdT) Enzym zu den Proben (wie im Abschnitt 4.5.2.4 beschrieben).
  6. TUNEL Folien sofort nach Abschluss des Tests zu beobachten.
    1. Nehmen Sie Fotos nach dem Zufallsprinzip Intervallen entlang jeder Abschnitt "Haut" am 200 X mit einem fluoreszierenden Mikroskop, mit Filter für beide den Rhodamin Fleck, die zeigt der Apoptotic Zellen und erscheint rot und DAPI die zeigt alle Kerne und erscheint blau, so dass eine Überlagerung der Zellen können generiert werden. Stellen Sie sicher, dass mindestens 100 Zellen pro hüllenquerschnitt pro Probe fotografiert werden. Speichern Sie die Folien in einer dunklen Mikroskop-Box bei-20 ° C.
    2. Zählen von Zellen (blaue DAPI gefärbt) pro Bild. Sicherstellen Sie, dass mindestens 100 Zellen pro hüllenquerschnitt gezählt werden. Um 100 Zellen zu erreichen, zählen Sie alle Zellen innerhalb des Bildes. Wenn weniger als 100 Zellen in einem Bild vorhanden sind, zählen Sie ein anderes Bild, bis mindestens 100 Zellen pro hüllenquerschnitt pro Tier erreicht werden.
    3. Als nächstes die Anzahl der TUNEL positive Zellen in der gleichen Bilder (roter Rhodamin gebeizt). TUNEL positive Zellen, die Apoptose und Nekrose weder Hintergrund angeben, sind einzelne Zellen mit klaren Zellränder (Membranen sind intakt mit keine Lyse). Manchmal schrumpfen die Zellen zu apoptotischen Formkörper.
    4. Suchen Sie die Bereiche in der TUNEL-Test gezählt und analysieren Sie die entsprechenden Regionen auf der H & E gefärbt Histosections. Bestätigen, dass die H & E gefärbt Abschnitte entsprechen Sites der Bd Infektion sorgt für Bd-infizierten Websites werden verwendet, wenn apoptotische Zellen in den TUNEL-Assay zählen.

5. Caspase 3/7 Test

  1. Sammle Zehenspitzen von jedem Tier ( Bd- ausgesetzt und Bd- negative) einmal wöchentlich durch 3. Woche Post Inokulation, und alle zwei Wochen bis zum Ende des Experiments, bis zu 8 Zehen pro Person.
    1. Schneiden Sie die Fußspitze an der zweiten Phalanx mit Flamme sterilisiert Schere, und legen Sie in einem 1,5 mL reaktionscup und frieren Sie sofort bei-80 ° C.
  2. Proteine aus gefrorenen Zeh Probe zu extrahieren.
    1. Legen Sie Proben in 100 µL Probenpuffer (25 mM HEPES pH 7, 5 mM MgCl2) mit zwei Edelstahl-Perlen (3,2 mm) in einer 1,5 mL Schraubverschluss reaktionscup. Lösen Sie Proben von 4 Zyklen 1 min Raupe mit maximaler Geschwindigkeit (in der gleichen Wulst Schläger für Schritt 1.2.1) gefolgt von 3 min auf Eis zu schlagen. Zentrifugieren Sie nach der Lyse Proben bei 12.000 x g und 4 ° C für 5 min. sammeln überstand im Test verwenden.
  3. Proteinkonzentration pro Probe unter Verwendung des Bradford-Tests zu quantifizieren.
    1. In 384 well-Platte 10 µL Protein Extrakt mit 10 µL des Bradford-Reagenz vermischen und 2 min bei Raumtemperatur inkubieren. Führen Sie jede Probe in zweifacher Ausfertigung, zusammen mit einer Reihe von 5 Falten Sie BSA Verdünnung Normen. Lesen Sie die Extinktion bei 595 nm auf eine Extinktion Platte Leser.
  4. Alternativ, wenn die Zehe Spitze Proben sind zu klein (die Proteinkonzentration ist in der Nähe von der niedrigsten Standard, wie aus der Bradford-Test in Schritt 4.3.1 ermittelt, ob die Frösche, die abgetastet werden unter 3 g Gesamtgewicht sind), standardisieren Sie Proben durch Schätzung der Hautoberfläche Bereich mit Fotos, anstelle des Bradford-Tests.
    1. Vor dem Extrahieren fotografieren die Proteine aus der Probe für die Caspase-Assay jeden Zeh bei 40 X Vergrößerung mit einer invertierten Lichtmikroskop.
    2. Analysieren Sie die Zehe-Probe mit einem Computer imaging-Software, durch Schätzung Bereich der Zehe. Zu diesem Zweck eine Linie um den Rand des Toe Clips, und imaging Software-Schätzung-Bereich innerhalb der Form haben. Multiplizieren Sie diesen Bereich mit Pi (3,14), die die Fläche von der 3-dimensionalen Hautprobe ungefähre wird (als Länge x Querschnittsfläche (Pi x Durchmesser) gibt die äußere Fläche einer Röhre).
  5. Führen Sie die Caspase 3/7-Assay.
    1. Fügen Sie in einem 384 auch Lumineszenz-Teller 10 µL Reagenz im Handel erhältlichen Caspase 3/7 und 10 µL Proteinextrakt hinzu. Führen Sie jede Probe in dreifacher Ausfertigung.
    2. Mischen der Reagenzien durch schütteln die Platte langsam für 15 S. Inkubation die Platte vom Licht für 30 min bei Raumtemperatur. Lumineszenz mit einem leuchtenden Platte Reader zu messen.

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Representative Results

TUNEL-Test

Bei den infizierten Tieren als gab es mehr TUNEL positive Zellen in der nicht infizierten Tiere. Die in Situ -Lage der TUNEL positive Zellen unterschieden sich in infiziert und Tiere zu kontrollieren. In Kontrolltieren gab es eine gleichmäßige Verteilung der TUNEL positive Zellen in die dermalen und epidermalen Hautschichten auf einem niedrigen Niveau (siehe Abbildung 1A), aber in den infizierten Tieren und die TUNEL positive Zellen waren häufiger in der Epidermis (Abbildung 1 b). die Sites der Infektion (wie auf der H & E gefärbt Folien beobachtet) wurden beobachtet, wie verklumpten Bd Sporangien verstreut durch die Oberschenkel und ventralen Hautpartien mit keiner in den Handrücken Abschnitten. Während die TUNEL positive Zellen konzentrierten sich mehr auf und direkt auf Seiten der infizierten Zellen (Abbildung 1), gab es auch weiter verbreitete TUNEL positive Zellen in der Epidermis und in epidermalen Schichten, die tiefer als wo waren Bd gewohnt. In Bd infizierte Tiere gab es mehr TUNEL positive Zellen in alle drei Hauttypen analysiert, sondern ein besonders hohes Niveau in der Oberschenkel und Venter Haut (12.01 mal höher (95 % CI: 4.92-26.30) in den Oberschenkel Haut und 22,31 mal höher (95 % CI 5,25-94.82) in der Venter Haut) (Abbildung 2).

Caspase-3/7 Test

Im Laufe der Infektion gab es ein Unterschied in der Caspase-Aktivität. Bei Bd infizierten Tieren war Infektion Intensität positiv korreliert mit Caspase 3/7 Aktivität (Abbildung 3). Auch gab es ein Unterschied zwischen infizierten und nicht infizierten Tieren im Laufe der Zeit Post Inokulation. Caspase 3/7 Aktivität sank in den ersten Wochen nach der Inokulation (mit 48.36 % weniger Aktivität bei infizierten Tieren) und dann gegen Ende der Woche 7 (Abbildung 4) in Bd infizierte Tiere, aber konstant in nicht infizierten erhöht Personen.

Figure 1
Abbildung 1: Terminal Transferase-vermittelten dUTP Nick Ende-Kennzeichnung (TUNEL) in Situ-Assay von infizierten und nicht infizierten Tieren. (A) Bd- Steuerteil Oberschenkel Haut Pseudophryne Corroboree, und B) Bd+ Oberschenkel Haut Abschnitt p. Corroboree befleckt von in Situ TUNEL-Test. Das blau ist DAPI-Färbung zeigt Kernen der Zellen, und die rote ist Rhodamin Fleck, der DNA-Fragmentierung charakteristisch durch Apoptose verursacht angibt. Der gelbe Pfeil zeigt die Position des Clusters Bd gesehen im Bedienfeld "C. C) p. Corroboree Teil der Oberschenkel Haut gefärbt mit H & E. Der H & E Abschnitt ist seriell zu Panel B. Es ist eine Ansammlung von leere Bd Sporangien (Pfeil) und ein paar dunkle unreifen Sporangien nahe der Hautoberfläche. Die Epidermis ist für alle drei Platten oben auf dem Foto. Vergleicht man Platten B und C zeigt, dass die Rhodamine gefärbten Epidermiszellen sind konzentriert, um und unter dem Cluster von Bd und wo Hautschäden ist sichtbar, wie z. B. Mikro-Bläschen Bildung zwischen basalen Epidermiszellen. 400 X Vergrößerung und die Maßstabsleiste zeigt 0,03 mm. Adapted aus Abbildung 2 in Brannelly Et Al. 2017 Peer J22. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: der Anteil der positiven TUNEL (TUNEL +) Zellen pro Hauttyp. Der Anteil der TUNEL positive Apoptotic Zellen pro Hauttyp in p. Corroboree, mit infizierten Tieren zeigt Tiere, die Krankheit erlegen (n = 9) und nicht-infizierte Tiere (n = 10). Fehlerbalken geben 95 %-Konfidenzintervall eines Anteils und * zeigt eine deutliche Zunahme der TUNEL + Zelle Proportionen. Die infizierten Tiere hatte in der rückenhaut 14,38 (95 % CI 3,32 62,24) mal mehr TUNEL positive Zellen als Kontrolltiere (Odds Ratio: Z = 3,57, p < 0,01). In der Oberschenkel-Haut, infizierte Tiere hatten 12,01 (95 % CI: 4.92-26.30; Odds Ratio: Z = 5,46, p < 0,01) mal mehr TUNEL positive Zellen als Kontrolltiere (Pearson Chi Quadrat: χ21 = 44.30, p < 0,01). In der Venter Haut, infizierte Tiere hatten 22.31 (95 % CI 5,25-94.82) mal mehr TUNEL positive Zellen als Kontrolltiere (Odds Ratio: Z = 4,21, p < 0,01). Adaptiert von Abbildung 3 in Brannelly Et Al. 2017 Peer J22. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Die Korrelation zwischen Infektion Intensität, Log10(Zoospore äquivalente) und Caspase 3/7, Log10(Caspase) geimpft Litoria Verreauxii Alpina im Laufe des Experiments. Die Korrelation zwischen Infektion Intensität und Caspase-Aktivität ist 0.463 und die Trendlinie hat eine Gleichung y = (0.229) X + 0.939. Aus Abbildung 4 in Brannelly Et al.angepasst. 2017 Peer J22. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Caspase 3/7-Aktivität durch die 7. Woche für jede Gruppe von Litoria Verreauxii Alpina: Bd-infizierte Tiere, die Krankheit erlegen (n = 4) und nicht infizierten Kontrollen (n = 8). Caspase-Aktivität ist definiert als die Lumineszenz lesen Proteinkonzentration pro Probe für gesteuert und melden dann Basis 10 umgewandelt. Die Caspase-Aktivität (Log10 verwandelt) für jede Gruppe pro Woche. Fehlerbalken zeigen Standardfehler. * zeigt, dass die infizierten Tiere Unterschied sich von den nicht infizierten Kontrollen in dieser Woche. (Lineare gemischte Effekte Modell: Woche, F4 = 11.974, p < 0,01; Woche * Status, F8 = 2.139, p = 0,037; Woche 3 ANOVA, F2,18 = 5.512, p = 0,014), adaptiert aus Abbildung 5 in Brannelly Et Al. 2017 Peer J22. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Wir untersuchten epidermalen Apoptosis und Zelle Tod als ein möglicher Mechanismus der Pathologie der tödlichen Krankheit Chytridiomycosis oder einen Mechanismus der Resistenz gegen Krankheiten in Bd empfänglicher Arten. Wir haben zwei Methoden der Bewertung Absterben von Zellen in der Epidermis, TUNEL-Test zur in Situ epidermalen Zelle Tod Analyse und Caspase 3/7-Assay für die Überwachung der epidermalen Zelle Tod in den Fortschritt der Infektion. Wir fanden, dass Zelltod und Apoptose mit Infektion Last korreliert sind und Zelltod am Ort der Infektion deutlich höher ist. In frühen Infektion gibt es ein Rückgang bei der Apoptose in der Epidermis, aber Apoptose als Erreger Belastung steigt in das infizierte Gewebe erhöht.

Apoptose in Zellen kann mit zahlreichen verschiedenen Vorgehensweisen, jeweils mit vor- und Nachteile getestet werden. Es ist wichtig zu untersuchen, Apoptosis und Zelle Tod mit mehrere Tests, um Ergebnisse zu bestätigen. In dieser Studie haben wir zwei verschiedene Tests untersuchen epidermalen Zelltod und Apoptose in Frösche mit Chytridiomykose erkundet. Erstens, wir erprobt die TUNEL assay um Zelle Tod in Situzu beurteilen. Dieser Test ist zeitaufwendig und teuer pro Probe und Folien müssen sofort gelesen werden, da das Fluoreszenzsignal schnell verblasst. Trotz dieser Einschränkungen sind die Ergebnisse dieses Experiments in Situ zum weiteren Verständnis der Mechanismen des Wirt-Pathogen Interaktionen wichtig. Informationen zur Lokalisierung kann mit dieser Methode bestimmt werden, und in unserer Studie war Apoptose in ein hohes Maß an die Stelle der Pilzinfektion und mehr diffus an anderen Standorten. Zusätzlich ist zu beachten, dass der TUNEL-Test misst DNA-Schäden, verursacht durch eine Reihe von verschiedenen Zellmechanismen Tod einschließlich Pyroptosis, Apoptose und Nekrose17. Zwar gibt es Unterschriften von Apoptose-assoziierten Zelltod (wie z. B. Einzelzellen mit Membranen noch intakt, Protokoll Linie 4.6.3 sehen, die Klassifikation stützt sich auf die Interpretation des Forschers. Da der Mechanismus des Zelltods nicht durch den TUNEL-Assay bestimmt wird, ist es möglich, dass einem anderen nicht-Apoptose Zelle Tod Weg die Erhöhung TUNEL positive Zellen an Morbidität von infizierten Tieren verursacht haben kann. Der Unterschied in welche jedes Assay-Maßnahmen, Muster Unterschiede in den beiden erklären könnte Tests erprobt hier.

Die Caspase 3/7 Test kann verwendet werden, um die Wirkung der Infektion durch die Zeit zu quantifizieren. Da Frosch Zehe Proben klein sind, ist jedoch begrenzt Probe für die Analyse und Standardisierung. Eine gängige Methode zur Probe Standardisierung soll die Gesamt-Protein-Konzentration von jeder Extrakt festgestellt. Da der Bradford Protein Quantifizierung Test Probe verbraucht, ist es keine wirksame Methode für kleine Auszüge. Darüber hinaus fanden wir, dass die Pigmente in der Frosch ausgeschlossen Analyse durch Nano UV-Vis-Spektrometrie Haut. Kleinen Stichprobengrößen verhinderte auch Standardisierung durch Trockengewicht. Wir empfehlen Ihnen, Hautfläche der Zehe mit Fotografie, Schätzung, wie die Zehe Spitze Proben (diese Frösche waren weniger als 3 g in der Körpergröße) zu klein waren, um Assays für die Proteinkonzentration und Caspase Konzentration zulassen. Wir fanden, dass fotografieren die Zehen und mithilfe einer Haut Fläche Schätzung genauso wirksam wie herkömmliche Protein-Konzentration-Analysen ist.

In dieser Studie wir zwei Standardmethoden für die Quantifizierung Zelltod und Apoptose verwendet, aber die Methoden für Amphibien und kleine Gewebeproben angepasst. Zum TUNEL-Test eingeschläfert wir das Tier um sicherzustellen, dass genügend Gewebe zum Test zur Verfügung, und für den Vergleich der verschiedenen Hauttypen Standorten erlaubt. Es ist möglich, diese Methode, um kleinere Gewebeproben, z. B. eine Zehe Gurtband Biopsie anzupassen die Euthanasie des Tieres nicht erfordern würde. Je nach Größe des Tieres, Biopsien könnten eine Zeitlang Serie testen, ähnlich wie unser Ansatz für die Caspase 3/7-Assay.

In Zukunft Studien, empfehlen wir die Verwendung von zusätzlichen Assays für die Erkundung Zelltod und Apoptose im Laufe der Chytridiomykose Infektion, denn es noch viel gibt zu lernen der kausalen Mechanismen der Pathogenese Chytridiomykose. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Apoptose und Absterben von epidermalen Zellen in der Pathogenese der Bdwichtig sein können; jedoch ist mehr Forschung notwendig, um den Einfluss der Apoptose auf Krankheitsverläufe, insbesondere Gastgeber zu bestimmen, die nicht auf eine Infektion. erliegen

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Disclosures

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgments

Wir bedanken uns bei die folgenden Personen, die mit Tierhaltung und Datenerfassung unterstützt: D. Tegtmeier, C. De Jong, J. Hawkes, K. Fossen, S. Percival, M. McWilliams, L. Bertola, M. Stewart, N. Harney und T. Knavel; und M. Merces Unterstützung bei Dissektionen. Wir möchten auch danke M. McFadden, P. Harlow und Taronga Zoo für die Anhebung der L. v. Alpinaund G. Marantelli für die Anhebung der p. Corroboree. Wir danken F. Pasmans, A. Martel für Ratschläge, Apoptose-Assays, C. Constantine, A. Kladnik und R. Webb für Hilfe mit TUNEL-Test, und T. Emeto und W. Weßels für Hilfe mit Protokoll und Kit für Caspase 3/7-Assay. Dieses Manuskript und Protokoll ist adaptiert von Brannelly Et Al 2017 Peer J22.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
POLARstar Omega BMG Labtech Luminescent plate reader
384 well flat clear bottom plate Corning 3707
384 well low flange white flat bottom plate Corning 3570
Agar Bacteriological (Oxoid) Fisher OXLP0011B
Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin Fisher 6764254
Lactose Broth (Oxoid) Fisher OXCM0137B
Sodium Bicarbonate Fisher BP328-500
Tricane-S (MS-222) Fisher NC0872873
Tryptone Fisher BP1421-500
Bovine Serum Albumin Invitrogen 15561020
Sterile rayon swab Medical Wire & Equipment MW-113
ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit Merck Millipore S7165
Coomassie Bradford reagent Pierce 23200
Caspase Glo  3/7 Promega G8090
HEPES buffer Sigma Aldrich H0887-20ML
Magnesium chloride Sigma Aldrich 1374248-1G
Gelatin hydrolysate Enzymatic Sigma-Aldrich G0262
PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X) Thermo/Life 20-012-043
Prepman Thermo/Life 4318930
TaqMan Fast Advanced Master Mix ThermoFisher 4444556
Parafilm Bemis PM996
Clorox bleach Clorox
Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade Fisher BP2818500
ZEISS Axio Scan florescent miscroscope Carl Zeiss Florescent microscope
3.2mm stainless steel beads BioSpec 11079132SS
Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGAT
ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′)		 Taqman Individual design for primers and probe
Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTT
CTCTAGGCAACAGTTT-3′)		 Taqman Individual design for primers and probe
Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′) Taqman Individual design for primers and probe
Rotor-Gene qPCR Instruments Qiagen qPCR machine
Microcentrifuge tubes 1.5ml Fisher 02-681-372
Cell culture petri plates Nunc 263991
Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm BioSpec 11079105Z

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References

  1. Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
  2. Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
  3. Voyles, J., et al. Pathogenesis of chytridiomycosis, a cause of catastrophic amphibian declines. Science. 326 (5952), 582-585 (2009).
  4. Woodhams, D. C., et al. Population trends associated with skin peptide defenses against chytridiomycosis in Australian frogs. Oecologia. 146 (4), 531-540 (2006).
  5. Woodhams, D. C., Voyles, J., Lips, K. R., Carey, C., Rollins-Smith, L. A. Predicted disease susceptibility in a Panamanian amphibian assemblage based on skin peptide defenses. Journal of Wildlife Diseases. 42 (2), 207-218 (2006).
  6. Woodhams, D. C., Rollins-Smith, L. A., Alford, R. A., Simon, M. A., Harris, R. N. Innate immune defenses of amphibian skin: antimicrobial peptides and more. Animal Conservation. 10, 425-428 (2007).
  7. Savage, A. E., Zamudio, K. R. MHC genotypes associate with resistance to a frog-killing fungus. PNAS. 108 (40), 16705-16710 (2011).
  8. Bataille, A., et al. Susceptibility of amphibians to chytridiomycosis is associated with MHC class II conformation. Proceeding of the Royal Society B. 282, 20143127 (2015).
  9. Fites, J. S., Reinert, L. K., Chappell, T. M., Rollins-Smith, L. A. Inhibition of local immune responses by the frog-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Infection and Immunity. 82 (11), 4698-4706 (2014).
  10. Brannelly, L. A., Webb, R. J., Skerratt, L. F., Berger, L. Effects of chytridiomycosis on hematopoietic tissue in the spleen, kidney and bone marrow in three diverse amphibian species. Pathogens and Disease. 74 (7), ftw069 (2016).
  11. Brutyn, M., et al. Batrachochytrium dendrobatidis zoospore secretions rapidly disturb intercellular junctions in frog skin. Fungal Genetics and Biology. 49 (10), 830-837 (2012).
  12. Berger, L., Hyatt, A. D., Speare, R., Longcore, J. E. Life cycle stages of the amphibian chytrid Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 68 (1), 51-63 (2005).
  13. Pasmans, F., et al. Chytridiomycosis related mortality in a midwife toad (Alytes obstetricans) in Belgium. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. 79 (6), 460-462 (2010).
  14. Ellison, A. R., et al. More than skin deep: Functional genomic basis for resistance to amphibian chytridiomycosis. Genome Biology and Evolution. 7 (1), 286-298 (2014).
  15. Fites, J. S., et al. The invasive chytrid fungus of amphibians paralyzes lymphocyte responses. Science. 342 (6156), 366-369 (2013).
  16. Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
  17. Kelly, K. J., Sandoval, R. M., Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. A novel method to determine specificity and sensitivity of the TUNEL reaction in the quantitation of apoptosis. American Journal of Cell Physiology. 284 (5), C1309-C1318 (2003).
  18. Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Diseases of Aquatic Organisms. 60 (2), 141-148 (2004).
  19. Brannelly, L. A., Webb, R., Skerratt, L. F., Berger, L. Amphibians with infectious disease increase their reproductive effort: evidence for the terminal investment hypothesis. Open Biology. 6 (6), 1-24 (2016).
  20. Webb, R., Mendez, D., Berger, L., Speare, R. Additional disinfectants effective against the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 74 (1), 13-16 (2007).
  21. Woods, A., Ellis, R. Laboratory Histopathology: A Complete Reference. , Churchill Livingstone: Edinburgh. (1994).
  22. Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis. PeerJ. 5, e2925 (2017).

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Immunologie und Infektion Ausgabe 135 Apoptose Caspase Histologie Pathologie TUNEL Wildlife Krankheit
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Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis. J. Vis. Exp. (135), e57345, doi:10.3791/57345 (2018).

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