Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bruke Terminal Transferase-mediert dUTP søk Nick slutten-merking (tunnel) og Caspase 3/7 til mål Epidermal celledød i frosker med Chytridiomycosis

Published: May 16, 2018 doi: 10.3791/57345
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1One Health Research Group, College of Public Health, Medical and Veterinary Sciences, James Cook University, 2Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh

Summary

Vi kvantifisere epidermal celledød i frosker med chytridiomycosis bruker to metoder. Først bruker vi terminal transferase-mediert dUTP nick slutten-merking (tunnel) i situ histology til å finne forskjellen klinisk infisert og smittet dyr. Andre gjennomføre vi en tidsserier analyse av apoptose over infeksjon med en caspase 3/7 protein analyse.

Abstract

Amfibier opplever stor tap i biomangfoldet globalt og en av de viktigste årsakene er smittsomme sykdommer-chytridiomycosis. Denne sykdommen er forårsaket av sopp patogen Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), som infiserer og forstyrrer frosk overhuden; imidlertid har patologiske forandringer ikke vært eksplisitt preget. Apoptose (programmert celledød) kan brukes av patogener skade vert vev, men kan også være en vert mekanisme sykdomsresistens patogen fjerning. I denne studien vi kvantifisere epidermal celledød infisert og smittet dyr med to forskjellige analyser: terminal transferase-mediert dUTP nick slutten-merking (tunnel), og caspase 3/7. Bruke ventrale, rygg, og lår hud vev i tunnel analysen, vi observerer celle død i epidermal celler i situ klinisk infiserte dyr og sammenligne celledød med infisert dyr med fluorescerende mikroskopi. For å finne ut hvordan apoptose nivåer i overhuden endre løpet av infeksjon vi fjerne toe-spissen prøver hver fjortende dag over en 8-ukers periode, og bruk en caspase 3/7 analysen med utdraget proteiner for å kvantifisere aktivitet innen prøvene. Vi da relateres caspase 3/7 aktivitet med infeksjon belastning. TUNNEL analysen er nyttig for lokalisering av celle død i situ, men er dyrt og tid intensiv per prøve. Caspase 3/7 analysen er effektivt for store og tid selvfølgelig eksperimenter. Men fordi frosk tå tips biopsier er små er det begrenset ekstrakt tilgjengelig for eksempel standardisering via protein kvantifisering metoder, for eksempel Bradford analysen. Derfor foreslår vi anslå huden overflate gjennom fotografiske analyse av tå biopsies å unngå tidkrevende ekstrakter under eksempel standardisering.

Introduction

Amfibier opplever for tiden en største tap av global biodiversitet av Alle virveldyr taxa1. En viktig årsak til disse synker er dødelig hud sykdom chytridiomycosis, forårsaket av sopp patogen Batrachochytrium dendrobatidis, Bd2. Patogen infiserer overfladisk epidermis, som kan føre til avbrudd i huden fungerer som resulterer i alvorlige elektrolytt tap og hjertestans død3. Ulike potensielle vert immun mekanismer mot Bd er for tiden blir studert, som antimikrobielle peptider4,5, cutaneous bakteriefloraen6, immun celle reseptorer7,8, og lymfocytt aktivitet9,10. Imidlertid utforske få studier om epidermal apoptose og celle død er en immun mekanisme mot denne dødelige patogen.

Celledød, enten gjennom apoptose (programmert celledød) eller nekrose (overværer død), i overhuden kan være en patologi av Bd infeksjon. Tidligere forskning tyder på at Bd infeksjon kan indusere apoptose fordi avbrudd av intracellulær knutepunktene er observert når huden explants er utsatt for zoospore supernatants i vitro11. I tillegg degenerative epidermal endringer i Bd-infiserte frosker er observert med elektronmikroskop12,13. Transcriptomic analyser viser at apoptose veier er upregulated i infisert hud14, og amfibier splenocytes gjennomgår apoptose når de er utsatt for Bd supernatants i vitro15. Til tross for den voksende mengden bevis som tyder på at Bd kan indusere celle apoptose og vert død i vitro, i vivo studier som utforske eller kvantifisere apoptose mekanismer gjennom utviklingen av infeksjon mangler. Videre er det ukjent hvis verten bruker apoptose som en defensiv immun strategi for å bekjempe Bd infeksjon, eller hvis apoptose er en patologi av sykdom.

I denne studien vi som mål å oppdage epidermal celledød og apoptose i infiserte dyr i vivo bruker to metoder: caspase 3/7 protein analysen og terminal transferase-mediert dUTP nick slutten-merking (tunnel) i situ analysen. Som hver analysen oppdager ulike aspekter av celle død16, sammen disse metodene gir en full forståelse av mekanismene som er involvert i celledød, og sikre et nøyaktig mål på effekten. Caspase 3/7 analysen kvantifiserer aktiviteten til effektor caspases 3 og 7, som lar kvantifisering av både indre og ytre apoptose veier. Derimot oppdager tunnel analysen DNA fragmentering, som er forårsaket av celle død mekanismer inkludert apoptose, nekrose og pyroptosis17. Vi bruker tunnel analysen undersøke plasseringen av celledød i epidermis, både klinisk infisert og smittet dyr bruker tre ulike huden deler: dorsum, venter og låret av Pseudophryne corroboree. Denne metoden identifiserer anatomiske området av celledød, samt skille ligger i bestemte epidermal lag. Deretter bruker vi caspase 3/7 analysen for å gjennomføre en gang serien kvantifisering av apoptose i en 8-ukers infeksjon i Litoria verreauxii alpina. Vi tar tå tips prøver hver fjortende dag fra de samme dyrene og kan relatere patogen infeksjon Last med caspase 3/7 aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

James Cook University godkjent dyreetikk i programmer A1875 P. corroboree og A1897 og A2171 for L. v. alpina.

1. husdyrhold og overvåking

  1. Huset dyr, i et miljø som passer for arten, med en passende vann, fôring og rengjøring tidsplan. Sjekk dyr daglig.
    1. Bruke voksne individer av kritisk truede Pseudophryne corroboree (for tunnel analysen, del 4) og truet Litoria verreauxii alpina (for Caspase 3/7 analysen, seksjon 5), donerte fra fange avl fasiliteter. Opprettholde dyrene på 15-18 ° C, på en moss og grus substrat, tåke dem daglig med omvendt osmose vann og mate 3 ganger ukentlig med gut lastet gresshopper.
  2. Samle inn data på hver enkelt gang ukentlig. Vattpinne enkeltpersoner for Bd som beskrevet i trinn 2.1. Veie hvert dyr til neared 0,1 g med en skala og måle sin snute vent (SVL) lengde til nærmeste 0,01 mm bruker ekstern callipers.
  3. Etter vaksinering (som beskrevet i kapittel 3), sjekk dyr daglig for klinisk underskriver av infeksjon (uregelmessig huden slough, inappetence, Ben rødhet, slapphet eller forsinket rettende refleks) i samsvar med dyreetikk retningslinjer. Avlive dyrene hvis klinisk underskriver og sykelighet.
    1. Euthanize med en overdose av tricaine methanesulfonate (MS222) (0,1% w/v MS222 til pH 6-7 med natriumbikarbonat i alderen springvann). Holde dyr i MS222 for 10 min etter alle bevegelse opphører og de viser ingen respons på stimuli.

2. testing for Bd infeksjon

  1. Swabbing for Bd
    1. Vattpinne hvert dyr med en ny sterilt rayon vattpinne (en vattpinne per dyr). Bruk følgende swabbing metode: fem ganger på venter, fem ganger hver lår, side og lem. Dette er totalt 45 slag.
    2. Forsiktig Roter vattpinnen i og mellom slag å sikre effektiv erobringen av DNA. Bryte vattpinne spissen til 1,5 mL microcentrifuge rør og lagre på 20 ° C til utvinning.
  2. DNA utvinning og qPCR analysen
    1. Pakk ut genomisk DNA fra av vattpinner ved å legge til 50 µL av en kommersielt tilgjengelig DNA utvinning reagens med 30-40 mg av 0,5 mm silica perler. Perle slo prøvene i en perle beater celle disrupter med maksimal hastighet i 2 minutter. Etter det perle beater trinnet sentrifuge prøvene 2000 x g for 1 min.
    2. Inkuber prøvene ved 100 ° C i 10 min, og la den avkjøles. Sentrifuge prøvene 5000 x g i 3 minutter, og deretter overføre nedbryting til individuelle 1,5 mL mikro sentrifuge rør og lagre på 20 ° C til qPCR.
    3. Bruk kvantitativ PCR (qPCR) etter Boyle et al. 200418 analysere infeksjonen laste. Bruk følgende endringer:
      1. Fortynne DNA utvinning prøver 6:100 med dobbel deionisert vann. Legge til 0,7 µL av bovin serum albumin (BSA) i hver brønn for å hindre PCR hemming. Kjøres hver prøve singlicate. På hver plate du bruk en negativ (ingen mal)-kontroll og en positiv kontroll med en rekke fortynning standarder til å beregne zoospore (infeksjon) belastning.

3. vaksinering

  1. Kultur Bd
    1. Forberede kultur suppen ved å legge til 16 g tryptone, gelatin hydrolyse 2 g og 4 g av laktose (TGHL) 1 L deionisert vann. Autoclave (121 ° C i 40 minutter) og la suppen å kjøle.
    2. Vaksinere Bd isolere (i dette tilfellet, isolert fra New South Wales isolere, AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1, passasjen nummer 11) i en TGHL buljong og vokse for 7 d på 23 ° C og deretter overføre kjøttkraft kulturen til TGHL agar plater.
    3. For å lage plater, legge til 16 g av tryptone, 2 g gelatin hydrolyse, 4 g av laktose (TGHL) og 10 g bakteriologiske agar 1 L deionisert vann og autoklav (121 ° C i 40 minutter). Når blandingen er kult nok å ta, men før det stivner, hell TGHL agar i 92 mm diameter kultur plater slik at de er 1/4 til 1/3 full, i en klasse II biologiske sikkerhetskabinett kabinett.
    4. Når agar har styrket og avkjølt helt, vaksinere hver plate med 0,5 mL Bd fra flytende kjøttkraft og jevnt. Tillate Bd kjøttkraft blandingen å tørke på plate ca 1t og deretter forsegle plater med plast parafin film. Inkuber plater agar side ned ved 23 ° C i 5-7 d.
  2. Flom plater for zoospore inoculation løsning
    1. Sjekk zoospore motilitet under en invertert lys mikroskopet slik levedyktighet daglig før vaksinering. Når zoospore utgivelse er høy, med mange zoospores svømming utenfor sporangia, er kulturen klar for vaksinering.
    2. Flommen hver plate med 3 mL alderen vann eller kunstige dammen vann, ved å helle vann inn i platen og rugende ved romtemperatur for 10 min å tillate zoospores å løslate i vannet. Etter vekst, Dekanter zoospore suspensjon i en ny sterile containeren.
    3. Beregne zoospore konsentrasjon følg produsentens instruksjoner ved hjelp av en haemocytometer. Når konsentrasjonen av zoospore suspensjon er kjent, fortynne suspensjon å en konsentrasjon av 1 x 106 zoospores per 3 mL med alderen vann fra springen.
  3. Vaksinere dyr
    1. Vaksinere hvert dyr av helle 3 mL inoculum blandingen over sin venter19 i individuelle 50 mL beholdere. Tillate overflødig inoculum å samle inn beholderen vaksinering. La hvert dyr i individuelle inoculation beholderen på 24 h slik infeksjon, og etter 24 h inoculation, returnere hver enkelt til et desinfiseres terrarium.
      1. Desinfisere terraria bruker en 13% volum/volum (v/v) kommersielle blekemidler løsning20, skylles med vann og minst to ganger, og la det tørke i ikke mindre enn 24 timer.
    2. For Bd-negative kontroller, mock vaksinere dyrene med samme metodene som 3.2 3,3, men flom Bd-gratis agar plater med 5 mL av alderen vann fra springen i stedet for Bd inokulert agar plater.

4. tunnel analysen

  1. Avlive dyrene det viser klinisk underskriver av chytridiomycosis, som beskrevet i trinn 1.3.1 og av Bd-negativ kontrollen dyr.
  2. Dissekere hud (rygg, ventrale og lår) prøver fra hvert dyr. Reparere hud prøvene for 2t i 4% v/v fosfat bufret formaldehyd. Den korte og konsekvente bestemmer tiden tillater vev løses fullt, men også gir effektiv og nøyaktig immunohistochemistry flekker. Deretter overføre til 80% etanol til innebygging snitting.
  3. Bygge inn huden i parafinvoks for histologiske forberedelse etter standardmetoder21. Kort, protokollen er som følger:
    1. Tørke vev i en gradert rekke etanol, og fjern etanol med xylen. Bygge vevet i parafinvoks, og plasser alle tre hud prøver for hver enkelt i en parafin blokk.
  4. Delen huden med en mikrotom følge standard histologiske forberedelse21. Seksjon vevet serielt på 5 µm og deretter påføre til hydrofile glass lysbilder. Plass fire føljetong histosections per hudtype per lysbilde. Gjøre tre lysbilder per person med føljetong huden deler, husk at hvert lysbilde har fire deler av hvert vev festet.
  5. Stain lysbildene i følgende rekkefølge:
    1. Flekk det første lysbildet med hematoxylin etterfulgt av eosin counterstaining (H & E). Dette lysbildet er å visualisere hvor Bd sporangia innenfor huden.
    2. Flekk det andre lysbildet etter en kommersielt tilgjengelig tunnel analysen for histologiske forberedelse og følg produsentens instruksjoner, som er beskrevet nedenfor.
      1. Først deparaffinize avsnittene vev i en coplin krukke ved å vaske lysbildene med tre endringer av xylen for 5 min per vask, og følge med to endringer av 100% etanol i 5 min hver vask. Følg med en vask 95% etanol for 3 min og deretter 70% etanol for 3 min. Finish med en vask av PBS i 5 min.
      2. Pretreat vev med fersk utvannet protein oversikten enzym (proteinasen K på en konsentrasjon på 20 μg/mL fortynnet i PBS), og legge til direkte i lysbildet. Tillat for å ruge i 15 min. vask med to endringer av PBS i en coplin krukke i 2 minutter.
      3. Trykk av overflødig væske og slukke i 3.0% Hydrogenperoksid i PBS i en coplin krukke i 2 minutter ved romtemperatur. Skyll to ganger med PBS, i fem minutter hver vask.
      4. Trykk av overflødig væske, deretter bruke 75 µL/5 cm2 likevekt bufferen direkte på vevet på lysbildet. Inkuber for 10 s. Tap av overflødig væske rundt delen og bruker 55 µL/5 cm2 av arbeider terminal deoxynucleotidyl tranferase (TdT) enzymet. Inkuber i en fuktet kammer 1t på 37 ° C.
      5. Etter TdT inkubering, sette lysbildet i et coplin glass arbeider styrke stopp/vaskebuffer, agitere for 15 s og Inkuber i 10 min ved romtemperatur. Vask lysbildet med tre endringer av PBS for 1 min per vask. Trykk av overflødig væske.
      6. Bruke anti-digoxigenin konjugert (rhodamine) som har blitt varmet til romtemperatur til vev, 65 µL/5 cm2. Inkuber i en fuktet kammer i 30 min ved romtemperatur og unngå eksponering for lys. Vask med fire endringer av PBS i 2 minutter per vask. Trykk av overflødig væske.
      7. Fullfør ved å legge til 15 µL på 0,5 - 1 µg/mL DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) i lysbildet montering medium i lysbildet, som fungerer som en teller flekk. Da dekke med en cover slip og forsegle neglelakk eller gummi sement. Tillate lysbilder tørke i mørket som analysen er lysfølsom.
    3. Flekk tredje lysbilde er farget med tunnel analysen og DAPI counterstain, men bruk som en positiv og negativ kontroll for hvert utvalg.
      Merk: I de 4 histosections på kontroll lysbildene, de første 2 er positiv kontroll gjentak og 2 siste er negativ kontroll gjentak.
      1. Av positive kontrollene, i stedet for trinn 4.5.2.2, pre-spandere vevet med DN buffer (30mM trizma base, pH 7.2, 4mM MgCl2, 0,1 mM DDT) og la ruge ved romtemperatur i 5 minutter. Deretter oppløse Dnase I DN buffer for en siste konsentrasjon av 0.1ug / mL, og bruke det direkte på lysbildet. Inkuber i 15 minutter ved romtemperatur.  Deretter vaskes lysbildet med 5 vask av dH2O i 3 minutter hver vask. Blot av overflødig væske. Deretter fortsette tunnel analysen som anvist i delen 4.5.2.3.
      2. For de negative kontrollene ikke Legg til terminal deoxynucleotidyl tranferase (TdT) enzymet eksemplene (som beskrevet i delen 4.5.2.4).
  6. Observere tunnel lysbilder umiddelbart ved ferdigstillelse av analysen.
    1. Ta bilder tilfeldige intervaller langs hver hud delen på 200 X bruker en fluorescerende mikroskop, bruke filtre for begge rhodamine flekken, som avslører apoptotisk cellene og rødt, og DAPI som avslører alle kjerner og vises blå, slik at en overlapping av cellene kan genereres. Sikre minst 100 celler er fotografert per huden seksjon per prøve. Lagre lysbilder i en mørk mikroskopet på 20 ° C.
    2. Telle celler (blå DAPI farget) per bilde. Sikre minst 100 celler telles per huden delen. For å nå 100 celler, Tell alle celler i bildet. Hvis mindre enn 100 celler finnes i ett bilde, telle et annet bilde til minst 100 celler er nådd per huden seksjon per dyr.
    3. Neste, telle antall tunnel positiv celler i de samme bildene (røde rhodamine farget). TUNNEL positiv celler, som angir apoptose og ikke nekrose eller bakgrunnen, er enkeltceller med klare celle kanter (membraner er intakt med ingen lysis). Noen ganger forminskes cellene til skjemaet apoptotisk organer.
    4. Finne områdene telles i tunnel analysen, og analysere de tilsvarende områdene på H & E farget histosections. Bekrefte at H & E farget delene tilsvarer områder av Bd -smitte, som sikrer Bd-infiserte områder brukes ved telling apoptotisk celler i tunnel analysen.

5. Caspase 3/7 analysen

  1. Samle Tåspissene fra hvert dyr ( Bd- utsatt og Bd- negativ) gang ukentlig gjennom uke 3 innlegg vaksinering og fortnightly slutten av eksperimentet, opp til 8 tær per person.
    1. Klipp spissen tå i den andre phalange med flammen-steriliseres saks, og plasser i en 1,5 mL microtube fryse umiddelbart på-80 ° C.
  2. Ekstra proteiner fra frosne tå utvalg.
    1. Sett prøvene i 100 µL eksempel bufferen (25 mM HEPES pH 7, 5 mM MgCl2) med to rustfritt stål perler (3,2 mm) i en 1,5 mL skrukork microtube. Lyse prøver av 4 sykluser av 1 min perle slo med maksimal hastighet (i den samme perle beater som brukes i trinnet 1.2.1) etterfulgt av 3 min på is. Etter lyse, sentrifuge eksempler på 12.000 x g og 4 ° C i 5 min. samle nedbryting bruke i analysen.
  3. Kvantifisere protein konsentrasjon per utvalget med Bradford analysen.
    1. En 384 godt plate, bland 10 µL av protein pakke med 10 µL av Bradford reagensen og ruge i 2 minutter ved romtemperatur. Utføre hver prøve i duplikat, sammen med en rekke 5 brett BSA fortynning standarder. Lese absorbans ved 595 nm på en absorbansen plate leser.
  4. Alternativt, hvis tå tips prøvene er for liten (protein konsentrasjonen er nær den laveste standarden som bestemmes av Bradford analysen i trinn 4.3.1, eller hvis froskene som tas under 3 g totalvekt), standardisere prøver estimering av hudoverflaten området med fotografier, i stedet for Bradford analysen.
    1. Tidligere utdrager fotografi proteiner fra utvalget for caspase analysen, hver toe på 40 X forstørrelse med en invertert lys mikroskop.
    2. Analysere tå prøven ved hjelp av en datamaskin bildebehandlingsprogrammer, estimering av området på tå. Gjør dette ved å tegne en linje rundt kanten av klippet tå, og har tenkelig programvare estimat området i figuren. Deretter multiplisere området med pi (3.14), som vil anslå areal på 3-dimensjonal hud prøven (som lengde x tverrsnitt (pi x diameter) gir den ytre overflaten av et rør).
  5. Utføre caspase 3/7 analysen.
    1. En 384 godt luminescence tallerken, Legg 10 µL av kommersielt tilgjengelige caspase 3/7 reagensen og 10 µL av protein ekstrakt. Kjøre hvert utvalg i tre eksemplarer.
    2. Bland reagensene ved risting platen sakte for 15 s. Incubate platen fra lys for 30 min ved romtemperatur. Måle luminescence likner en selvlysende plate.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TUNNEL analysen

Det var flere tunnel positiv celler i den infiserte dyr enn i infisert kontrollen dyr. Hvor i situ tunnel positiv celler forskjellig i infisert og kontrollere dyr. I kontrollen dyr var det en jevn distribusjon av tunnel positiv celler gjennom den dermal og epidermal hud lag på lavt nivå (se figur 1A), men i den infiserte dyr, tunnel positiv cellene var hyppigere i overhuden (figur 1B). nettstedene til infeksjon (som observert på H & E farget lysbilder) ble observert som klumpet seg Bd sporangia spredt gjennom lår og ventrale huden deler med ingen i delene dorsum. Mens tunnel positiv celler var mer konsentrert på og direkte tilknytning til nettsteder av infiserte celler (figur 1 c), det var også mer utbredt tunnel positiv celler over overhuden og i epidermal lag som var dypere enn hvor Bd bodde. I Bd infisert dyr det var flere tunnel positiv celler i alle tre hudtyper analysert, men spesielt høy i lår og venter huden (12.01 ganger høyere (95% CI: 4,92-26.30) i låret hud og 22.31 ganger høyere (95% CI 5,25-94.82) i den venter hud) (figur 2).

Caspase 3/7 analysen

I løpet av infeksjonen var det en forskjell i caspase aktivitet. I Bd infisert dyr, var infeksjon intensitet positivt korrelert med caspase 3/7 aktivitet (Figur 3). Det var også en forskjell mellom infisert og smittet dyr gjennom tid, post vaksinering. Caspase 3/7 aktivitet redusert i de første ukene etter vaksinasjon (med 48.36% mindre aktivitet i infiserte dyr), og deretter økes mot slutten av uken 7 (Figur 4) i Bd infisert dyr, men forble konstant i infisert enkeltpersoner.

Figure 1
Figur 1: Terminal transferase-mediert dUTP nick slutten-merking (tunnel) i situ analysen av infisert og infisert dyr. A) Bd- postkontroll lår huden av Pseudophryne corroboree, og B) Bd+ lår huden delen av P. corroboree farget av i situ tunnel analysen. Blå DAPI flekker som angir kjerner i cellene, og røde er rhodamine flekken, som angir DNA fragmentering karakteristisk forårsaket av apoptose. Den gule pilen indikerer plasseringen av Bd klyngen i panelet C. C) P. corroboree delen av låret hud farget med H & E. H & E delen er seriell panelet B. Det er en klynge av tom Bd sporangia (pil) og noen mørke umoden sporangia nær huden overflate. For alle tre paneler er overhuden på toppen av bildet. Paneler B og C viser at rhodamine farget epidermal celler er konsentrert rundt og under klyngen av Bd og hvor hudskader er synlige, for eksempel mikro-vesicle formasjon mellom basale epidermal celler. 400 X forstørrelse og baren skala angir 0,03 mm. tilpasset fra figur 2 i Brannelly et al. 2017 Peer J22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: andelen tunnel positiv (tunnel +) celler per hudtype. Andelen av tunnel positiv apoptotisk celler per hudtype i P. corroboree, med infiserte dyr som viser dyr som døde av sykdom (n = 9) og infisert kontrollen dyr (n = 10). Feilfelt viser 95% sikkerhet intervaller av en prosentandel og * angir en betydelig økning i tunnel + celle proporsjoner. Dorsal huden, den infiserte dyr hadde 14.38 (95% CI 3.32-62.24) ganger flere tunnel positiv celler enn kontrollen dyr (Odds Ratio: Z = 3.57, p < 0,01). I låret huden, infiserte dyr hadde 12.01 (95% CI: 4,92-26.30; Odds Ratio: Z = 5.46, p < 0,01) ganger flere tunnel positiv celler enn kontrollen dyr (Pearson's Chi kvadrat: χ21 = 44.30, p < 0,01). Venter huden, infiserte dyr hadde 22.31 (95% CI 5,25-94.82) ganger flere tunnel positiv celler enn kontrollen dyr (Odds Ratio: Z = 4,21, p < 0,01). Tilpasset fra Figur 3 i Brannelly et al. 2017 Peer J22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Sammenhengen mellom infeksjon intensitet, Logg10(zoospore ekvivalenter) og caspase 3/7, Logg10(Caspase) av inokulert Litoria verreauxii alpina i løpet av eksperimentet. Sammenhengen mellom infeksjon intensitet og caspase aktivitet er 0.463, og trendlinjen har en ligning av y = (0.229) x + 0.939. Tilpasset fra Figur 4 i Brannelly et al. 2017 peer J22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Caspase 3/7 aktivitet gjennom uke 7 for hver gruppe med Litoria verreauxii alpina: Bd-infisert dyr som døde av sykdom (n = 4) og infisert kontroller (n = 8). Caspase aktivitet er definert som luminescence lesing kontrolleres av protein konsentrasjon per prøve og logge grunntall 10 forvandlet. Caspase aktivitet (Logg10 forvandlet) for hver gruppe per uke. Feilfelt viser standardfeil. * Angir at den infiserte dyr skilte seg fra infisert kontrollene på denne uken. (Lineær blandet effekter modell: uke, F-4 = 11.974, p < 0.01; uke * status, F8 = 2.139, p = 0.037; Uke 3 ANOVA, F2,18 = 5.512, p = 0.014), tilpasset fra figur 5 i Brannelly et al. 2017 Peer J22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi utforsket epidermal apoptose og celledød som en potensiell mekanisme patologi av den dødelige sykdommen chytridiomycosis eller en mekanisme for sykdomsresistens i Bd utsatt arter. Vi brukte to metoder for å vurdere celledød i overhuden, tunnel analysen for i situ epidermal celle død analyse og caspase 3/7 analysen for overvåking epidermal celledød gjennom utviklingen av infeksjon. Vi fant at celledød og apoptose er korrelert med infeksjon belastning og celledød er betydelig høyere området av smitte. I tidlig infeksjon, det er en nedgang i apoptose i overhuden, men apoptose øker som patogen byrde øker i infiserte vevet.

Apoptose i celler kan testes ved hjelp av mange ulike tilnærminger, hver med fordeler og begrensninger. Det er viktig å studere apoptose og celle død med flere analyser for å bekrefte resultatene. I denne studien utforsket vi to forskjellige analyser for å undersøke epidermal celledød og apoptose i frosker med chytridiomycosis. Først, vi trialled i tunnel analysen for å vurdere celle død i situ. Denne testen er tidkrevende og kostbar per prøve lysbilder må leses umiddelbart som fluorescerende signalet raskt forsvinner. Til tross for disse begrensningene er resultatene av dette i situ eksperimentet viktig for videre forstå mekanismene av vert-patogen interaksjoner. Informasjon om lokalisering kan bestemmes ved hjelp av denne metoden, og i vår undersøkelse apoptose var til stede i høye nivåer på stedet av fungal infeksjoner og mer diffusely på andre steder. I tillegg må det bemerkes at tunnel analysen måler DNA skade, som kan være forårsaket av en rekke ulike celle død mekanismer inkludert apoptose, nekrose og pyroptosis17. Mens det er signaturer av apoptose-assosiert celledød (som enkeltceller med membraner ser intakt, protokollen linje 4.6.3, klassifiseringen avhengig tolkning av forskeren. Fordi mekanisme celledød ikke er bestemt av tunnel analysen, er det mulig at en annen ikke-apoptose-programmert celle død veien kan ha forårsaket økningen i tunnel positiv celler på sykelighet av infiserte dyr. Forskjellen i hva hver analysen tiltak kan forklare mønster forskjeller i to søk trialled her.

Caspase 3/7 analysen kan brukes å kvantifisere effekten av smitte gjennom tiden. Som frosk tå eksempler er små, er det imidlertid begrenset utvalg for analyse og standardisering. En vanlig metode for eksempel standardisering er å bestemme total protein konsentrasjonen av hver pakke. Som Bradford protein kvantifisering analysen forbruker prøven, er det ikke en effektiv metode for små ekstrakter. I tillegg fant vi at pigmenter i frosken huden utelukket analyse av nano UV-Vis massespektrometri. Små utvalgsstørrelser også forhindret standardisering av tørr vekt. Foreslår vi anslå huden areal på tå med fotografering, tå tips prøvene (disse froskene var mindre enn 3 g i kroppsstørrelse) var for liten til å tillate analyser for både protein konsentrasjon og caspase konsentrasjon. Vi fant at fotografere tærne og bruke en hud areal anslag er så effektiv som tradisjonelle protein konsentrasjonen analysene.

I denne studien vi brukte to standard teknikker for kvantifisere celledød og apoptose, men tilpasset metodene for amfibier og små vevsprøver. For tunnel analysen euthanized vi dyret for å sikre nok tissue var tilgjengelig for analysen, og tillatt for sammenligning av ulike huden steder. Det er mulig å tilpasse denne metoden å mindre vevsprøver, for eksempel en tå webbing biopsi, som ikke ville kreve euthanasia av dyret. Avhengig av dyret, biopsies kan tillate tid serien teste ligner på vår tilnærming for caspase 3/7 analysen.

I fremtidige studier, vi foreslå bruken av flere analyser for å utforske celledød og apoptose i løpet av chytridiomycosis fordi det er fortsatt mye å lære av de kausale chytridiomycosis patogene mekanismene. Disse resultatene tyder på at apoptose og epidermal celledød kan være viktig i patogenesen av Bd; men er mer forskning nødvendig for å bestemme påvirker apoptose sykdom utfall, spesielt i verter som ikke bukke til infeksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi takker følgende personer som hjalp med rettsgrunnlag og datainnsamlingen: D. Tegtmeier, C. De Jong, J. Hawkes, K. Fossen, S. Percival, M. McWilliams, L. Bertola, M. Stewart, N. Harney og T. Knavel; og M. Merces for hjelp med disseksjoner. Vi vil også gjerne takke M. McFadden, P. Harlow og Taronga Zoo for å øke L. v. alpinaog G. Marantelli for å øke P. corroboree. Vi takker F. Pasmans, A. Martel for råd om apoptose analyser, C. Konstantin, A. Kladnik og R. Webb for hjelp med tunnel analysen, og T. Emeto og W. Weßels for hjelp med protokollen og utstyr for caspase 3/7 analysen. Dette manuskriptet og protokollen er tilpasset fra Brannelly et al 2017 Peer J22.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
POLARstar Omega BMG Labtech Luminescent plate reader
384 well flat clear bottom plate Corning 3707
384 well low flange white flat bottom plate Corning 3570
Agar Bacteriological (Oxoid) Fisher OXLP0011B
Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin Fisher 6764254
Lactose Broth (Oxoid) Fisher OXCM0137B
Sodium Bicarbonate Fisher BP328-500
Tricane-S (MS-222) Fisher NC0872873
Tryptone Fisher BP1421-500
Bovine Serum Albumin Invitrogen 15561020
Sterile rayon swab Medical Wire & Equipment MW-113
ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit Merck Millipore S7165
Coomassie Bradford reagent Pierce 23200
Caspase Glo  3/7 Promega G8090
HEPES buffer Sigma Aldrich H0887-20ML
Magnesium chloride Sigma Aldrich 1374248-1G
Gelatin hydrolysate Enzymatic Sigma-Aldrich G0262
PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X) Thermo/Life 20-012-043
Prepman Thermo/Life 4318930
TaqMan Fast Advanced Master Mix ThermoFisher 4444556
Parafilm Bemis PM996
Clorox bleach Clorox
Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade Fisher BP2818500
ZEISS Axio Scan florescent miscroscope Carl Zeiss Florescent microscope
3.2mm stainless steel beads BioSpec 11079132SS
Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGAT
ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′)		 Taqman Individual design for primers and probe
Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTT
CTCTAGGCAACAGTTT-3′)		 Taqman Individual design for primers and probe
Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′) Taqman Individual design for primers and probe
Rotor-Gene qPCR Instruments Qiagen qPCR machine
Microcentrifuge tubes 1.5ml Fisher 02-681-372
Cell culture petri plates Nunc 263991
Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm BioSpec 11079105Z

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
  2. Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
  3. Voyles, J., et al. Pathogenesis of chytridiomycosis, a cause of catastrophic amphibian declines. Science. 326 (5952), 582-585 (2009).
  4. Woodhams, D. C., et al. Population trends associated with skin peptide defenses against chytridiomycosis in Australian frogs. Oecologia. 146 (4), 531-540 (2006).
  5. Woodhams, D. C., Voyles, J., Lips, K. R., Carey, C., Rollins-Smith, L. A. Predicted disease susceptibility in a Panamanian amphibian assemblage based on skin peptide defenses. Journal of Wildlife Diseases. 42 (2), 207-218 (2006).
  6. Woodhams, D. C., Rollins-Smith, L. A., Alford, R. A., Simon, M. A., Harris, R. N. Innate immune defenses of amphibian skin: antimicrobial peptides and more. Animal Conservation. 10, 425-428 (2007).
  7. Savage, A. E., Zamudio, K. R. MHC genotypes associate with resistance to a frog-killing fungus. PNAS. 108 (40), 16705-16710 (2011).
  8. Bataille, A., et al. Susceptibility of amphibians to chytridiomycosis is associated with MHC class II conformation. Proceeding of the Royal Society B. 282, 20143127 (2015).
  9. Fites, J. S., Reinert, L. K., Chappell, T. M., Rollins-Smith, L. A. Inhibition of local immune responses by the frog-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Infection and Immunity. 82 (11), 4698-4706 (2014).
  10. Brannelly, L. A., Webb, R. J., Skerratt, L. F., Berger, L. Effects of chytridiomycosis on hematopoietic tissue in the spleen, kidney and bone marrow in three diverse amphibian species. Pathogens and Disease. 74 (7), ftw069 (2016).
  11. Brutyn, M., et al. Batrachochytrium dendrobatidis zoospore secretions rapidly disturb intercellular junctions in frog skin. Fungal Genetics and Biology. 49 (10), 830-837 (2012).
  12. Berger, L., Hyatt, A. D., Speare, R., Longcore, J. E. Life cycle stages of the amphibian chytrid Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 68 (1), 51-63 (2005).
  13. Pasmans, F., et al. Chytridiomycosis related mortality in a midwife toad (Alytes obstetricans) in Belgium. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. 79 (6), 460-462 (2010).
  14. Ellison, A. R., et al. More than skin deep: Functional genomic basis for resistance to amphibian chytridiomycosis. Genome Biology and Evolution. 7 (1), 286-298 (2014).
  15. Fites, J. S., et al. The invasive chytrid fungus of amphibians paralyzes lymphocyte responses. Science. 342 (6156), 366-369 (2013).
  16. Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
  17. Kelly, K. J., Sandoval, R. M., Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. A novel method to determine specificity and sensitivity of the TUNEL reaction in the quantitation of apoptosis. American Journal of Cell Physiology. 284 (5), C1309-C1318 (2003).
  18. Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Diseases of Aquatic Organisms. 60 (2), 141-148 (2004).
  19. Brannelly, L. A., Webb, R., Skerratt, L. F., Berger, L. Amphibians with infectious disease increase their reproductive effort: evidence for the terminal investment hypothesis. Open Biology. 6 (6), 1-24 (2016).
  20. Webb, R., Mendez, D., Berger, L., Speare, R. Additional disinfectants effective against the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 74 (1), 13-16 (2007).
  21. Woods, A., Ellis, R. Laboratory Histopathology: A Complete Reference. , Churchill Livingstone: Edinburgh. (1994).
  22. Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis. PeerJ. 5, e2925 (2017).

Tags

Immunologi og infeksjon utstede 135 apoptose Caspase Histology patologi tunnel Wildlife sykdom
Bruke Terminal Transferase-mediert dUTP søk Nick slutten-merking (tunnel) og Caspase 3/7 til mål Epidermal celledød i frosker med Chytridiomycosis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brannelly, L. A., Roberts, A. A.,… More

Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis. J. Vis. Exp. (135), e57345, doi:10.3791/57345 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter