Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

С помощью dUTP трансферазы терминал-опосредованной Ник конце маркировки (TUNEL) и Caspase 3/7 Assays для измерения эпидермальный клеточной гибели лягушек с Chytridiomycosis

Published: May 16, 2018 doi: 10.3791/57345
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1One Health Research Group, College of Public Health, Medical and Veterinary Sciences, James Cook University, 2Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh

Summary

Мы количественно эпидермального клеточной гибели лягушек с chytridiomycosis, с использованием двух методов. Во-первых мы используем маркировки конце терминал dUTP трансферазы опосредованной Ник (TUNEL) в situ гистология для определения различия между клинически инфицированных и неинфицированных животных. Во-вторых мы проводим анализ временных рядов апоптоза над инфекции с помощью анализа белка каспазы-3/7.

Abstract

Земноводные испытывают большие потери биоразнообразия во всем мире и одна из основных причин является chytridiomycosis инфекционных заболеваний. Это заболевание обусловлено грибкового патогена Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), который заражает и разрушает лягушка эпидермиса; Однако патологические изменения не характеризовались явным образом. Апоптоз (запрограммированная смерть клетки) может использоваться патогенами для повреждать ткани макроорганизма, но также может быть принимающей механизм болезни сопротивления для удаления патогена. В этом исследовании, мы количественно эпидермальных клеток смерть инфицированных и неинфицированных животных, с использованием двух различных анализов: терминал dUTP трансферазы опосредованной Ник конце маркировки (TUNEL) и caspase 3/7. С помощью вентральных, спинной и ткани кожи бедра в TUNEL assay, мы наблюдаем мобильный смерти клетки эпидермиса в situ клинически зараженных животных и сравнивать гибель клеток с неинфицированным животных с помощью флуоресцентной микроскопии. Для того, чтобы определить, как изменить уровни апоптоз в эпидермисе течение инфекции мы удалить образцы мыс Совет недели над 8-недельного периода и использовать пробирного каспазы-3/7 с извлеченные протеины для количественной оценки деятельности в рамках образцы. Затем мы сопоставляем активность каспазы-3/7 с нагрузкой инфекции. TUNEL assay полезен для локализации клеток смерть на месте, но дорого и времени интенсивно на сэмпл. Assay каспазы-3/7 эффективен для больших выборок и времени курс экспериментов. Однако потому что маленькие лягушки мыс наконечник биопсии имеется ограниченный экстракт для выборки стандартизации через методы количественной оценки белков, таких как assay Брадфорд. Поэтому мы предлагаем оценки площади поверхности кожи через фотографического анализа мыс биопсий, чтобы избежать потребления экстракты во время выборки стандартизации.

Introduction

Амфибии в настоящее время испытывают один наибольшие потери глобального биоразнообразия любой позвоночных таксонов1. Главной причиной этих падений является фатальным кожи chytridiomycosis болезни, вызванные грибкового патогена Batrachochytrium dendrobatidis, Bd2. Возбудитель поверхностно заражает эпидермис, что может привести к нарушению функции кожи, что приводит к тяжелой электролита потери, инфаркт миокарда и смерти3. В настоящее время изучаются различные потенциал принимающей иммунные механизмы против Bd , например антимикробных пептидов4,5, кожный бактериальной флоры6, иммунных клеток рецепторов7,8, и активность лимфоцитов9,10. Однако несколько исследований изучить ли эпидермальный апоптоз и клеток смерть является механизм иммунитета против этого смертоносного возбудителя.

Патология Bd -инфекции может быть смерть клетки, apoptosis (запрограммированная смерть клетки) или некроз (незапрограммированным смерти), в эпидермисе. Предыдущие исследования свидетельствуют о том, что инфекция Bd может индуцировать апоптоз, потому что нарушения внутриклеточного соединения наблюдается, когда кожа эксплантов подвергаются zoospore supernatants в vitro11. Кроме того дегенеративные изменения эпидермиса в Bd-инфицированных лягушки наблюдаются с помощью электронной микроскопии12,13. Транскриптомики анализы показывают, что apoptosis пути upregulated в14инфицированных кожи, и амфибии splenocytes проходят apoptosis, когда они подвергаются воздействию Bd supernatants в vitro15. Несмотря на растущий объем доказательств, предполагая, что Bd может вызвать apoptosis и принимающей ячейки смерти в пробирке, в vivo исследований, которые изучить или количественно апоптоз, что отсутствуют механизмы через прогрессирование инфекции. Кроме того это неизвестно, если узел использует апоптоз как оборонительные иммунной стратегия борьбы с Bd инфекции, или если апоптоз патологии заболеваний.

В этом исследовании, мы пытались обнаружить смерть эпидермальные клетки и апоптоз в зараженных животных в естественных условиях с помощью двух методов: assay протеина каспазы-3/7 и терминал dUTP трансферазы опосредованной Ник маркировки конце () в situ assay TUNEL. Как каждый assay обнаруживает различные аспекты смерти клетки16, вместе эти методы обеспечивают полное понимание механизмов, участвующих в смерти клетки и обеспечить точное измерение эффекта. Assay каспазы-3/7 дает количественную оценку деятельности эффекторных caspases 3 и 7, который позволяет количественной оценки как внутренние и внешние апоптоз пути. В противоположность этому TUNEL assay выявляет фрагментацию ДНК, которая вызвана механизмов смерти клеток, включая апоптоза, некроз и pyroptosis17. Мы используем TUNEL assay расследовать на месте гибели клеток в пределах эпидермиса клинически инфицированных и неинфицированных животных, с использованием трех различных кожи секций: спинку, Вентер и бедра корробори Ложные жабы. Этот метод определяет анатомические сайт гибели клеток, а также отличительные его расположение в пределах конкретных слоев эпидермиса. Затем мы используем пробирного каспазы-3/7 провести количественную оценку серии времени апоптоза на протяжении 8-недельного инфекции в Австралийские квакши verreauxii alpina. Мы принимаем образцы кончик пальца две недели от же животных и возможность соотнести возбудителя инфекции нагрузки с активность каспазы-3/7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Университет Джеймса Кука одобрил животных этики в приложениях A1875 P. корробори и A1897 и A2171 для л. alpina.

1. Животноводство и мониторинг

  1. Дом животные индивидуально, в среде подходит для видов, с соответствующим водой, кормления и график уборки. Ежедневно проверяйте животных.
    1. Взрослые особи в критическом Ложные жабы корробори (для Assay TUNEL, раздел 4) и угрозой Австралийские квакши verreauxii alpina (для каспазы-3/7 assay, раздел 5), в дар от плен селекции зал. Сохранить животных на 15-18 ° C, на мох и гравий субстрат, туман их ежедневно с обратного осмоса вода и кормить 3 раза за неделю с кишки загружен сверчков.
  2. Сбор данных на каждый отдельным один раз за неделю. Тампоном лиц для Bd , как описано в шаге 2.1. Вес каждого животного практически 0,1 г, используя шкалу и измерить их морда провентилировать длины (SVL) с точностью до 0,01 мм, с помощью удаленного суппорты.
  3. После прививки (как описано в разделе 3) Проверьте животных ежедневно для клинических признаков инфекции (нерегулярных кожи Слау, inappetence, покраснение ног, летаргия или задержки восстанавливающих рефлекс) животных этики руководящим принципам. Усыпить животных, если имеются клинические признаки и заболеваемости.
    1. Усыпить с передозировкой Метансульфонат tricaine (MS222) (0,1% w/v MS222, до pH 6-7 с бикарбонатом натрия в возрасте водопроводной воды). Держите животных в MS222 10 мин после всех движение прекращается, и они отображают без реакции на стимулы.

2. тестирование для Bd инфекции

  1. Свабирование скважин для Bd
    1. Тампоном каждое животное новых стерильных района тампоном (один мазок на животное). Используйте следующий способ тампонирования: пять раз на Вентер, пять раз на каждом бедра, стороне и конечностей. Это в общей сложности 45 штрихов.
    2. Осторожно поверните тампон во время и между штрихами для обеспечения эффективного захвата ДНК. Разорвать кончик тампона в 1,5 мл microcentrifuge трубы и хранить при температуре от-20 ° C до добычи.
  2. Экстракции ДНК и ПЦР-анализа
    1. Экстракт геномной ДНК от тампонов, добавляя 50 мкл Реагента коммерчески доступных экстракции ДНК с 30-40 мг шариков кремний 0,5 мм. Шарик бить образцы в шарик колотушки клеток аннулятора максимальной скоростью за 2 мин. После шаг било шарик Центрифугуйте образцы на 2000 x г за 1 мин.
    2. Проинкубируйте образцы на 100 ° C в течение 10 мин и дайте ему остыть. Центрифугуйте образцы на 5000 g x 3 мин, а затем передавать отдельные 1,5 мл пробирок микро супернатант и хранить при температуре от-20 ° C до ПЦР.
    3. Использование количественного PCR (ПЦР) после Бойл и др. 200418 для анализа нагрузки инфекции. Используйте следующие изменения:
      1. Разбавьте экстракции ДНК образцов 6:100 двойной деионизированной водой. 0,7 мкл бычьим сывороточным альбумином (БСА), для каждой скважины, чтобы помочь предотвратить ингибирование ПЦР. Запуск каждого образца в singlicate. На каждой табличке используйте отрицательные (без шаблона) управления и позитивные с серию разрежения стандартов для оценки нагрузки zoospore (инфекции).

3. прививки

  1. Культура- Bd
    1. Готовят отвар культуры путем добавления 16 g Триптон, гидролизат желатина 2 g и 4 g лактозы (TGHL) 1 Л деионизированной воды. Автоклав (121 ° C 40 мин) и позволяют отвар охладить.
    2. Прививать изолировать Bd (в данном случае, изолированных от Нового Южного Уэльса изолировать, AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1, проезд № 11) в TGHL бульон и растут на 7 d при 23 ° C, а затем передать плиты агара TGHL бульон культуры.
    3. Чтобы сделать плиты, добавьте 16 g Триптон, гидролизат желатина 2 g, 4 g лактозы (TGHL) и 10 g бактериологического агар до 1 Л деионизированной воды и автоклав (121 ° C 40 мин). После того, как смесь достаточно прохладно, чтобы коснуться, но прежде чем он твердеет, залить TGHL агар в 92 мм диаметр культуры пластин так, что они являются полностью 1/4 до 1/3, в биологической безопасности II класса кабинета.
    4. Когда затвердевшим агар и остыть, прививок каждой пластины с 0,5 мл Bd из жидкого бульона и равномерно. Разрешить Bd бульон смесь сухая пластина для примерно 1 час и затем уплотнение пластины с пластиковой парафин фильм. Инкубируйте плиты агара стороне вниз при 23 ° C за 5-7 d.
  2. Наводнение пластины для решения прививки zoospore
    1. Проверьте zoospore подвижности под Перевернутый световой микроскоп для обеспечения жизнеспособности ежедневно перед прививкой. Когда zoospore релиз является высокой, с много zoospores, плавание за пределами данные, культура готова к вакцинации.
    2. Наводнение каждой пластины с 3 мл возрасте водопроводной воды или искусственный пруд воды, путем лить воду в пластину и инкубации при комнатной температуре за 10 минут, чтобы позволить zoospores выпустить в воду. После инкубационного периода сцеживаться zoospore подвеска в новый стерильный контейнер.
    3. Оценка концентрации zoospore, следуя инструкциям изготовителя, с помощью haemocytometer. После того, как концентрация zoospore подвеска, как известно, разбавляют подвеска к концентрации 1 x 10 zoospores6 на 3 мл возрасте водопроводной водой.
  3. Прививок животных
    1. Прививать каждое животное лить 3 мл смеси посевным материалом над своей Вентер19 в контейнерах отдельных 50 мл. Разрешить превышение посевным материалом для сбора в базу прививка контейнера. Оставить каждое животное в отдельных прививка контейнер для 24 ч для обеспечения инфекции и после 24 ч прививка, возвращение каждого человека к дезинфекции террариум.
      1. Лечить террариумах с помощью решения коммерческих отбеливатель 13% объем/объем (v/v)20, по крайней мере дважды промыть водой, а затем дайте высохнуть не менее 24 ч.
    2. Для Bd-негативные элементы управления, макет прививок животных, используя те же методы, как 3.2-3.3, но наводнения Bd-бесплатные агар пластины с 5 мл возрасте водопроводной воды вместо из Bd прививку плиты агара.

4. Assay TUNEL

  1. Усыпить животных, которые наблюдаются клинические признаки chytridiomycosis, как описано в шаге 1.3.1 и равное количество Bd-отрицательные контрольных животных.
  2. Рассечения кожи (спинной, вентральной и бедро) проб из каждого животного. Исправьте кожных проб на 2 ч в 4% v/v фосфатного буфера формальдегида. Короткие и последовательной фиксации времени позволяет ткани будет полностью исправлена, но также позволяет для эффективной и точной иммуногистохимия пятнать. Затем перенесите 80% этанола до встраивания для разрезания.
  3. Внедрите кожи в парафин для гистологической подготовки следующие стандартные методы21. Вкратце протокол является следующим:
    1. Обезвоживания тканей в градуированных серии этанола и снимите этанола с ксилола. Внедрить в парафин ткани и место всех трех кожных проб для каждого человека в одном парафин блока.
  4. Раздел кожи, используя микротом после стандартных гистологические подготовку21. В разделе ткани серийно на 5 мкм и затем аффикс гидрофильные стеклянных скольжениях. Место четыре последовательных histosections каждого типа кожи на слайд. Сделать три слайда на лицо с разделами серийный кожи, помните, что каждый слайд имеет четыре секции каждой ткани прикреплена.
  5. Пятно слайды в следующем порядке:
    1. Пятно первый слайд с гематоксилином следуют эозина counterstaining (H & E). Этот слайд должен визуализировать расположение Bd данные внутри кожи.
    2. Пятно второго слайда после коммерчески доступных assay TUNEL для гистологической подготовки и следуйте инструкциям производителя, которые описаны ниже.
      1. Во-первых deparaffinize разделов ткани в опарник coplin, омыв слайды с тремя изменениями ксилол 5 мин в мыть и следуйте с двумя изменениями 100% этанола за 5 мин каждый мыть. Следуйте с одной мыть этанола 95% за 3 мин и затем 70% этанола на 3 мин закончить с одной стирки PBS на 5 мин.
      2. Предварительной обработки ткани с свежезаваренным разреженных белка, переваривание фермента (протеиназы K в концентрации 20 мкг/мл разбавленной в PBS) и добавить непосредственно на слайд. Позволяют Инкубируйте 15 мин мыть с двумя изменениями PBS в опарник coplin на 2 мин.
      3. Кран лишнюю жидкость и утолить в 3,0% перекиси водорода в PBS в опарник coplin за 2 мин при комнатной температуре. Промойте дважды с PBS, за пять минут каждый мыть.
      4. Избыток жидкости, а затем применить 75 мкл/5 см2 буфера равновесия непосредственно на ткани на слайде. Инкубируйте 10 s. Tap избыток жидкости вокруг раздела и применять 55 мкл/5 см2 работы терминала deoxynucleotidyl фермента tranferase (TdT). Инкубировать в камере увлажненные за 1 ч при 37 ° C.
      5. После инкубации TdT, поместите слайд в опарник coplin рабочей силы остановка/мыть буфера, агитировать за 15 s и проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре. Вымойте слайд с тремя изменениями PBS 1 мин в мыть. Кран лишнюю жидкость.
      6. Примените конъюгат анти digoxigenin (родамин) которая нагрелась до комнатной температуры в ткани, 65 мкл/5 см2. Инкубировать в камере увлажненные за 30 мин при комнатной температуре и избегать воздействия света. Вымойте с четырьмя изменения PBS 2 мин в мыть. Кран лишнюю жидкость.
      7. Отделка, добавив 15 мкл 0,5 - 1 мкг/мл DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) в среде монтажа слайда к слайду, который действует как пятно счетчика. Затем накрыть крышкой скольжения и печать с лак или резиновый клей. Разрешить слайды для просушки в темноте, как assay светочувствительный.
    3. Пятно третий слайд окрашивается с помощью TUNEL assay и DAPI изображение, но использовать в качестве положительной и отрицательной контроля для каждого образца.
      Примечание: Из 4 histosections на слайдах управления, первые 2 положительный контроль реплицирует и последние 2 реплицирует отрицательного контроля.
      1. Для положительных элементов управления, вместо того, чтобы шаг 4.5.2.2, предварительно обрабатывать ткани с DN буфера (30 мм trizma база, рН 7,2, 4 мм2MgCl 0,1 ДДТ) и пусть инкубации при комнатной температуре в течение 5 минут. Затем растворить Dnase в DN буфере для конечной концентрации 0.1ug / мл и применить его непосредственно к слайду. Инкубируйте 15 минут при комнатной температуре.  Затем промойте слайд 5 мыть dH2O 3 минуты каждый мыть. Помарки избыток жидкости. Затем возобновите TUNEL assay, как указано в разделе 4.5.2.3.
      2. Для отрицательных элементов управления не добавить фермента tranferase (TdT) терминала deoxynucleotidyl этих образцов (как описано в разделе 4.5.2.4).
  6. Соблюдайте TUNEL слайды сразу же после завершения анализа.
    1. Возьмите фотографии случайные интервалы вдоль каждой секции кожи на 200 X с помощью флуоресцентный Микроскоп, используя фильтры для обеих родамин пятно, которое показывает apoptotic клетки и появляется красный и DAPI, который показывает все ядра и появляется синий, так что накладкой клетки могут быть созданы. Убедитесь, что по крайней мере 100 клеток фотографируются в каждой секции кожи на сэмпл. Хранить слайды в коробке темный микроскопа при-20 ° C.
    2. Подсчитать ячейки (тонированный голубой DAPI) на изображение. Убедитесь, что по крайней мере 100 клеток учитываются в разделе кожи. Достичь 100 клеток, подсчитать все ячейки в пределах изображения. Если меньше чем 100 клетки присутствуют в одном изображении, граф другое изображение до тех пор, пока по крайней мере 100 клеток достигаются каждой секции кожи на животное.
    3. Далее подсчитать количество TUNEL клеток в те же образы (красный родамин окрашенные). TUNEL позитивные клетки, которые указывают апоптоза и не некроза или фона, представляют собой отдельные ячейки с Светлоклеточная краями (мембраны нетронутыми с не lysis). Иногда клетки сокращаться в форме apoptotic тела.
    4. Найдите районы, учтенные в TUNEL assay и анализировать соответствующие регионы на запятнанных H & E histosections. Убедитесь, что запятнанных H & E разделов соответствуют сайты Bd инфекции, которая обеспечивает Bd-зараженных сайтов используются при подсчете apoptotic клеток в TUNEL assay.

5. Caspase 3/7 Assay

  1. Собирать мыс советы от каждого животного ( Bd- воздействию и Bd- отрицательные) один раз в неделю через 3 недели поста прививки и раз в две недели до конца эксперимента, до 8 пальцы на единицу.
    1. Вырезать кончик пальца на второй фаланги с пламенем стерилизовать ножницами и место в 1,5 мл микропробирок и немедленно заморозить при температуре-80 ° C.
  2. Экстракт белков из образца замороженный палец.
    1. Поместите образцы в 100 мкл пример буфера (25 мм HEPES рН 7, 5 мм MgCl2) с двумя бусы из нержавеющей стали (3,2 мм) в 1,5 мл микропробирок колпачок. Лизируйте образцы по 4 циклов шарик 1 мин, победив на максимальной скорости (в же било шарик как используется в шаг 1.2.1) следуют 3 мин на льду. После лизиса Центрифугуйте образцы на 12000 x g и 4 ° C для 5 минут соберите супернатант для использования в assay.
  3. Количественно определить концентрацию белка на сэмпл, используя assay Брадфорд.
    1. В 384 хорошо пластины смешать 10 мкл белков экстракта с 10 мкл Реагента Брэдфорд и инкубировать в течение 2 минут при комнатной температуре. Выполнять каждый образец в двух экземплярах, наряду с серии 5 раз BSA разбавления стандартов. Читайте поглощения в 595 Нм на читателя пластины поглощения.
  4. В качестве альтернативы если образцы кончик пальца слишком малы (концентрация белка находится рядом минимальный стандарт, как определено от assay Брадфорд на шаге 4.3.1, или если лягушек, которые отбираются под 3 g общий вес), стандартизировать образцов путем оценки поверхности кожи область, используя фотографии, вместо assay Брадфорд.
    1. Перед извлечением белки из образца для caspase assay, фотография каждый палец на 40 кратном увеличении с помощью инвертированного микроскопа света.
    2. Проанализируйте образец мыс, с помощью компьютера изображений программное обеспечение, путем оценки области ног. Сделать это, создав линию вокруг края пальца клип и имеют изображений программного обеспечения оценки область в пределах формы. Затем умножить этой области Пи (3.14), который будет примерная площадь поверхности образца кожи 3-режиме (как длина х сечение (Пи х диаметр) дает внешняя поверхность трубки).
  5. Выполните assay каспазы-3/7.
    1. В 384 хорошо люминесценции тарелку добавьте 10 мкл Реагента коммерчески доступных caspase 3/7 и 10 мкл белков экстракта. Запуск каждого образца в трех экземплярах.
    2. Смешайте реактивы, медленно покачивая пластину для 15 s. инкубировать пластину от света на 30 минут при комнатной температуре. Измерения люминесценции, используя читателя светящиеся пластины.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TUNEL Assay

Там были более TUNEL позитивные клетки в зараженных животных, чем неинфицированных контрольных животных. В месте расположения TUNEL положительных клеток различались в инфицированных и контроля животных. В животных управления было равномерное распределение TUNEL позитивных клеток дермы и эпидермиса кожи слои при низких уровнях (см. Рисунок 1A), но в зараженных животных, TUNEL позитивные клетки были более частыми в эпидермис (Рисунок 1В). сайты инфекции (как это наблюдается на запятнанных H & E слайды) были замечены как неравномерное Bd данные разбросаны через бедро и кожи брюшной секции с ни в разделах спинку. Хотя TUNEL позитивные клетки были более сосредоточены на и непосредственно прилегающих к сайтам инфицированных клеток (рис. 1 c), существует также более широко TUNEL позитивных клеток эпидермиса и эпидермальных слоев, которые были глубже, чем где Bd проживали. В Bd инфицированных животных, там были более TUNEL позитивные клетки во всех типах три кожи анализируется, но особенно высокого уровня в кожу бедра и Вентер (12.01 раза выше (95% ДИ: 4.92-26.30) в кожу бедра и 22.31 раз выше (95% ДИ от 5,25-94.82) в Вентер кожи) (Рисунок 2).

Assay каспазы-3/7

В течение инфекции была разница в активности каспазы. В Bd инфицированных животных интенсивность инфекции был положительно коррелирует с активность каспазы-3/7 (рис. 3). Существует также разница между инфицированными и неинфицированными животных через время, должность прививка. Активность каспазы-3/7 снизилась в течение первых нескольких недель после прививки (с 48,36% меньше активности в зараженных животных), а затем увеличивается к концу недели 7 (рис. 4) в Bd инфицированных животных, но оставалась неизменной в незараженных лица.

Figure 1
Рисунок 1: терминал dUTP трансферазы опосредованной Ник конце маркировки (TUNEL) в situ assay инфицированных и неинфицированных животных. ) Bd- Секция кожи бедра корробори Ложные жабы, и B) Bd+ бедра кожи раздел P. корробори запятнана в situ assay TUNEL. Синий DAPI пятнать указанием ядер клеток, и красный родамин пятно, которое указывает фрагментация ДНК, характерно вызванных апоптоз. Желтая стрелка указывает положение Bd кластера, видели в панели C. C) P. корробори секции кожи бедра витражи с H & е. H & E Секция является последовательной группы B. Есть ли кластер пустые данные Bd (стрелка) и несколько темных незрелых данные вблизи поверхности кожи. Для всех трех панелей эпидермис находится в верхней части фотографии. Сравнение групп B и C показывает, что окрашенные клетки эпидермиса родамин сосредоточены вокруг и ниже кластера Bd и где повреждения кожи виден, как формирование микро пузырьков между базальных клеток эпидермиса. 400 X увеличение и линейки шкалы указывает 0,03 мм. адаптировано из рис. 2 в Brannelly et al. 2017 Коллегиального J22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: доля TUNEL позитивные (TUNEL +) клетки кожи типа. Доля TUNEL позитивные apoptotic клеток кожи типа в P. корробори, с зараженных животных, о животных, которые поддался болезни (n = 9) и неинфицированных контрольных животных (n = 10). Ошибка бары указывают на 95% доверительных интервалов по пропорции и * указывает на значительное увеличение TUNEL + клеток пропорциях. В спинной кожи, инфицированных животных имели 14.38 (95% ДИ 3.32-62.24) раз больше TUNEL позитивных клеток, чем контрольных животных (отношение шансов: Z = 3.57, p < 0.01). В кожу бедра, зараженных животных было 12.01 (95% ДИ: 4.92-26,30; Отношение шансов: Z = 5.46, p < 0.01) раза больше TUNEL позитивных клеток, чем контрольных животных (квадрат Пирсона Чи: χ21 44.30, p = < 0.01). В коже Вентер, зараженных животных было 22.31 (95% ДИ от 5,25-94.82) раз больше TUNEL позитивных клеток, чем контрольных животных (отношение шансов: Z = 4.21, p < 0.01). Адаптировано из рис в Brannelly et al. 2017 коллегиального J22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Взаимосвязь между интенсивность инфекции, журнал10(zoospore эквиваленты) и caspase 3/7, журнал10(Caspase) привиты Австралийские квакши verreauxii alpina в течение эксперимента. Корреляция между интенсивностью инфекции и активность каспазы 0.463, и линия тренда имеет уравнение y = x (0,229) + 0.939. Адаптировано из рисунка 4 , в Brannelly и др. 2017 коллегиального J22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Активность каспазы-3/7 через неделю 7 для каждой группы Австралийские квакши verreauxii alpina: Bd-инфицированных животных, которые поддался болезни (n = 4) и неинфицированных контроля (n = 8). Активность каспазы определяется как люминесценция чтения для контролируемых концентрацию белка на сэмпл и затем основания логарифма 10 превращается. Активность каспазы (Log10 преобразован) для каждой группы в неделю. Планки погрешностей указывают стандартную ошибку. * Указывает, что инфицированные животные отличаются от неинфицированных элементы управления на этой неделе. (Модель линейной смешанных эффектов: неделя, F4 11.974, p = < 0,01; неделя * статус, F8 = 2,139, p = 0,037; Неделя 3 ANOVA,2,18 F = 5.512, p = 0,014), адаптированных на рисунке 5 в Brannelly et al. 2017 коллегиального J22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы исследовали эпидермальный апоптоз и смерть клетки как потенциального механизма патологии chytridiomycosis смертельной болезнью или механизма болезни сопротивления в Bd восприимчивых видов. Мы использовали два метода оценки смерть клетки эпидермиса, assay TUNEL для в месте смерти анализа эпидермальных клеток и caspase 3/7 пробирного контроля за смерть эпидермальных клеток на протяжении всего хода инфекции. Мы обнаружили, что гибель клеток и апоптоз коррелируют с нагрузкой инфекции и смерть клетки значительно выше в месте инфекции. В начале инфекции снижение апоптоза в эпидермис, но апоптоз увеличивает как возбудитель бремя увеличивается в пределах инфицированные ткани.

Апоптоз в клетках может испытываться с использованием многочисленных различных подходов, каждый с преимущества и ограничения. Это важно для изучения апоптоз и клеток смерть, используя несколько анализов с целью подтвердить выводы. В этом исследовании мы изучили два различных анализов расследовать гибель клеток эпидермиса и апоптоз в лягушек с chytridiomycosis. Во-первых, мы опробован TUNEL анализа для оценки клеток смерть в situ. Этот тест является трудоемким и дорогим за образец, и слайды должны быть прочитаны сразу как флуоресцентного сигнала быстро исчезает. Несмотря на эти ограничения результаты этого эксперимента в situ являются важными для дальнейшего понимания механизмов взаимодействия хост патогена. Информация о локализации может быть определена с помощью этого метода, и в нашем исследовании апоптоз присутствовал в высоких уровнях на сайте грибковой инфекции и более диффузно на других сайтах. Кроме того следует отметить, что TUNEL assay меры повреждение ДНК, которое может быть вызвано ряд различных клеток смерть механизмов, включая апоптоза, некроз и pyroptosis17. Хотя есть подписи смерть клетки, apoptosis связанные (такие как единичных клеток с мембранами с по-прежнему нетронутыми, увидеть протокол линии 4.6.3, классификация основывается на интерпретации исследователем. Поскольку механизм клеточной смерти определяется не TUNEL assay, вполне возможно, что другой не апоптоз клеток смерть путь может быть причиной увеличения позитивных клетках TUNEL на заболеваемость зараженных животных. Разница в какие каждого пробирного меры могут объяснить шаблон различия в двух assays trialled здесь.

Assay каспазы-3/7 может использоваться для количественного определения воздействия инфекции через время. Однако как лягушка мыс образцы являются небольшими, существует ограниченное образцов для анализа и стандартизации. Общий метод для стандартизации выборки является определение общего белка концентрацию каждого экстракта. Как квантификация assay протеина Брадфорд потребляет образец, это не эффективный метод для малых экстрактов. Кроме того мы обнаружили, что исключает анализ пигментов в пределах лягушка кожи nano UV-Vis спектрометрическим методом. Небольшие размеры выборки также предотвратить стандартизации сухого веса. Мы предлагаем оценки площади поверхности кожи ног с помощью фотографии, как мыс кончик образцы (эти лягушки были меньше, чем 3 g в размер тела) были слишком малы, чтобы позволить анализов для концентрации протеина и caspase концентрации. Мы обнаружили, что фотографирование пальцев и с помощью оценки площади поверхности кожи является столь же эффективным, как традиционные белка концентрацию анализы.

В этом исследовании мы использовали два стандартных методы для количественного определения клеточной смерти и апоптоз, но адаптирована методы для амфибий и образцы малых тканей. Для assay TUNEL мы умерщвлены животное, чтобы обеспечить достаточно ткани был доступен для анализа и для сравнения различных кожи мест. Это позволяет адаптировать этот метод для небольших образцов тканей, как биопсия лямки мыс, который не потребует эвтаназии животного. В зависимости от размера животного, биопсия может позволить время серии тест похож на наш подход для assay каспазы-3/7.

В будущем исследования, мы предлагаем использование дополнительных анализов для изучения гибель клеток и апоптоз в течение chytridiomycosis инфекции, потому что есть еще много узнать о причинно-следственных механизмах патогенеза chytridiomycosis. Эти результаты показывают, что apoptosis и эпидермальных клеток смерть может быть важным в патогенезе Bd; Однако необходимы дополнительные исследования, чтобы определить влияние апоптоза на исходы заболевания, особенно в хостов, которые не поддаются инфекции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим следующих людей, которые помогал с земледелия и сбора данных: D. Tegtmeier, C. де Йонг, J. Hawkes, K. Фоссену, S. Персиваль, м. Мак-Вильямс, L. Бертола, м. Стюарт, н. Харни и т. Knavel; и м. Merces для помощи с вскрытия. Мы также хотели бы поблагодарить M. McFadden, P. Харлоу и Таронга зоопарк для повышения л. alpinaи G. Marantelli для повышения P. корробори. Мы благодарим F. Pasmans, A. Martel для консультации по апоптоз анализов, C. Константин, а. Кладник и р. Уэбб для помощи с TUNEL assay, и т. Emeto и W. Weßels для помощи с протоколом и комплект для assay каспазы-3/7. Эта рукопись и протокол заимствован из Brannelly et al 2017 Коллегиального J22.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
POLARstar Omega BMG Labtech Luminescent plate reader
384 well flat clear bottom plate Corning 3707
384 well low flange white flat bottom plate Corning 3570
Agar Bacteriological (Oxoid) Fisher OXLP0011B
Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin Fisher 6764254
Lactose Broth (Oxoid) Fisher OXCM0137B
Sodium Bicarbonate Fisher BP328-500
Tricane-S (MS-222) Fisher NC0872873
Tryptone Fisher BP1421-500
Bovine Serum Albumin Invitrogen 15561020
Sterile rayon swab Medical Wire & Equipment MW-113
ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit Merck Millipore S7165
Coomassie Bradford reagent Pierce 23200
Caspase Glo  3/7 Promega G8090
HEPES buffer Sigma Aldrich H0887-20ML
Magnesium chloride Sigma Aldrich 1374248-1G
Gelatin hydrolysate Enzymatic Sigma-Aldrich G0262
PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X) Thermo/Life 20-012-043
Prepman Thermo/Life 4318930
TaqMan Fast Advanced Master Mix ThermoFisher 4444556
Parafilm Bemis PM996
Clorox bleach Clorox
Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade Fisher BP2818500
ZEISS Axio Scan florescent miscroscope Carl Zeiss Florescent microscope
3.2mm stainless steel beads BioSpec 11079132SS
Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGAT
ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′)		 Taqman Individual design for primers and probe
Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTT
CTCTAGGCAACAGTTT-3′)		 Taqman Individual design for primers and probe
Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′) Taqman Individual design for primers and probe
Rotor-Gene qPCR Instruments Qiagen qPCR machine
Microcentrifuge tubes 1.5ml Fisher 02-681-372
Cell culture petri plates Nunc 263991
Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm BioSpec 11079105Z

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
  2. Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
  3. Voyles, J., et al. Pathogenesis of chytridiomycosis, a cause of catastrophic amphibian declines. Science. 326 (5952), 582-585 (2009).
  4. Woodhams, D. C., et al. Population trends associated with skin peptide defenses against chytridiomycosis in Australian frogs. Oecologia. 146 (4), 531-540 (2006).
  5. Woodhams, D. C., Voyles, J., Lips, K. R., Carey, C., Rollins-Smith, L. A. Predicted disease susceptibility in a Panamanian amphibian assemblage based on skin peptide defenses. Journal of Wildlife Diseases. 42 (2), 207-218 (2006).
  6. Woodhams, D. C., Rollins-Smith, L. A., Alford, R. A., Simon, M. A., Harris, R. N. Innate immune defenses of amphibian skin: antimicrobial peptides and more. Animal Conservation. 10, 425-428 (2007).
  7. Savage, A. E., Zamudio, K. R. MHC genotypes associate with resistance to a frog-killing fungus. PNAS. 108 (40), 16705-16710 (2011).
  8. Bataille, A., et al. Susceptibility of amphibians to chytridiomycosis is associated with MHC class II conformation. Proceeding of the Royal Society B. 282, 20143127 (2015).
  9. Fites, J. S., Reinert, L. K., Chappell, T. M., Rollins-Smith, L. A. Inhibition of local immune responses by the frog-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Infection and Immunity. 82 (11), 4698-4706 (2014).
  10. Brannelly, L. A., Webb, R. J., Skerratt, L. F., Berger, L. Effects of chytridiomycosis on hematopoietic tissue in the spleen, kidney and bone marrow in three diverse amphibian species. Pathogens and Disease. 74 (7), ftw069 (2016).
  11. Brutyn, M., et al. Batrachochytrium dendrobatidis zoospore secretions rapidly disturb intercellular junctions in frog skin. Fungal Genetics and Biology. 49 (10), 830-837 (2012).
  12. Berger, L., Hyatt, A. D., Speare, R., Longcore, J. E. Life cycle stages of the amphibian chytrid Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 68 (1), 51-63 (2005).
  13. Pasmans, F., et al. Chytridiomycosis related mortality in a midwife toad (Alytes obstetricans) in Belgium. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. 79 (6), 460-462 (2010).
  14. Ellison, A. R., et al. More than skin deep: Functional genomic basis for resistance to amphibian chytridiomycosis. Genome Biology and Evolution. 7 (1), 286-298 (2014).
  15. Fites, J. S., et al. The invasive chytrid fungus of amphibians paralyzes lymphocyte responses. Science. 342 (6156), 366-369 (2013).
  16. Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
  17. Kelly, K. J., Sandoval, R. M., Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. A novel method to determine specificity and sensitivity of the TUNEL reaction in the quantitation of apoptosis. American Journal of Cell Physiology. 284 (5), C1309-C1318 (2003).
  18. Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Diseases of Aquatic Organisms. 60 (2), 141-148 (2004).
  19. Brannelly, L. A., Webb, R., Skerratt, L. F., Berger, L. Amphibians with infectious disease increase their reproductive effort: evidence for the terminal investment hypothesis. Open Biology. 6 (6), 1-24 (2016).
  20. Webb, R., Mendez, D., Berger, L., Speare, R. Additional disinfectants effective against the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 74 (1), 13-16 (2007).
  21. Woods, A., Ellis, R. Laboratory Histopathology: A Complete Reference. , Churchill Livingstone: Edinburgh. (1994).
  22. Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis. PeerJ. 5, e2925 (2017).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 135 апоптоз Caspase гистология патологии TUNEL дикой природы заболевания
С помощью dUTP трансферазы терминал-опосредованной Ник конце маркировки (TUNEL) и Caspase 3/7 Assays для измерения эпидермальный клеточной гибели лягушек с Chytridiomycosis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brannelly, L. A., Roberts, A. A.,… More

Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis. J. Vis. Exp. (135), e57345, doi:10.3791/57345 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter