Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Använda Terminal transferas-medierad dUTP analyser Nick slutet-märkning (TUNEL) och kaspas 3/7 till åtgärd Epidermal celldöd hos grodor med ranoides

Published: May 16, 2018 doi: 10.3791/57345
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1One Health Research Group, College of Public Health, Medical and Veterinary Sciences, James Cook University, 2Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh

Summary

Vi kvantifiera epidermal celldöd hos grodor med ranoides med två metoder. Först använder vi terminal transferas-medierad dUTP nick slutet-märkning (TUNEL) i situ histologi för att avgöra skillnader mellan kliniskt infekterade och icke-infekterade djur. För det andra, vi bedriver en tidsserieanalys av apoptos över infektion genom en analys av kaspas 3/7-protein.

Abstract

Amfibier upplever en stor förlust av biologisk mångfald globalt och en av de viktigaste orsakerna är den smittsamma sjukdomen ranoides. Denna sjukdom orsakas av svamp patogenen Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), som infekterar och stör groda epidermis; dock har patologiska förändringar inte uttryckligen karaktäriserats. Apoptos (programmerad celldöd) kan användas av patogener för att skada värd vävnad, men kan också vara en värd mekanismen av motståndskraft mot sjukdomar för patogen borttagning. I denna studie vi kvantifiera epidermal celldöd smittade och oinfekterade djur använder två olika analyser: terminal transferas-medierad dUTP nick slutet-märkning (TUNEL) och kaspas 3/7. Med hjälp av ventrala, dorsala, och lår hudvävnad i TUNEL-analysen, vi observerar celldöd i den epidermala celler i situ kliniskt smittade djur och jämför celldöd med oinfekterade djur med fluorescerande mikroskopi. För att avgöra hur apoptos nivåer i epidermis förändras under loppet av infektion vi bort tå-tip prover var fjortonde dag under en 8-veckorsperiod, och använda en kaspas 3/7 analys med extraherade proteiner för att kvantifiera aktivitet inom proverna. Vi korrelerar sedan kaspas 3/7 aktivitet med infektion belastning. TUNEL analysen är användbart för lokalisering av cell death i situ, men är dyra och tid intensivt per prov. Kaspas 3/7 analysen är effektivt för stora urvalsstorlekar och tid kurs experiment. Men eftersom groda tå tip biopsier är små finns begränsad extrakt för provet standardisering via protein kvantifiering metoder, såsom Bradford analysen. Vi föreslår därför uppskatta hud yta genom fotografisk analys av tå biopsier att undvika tidskrävande extrakt under provet standardisering.

Introduction

Groddjur för närvarande upplever en största förlusterna av global biologisk mångfald av alla ryggradsdjur taxa1. En viktig orsak till dessa nedgångar är den dödlig hud sjukdom ranoides, orsakade av svamp patogenen Batrachochytrium dendrobatidis, Bd2. Patogenen infekterar ytligt epidermis, som kan leda till störningar i hudens funktion vilket resulterar i svår elektrolyt förlust, hjärtstopp och död3. Olika potentiella värd immunologiska mekanismer mot Bd studeras för närvarande, såsom antimikrobiella peptider4,5, kutan bakteriefloran6, immunceller receptorer7,8, och lymfocyter aktivitet9,10. Dock undersöka få studier huruvida epidermal apoptos och cell death är en immunmekanism mot denna dödliga patogener.

Celldöd genom apoptos (programmerad celldöd) eller nekros (unprogrammed död), i överhuden kan vara en patologi av Bd infektion. Tidigare forskning tyder på att Bd infektion kan inducera apoptos eftersom störningar av intracellulära korsningar observeras när huden bladsticklingar utsätts för zoospore supernatanterna in vitro-11. Dessutom degenerativa epidermala förändringar i Bd-infekterade grodor observeras med hjälp av elektronmikroskopi12,13. Transcriptomic analyserna indikerar att apoptos vägar är uppreglerad i infekterade huden14och amfibie splenocytes genomgå apoptos när de utsätts för Bd supernatanterna in vitro-15. Trots den växande mängden bevis som tyder på att Bd kan inducera cell apoptos och värd death in vitro-, in-vivo studier att utforska eller kvantifiera apoptos mekanismer genom progressionen av infektion saknas. Ytterligare, det är okänt om värden använder apoptos som en defensiv strategi för immunförsvaret för att bekämpa Bd infektion eller om apoptos är en patologi av sjukdomen.

I denna studie syftar vi till att upptäcka epidermal celldöd och apoptos i smittade djur i vivo som med hjälp av två metoder: kaspas 3/7 protein assay och terminal transferas-medierad dUTP nick slutet-märkning (TUNEL) i situ assay. Som varje test upptäcker olika aspekter av cell död16, tillsammans dessa metoder ger en full förståelse av mekanismerna som är involverade i celldöd och säkerställa ett korrekt mått på effekten. Kaspas 3/7 analysen kvantifierar aktiviteten av effektor kaspaserna 3 och 7, som möjliggör kvantifiering av både inre och yttre apoptos vägar. Däremot identifierar TUNEL analysen DNA-fragmentering, som orsakas av cell death mekanismer inklusive apoptos, nekros och pyroptosis17. Vi använder TUNEL analysen för att undersöka platsen för celldöd inom epidermisen av både kliniskt smittade och oinfekterade djur använder tre olika hud sektioner: dorsum, venter och låret av Pseudophryne corroboree. Den här metoden identifierar anatomiska platsen av celldöd, liksom skilja dess läge inom specifika epidermala skikt. Vi använder sedan kaspas 3/7 analysen för att genomföra en tid serien kvantifiering av apoptos i hela en 8-veckors infektion i Litoria verreauxii alpina. Vi tar tå tip prover var fjortonde dag från samma djur och kan korrelera patogen infektion belastning med kaspas 3/7 aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

James Cook University godkända djuretik i A1875 applikationer för P. corroboree och A1897 och A2171 för L. v. alpina.

1. djurhållning och övervakning

  1. Hus djur individuellt, i en miljö som är lämplig för arten, med ett lämpligt vatten, utfodring och rengöring schema. Kontrollera djur dagligen.
    1. Använda vuxna individer av den akut hotad Pseudophryne corroboree (för TUNEL analysen, avsnitt 4) och hotade Litoria verreauxii alpina (för kaspas 3/7 analysen, avsnitt 5), donerade från fångenskap avel faciliteter. Upprätthålla djuren på 15-18 ° C, på en mossa och grus substrat, spraya dem dagligen med omvänd osmos vatten och foder 3 gånger per vecka med gut laddad syrsor.
  2. Samla in uppgifter om varje enskild gång varje vecka. Svabba individerna för Bd som beskrivs i steg 2.1. Väga varje djur till neared 0.1 g med hjälp av en skala, och mäta sin nos för att ventilera (SVL) längd till närmaste 0,01 mm använda dial skjutmått.
  3. Efter inympningen (som beskrivs i avsnitt 3), kontrollera djur dagligen i kliniska tecken på infektion (oregelbunden hud slough, aptitlöshet, ben rodnad, letargi eller fördröjd rätande reflex) i enlighet med djuretik riktlinjer. Avliva djur om kliniska tecken och sjuklighet är närvarande.
    1. Eutanasi med en överdos av tricaine methanesulfonate (MS222) (0,1% w/v MS222 till pH 6-7 med natriumbikarbonat i åldern kranvatten). Hålla djur i MS222 för 10 min efter alla rörelse upphör och de visar inga svar på stimuli.

2. testning för Bd infektion

  1. Badda för Bd
    1. Svabba varje djur med en ny steril rayon (en kompress per djur). Använd följande swabbing metod: fem gånger på venter, fem gånger på varje lår, side och lem. Detta är totalt 45 slag.
    2. Rotera pinnen försiktigt under och mellan stroke att säkerställa effektiv avskiljning av DNA. Bryta den pinne spetsen i 1,5 mL mikrocentrifugrör och förvaras vid-20 ° C fram till extraktion.
  2. DNA-extraktion och qPCR-analys
    1. Extrahera genomiskt DNA från kompresser genom att lägga till 50 µL av en kommersiellt tillgänglig DNA extraktion reagens med 30-40 mg av 0,5 mm kvarts pärlor. Bead beat proverna i en pärla drevkarlen cell ämnen med maximal hastighet i 2 min. Efter steget pärla drevkarlen Centrifugera proverna vid 2000 x g i 1 min.
    2. Inkubera proverna vid 100 ° C i 10 min och låt svalna. Centrifugera proverna på 5 000 x g i 3 min, och sedan överför supernatanten till enskilda 1,5 mL micro centrifugrör och förvaras vid-20 ° C tills qPCR.
    3. Använda kvantitativ PCR (qPCR) efter Boyle m.fl. 200418 att analysera infektion lasten. Använd följande ändringar:
      1. Späd DNA extraktion prover 6:100 med dubbel avjoniserat vatten. Tillsätt 0.7 µL av bovint serumalbumin (BSA) till varje brunn för att förhindra PCR-hämning. Kör varje prov i singlicate. På varje platta Använd en negativ (ingen mall) kontroll och en positiv kontroll med en serie utspädning standarder för att uppskatta zoospore (infektion) belastning.

3. inympning

  1. Kultur Bd
    1. Förbereda kultur buljong genom att lägga till 16 g trypton, 2 g gelatin hydrolysat och 4 g laktos (TGHL) 1 L avjoniserat vatten. Autoklav (121 ° C i 40 min) och låt buljongen svalna.
    2. Inokulera Bd isolatet (i detta fall, isolerade från New South Wales isolera, AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1, Passage nummer 11) i en TGHL buljong och växa för 7 d vid 23 ° C och sedan överföra den buljong kulturen till TGHL agarplattor.
    3. För att göra tallrikar, tillsätt 16 g trypton, 2 g gelatin hydrolysat, 4 g laktos (TGHL) och 10 g av bakteriologisk agar till 1 L avjoniserat vatten och autoklav (121 ° C i 40 min). När blandningen är tillräckligt svalt för att röra, men innan det stelnar, häll TGHL ägarn i 92 mm diameter kultur plattor så att de fullt ut 1/4 till 1/3, i biologiska säkerhetsdragskåp med klass II.
    4. När ägarn har stelnat och svalnat helt, Inokulera varje platta med 0,5 mL av Bd från flytande buljong, och jämnt. Låt Bd buljong blandningen torka på tallrik för ca 1 h och sedan försegla plattor med plast paraffin film. Inkubera plattorna agar sida ner vid 23 ° C i 5-7 d.
  2. Översvämma plattor för zoospore inympning lösning
    1. Kontrollera zoospore motilitet under ett inverterat ljusmikroskop att säkerställa bärkraft dagligen före inympning. När zoospore release är hög, med många zoospores simning utanför sporangier, är kulturen redo för inympning.
    2. Översvämning varje platta med 3 mL år kranvatten eller konstgjord damm vatten, genom att hälla vattnet i plattan och ruvar i rumstemperatur i 10 min så att zoospores att släppa i vattnet. Häll upp zoospore suspensionen i en ny steril behållare efter inkubationstiden.
    3. Uppskatta zoospore koncentration efter tillverkarens anvisningar med hjälp av en haemocytometer. När koncentrationen av zoospore suspensionen är känt, späd suspensionen till en koncentration av 1 x 106 zoospores per 3 mL med åldern kranvatten.
  3. Inokulera djur
    1. Inokulera varje djur genom att hälla 3 mL av inokulatet blandningen över dess venter19 i enskilda 50 mL behållare. Låt överflödig inokulum att samla in i botten av behållaren inympning. Lämnar varje djur i enskilda inympning behållare för 24 h att säkerställa infektion och efter 24 h inympningen, återvända varje individ till ett desinficerat terrarium.
      1. Desinficera terraria med en 13% volym/volym (v/v) kommersiella blekmedel lösning20, skölj minst två gånger med vatten och låt torka i inte mindre än 24 h.
    2. För Bd-negativa kontroller, håna Inokulera djuren med samma metoder som i 3.2-3.3, men översvämningar Bd-gratis agarplattor med 5 mL år kranvatten istället för Bd inokuleras agarplattor.

4. TUNEL Assay

  1. Avliva djur som visar kliniska tecken på ranoides, enligt beskrivningen i steg 1.3.1 och ett lika stort antal Bd-negativ kontrolldjur.
  2. Dissekera hud (dorsala, ventrala och lår) prover från varje djur. Fixa huden proverna för 2 h i 4% v/v fosfatbuffrad formaldehyd. De korta och konsekventa fastställande tid tillåter vävnaderna att vara helt fast, utan också möjliggör effektiv och korrekt immunohistokemi färgning. Överför sedan till 80% etanol tills inbäddning för snittning.
  3. Bädda in huden i paraffin vax för histologiska preparat efter standardmetoder21. Kort, protokollet är följande:
    1. Torka vävnader i en graderad serie av etanol och avmarkera etanol med xylen. Bädda in vävnaden i paraffinvax, och placera alla tre hud prover för varje individ i ett paraffin-block.
  4. Avsnitt huden med hjälp av en mikrotom efter histologiska standardpreparatet21. Avsnitt vävnaden seriellt på 5 µm och sedan fästa till hydrofil glasskivor. Placera fyra seriella histosections per hudtyp per bild. Gör tre bilder per individ med seriell hud sektioner, kom ihåg att varje bild har fyra sektioner varje vävnad som anbringas.
  5. Fläcken bilder i följande ordning:
    1. Fläcken den första bilden med hematoxylin följt av eosin från (H & E). Denna bild är att visualisera platsen för Bd sporangier i huden.
    2. Färga den andra bilden efter en kommersiellt tillgänglig TUNEL-analysen för histologiska preparat och följa tillverkarens anvisningar, som beskrivs nedan.
      1. Först deparaffinize avsnitten vävnad i en coplin burk genom tvättning bilderna med tre ändringar av xylen för 5 min per tvätt, och följ med två ändringar av 100% etanol för 5 min varje tvätt. Följ med en tvätt av 95% etanol för 3 min och sedan 70% etanol för 3 min. Finish med en tvätt av PBS för 5 min.
      2. Förbehandla vävnaden med nymalen utspädda protein smälta enzym (proteinas K vid en koncentration på 20 μg/mL utspädd i PBS) och lägga till direkt i bilden. Låt Inkubera i 15 min. Tvätta med två ändringar av PBS i en coplin burk för 2 min varje.
      3. Tryck ut överflödig vätska och släcka i 3,0% väteperoxid i PBS i en coplin burk i 2 min i rumstemp. Skölj två gånger med PBS, i fem minuter varje tvätt.
      4. Tryck ut överflödig vätska och tillämpa 75 µL/5 cm2 jämvikt bufferten direkt på vävnaden i bilden. Inkubera i 10 s. Knacka av överflödig vätska runt avsnittet och tillämpa 55 µL/5 cm2 arbeta terminal deoxynucleotidyl tranferase (TdT) enzymet. Inkubera i en fuktig kammare för 1 h vid 37 ° C.
      5. Efter TdT ruvning, sätta bilden i en coplin burk arbetar styrka stopp/tvättbuffert, agitera för 15 s och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur. Tvätta i bilden med tre ändringar av PBS för 1 min per tvätt. Tryck ut överflödig vätska.
      6. Tillämpa anti-digoxigenin konjugat (rodamin) som har värmt till rumstemperatur i vävnad, 65 µL/5 cm2. Inkubera i en fuktig kammare för 30 min vid rumstemp och undvika exponering för ljus. Tvätta med fyra ändringar av PBS för 2 min per tvätt. Tryck ut överflödig vätska.
      7. Slutför genom att lägga till 15 µL 0,5 - 1 µg/mL DAPI (4', 6-diamidin-2-fenylindol) i monteringsmedium bild till bild, som fungerar som en counter fläck. Täck med ett täckglas och försegla med nagellack eller gummi cement. Låt bilderna ska torka i mörker som analysen är ljuskänsligt.
    3. Fläcken tredje bilden är målat med TUNEL assay och DAPI motfärg, men använder som en positiv och negativ kontroll för varje prov.
      Obs: Av de 4 histosections i kontroll bilderna, de första 2 är positiv kontroll replikat och 2 sista är negativ kontroll replikat.
      1. För de positiva kontrollerna, i stället för steg 4.5.2.2, förbehandla vävnaden med DN buffert (30mM trizma bas, pH 7,2, 4mM MgCl2, 0,1 mM DDT) och låt Inkubera vid rumstemperatur i 5 minuter. Lös sedan DNAS jag i DN buffert för en slutlig koncentration på 0.1ug / mL, och tillämpa den direkt på bilden. Inkubera i 15 minuter i rumstemperatur.  Tvätta sedan bilden med 5 tvätta av dH2O 3 minuter varje tvätt. Torka bort överflödig vätska. Sedan återuppta TUNEL-analysen enligt anvisningarna i avsnittet 4.5.2.3.
      2. För de negativa kontrollerna, Lägg inte till enzymet terminal deoxynucleotidyl tranferase (TdT) att dessa prover (som beskrivs i avsnitt 4.5.2.4).
  6. Iaktta TUNEL bilder omedelbart efter slutförandet av analysen.
    1. Ta bilder på måfå mellanrum längs varje hud avsnitt på 200 X med fluorescerande Mikroskop, använda filter för båda rodamin fläcken, som avslöjar de apoptotiska cellerna och visas rött och DAPI som avslöjar alla kärnor och visas i blått, så att en överlagring av celler kan genereras. Se till att minst 100 celler är fotograferade per hud avsnitt per prov. Lagra bilder i en mörk Mikroskop låda vid-20 ° C.
    2. Räkna celler (blå DAPI målat) per bild. Se till att minst 100 celler räknas per hud avsnitt. För att nå 100 celler, räkna alla celler i bilden. Om mindre än 100 celler finns i en bild, räknas en annan bild tills minst 100 celler nås per hud avsnitt per djur.
    3. Nästa, räkna antalet TUNEL positiva celler i samma bilder (röda rodamin målat). TUNEL positiva celler, som indikerar apoptos och nekros eller inte bakgrunden, är enstaka celler med klarcellig kanter (membran är intakt med ingen lysis). Ibland krympa cellerna till formuläret apoptotiska kroppar.
    4. Leta upp de områden som räknas i TUNEL-analysen och analysera motsvarande regioner i H & E målat histosections. Bekräfta att H & E målat avsnitt motsvarar platser av Bd -infektion som säkerställer Bd-infekterade webbplatser används vid inventering apoptotiska celler i TUNEL-analysen.

5. kaspas 3/7 Assay

  1. Samla in tå tips från varje djur (både Bd- exponerade och Bd- negativa) en gång per vecka genom vecka 3 post inympningen och var fjortonde dag i slutet av experimentet, upp till 8 tår per individ.
    1. Skär tå spetsen på den andra phalange med flame-steriliseras sax, och placera i en 1,5 mL mikrorör och frysa omedelbart vid-80 ° C.
  2. Extrahera proteiner från frusen tå provet.
    1. Placera prover i 100 µL prov buffert (25 mM HEPES pH 7, 5 mM MgCl2) med två rostfria pärlor (3,2 mm) i en 1,5 mL skruvlock mikrorör. Lysera prover av 4 cykler av 1 min pärla slå på högsta hastighet (i samma pärla drevkarlen som används i steg 1.2.1) följt av 3 min på is. Efter Lys, Centrifugera proverna på 12 000 x g och 4 ° C för 5 min. samla supernatanten att använda i analysen.
  3. Kvantifiera proteinkoncentration per prov med Bradford-analys.
    1. I en 384 väl tallrik, blanda 10 µL av protein extrakt med 10 µL Bradford reagens och inkubera i 2 min i rumstemperatur. Utför varje prov i två exemplar, tillsammans med en rad 5 vik BSA utspädning standarder. Läs absorbansen vid 595 nm på en absorbans Plattläsare.
  4. Alternativt, om tå tip proverna är för liten (protein koncentrationen är nära den lägsta standarden som bestäms från Bradford analysen i steg 4.3.1, eller om de grodor som provtas är under 3 g totalvikt), standardisera prover genom att uppskatta hudytan område med fotografier, i stället för Bradford analysen.
    1. Innan utvinna proteiner från provet för kaspas-analysen, fotografera varje tå på 40 X förstoring med ett inverterat ljusmikroskop.
    2. Analysera tå provet med hjälp av en dator bildhanteringsprogram, genom att uppskatta området av tån. Gör detta genom att rita en linje runt kanten på tå klippet och har området imaging programvara uppskattning inom formen. Sedan multiplicera detta område med pi (3.14), som kommer ungefärlig yta 3-dimensionella hud provet (som längden x tvärsnittsarea (pi x diameter) ger ett rör yttre yta).
  5. Utför analysen kaspas 3/7.
    1. I en 384 väl luminiscens plattan, tillsätt 10 µL av kommersiellt tillgängliga kaspas 3/7 reagens och 10 µL av protein extrakt. Kör varje prov i tre exemplar.
    2. Blanda reagenserna genom att skaka plattan långsamt för 15 s. Inkubera plattan från ljus i 30 min i rumstemperatur. Mäta luminiscens använder en självlysande Plattläsare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TUNEL Assay

Det fanns fler TUNEL positiva celler i de infektera djuren än i oinfekterade kontroll djuren. Placering i situ TUNEL positiva celler skilde sig i infekterad och kontrolldjuren. I djuren i kontrollgruppen fanns det en jämn fördelning av TUNEL positiva celler i hela den dermala och epidermala hud lager på låga nivåer (se figur 1A), men i de infektera djuren, TUNEL positiva cellerna var mer frekventa i överhuden (figur 1b). platserna av infektion (som observerats i H & E målat bilder) observerades som klumpgranulat Bd sporangier utspridda genom låret och ventrala hud sektioner med ingen i avsnitten dorsum. Medan TUNEL positiva celler var mer koncentrerad på och direkt anslutning till platser av infekterade celler (figur 1 c), det var också vanligare TUNEL positiva celler över epidermis och i epidermala skikt som var djupare än där Bd bodde. I Bd smittade djur fanns mer TUNEL positiva celler i alla tre hudtyper analyseras, men en särskilt hög nivå i låret och venter huden (12,01 gånger högre (95% CI: 4,92-26.30) i låret hud och 22.31 gånger högre (95% CI 5,25-94.82) i den Venter hud) (figur 2).

Kaspas 3/7 Assay

Under loppet av infektion fanns det en skillnad i kaspas aktivitet. I Bd infekterade djur, var infektion intensitet positivt korrelerade med kaspas 3/7 aktivitet (figur 3). Det fanns också en skillnad mellan smittade och oinfekterade djur genom tiden, post inympning. Kaspas 3/7 aktivitet minskade inom de första veckorna efter inympningen (med 48.36% mindre aktivitet i infekterade djur) och sedan ökade mot slutet av vecka 7 (figur 4) i Bd smittade djur, men förblev konstant i icke-infekterade individer.

Figure 1
Figur 1: Terminal transferas-medierad dUTP nick slutet-märkning (TUNEL) i situ haltbestämning av infekterade och infekterade djur. En) Bd- postkontroll låret hud Pseudophryne corroboree, och B) Bd+ lår hud avsnitt av P. corroboree färgas av i situ TUNEL assay. Blå är DAPI färgning indikerande kärnor av cellerna, och röda är rodamin fläcken, vilket indikerar DNA-fragmentering egenskapt orsakas av apoptos. Den gula pilen anger positionen för Bd klustret sett i panelen C. C) P. corroboree avsnitt av låret hud färgad med H & E. Avsnittet H & E är seriell till panelen B. Det finns ett kluster av Tom Bd sporangier (pil) och några mörka omogna sporangier nära hudytan. För alla tre paneler är överhuden överst på bilden. Jämföra paneler B och C visar att den rodamin målat epidermala celler är koncentrerad runt och under klustret av Bd och där hudskador är synliga, såsom mikro-vesikler bildning mellan basala epidermala celler. 400 X förstoring och skalstapeln anger 0,03 mm. anpassas från figur 2 i Brannelly et al. 2017 Peer J22. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: andelen TUNEL positiva (TUNEL +) celler per hudtyp. Andelen TUNEL positiva apoptotiska celler per hudtyp i P. corroboree, med infekterade djur som visar djur som dukade under till sjukdom (n = 9) och icke-infekterade kontrolldjur (n = 10). Felstaplar visar 95% konfidensintervall en andel och * visar en markant ökning TUNEL + cell proportioner. I dorsala huden, de infektera djuren hade 14.38 (95% CI 3,32-62.24) gånger mer TUNEL positiva celler än djuren i kontrollgruppen (oddskvot: Z = 3,57, p < 0,01). I låret huden, smittade djur hade 12,01 (95% CI: 4,92-26.30; Oddskvot: Z = 5,46, p < 0,01) gånger mer TUNEL positiva celler än djuren i kontrollgruppen (Pearson's Chi Squared: χ21 = 44,30, p < 0,01). I venter huden, smittade djur hade 22.31 (95% CI 5,25-94.82) gånger mer TUNEL positiva celler än djuren i kontrollgruppen (oddskvot: Z = 4.21, p < 0,01). Anpassad från figur 3 i Brannelly et al. 2017 Peer J22. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Sambandet mellan infektion intensitet, Log10(zoospore medel) och kaspas 3/7, Log10(kaspas) av inokuleras Litoria verreauxii alpina under loppet av experimentet. Sambandet mellan infektion intensitet och kaspas aktivitet är 0.463 och trenden har en ekvation y = (0.229) x + 0.939. Anpassad från figur 4 i Brannelly et al. 2017 peer J22. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Kaspas 3/7 verksamhet genom vecka 7 för varje grupp av Litoria verreauxii alpina: Bd-infekterade djur som dukade under till sjukdom (n = 4) och infekterade kontroller (n = 8). Kaspas aktivitet definieras som den luminiscens läsning kontrolleras för av proteinkoncentration per prov och logga sedan bas 10 omvandlas. Kaspas aktiviteten (Log10 omvandlas) för varje grupp per vecka. Felstaplar visar standardfel. * anger att de infektera djuren skilde sig från de icke-infekterade kontrollerna vid denna vecka. (Linjär blandade effekter modell: vecka, F4 = 11.974, p < 0,01; vecka * status, F8 = 2.139, p = 0.037; Vecka 3 ANOVA, F2,18 = 5.512, p = 0,014), anpassade från figur 5 i Brannelly et al. 2017 Peer J22. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi utforskade epidermal apoptos och celldöd som potentiella mekanism patologi av den dödliga sjukdomen ranoides eller en mekanism av motståndskraft mot sjukdomar i Bd mottagliga arter. Vi använde två metoder för bedömning av celldöd i epidermis, TUNEL assay för i situ epidermal cell death analys och kaspas 3/7 analys för övervakning epidermal celldöd i hela förloppet för infektion. Vi fann att celldöd och apoptos är korrelerade med infektion belastning och celldöd är betydligt högre på platsen för infektionen. I tidig infektion, det är en minskning i apoptos i överhuden, men apoptos ökar som patogen belastningen ökar inom den infektera vävnaden.

Apoptos i celler kan testas med hjälp av många olika metoder, var och en med fördelar och begränsningar. Det är viktigt att studera apoptos och cell död med flera analyser för att bekräfta resultaten. I denna studie utforskade vi två olika analyser för att undersöka epidermal celldöd och apoptos i grodor med ranoides. Första, vi testas TUNEL analys för att bedöma cell death in situ. Detta test är tidskrävande och dyra per prov, och bilder måste läsas omedelbart som fluorescerande signalen snabbt bleknar. Trots dessa begränsningar är resultatet av detta i situ -experiment viktigt att ytterligare förstå mekanismerna för värd-patogen interaktioner. Information om lokalisering kan bestämmas med hjälp av denna metod, och i vår studie apoptos var närvarande i höga nivåer på platsen för svampinfektion och mer diffust på andra platser. Det skall dessutom noteras att TUNEL analysen mäter DNA-skador, vilket kan orsakas av ett antal olika cell death mekanismer inklusive apoptos, nekros och pyroptosis17. Medan det finns signaturer av apoptos-associerade celldöd (såsom enstaka celler med membran fortfarande intakt, se protokollet line 4.6.3, klassificeringen bygger på tolkning av forskaren. Eftersom mekanismen av celldöd inte bestäms av TUNEL analysen, är det möjligt att en annan icke-apoptos cell death väg kan ha orsakat ökningen i TUNEL positiva celler på sjuklighet infekterade djur. Skillnaden i vilka varje assay åtgärder kan förklara mönster skillnader i två analyser testas här.

Kaspas 3/7 analysen kan användas för att kvantifiera effekten av infektion genom tiden. Dock som grodan tå prover är små, finns det begränsade prov för analys och standardisering. En vanlig metod för provet standardisering är att bestämma totalprotein koncentrationen av varje utdrag. Som Bradford protein kvantifiering analysen förbrukar prov, är det inte en effektiv metod för små extrakt. Dessutom hittade vi det pigment inom grodan hud uteslutas analys av nano UV-Vis-spektrometriska. Små urvalsstorlekar förhindras också standardisering av torrvikt. Vi föreslår att uppskatta hud yta på tån med fotografi, som tå tip proverna (dessa grodor var mindre än 3 g i kroppsstorlek) var för liten för att möjliggöra analyser för både proteinkoncentration och kaspas koncentration. Vi hittade att fotografera tårna och använder en hud yta uppskattning är lika effektiv som traditionell protein koncentration analyser.

I denna studie vi används två vanliga tekniker för att kvantifiera celldöd och apoptos, men anpassade metoder för amfibier och små vävnadsprover. För TUNEL analysen euthanized vi djuret för att säkerställa tillräckligt vävnad var tillgänglig för analysen, och tillåtet för jämförelse av olika hud platser. Det är möjligt att anpassa metoden till mindre vävnadsprover, såsom en tå sadelgjord biopsi, som inte skulle kräva avlivning av djuret. Beroende på storleken på djuret, biopsier kan möjliggöra för en tid serien testa liknar vår strategi för kaspas 3/7 analysen.

I framtida studier, vi föreslår användning av ytterligare analyser för att utforska celldöd och apoptos under loppet av ranoides infektion eftersom det finns fortfarande mycket att lära av ranoides patogenes kausala mekanismer. Dessa resultat tyder på att apoptos och epidermal celldöd kan vara viktigt i patogenesen av Bd; Mer forskning behövs dock för att bestämma påverkan av apoptos på sjukdomen resultat, särskilt i värdar som inte ge efter för infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inget konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Vi tacka följande personer som bistod med djurhållning och datainsamling: D. Tegtmeier, C. De Jong, J. Hawkes, K. Fossen, S. Percival, M. McWilliams, L. Bertola, M. Stewart, N. Harney och T. Knavel; och M. Merces för hjälp med dissektioner. Vi vill också tacka M. McFadden, s. Harlow och Taronga Zoo för att höja den L. v. alpinaoch G. Marantelli för att höja den P. corroboree. Vi tackar F. Pasmans, A. Martel för råd om apoptos analyser, C. Constantine, A. Kladnik och R. Webb för hjälp med TUNEL assay, och T. Emeto och W. Weßels för hjälp med protokoll och kit för kaspas 3/7 assay. Detta manuskript och protokollet är anpassad från Brannelly et al 2017 Peer J22.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
POLARstar Omega BMG Labtech Luminescent plate reader
384 well flat clear bottom plate Corning 3707
384 well low flange white flat bottom plate Corning 3570
Agar Bacteriological (Oxoid) Fisher OXLP0011B
Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin Fisher 6764254
Lactose Broth (Oxoid) Fisher OXCM0137B
Sodium Bicarbonate Fisher BP328-500
Tricane-S (MS-222) Fisher NC0872873
Tryptone Fisher BP1421-500
Bovine Serum Albumin Invitrogen 15561020
Sterile rayon swab Medical Wire & Equipment MW-113
ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit Merck Millipore S7165
Coomassie Bradford reagent Pierce 23200
Caspase Glo  3/7 Promega G8090
HEPES buffer Sigma Aldrich H0887-20ML
Magnesium chloride Sigma Aldrich 1374248-1G
Gelatin hydrolysate Enzymatic Sigma-Aldrich G0262
PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X) Thermo/Life 20-012-043
Prepman Thermo/Life 4318930
TaqMan Fast Advanced Master Mix ThermoFisher 4444556
Parafilm Bemis PM996
Clorox bleach Clorox
Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade Fisher BP2818500
ZEISS Axio Scan florescent miscroscope Carl Zeiss Florescent microscope
3.2mm stainless steel beads BioSpec 11079132SS
Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGAT
ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′)		 Taqman Individual design for primers and probe
Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTT
CTCTAGGCAACAGTTT-3′)		 Taqman Individual design for primers and probe
Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′) Taqman Individual design for primers and probe
Rotor-Gene qPCR Instruments Qiagen qPCR machine
Microcentrifuge tubes 1.5ml Fisher 02-681-372
Cell culture petri plates Nunc 263991
Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm BioSpec 11079105Z

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
  2. Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
  3. Voyles, J., et al. Pathogenesis of chytridiomycosis, a cause of catastrophic amphibian declines. Science. 326 (5952), 582-585 (2009).
  4. Woodhams, D. C., et al. Population trends associated with skin peptide defenses against chytridiomycosis in Australian frogs. Oecologia. 146 (4), 531-540 (2006).
  5. Woodhams, D. C., Voyles, J., Lips, K. R., Carey, C., Rollins-Smith, L. A. Predicted disease susceptibility in a Panamanian amphibian assemblage based on skin peptide defenses. Journal of Wildlife Diseases. 42 (2), 207-218 (2006).
  6. Woodhams, D. C., Rollins-Smith, L. A., Alford, R. A., Simon, M. A., Harris, R. N. Innate immune defenses of amphibian skin: antimicrobial peptides and more. Animal Conservation. 10, 425-428 (2007).
  7. Savage, A. E., Zamudio, K. R. MHC genotypes associate with resistance to a frog-killing fungus. PNAS. 108 (40), 16705-16710 (2011).
  8. Bataille, A., et al. Susceptibility of amphibians to chytridiomycosis is associated with MHC class II conformation. Proceeding of the Royal Society B. 282, 20143127 (2015).
  9. Fites, J. S., Reinert, L. K., Chappell, T. M., Rollins-Smith, L. A. Inhibition of local immune responses by the frog-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Infection and Immunity. 82 (11), 4698-4706 (2014).
  10. Brannelly, L. A., Webb, R. J., Skerratt, L. F., Berger, L. Effects of chytridiomycosis on hematopoietic tissue in the spleen, kidney and bone marrow in three diverse amphibian species. Pathogens and Disease. 74 (7), ftw069 (2016).
  11. Brutyn, M., et al. Batrachochytrium dendrobatidis zoospore secretions rapidly disturb intercellular junctions in frog skin. Fungal Genetics and Biology. 49 (10), 830-837 (2012).
  12. Berger, L., Hyatt, A. D., Speare, R., Longcore, J. E. Life cycle stages of the amphibian chytrid Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 68 (1), 51-63 (2005).
  13. Pasmans, F., et al. Chytridiomycosis related mortality in a midwife toad (Alytes obstetricans) in Belgium. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. 79 (6), 460-462 (2010).
  14. Ellison, A. R., et al. More than skin deep: Functional genomic basis for resistance to amphibian chytridiomycosis. Genome Biology and Evolution. 7 (1), 286-298 (2014).
  15. Fites, J. S., et al. The invasive chytrid fungus of amphibians paralyzes lymphocyte responses. Science. 342 (6156), 366-369 (2013).
  16. Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
  17. Kelly, K. J., Sandoval, R. M., Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. A novel method to determine specificity and sensitivity of the TUNEL reaction in the quantitation of apoptosis. American Journal of Cell Physiology. 284 (5), C1309-C1318 (2003).
  18. Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Diseases of Aquatic Organisms. 60 (2), 141-148 (2004).
  19. Brannelly, L. A., Webb, R., Skerratt, L. F., Berger, L. Amphibians with infectious disease increase their reproductive effort: evidence for the terminal investment hypothesis. Open Biology. 6 (6), 1-24 (2016).
  20. Webb, R., Mendez, D., Berger, L., Speare, R. Additional disinfectants effective against the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 74 (1), 13-16 (2007).
  21. Woods, A., Ellis, R. Laboratory Histopathology: A Complete Reference. , Churchill Livingstone: Edinburgh. (1994).
  22. Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis. PeerJ. 5, e2925 (2017).

Tags

Immunologi och infektion utfärda 135 apoptos kaspas histologi patologi TUNEL Wildlife sjukdom
Använda Terminal transferas-medierad dUTP analyser Nick slutet-märkning (TUNEL) och kaspas 3/7 till åtgärd Epidermal celldöd hos grodor med ranoides
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brannelly, L. A., Roberts, A. A.,… More

Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis. J. Vis. Exp. (135), e57345, doi:10.3791/57345 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter