Summary
İnsan beyin dokusundan izole beyin kılcal bariyer fonksiyonu fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında çalışmaya preklinik model olarak kullanılabilir. Burada, beynin kılcal taze insan beyin dokusundan izole etmek için en iyi duruma getirilmiş bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Anlayış kan - beyin bariyerini işlevi fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında beyin ilaç dağıtım geliştirmek için beyin korumasını geliştirmek ve beyin tedavi sözü tutun yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için önemlidir bozuklukları. Ancak, insan kan - beyin bariyerini işlev eğitim meydan okuyor. Böylece, uygun modelleri için kritik bir ihtiyaç vardır. Bu bağlamda, beyin kılcal insan beyin dokusundan izole bariyer fonksiyonu olarak insan vivo içinde durum mümkün olduğunca yakın çalışma için eşsiz bir araç temsil eder. Burada, kılcal bir yüksek verimli ve tutarlı kalite ve saflık insan beyin dokusundan izole etmek için en iyi duruma getirilmiş bir protokolü açıklar. Kılcal mekanik homojenizasyon, yoğunluğu-gradient Santrifüjü ve filtrasyon kullanma taze insan beyin dokusundan izole edilmiştir. Yalıtım sonra insan beyin kapiller protein ifade ve işlev, enzim aktivitesi veya hücre içi sinyal çalışmaya sızıntı deneyleri, canlı hücre görüntüleme ve bağışıklık tabanlı deneyleri gibi çeşitli uygulamalar için kullanılabilir. İzole insan beyin kılcal insan kan - beyin bariyerini işlevi Yönetmeliği aydınlatmak için benzersiz bir model vardır. Bu model CNS hastalıkları tedavisi için tedavi edici stratejiler geliştirilmesine yardımcı olacak merkezi sinir sistemi (MSS) patogenezinde kazandırabileceğini.
Introduction
Kan - beyin bariyerini kan ve ne gider ve beyin dışarı geliyor belirler beyin arasındaki sıkı şekilde denetlenen bir arabirimdir. Anatomik olarak, endotel hücreleri kan - beyin bariyerini oluşturmak ve karmaşık, sürekli kılcal ağ oluşturur. Fizyolojik açıdan, bu kılcal ağ aynı anda karbon dioksit ve metabolik atık ürünlerin atılması sırasında beyin oksijen ve besin sağlar. Önemlisi, kanıt bariyer değişikliklere Alzheimer hastalığı, epilepsi ve kontur1,2,3,4,5 de dahil olmak üzere çok sayıda patolojiler için katkıda destekler , 6 , 7. endotel hücreleri de hizmet tedavi için bir engel olarak beyne, Örneğinilaç alımı bloke ederek beyin., kemoterapi glioblastoma multiforme Tümör rezeksiyonu8,9, takip 10. Bu bağlamda, izole insan beyin kılcal damarlar çok bariyer fonksiyonu ve sağlıkta disfonksiyon eğitim veren bariyer özellikleri içinde vivo benzeyen bir benzersiz ex vivo kan - beyin bariyerini modeli temsil ve hastalık. Bu makalede, biz--dan sürekli yüksek kapiller kalitede insan beyin beyin kılcal yalıtmak ve kan - beyin bariyerini çalışmaya verim için bir protokol sağlar.
1969 yılında, Siakotos ve ark. 11 ilk beyin kapiller yoğunluk gradient Santrifüjü ve cam boncuk sütun ayrımı yöntemi kullanılarak sığır ve insan beyin dokusundan yalıtım rapor edildi. Daha sonra Goldstein vd. 12 bu yöntem doku sıçanlarından emir, glikoz taşıma metabolik aktivite koruyarak izole beyin kılcal çalışma için gerekli azaltmak için birden fazla filtrasyon adımları ekleyerek geliştirilmiş. O zamandan beri araştırmacılar çok kez, yöntemi ve beyin kapiller modeli her yineleme13,14,15ile iyileştirilmesi kapiller yalıtım yordamı optimize edilmiştir. Örneğin, Pardridge ve ark. 16 sığır kılcal mekanik homojenizasyon yerine enzimatik sindirim kullanarak izole ve sonra daha sonra 210 µm gözenekli filtre ve cam boncuk sütun kılcal bir süspansiyon geçti. Bu değişiklikler trypan mavi dışlama leke izole beyin kapiller geliştirilmiş ve böylece, endotel hücre canlılığı arttı. 1990'ların başında Dallaire ve ark. 17 nöronal kirlenme açıktı ve γ-glutamil transpeptidase (γ-GTase) ve alkalen fosfataz metabolik aktivite yapılmaktadır sığır ve sıçan kılcal izole. 2000'de, Miller ve ark. 18, izole sıçan ve domuz beyin kılcal confocal mikroskobu ile birlikte taşıma yüzeylerde birikimi kılcal lümen içine göstermek için kullanılır. Daha sonra bizim laboratuvar beyin kapiller yalıtım yordamı optimize etmek devam etmiştir ve P-glikoprotein (P-gp)19,20,21, meme kanseri belirlemek için taşıma deneyleri kurduk direnç protein (BCRP)22,23ve çoklu ilaç direnci protein 2 (Mrp2)24 taşıma etkinlik. 2004 yılında, biz nereye biz izole sıçan beyin kılcal çeşitli sinyal yolları araştırmak için kullanılan iki raporlar yayınlandı. Hartz ve ark. 21, peptid endotelin-1 P-gp taşıma işlevinde beyin kılcal (PKC) endotelin reseptör B (ETB) reseptör, nitrik oksit sentaz (NOS) ve protein kinaz C üzerinden hareket ederek hızla ve geri dönülebilir olarak azaltılmış bulduk. Bauer vd. 19, nükleer reseptör pregnane X reseptör (PXR) ifade ve P-gp ifade ve taşıma fonksiyonunu kullanabilirsiniz beyin kılcal gösterdi PXR modülasyon gösterdi. Deneylerde transgenik insanlaşmış PXR fareler ile bu satırı araştırma, genişletilmiş ve in vivo etkinleşmiş P-gp ile hPXR harekete geçirmek25tarafından bariyer sıkma gösterdi. 2010 yılında, Hartz ve ark. P-gp protein ifade geri yüklemek ve etkinlik mutlu overexpress transgenik insan amiloid precursor protein (mutlu) farelerde taşımak için bu yaklaşım 26 ' yı kullandık. Ayrıca, P-gp mutlu içinde geri fareler amiloid beta (Aβ)40ve Aβ42beyin düzeyleri azaltılacağını.
Sinyal yolları eğitim ek olarak, izole beyin kılcal biz kapiler kaçak başvuran kapiller permeabilite değişiklikleri belirlemek için kullanılabilir. Özellikle, Texas kırmızı sızıntı tahlil zaman ve bu veriler üzerinde kılcal lümen Texas kırmızıdan sonra kaçak oranları analiz etmek için kullanılan floresan boya kaçağı değerlendirmek için kullanılır. Bu denetim kılcal kıyasla artmış kapiller sızıntı kan - beyin bariyerini2fiziksel bütünlüğünü değişimler gösterir. Çok sayıda hastalık durumlarında bariyer bozulma, e.gile ilişkili olduğundan bu değerlidir., epilepsi, multipl skleroz, Alzheimer hastalığı ve travmatik beyin hasarı27,28,29, 30. Diğer grupları da protein ifade ve proteinler31,32,33,34taşıma faaliyetleri düzenleyen sinyal yolları ayırt etmek izole kılcal kullanılmıştır, 35,36,37. Son olarak, bu yöntem insan beyin kapiller yalıtım için optimize etmek devam etmiştir ve son zamanlarda, biz artan P-gp ifade insan kan - beyin bariyerini hastalarda, epilepsi nöbet ücretsiz kontrol bireylere38 karşılaştırıldığında ile gösterdi . Birlikte ele alındığında, bu gelişmeler izole beyin kılcal bariyer fonksiyonu eğitim için çok yönlü bir model olarak hizmet verebilir göstermektedir.
Çeşitli içinde vivo, ex vivove in vitro kan - beyin bariyerini modelleri temel araştırma ve endüstriyel uyuşturucu tarama, esas olarak ilaç dağıtım beyin39,40,41 test amacı ile kullanılmıştır ,42,43,44. İzole ex vivo beyin kılcal yanı sıra, geçerli kan - beyin bariyerini modelleri dahil silico modelleri, vitro hücre kültürü izole beyin kapiller endotel hücreleri veya çeşitli ölümsüzleştirdi hücre satırlarından türler, vitro kültür insan pluripotent kök beyin kapiller endotel hücreleri ve mikrosıvısal modelleri bir yonga üzerinde içine hücre (hPSC).
Silico modelleri tahmin edilen emme, dağıtım, metabolizması ve atılımı (ADME) özellikleri dayalı ilaç adaylarının seçmek için ilaç geliştirme içinde en yaygın olarak kullanılır. Niceliksel yapısı-özelliği ilişki (QSPR) modelleri ve niceliksel yapısı-etkinlik ilişkisi (QSAR) modelleri gibi yöntemleri kütüphanelerin yüksek üretilen iş tarama beyin penetrasyon ilaç adaylarının tahmin etmek için kullanılan popüler yöntem vardır 45 , 46. bu modeller ekran moleküllere bariyer penetrasyonu özellikleri için yararlıdır.
Betz vd. 47 monolayers kültürlü beyin kapiller endotel hücrelerinin bir vitro kan - beyin bariyerini modeli kurulmuş. Vitro hücre kültür modelleri taze doku veya ölümsüzleştirdi endotel hücre hatları gibi insan beyin microvessel endotel hücreleri (hCMECs) kullanarak beyin penetrasyon veya mekanik çalışmaları için başka bir yüksek üretilen iş tarama aracı olabilir. Ancak, beyin kapiller endotel hücre kültür modelleri fizyolojik kesme stres kan akımı kapiller lümen içinde eksikliği, genel olarak biyolojik karmaşıklığı sınırlıdır ve değişiklikleri ifade ve yerelleştirme önemli bariyer bileşenlerinin meydana sıkı kavşak proteinler gibi yüzey reseptörlerinin, ışınlayıcılar, enzimler ve iyon kanalları48,49,50. Diğer taraftan, endotel monolayers hPSCs türetilmiş, hCMEC/D3 kültürlere göre düşük sükroz geçirgenliği var ve bazı kan - beyin bariyerini taşıyıcılar, adezyon molekülleri ve sıkı kavşak51, polarize ifade içeren 52. ancak, bu hücreler aynı zamanda kültür özellikleri değiştirme tabi, ve sistem içinde vivo bariyer özellikleri52onun tekrarlama için doğrulanması gerekir.
Kan - beyin bariyerini araştırma daha yeni eğilimler mikrosıvısal cihazlar üretmek için organ-on-chip teknolojisini kullanarak veya içi boş fiber teknolojisi53, kullanan yapay kılcal damarlar, oluşturmak için 3D doku kültürü sistemleri kullanan dahil 54 , 55. yapay kılcal damarlar, ancak, önemli ölçüde daha büyük çaplarda (100 – 200 µm) beyin kılcal damarlar (3-7 µm) daha vardır. Bu nedenle, kesme kuvvetleri vitro değil tamamen benzer vivo içinde durum. Bu "blood-brain-barrier-on-a-chip" mikrosıvısal cihazlar, Yapay membran formu "kan" ve "beyin" bölmeleri ve sıvıları mikrosıvısal kesme kuvvetleri bu cihazlar aracılığıyla nerede pompalanır ele olduğunu. Benzer şekilde, astrocytes ile çeşitli kombinasyonlarda endotel hücreleri ve vasküler düz kas hücreleri ortak kültürleri de hollow fiber teknolojisi ile rheological parametreleri vivo içinde koşullar56 altında mevcut yeniden oluşturmak için kullanılmıştır , 57 , 58. ancak, ne kadar iyi bu modeli kan - beyin bariyerini taşıma, metabolizma, sinyal ve diğerleri gibi diğer özelliklerini yansıtır belli değildir. Bu yapay kılcal ve chip modelleri ilaçların yüksek üretilen iş tarama için uygundur, ancak bu modeller oluşturmak için kullanılan hücrelere de kültür sırasında değiştirilebilir.
Dondurulmuş ve sabit beyin dilimler veya birincil beyin kapiller endotel hücre kültürlerindeinsan microvasculature çalışma5,59,60,61için kullanılabilecek ek modellerdir. Örneğin, immünhistokimya sabit beyin dokusunun protein yerelleştirme belirlemek için kullanılır ve sağlıklı ifadede hastalıklı dokusu ile karşılaştırıldığında.
Dokusu dilimlerin ve vitro modelleri yanı sıra yukarıda açıklanan, taze izole beyin kılcal kan - beyin bariyerini işlev eğitim için yararlı olabilir. Bu izole kapiller modelin sınırlamaları içerir taze insan beyin dokusu, elde etmek için zorluk olmaması astrocytes ve nöronlar ve nispeten zaman alan ayırma işlemi. Bir avantajdır izole beyin kapiller modeli bu modeli çok benzeyen vivo içinde durum ve bu nedenle, bariyer fonksiyonu ve fonksiyon bozukluğu karakterize etmek için kullanılabilir. Önemlisi, bu da sinyal mekanizmalarını deneyleri ve moleküler teknikleri3,19,62,63çok sayıda kullanma ayırt için kullanılabilir.
Bizim Laboratuvar her iki taze ve donmuş insan beyin dokusu yaşlanma Sanders-kahverengi Merkezi aracılığıyla erişebilir (IRB #B15-2602-M)64. Bu bağlamda, standart bir protokol otopsi izle, beyin içinde elde edilen < 4 h ve tüm yordamları uygun NIH Biospecimen en iyi pratik kurallar65için. Bu benzersiz erişim insan beyin dokusu ile göz önüne alındığında, biz kurulan ve beyin kılcal sağlam, uygun insan beyin kılcal yüksek bir verim içinde sonuçları insan beyin dokusundan izole etmek için bir iletişim kuralı en iyi duruma getirilmiş. Protein ifade ve etkinliğini belirlemek için iki ortak bitiş noktası ilgi vardır. Bu bağlamda, biz ve diğerleri ile izole beyin kapiller protein ifade ve aktivite düzeyleri kullanılabilir çeşitli deneyleri kurduk. Bu deneyleri Western blot, basit Western tahlil, enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA), Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR), nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), zymography, taşıma faaliyet deneyleri, içerir ve Kapiler kaçak deneyleri. Bu deneyleri araştırmacılar bariyer fonksiyonu insan patolojik koşullarında değişimler çalışma, protein ifade ve etkinlik düzenleyen yolları belirlemek ve kan - beyin bariyerini ilişkili tedavisi için farmakolojik hedefleri belirlemek izin hastalıklar.
Alınan birlikte, taze izole beyin kılcal kan - beyin bariyerini sağlam ve tekrarlanabilir model olarak hizmet verebilir. Özellikle, bu model bir yelpazeye bariyer fonksiyonu çalışma için bitiş noktaları belirlemek için birçok farklı deneyleri ile kombine edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki bilgileri geçerli güvenlik ve Kentucky Üniversitesi, Lexington, KY, ABD düzenleyici standartlara dayanmaktadır. Bir güvenlik önlemi olarak, kurumun biyolojik güvenliği programı ve en güncel yönetmelik ve öneriler için insan dokusu ile çalışmaya başlamadan önce bakın.
Dikkat: İnsan dokusu insan immün yetmezlik virüsü (HIV), Hepatit B virüsü (HBV), Hepatit C virüsü (HCV) ve diğerleri de dahil olmak üzere, kan yoluyla bulaşan patojenler bir kaynağı olabilir. İnsan dokusu ile çalışma patojenler kan yoluyla enfeksiyon riski. Bu nedenle, belirli bir düzenleyici ve güvenlik uygulaması insan dokusu ile laboratuar personeli korumaya çalışırken zorunludur. ABD insan dokusu ile çalışma bir Biyogüvenlik seviye 2 Laboratuvar yanı sıra güvenlik önlemleri ve NIH Bölüm IV-B-7, OSHA 1970 yan tümce 5(a)(1) ve kullanıcının kurumsal biyolojik güvenliği programı yasası uyarınca eğitim gerektirir. Genel olarak, kurumsal Biyogüvenlik kurulu ve/veya kurumsal İnceleme Kurulu onayı insan malzemeleri (doku, vücut sıvıları) içeren herhangi bir araştırma önce alınmalıdır. Eğitim insan malzeme ile çalışan tüm personel için gereklidir ve temel laboratuvar güvenlik eğitimi, Örneğin, kimyasal hijyen ve laboratuvar güvenliği, hem de biyolojik güvenlik, tehlikeli atık ve insan üzerinde özel eğitim içerir kan kaynaklı patojenler. İnsan malzeme ile çalışan tüm personelin hepatit B aşıları, önce insan malzeme ile çalışan almak için kesinlikle önerilir. Personel insan malzemelerle, e.gçalışırken belirli kişisel koruyucu donanımları gereklidir., kelepçeli bir önlük ve kalkan ve her zaman eldiven giymek bir yüz. İçinde bir Biyogüvenlik kabini (sınıf 2) gerçekleştirilmiş tüm işleri. İnsan malzemeler ile temas ve herhangi bir atık insan malzemelerden gelir tüm ekipman kirlenme ve/veya personel enfeksiyonu önlemek için uygun şekilde ele alınır. Tüm ekipman ve yüzeyler ile % 10 çamaşır suyu ve % 75 etanol insan malzemeler içeren her yordam aşağıdaki temizlenir. Bir sızıntı insan malzeme ile hemen temizlenmesi gerekir. Züccaciye Mağazaları her kullanımdan sonra autoclaved. Sabitlenmemiş insan dokusu, dahil olmak üzere atık, etiketli biohazard atık çantaya toplanan ve autoclaved. "Sharps" olarak biyolojik etiketli bir delik ve sızıntı geçirmez kap içinde toplanır. İnsan malzemelerden tüm atık kurumun biyolojik güvenlik yönetmeliklerine göre atıldı.
Not: Bizim laboratuvar taze frontal korteks örnekleri yaşlanma Sanders-kahverengi Merkezi aracılığıyla vefat eden bireyler elde eder (IRB #B15-2602-M). Dahil ölçütlerdir: kayıt UK-ADC boyuna otopsi kohort çalışma ve bir Post-Mortem aralığı (PMI) ≤4 s64. Otopsi standart bir protokol izleyin ve tüm yordamları NIH Biospecimen en iyi pratik kurallar65için uygun. Az 4 h kısa bir PMI yalıtım sonra kapiller canlılığı sağlamak için yüksek önem taşımaktadır. Dondurulmuş ve taze doku kullanılabilir. Donma gerekli ise, taze elde edilen insan beyin dokusu şok sıvı azot içinde donmuş olmalı ve-80 ° C'de depolanan Taze veya çözdürülen doku içinde yalıtım tampon (aşağıya bakınız) depolanabilir ve hızlı bir şekilde işlenebilir. Biz o 10 g taze insan dokusu verimleri yaklaşık 100 mg beyin kapiller (ıslak ağırlık) bulabilirsiniz.
1. Kurulum
-
Arabellek hazırlık
Not: Gerekli arabellek hacmi doku miktarına bağlıdır. Tüm arabellek güç aşağıdaki protokol içinde insan beyin korteksi doku 10 g üzerinde temel alır.- L izolasyon arabellek: 1, 5 L Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS; 2.7 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8.1 mM Na2HPO4, 0.9 mM CaCl2, 0,49 mM MgCl2) kullanın ve ek 5 mM D-glikoz (1.35 g ) ve 1 mM sodyum pyruvate (0,165 g). Glikoz ve pyruvate ekledikten sonra sodyum hidroksit ile pH 7.4 için ayarlayın. Serin ve 4 ° C kullanmadan önce arabelleğe saklayın.
- Sığır Serum Albumin (BSA): yalıtım arabelleği bir son BSA konsantrasyonu % 1 1 L 10 g BSA tozu ekleyin. Bubbles kaçınmak, pH 7.4 ayarlamak ve gecede 4 ° C'de depolamak için yavaş yavaş ilave edin. Hemen kullanmadan önce hafifçe karıştırın; albümin denatürasyon önlemek için kabarcıklar oluşturan kaçının.
- Yoğunluk gradient Orta: bir cam şişe içine yoğunluk gradient orta 18 g tartmak ve manyetik heyecan çubuğu ekleme. Yalıtım arabellek 60 mL ekleyin ve tüm toz askıya kadar 5 dk şiddetle çalkalanır. Mağaza gecede 4 ° C'de geçiyoruz yoğunluk degrade orta izin vermek için. Kullanmadan önce 10 dakika karıştırın.
- 4 ° C'de tüm arabellekleri depolar; Tüm araçlar ve buz arabellekleri tüm yalıtım işlem sırasında tutmak. Kullanmadan önce tüm arabellekleri karıştırın.
-
Deneysel Kur
- Potter-Elvehjem doku değirmeni elektronik havai karıştırıcı üzerine havaneli bağlayın. Potter-Elvehjem doku değirmeni ve Dounce homogenizer başlık altında buzda havaneli ile yerleştirin. 300 µm filtre mesh (5 x 5 cm2) hazırlamak, bir koni katlayın ve eklemek ve 50 mL Falcon tüp bandı (Şekil 1A) ile ekleyin.
- Bağlantı halkaları yerleştirin ve zorlanma filtreleri hücre (gözenek boyutu: 30 µm) 50 mL Falcon tüpler üzerinde. Biyolojik atık torbaları hazırlayın. Gerekli tüm ekipman Biyogüvenlik kabini yerleştirin (bkz. Tablo malzeme).
2. beyin numune hazırlama
Not: Şekil 1A aşağıda açıklanan tüm yalıtım yordamı iş akışı grafiğini gösterir. İnsan beyin dokusu korteks herhangi bir yerinden kök olabilir ve taze veya dondurulmuş kullanılabilir. Donmuş beyin dokusu oda sıcaklığında (arabellek yok; ~ 30 dk 10 g için) çözülmüş. Benzer sonuçlar elde etmek için beyin dokusu her deneme için aynı beyin bölgesinden alınmalıdır. Bu iletişim kuralı için taze optimize edilmiştir (PMI < 4 h) değil donmuş halde insan beyin korteksi.
- İnsan beyin dokusunun hazırlanması: beyin dokusunun ağırlık belge. Aşağıdaki iletişim kuralı tüm numaraları 10 g taze insan beyin doku için uygundur. Beyin dokusu bir 100 mm Petri kabına yerleştirin. Dikkatli bir şekilde tüm meninkslerde forseps ile çıkarın. Bir neşter beyaz madde kesmek için kullanın.
- İnsan beyin dokusunun kıyma: dikkatle beyin dokusu kadar kesin ve neşterle kıyma. Yaklaşık 5 dk (2-3 mm adet) kıyma. Beyin dokusu Potter-Elvehjem doku değirmeni aktarın. Yalıtım arabellek 30 mL ekleyin.
Not: Kıyılmış doku parçaları lapa kıyma sürecinde beyin dokusu dönüşüyor beri görmek zordur.
3. homojenizasyon
- Potter-Elvehjem doku değirmeni (izni: 150-230 µm): her örnek, 50 rpm homogenizer hızında 100 darbeleri ile homojenize. Zaman her 25 konturlar ve 100 vuruş için gereken toplam süreyi belge. Tablo 1 için önerilen homojenizasyon Protokolü Bkz:; insan frontal korteks 10 g homojenizasyon için toplam 22 dk zamanı. Hava kabarcıkları önlemek için heyecan değil.
- Dounce homogenizer (izni: 80-130 µm): homogenate Dounce homogenizer buzda Transfer. 20 vuruş (~ 6 s/kontur, ~ 2 dk toplam) ile süspansiyon lunaparkçı. Bubbles kaçınmak.
4. Santrifüjü
- Beyin homogenate dört 50 mL aralıklarla tüpler ve belge homogenate hacmi eşit olarak dağıtın. Yoğunluk gradient arabelleği 50 mL aralıklarla tüpler (12,5 mL tüp başına) içine dağıtmak. Yalıtım arabellek 10 mL Havan tokmağı ve homogenizer durulama ve dört Santrifüjü tüpler (~2.5 mL tüp başına) içine dağıtmak için kullanın.
- Santrifüj tüpleri kapakları sıkıca kapatın. Homogenate, yoğunluk gradient orta ve arabellek şiddetle tüpler sallayarak karıştırın. Vasıl 5,800 x g 4 ° c (sabit açılı rotor); 15 dakika santrifüj kapasitesi Tüp bağlı Pelet tutmak için bir orta yavaşlama hızı seçin. Süpernatant atın ve her Pelet 2 mL % 1 BSA resuspend.
5. filtrasyon
Not: kırmızı kan hücreleri ve diğer hücre artıkları kılcal ayırt etmek birkaç filtrasyon adımlar gereklidir.
- 300 µm kafes: Pelet yeniden askıya sonra süspansiyon 300 µm kafes aracılığıyla filtre. Daha büyük gemiler ve daha büyük beyin enkaz mesh kalır, ancak kılcal ağ, filtre uygulanır. Dikkatle mesh ilâ 50 mL % 1 BSA ile yıkayın. Mesh atmak.
Not: Bu filtrasyon adım kapiller süspansiyon herhangi bir büyük damarları ya da beyin enkaz parçalarını temizler. -
30 µM hücre zorlanma filtre
Not: Bu filtrasyon adım kılcal kırmızı kan hücreleri ve diğer beyin enkaz ayırır.- Adım 6.1 beş 30 µm hücre zorlanma süzgeçleri (kapiller filtrate hücre zorlanma filtre başına yaklaşık 10 mL) üzerindeki kapiller filtrate dağıtın. Oysa kırmızı kan hücreleri, diğer tek hücreleri ve küçük beyin enkaz filtreden geçmek ve filtrate içinde toplanan kılcal geri Bu filtre tarafından tutulur.
- Her filtre 25 mL % 1 BSA ile yıkayın. Daha sonra tüm filtrates verimi artırmak için altıncı filtre dökün. Her filtre 50 mL % 1 BSA ile yıkayın; zorlanma filtreleri ile kılcal içeren hücreyi tutmak ve filtrate atın.
6. kılcal koleksiyonu
- Filtreler ters çevirin ve 50 mL tüpler içine kılcal 50 mL her filtre için % 1 BSA ile yıkayın. Yavaşça pipettor 5 mL damlalıklı ucu ile basınç uygulayın ve beyin kılcal yıkamak için filtre arasında taşıyın.
- Özellikle filtre RIM tüm beyin kılcal kapalı yıkayın emin olun. Kabarcıklar kaçının beri bu filtrasyon işlemi daha zor hale getirir ve kapiller kaybı olasılığı artar.
7. çamaşır
- Kılcal topladıktan sonra 1.500 x g (kova rotor sallanan) 4 ° C'de 3 min için tüm örnekler santrifüj kapasitesi. Süpernatant kaldırmak ve Pelet yalıtım arabellek yaklaşık 3 mL yeniden askıya alma. 15 mL konik tüp içinde bir örnek tüm resuspended çökeltilerini birleştirmek ve yalıtım arabellek ile doldurun. Yine 1500 x g 4 ° C'de 3 dk de santrifüj kapasitesi ve iki kez daha yıkayın.
- Kapiller saflık ile mikroskop (100 X büyütme) ve fotoğraf makinesi (Şekil 1B) belge.
Not: Beyin kapiller insan beyin dokusunun 10 g den genellikle yaklaşık 100 mg verimidir. İzole beyin kılcal şimdi işlenen deneyler için kullanılabilir (Örn., lysate, membran izolasyon), veya flash donmuş ve-80 ° c en az 6-12 ay (birden çok donma-çözülme döngüsü önlemek) için cryotubes içinde saklı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İnsan beyin dokusundan izolasyonların insan beyin kılcal (Şekil 1B) zenginleştirilmiş bir süspansiyon daha büyük gemiler, kırmızı kan hücreleri, diğer tek hücreleri ve bazı hücre artıkları küçük miktarlarda verim. Bazı kılcal dallı ve bazı, kırmızı kan hücreleri kılcal lümen entrapped. Tipik kılcal bir 3-7 µm çapı ve yaklaşık 100-200 µm uzun ile açık lümen; çoğu kapiller biter daraltılır. Confocal mikroskobu kullanılarak, izole insan beyin kılcal borulu, sağlam yapısı ve morfoloji ortaya koyuyor. Şekil 2A bir temsilcisi insan beyninin kapiller ekli bir pericyte ve alyuvar lümen içinde ışık görüntü aktarılan gösterir. Uygun olarak izole beyin kılcal12,17,18yapısını önceki raporlarda çap, boyut ve morfolojisi ile ilgili bulgular vardır. İzole insan beyni Şekil 2B kapiller C219 birincil antikor (1 µg/mL); kullanma immunostained P-gp (yeşil) olduğunu çekirdeklerin DAPI ile counterstained (1 µg/mL).
Şekil 1: akış kapiller yalıtım için. (A) piktogram prosedürünün beyin kılcal taze insan dokusundan izole etmek için başlıca adımları göstermektedir. (B) resmi doğrudan yalıtım (100 X büyütme) sonra izole insan beyin kılcal hafif bir mikroskop altında gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: izole insan beyin kapiller. (A) A ışık aktarılan görüntü izole bir insan beyninin kılcal. (B) confocal mikroskop görüntü izole insan beyin kapiller immunostained P-gp için (yeşil; gösterir C219 1 µg/mL); çekirdeklerin DAPI (mavi; 1 µg/mL) ile counterstained. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: yoğunluk Santrifüjü sorun giderme. Piktogram yoğunluk gradient Santrifüjü sonra hazırlık gösterir. Bu çok fazla ve çok az yoğunluk gradient orta ve bu ayrılık ve ortaya çıkan kılcal Pelet etkilemesi etkilerini vurgular. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: P-gp protein ifade izole insan beyin kılcal. Western blot güçlü grupların P-gp için gösterir (1 µg/mL) hCMEC\D3 hücrelere kıyasla izole insan kılcal damarlar içinde. Β-aktin yükleme denetimi (1 µg/µL) olarak kullanılmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: uygulamaları yalıtılmış insan beyin kılcal damarlar için. En yaygın uygulamaları yalıtılmış beyin kılcal damarlar için genel bir bakış literatürde yayınlandı. İzole kılcal damarlar için kullanılmıştır: 1) genomik85,86, 2) proteomik3,38,87,88,89,90, 91,92,94,95,96, 3) fonksiyonel proteomik2,38ve 4) Cellomics82, 83,84,97,98,99. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Vuruş | Zaman [dakika] |
| 1 – 25 | 7-7.5 |
| 26-50 | 5-5,5 |
| 51-75 | 5-5,5 |
| 76-100 | 5-5,5 |
| Toplam süre: | 22 – 24 dk |
Tablo 1: homojenizasyon protokolü. Potter-Elvehjem doku değirmeni insan frontal korteks, 50 rpm homojenizasyon hızında 10 g homojenize homojenizasyon protokol. Not ilk birkaç vuruş kıyılmış doku homojenize için ek saat gerektirir. Bu ilk homojenizasyon sonra her konturun 12 yaşında s süresi (6 s aşağı doğru hareket, 6 için yukarı doğru hareket için s). Böylece, ilk homojenizasyon sonra 5 vuruş 1 dk veya 25 vuruş 5 min içinde gerçekleştirilebilir.
| Sorun | Olası neden | Çözüm |
| Kılcal damar yok Pelet | 1) yanlış Ficoll konsantrasyonu | 1) ayarlamak Ficoll konsantrasyonu |
| 2) yanlış Santrifüjü hız | 2) Santrifüjü hızını ayarlama | |
| 3) yanlış ivme ve/veya yavaşlama hızı | 3) ivme ve/veya yavaşlama hızı ayarlayın | |
| Düşük kapiller verim | 1) meninkslerde filtrasyon adımları engelleme | 1) filtrasyon önce tüm meninkslerde kaldırmak |
| 2) çok fazla kılcal yalıtım işlem sırasında kaybetti | 2) arabellek konsantrasyon doğru hesaplama, pipet ipuçları durulama | |
| 3) yıkama kılcal PluriStrainer filtreler kapalı yetersiz | 3) filtreler ters çevirin ve dikkatle incelemek için kılcal damarlar (kullanma mikroskop) | |
| 4) resuspensions sırasında aşırı kabarcıklar | 4) yavaş yavaş kabarcıklar önlemek için pipet | |
| Uygun olmayan kılcal | 1) genişletilmiş öldükten sonra aralığı | 1) mümkünse aralığı azaltmak veya ek donmuş beyin kullanın |
| Yalıtım için doku dondurulmuş 2) kullanma | 2) kullanım taze doku | |
| 3) yalıtım yordam çok uzun zaman | 3) iş akışı en iyi duruma getirme | |
| 4) ekipman/arabellekleri buza yalıtım işlem sırasında tutuldu değil | 4) sırasında yalıtım ekipman ve arabellekleri buz üstünde tutmak |
Tablo 2: ortak sorunların giderilmesi. En yaygın hataları ve yalıtım yordam ve onlar nasıl çözülebilir sırasında oluşan sorunları listesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut protokolünü sağlam ve kalıcı insan beyin kapiller taze dokusundan yalıtım açıklar. Bu bölümde, biz aşağıda ayrıntılı olarak ele: 1) değişiklikleri protokolü, 2) yaygın hataları giderme, 3) Teknik sınırlamaları, 4) modeli ile ilgili mevcut ve alternatif kan - beyin bariyerini modelleri, önemi ve 5). izole insan beyin kılcal damarlar için potansiyel uygulamalar.
Burada açıklanan protokol 10 g taze insan frontal korteks doku için optimize edilmiştir. Ancak, bu yordam için değiştirmek oldukça basittir: 1) aşağı yukarı 10 g doku, 2) donmuş beyin dokusu veya 3) beyin dokusundan frontal korteks dışında bir beyin bölgesi daha. İlk olarak, ile daha fazla veya az 10 g beyin dokusunun arabellekleri gerekli hacmi sadece yukarı veya aşağı doku kullanılabilir miktarı ölçeklendirilebilir. Sadece beyin dokusunun 5 g varsa, böylece, arabellekleri hacmi yarı yarıya azaltılacak. İkincisi, biz taze beyin dokusu kullanılan bir kılcal yalıtım açıklar, ancak donmuş doku taze doku kullanılamaz38ise kullanılabilir. Üçüncü olarak, frontal korteks alınan taze beyin dokusu kullanılmış, ama eğer yeterli kullanılabilir doku kılcal diğer kortikal beyin bölgelerden izole olabilir. Kılcal kortikal beyin bölgelerden izole etmek mümkündür (Örn., beyaz madde), ama bu bölgeler bir farklı hücre kompozisyon ve kapiller yoğunluk 66,67,68. Böylece, farklı beyin bölgesinden doku kullanarak büyük olasılıkla olmak Protokolü gerektirecektir ayarlanır (Örneğin, arabellek birim, degrade Orta yoğunluk, Santrifüjü hız, ve/veya filtrasyon adımları sayısı).
Kapiller yalıtım yordam değil karmaşık iken başına, küçük tedirginlikler veya protokolünde değişiklik duyarlıdır. Değişiklikleri bir azalmış kapiller verim veya azaltılmış kapiller canlılığı neden olabilir. Tablo 2 en yaygın hata ve yalıtım sırasında karşılaşılan sorunlar açıklanır ve bu hataları ve çözümleri durumunda sorun giderme için kaçınmak için ipuçları listeler. Yordamı ile ilişkili en yaygın sorun düşük kapiller verimidir. Kılcal kaybı genellikle küçük kayıp her adımda kümülatif toplamı ve küçük sapmalar nedeniyle bir yöntemdir. Önemli bir adım olan yoğunluğu Santrifüjü kılcal büyük miktarda kaybolabilir. Kılcal kapiller Pelet hacmi azaltır hücresel enkazı ayırmak için yanlış bir yoğunluk arabelleği hatalı bir konsantrasyon sonuçlanır. Şekil 3 Santrifüjü adım beyin homogenate göre çok az ya da çok fazla yoğunluk gradient orta sonuçlarını gösterir. Doğru için konsantrasyon ayarlama bu sorunu çözebilir. Santrifüj hızlanma ve yavaşlama hızı da beyin kapiller Pelet oluşumu etkileyebilir unutmayın. Pipet ipuçları kapiller malzemenin bir parçası sopa kılcal damarlar da adımları sırasında 6-7 kayıp olur. Bu sorunu iyice değiştirmeden önce her damlalıklı ucu durulama tarafından ele alınması. 7. adımı, kılcal hücre zorlanma filtresinin dışında kapalı yıkama tamamlanmamış olabilir ve/veya kılcal filtre azına kadar yapışabilir. Bu filtre tarafından ek yıkama adımları takip mikroskop altında kontrol ederek önlenebilir. Kılcal yalıtım yordamı her adımında kaybetme ihmal edilebilir bir kılcal Pelet veya kapiller yeterli malzeme daha fazla işleme ve deneme için neden olabilir.
Beyin kılcal taze insan dokusundan izole vivo içinde durum çok benzeyen bir benzersiz kan - beyin bariyerini modeli temsil eder. Ancak, tekniğin bazı sınırlamaları vardır. Taze insan dokusu kullanılabilirliğini bir mücadeledir. En iyi PMI ≤4 h olduğundan, beyin dokusu önemli ölçüde uzun bir PMI toplanan aşağı akım bazı uygulamalar için taze olmayacaktır. Bazı durumlarda, böylece aşağı akım uygulamaları sınırlama birden çok deneysel grupları için yeterince büyük olan doku tutarlar elde etmek zor olabilir. Böylece, taze kılcal kemirgen19, köpek69, sığır42veya domuz70 beyin dokusundan izole kan - beyin bariyerini modellemek daha uygun olabilir. İnsan beyin dokusu gibi yaş, cinsiyet, etnik köken, hastalık durumu, ilaç Geçmiş değişkenlik belirleyen faktörlerden, beyin bölgesi örnek ve PMI yorumlama ve veri yayımlama dikkate alınmalıdır. Bir deneysel düzeyde izole kılcal perisitlerden içermeye devam edecektir, ama astrositik endfeet yordam44tarafından kaldırılır unutmamak gerekir. Burada sunulan modeli kan - beyin bariyerini (yani, kapiller endotel hücreleri) bir ex vivo model olarak ancak nörovasküler biriminin bir model olarak hizmet veren dikkate alınması gerekir.
Herhangi bir insan dokusu ile çalışma, her zaman bir doğal güvenlik riski sunar ve araştırmacılar bulaşmasını önlemek için yalıtım işlem sırasında uygun önlemleri almanız gerekir. Özellikle, ABD, BSL 2 sertifikalı ve Biyogüvenlik kabini (sınıf A2) içeren belirtilen laboratuvar alanı insan dokusu ile çalışma gerektirir. Ayrıca, personel kişisel koruyucu ekipman kullanmanız gerekir (i.e., önlük, eldiven ve yüz kalkan) ve iş ile insan dokusu ve alet biyolojik atık işleme donatımı belirlenmiş. Bu güvenlik önlemlerini uygulamak zaman alan, maliyet-yoğun ve özellikle de deneyimsiz laboratuar personeli için yordamı, zorluk artırır.
Kan - beyin bariyerini son derece iyi tanımlanmış bir CNS71ile organizmalar arasında korunmuş. Çünkü karmaşık nörovasküler nörovasküler birim hücreler arasında kaplin insan kan - beyin bariyerini modelleme zordur. Yetişkin bir insan beyni ortalama yaklaşık 86 milyar nöronlarda olduğu tahmin ve hemen hemen her nöron kendi kılcal oksijen ve besin72,73ile uygun kaynağı sağlamak için çevresinde var düşünülmektedir. Kapiller endotel hücreleri kan-beyin arabiriminin (12-18 m2 için sağlıklı bir yetişkin insan) en büyük yüzey alanı oluşturmaktadır. Sıkı kavşak solutes paracellular difüzyon engelleyerek pharmacotherapeutics geniş bir dizi için engel temsil eder. Ayrıca, çok sayıda çalışma bariyer disfonksiyonu nörodejeneratif hastalıklarda, e.gaçıklamaktadır., Alzheimer hastalığı74, kontur75, epilepsi38,76, multipl skleroz77, ve travmatik beyin hasarı28,78. Böylece, yakından insan kan - beyin bariyerini simgeleyen ve daha iyi sağlık ve hastalığında bariyer fonksiyonu anlamak için izin modeller kurmak için zorunludur.
Çok sayıda vitro hücre kültür modellerinin kan - beyin bariyerini yok; konuyla ilgili uzman değerlendirmeler için bkz: 41,49,51,69,79,80. Kısaca, her ikisi de taze beyin kapiller endotel hücreleri birincil kültür için izole ve ölümsüzleştirdi beyin kapiller endotel hücre hatları kullanılabilir. Birincil beyin microvessel endotel hücre kültürleri, fare, fare, domuz ve inek çoğunlukla kullanılır. Ancak, hücre taze izole olması gerektiğinden birincil hücre kültürleri emek yoğun. Ölümsüzleştirdi beyin kapiller endotel hücre hatları fare, sıçan ve insan kullanılabilir ve daha uzun vadeli kullanım için passaged çünkü daha az emek yoğun. Ancak, hatta ölümsüzleştirdi hücre hatları ne sıklıkla onlar endotel özellikleri kaybetmeden evvel passaged bir sınırı var. Hem primer hücre hem de ölümsüzleştirdi hücre hatları genellikle beyin kapiller endotel modellemek ve böylece kan beyin taşıma41 taklit eden hücre monolayer arasında bariyer geçirgenliği ve uyuşturucu taşıma ölçmek için plakaları kültürlü ,81,82. Bu modeller kültür medyada da değiştirilebilir veya astrocytes, perisitlerden veya kamp41,83,84gibi fizyolojik ilgili diğer faktörler ile desteklenmiştir.
Ölümsüzleştirdi hücre hatları onların nispeten kolay erişim ve kullanılabilirlik avantajdır. Kültürlü endotel hücreleri izdiham ulaşabilirsiniz iken, yan yana büyüdükçe endotel hücre özelliklerini kaybederler bir monolayer içinde. Örneğin, kültürlü hCMECs taşıyıcılar P-gp, sıkı kavşak proteinler ve görüntü değişken geçirgenliği gibi azaltılmış ifade xenobiotics41olarak görüntüler. Şekil 4 P-gp protein ifade için bir Western blot taze izole insan kılcal damarlar için karşılaştırıldığında hCMEC/D3 hücreleri gösterir. Bir 10 kat daha düşük toplam protein miktarı rağmen P-gp sinyali izole insan kılcal hCMEC/D3 hücrelere göre güçlüdür. Bu hCMEC/D3 hücreleri P-gp protein ifade kültüründe önemli miktarda kaybetti gösterir. Ayrıca, Kültür medya, çevre ve ekipman farklılıkları anahtar ölçü bariyer bütünlüğünü, yani, Transwell plaka deneyleri ölçümlerde aylarının etkiler. Bu konulardan bazıları daha yakından insan kan - beyin bariyerini vivo içindegösteren izole beyin kapiller modeli kullanarak üstesinden gelebilir.
İzole beyin kılcal çalışmaları, genomik, proteomik, fonksiyonel proteomik ve cellomics çalışmaları (Şekil 5) de dahil olmak üzere geniş bir yelpazede için kullanılmıştır. Buna ek olarak, birçok teknikleri ve yöntemleri izole beyin kılcal bu alanların her biri içinde çözümlenecek adlı biri yok. Özellikle, Şekil 5 ' te gösterilen deneysel teknikleri bir dizi kaynaktan translasyonel araştırma kolaylaştırabilir, kemirgen, sığır ve domuz insan doku dahil olmak üzere, izole beyin kılcal damarlar üzerinde kullanılabilir. Örneğin, Li vd. 85 sıçan beyin kılcal izole mRNA arındırıcı tarafından bastırma Eksiltici hibridizasyon kullanarak kan - beyin bariyerini genomik okudu. Ayrıca, Ott vd. 86 RT-PCR ve qRT-PCR P-gp PXR tarafından düzenlenmesi çalışırdım. Birçok proteomik çalışma Western blot3, Dot Blot Analizi87, basit Western deneyleri3,38, ELISA88,89, immunoprecipitation3, kullanmak ve immunostaining3,90,91. Beyin endotel, McCaffrey vd kaçakçılığı ışınlama ayırt etmek 92 izole beyin kapiller hücre altı ayırma kullanılır. Sánchez del Pino ve ark. 93izole sığır endotel membran veziküller ışınlama konumu ve ulaşım yön kan - beyin bariyerini arasında ayırt eskiden. Diğer proteomik çalışmalarda araştırmacılar sıvı kromatografi ve tandem kütle spektrometresi taşıyıcı proteinler94,95,96ölçmek için kullanılır. Fonksiyonel proteomik çalışmalar ışınlama kullanılmaktadır ve2,38kaçak deneyi. Hartz vd. 2 zymography izole beyin kılcal enzim etkinliğini belirlemek için kullanılır. Buna ek olarak, büyük cellomic araştırma hücre kültürü kullanarak çok sayıda endotel hücre satırları ve kan - beyin bariyerini82,83,84modelleri üretti. Bu modellerde kullanılan ortak deneyleri geçiş deneyleri97,98, canlılık ve toksisite deneyleri99ve anjiogenezi deneyleri98içerir.
İzole beyin kapiller protein ifade ve aktivite doğru karakterizasyonu ve yollar, kan - beyin bariyerini sinyal bir açıklama sağlar. Bu, kısmen, hangi sadece yaklaşık % 1 (v/v) beynin kılcal içerik kaynaklanmaktadır. Böylece, saflaştırılmış kapiller endotel hücreleri için bir yedek olarak tüm beyin homogenate ya da beyin dilimleri kullanarak büyük olasılıkla bir zavallı sinyal-gürültü oranı24saat içinde neden olur. Ayrıca, yalıtım sonra beyin kılcal en az 6 çalışmaları belirli sinyal yolları ayırt sağlayan h için fare ve sıçan (yayınlanmamış veri), uygulanabilir. Bu aynı hazırlık kontrol grubundan eklemeniz önerilir.
Bu raporda, tartışılan izole kapiller modeli gibi kan - beyin bariyerini temsilcisi ve çevirim modellerinin bariyer fonksiyonu sağlık ve hastalığında çalışmaya ihtiyaç vardır. Burada izole insan beyin kılcal bir iyi verim ve kan - beyin bariyerini bir ex vivo model olarak hizmet verebilir yüksek kalite elde etmek için bir iletişim kuralı mevcut. İzole kılcal onların özgün yapısı ve işlevi, onları sonrası yalıtım moleküler, biyokimyasal bir dizi için kullanarak sağlayan ve fizyolojik deneyleri korur. Ne zaman insan dokusu işleme, tercihen bir BSL 2 veya daha yüksek ayar örnekleri özen gösterilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Biz teşekkür ederiz ve Dr Peter Nelson ve Sonya Anderson tüm insan beyin doku örnekleri sağlamak için UK-ADC beyin doku Bankası kabul (NIH izni numarası: P30 AG028383 yaşlanma Ulusal Enstitüsü). Matt Hazzard ve Tom Dolan, bilgi teknoloji hizmetleri, akademik teknoloji ve fakülte nişan, Kentucky Üniversitesi grafik yardım için teşekkür ederiz. Bu proje (BB için) hibe numara 1R01NS079507 sinir hastalıkları Ulusal Enstitüsü ve kontur ve grant numara 1R01AG039621 yaşlanma Ulusal Enstitüsünden (için A.M.S.H.) tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka sinir hastalıkları Ulusal Enstitüsü ve kontur veya Ulusal Enstitüsü resmi görüşlerini yaşlanma temsil etmiyor. Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Personal Protective Equipment (PPE) | |||
| Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium | VWR, Radnor, PA, USA | 32916-636 | PPE |
| Disposable Protective Labcoats | VWR, Radnor, PA, USA | 470146-214 | PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended |
| Face Shield, disposable | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 19460102 | PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended |
| Safety Materials | |||
| Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8 x 12 | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 01-815-6 | |
| Versi Dry Bench Paper 18" x 20" | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 14-206-32 | to cover working areas |
| VWR Sharps Container Systems | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 75800-272 | for used scalpels |
| Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz. | UK Supply Center, Lexington, KY, USA | 323775 | |
| Equipment | |||
| 4 °C Refrigerator | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 13-986-148 | |
| Accume BASIC AB15 pH Meter | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | AB15 | |
| Heidolph RZR 2102 Control | Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA | 501-21024-01-3 | |
| Sorvall LEGEND XTR Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 75004521 | |
| Leica L2 Dissecting Microscope | Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA | used to remove meninges | |
| POLYTRON PT2500 Homogenizer | Kinematica AG, Luzern, Switzerland | 9158168 | |
| Scale P-403 | Denver Instrument, Bohemia, NY, USA | 0191392 | |
| Standard mini Stir | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 1151050 | |
| Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar | Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA | 11-670-4C | used to freeze the tissue? |
| Voyager Pro Analytical Balance | OHAUS, Parsippany, NJ, USA | VP214CN | |
| ZEISS Axiovert Microcope | Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA | used to check isolated capillaries | |
| Tools and Glassware | |||
| Finnpipette II Pipette 1-5 mL | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 21377823T1 | wash capillaries off filter |
| Finnpipette II Pipette 100-1,000 µL | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 21377821T1 | resuspend pellet in BSA |
| Pipet Boy | Integra, Hudson, NH, USA | 739658 | |
| 50 mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs | VWR, Radnor, PA, USA | 21008-951 | |
| EISCO Scalpel Blades | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | S95938C | to mince brain tissue |
| PARAFILM | VWR, Radnor, PA, USA | 52858-000 | to cover beaker and volumetric flask |
| Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mL | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 21-377-304 | to wash capillaries off filter |
| 60 mL syringe with Luer-Lok | Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | BD309653 | used with connector ring to filter capillaries |
| Scalpel Handle #4 | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 10060-13 | used for mincing |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 11251-10 | used to remove meninges |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | 3431E25 | 50 mL volume, clearance: 150-230 μm |
| Dounce Homogenizer | VWR, Radnor PA USA | 62400-642 | 15 mL volume, clearance: 80-130 μm |
| Spectra/Mesh Woven Filters (300 µm) | Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA | 146424 | Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left |
| pluriStrainers (pore size: 30 µm) | pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany | 43-50030-03 | |
| Connector Ring | pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany | 41-50000-03 | reuse multiple time |
| 1 L Volumetric Flask | for preparation of Isolation Buffer | ||
| 1 L Beaker | for preparation of 1% BSA | ||
| Stir Bar | for preparation of 1% BSA and Ficoll® | ||
| Schott Bottle (60 mL) | for preparation of Ficoll® | ||
| Ice Bucket | to keep everything cold | ||
| 100 mm Petri dish | for mincing of brain tissue | ||
| Tissue Culture Cell Scraper | VWR, Radnor, PA, USA | 89260-222 | to remove supernatant after centrifugation |
| Chemicals | |||
| BSA Fraction V, A-9647 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647-500g | prepare in DPBS with Ca2+ & Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use. |
| DPBS with Ca2+ & Mg2+ | Hyclone | SH30264.FS | DPBS - part of the Isolation Buffer |
| Ficoll PM400 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F4375 | Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use. |
| Glucose (D-(+) Dextrose) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G7528 | Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM |
| Sodium Hydroxide Standard Solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 71474 | to adjust pH of the DPBS |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P2256 | Concentration: 1 mM |
References
- Aronica, E., et al. Expression and cellular distribution of multidrug resistance-related proteins in the hippocampus of patients with mesial temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 45 (5), 441-451 (2004).
- Hartz, A. M., et al. Amyloid-β contributes to blood-brain barrier leakage in transgenic human amyloid precursor protein mice and in humans with cerebral amyloid angiopathy. Stroke. 43 (2), 514-523 (2012).
- Hartz, A. M., et al. Aβ40 Reduces P-Glycoprotein at the Blood-Brain Barrier through the Ubiquitin-Proteasome Pathway. J Neurosci. 36 (6), 1930-1941 (2016).
- Kassner, A., Merali, Z. Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke. Stroke. 46 (11), 3310-3315 (2015).
- Lauritzen, F., et al. Monocarboxylate transporter 1 is deficient on microvessels in the human epileptogenic hippocampus. Neurobiol Dis. 41 (2), 577-584 (2011).
- Tishler, D. M., et al. MDR1 gene expression in brain of patients with medically intractable epilepsy. Epilepsia. 36 (1), 1-6 (1995).
- van Assema, D. M., et al. Blood-brain barrier P-glycoprotein function in Alzheimer's disease. Brain. 135 (Pt 1), 181-189 (2012).
- Oberoi, R. K., et al. Strategies to improve delivery of anticancer drugs across the blood-brain barrier to treat glioblastoma. Neuro Oncol. 18 (1), 27-36 (2016).
- Parrish, K. E., et al. Efflux transporters at the blood-brain barrier limit delivery and efficacy of cyclin-dependent kinase 4/6 inhibitor palbociclib (PD-0332991) in an orthotopic brain tumor model. J Pharmacol Exp Ther. 355 (2), 264-271 (2015).
- Thomas, A. A., Brennan, C. W., DeAngelis, L. M., Omuro, A. M. Emerging therapies for glioblastoma. JAMA Neurol. 71 (11), 1437-1444 (2014).
- Siakotos, A. N., Rouser, G., Fleische, S. Isolation Of Highly Purified Human And Bovine Brain Endothelial Cells And Nuclei And Their Phospholipid Composition. Lipids. 4 (3), 234-239 (1969).
- Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. ISOLATION OF METABOLICALLY ACTIVE CAPILLARIES FROM RAT-BRAIN. Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).
- Joo, F., Karnushina, I. A procedure for the isolation of capillaries from rat brain. Cytobios. 8 (29), 41-48 (1973).
- Joo, F., Rakonczay, Z., Wollemann, M. Camp-Mediated Regulation Of Permeability In Brain Capillaries. Experientia. 31 (5), 582-584 (1975).
- Panula, P., Joo, F., Rechardt, L. EVIDENCE FOR PRESENCE OF VIABLE ENDOTHELIAL CELLS IN CULTURES DERIVED FROM DISSOCIATED RAT-BRAIN. Experientia. 34 (1), 95-97 (1978).
- Pardridge, W. M., Eisenberg, J., Yamada, T. Rapid Sequestration And Degradation Of Somatostatin Analogs By Isolated Brain Microvessels. Journal of Neurochemistry. 44 (4), 1178-1184 (1985).
- Dallaire, L., Tremblay, L., Beliveau, R. Purification And Characterization Of Metabolically Active Capillaries Of The Blood-Brain-Barrier. Biochemical Journal. 276, 745-752 (1991).
- Miller, D. S., et al. Xenobiotic transport across isolated brain microvessels studied by confocal microscopy. Molecular Pharmacology. 58 (6), 1357-1367 (2000).
- Bauer, B., Hartz, A. M., Fricker, G., Miller, D. S. Pregnane X receptor up-regulation of P-glycoprotein expression and transport function at the blood-brain barrier. Mol Pharmacol. 66 (3), 413-419 (2004).
- Bauer, B., Hartz, A. M., Miller, D. S. Tumor necrosis factor alpha and endothelin-1 increase P-glycoprotein expression and transport activity at the blood-brain barrier. Mol Pharmacol. 71 (3), 667-675 (2007).
- Hartz, A. M., Bauer, B., Fricker, G., Miller, D. S. Rapid regulation of P-glycoprotein at the blood-brain barrier by endothelin-1. Mol Pharmacol. 66 (3), 387-394 (2004).
- Hartz, A. M., Madole, E. K., Miller, D. S., Bauer, B. Estrogen receptor beta signaling through phosphatase and tensin homolog/phosphoinositide 3-kinase/Akt/glycogen synthase kinase 3 down-regulates blood-brain barrier breast cancer resistance protein. J Pharmacol Exp Ther. 334 (2), 467-476 (2010).
- Hartz, A. M., Mahringer, A., Miller, D. S., Bauer, B. 17-β-Estradiol: a powerful modulator of blood-brain barrier BCRP activity. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (10), 1742-1755 (2010).
- Bauer, B., et al. Coordinated nuclear receptor regulation of the efflux transporter, Mrp2, and the phase-II metabolizing enzyme, GSTpi, at the blood-brain barrier. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1222-1234 (2008).
- Bauer, B., et al. In vivo activation of human pregnane X receptor tightens the blood-brain barrier to methadone through P-glycoprotein up-regulation. Mol Pharmacol. 70 (4), 1212-1219 (2006).
- Hartz, A. M., Miller, D. S., Bauer, B. Restoring blood-brain barrier P-glycoprotein reduces brain amyloid-beta in a mouse model of Alzheimer's disease. Mol Pharmacol. 77 (5), 715-723 (2010).
- Erickson, M. A., Banks, W. A. Blood-brain barrier dysfunction as a cause and consequence of Alzheimer's disease. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (10), 1500-1513 (2013).
- Marchi, N., et al. Consequences of repeated blood-brain barrier disruption in football players. PLoS One. 8 (3), e56805 (2013).
- Rempe, R. G., Hartz, A. M., Bauer, B. Matrix metalloproteinases in the brain and blood-brain barrier: Versatile breakers and makers. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (9), 1481-1507 (2016).
- van Vliet, E. A., et al. Blood-brain barrier leakage may lead to progression of temporal lobe epilepsy. Brain. 130, 521-534 (2007).
- Banks, W. A., et al. Tau Proteins Cross the Blood-Brain Barrier. J Alzheimers Dis. 55 (1), 411-419 (2017).
- Chan, G. N., et al. et al. In vivo induction of P-glycoprotein expression at the mouse blood-brain barrier: an intracerebral microdialysis study. J Neurochem. 127 (3), 342-352 (2013).
- Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
- Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
- Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
- Sugiyama, D., et al. Functional characterization of rat brain-specific organic anion transporter (Oatp14) at the blood-brain barrier: high affinity transporter for thyroxine. J Biol Chem. 278 (44), 43489-43495 (2003).
- Wang, X., et al. Nrf2 upregulates ATP binding cassette transporter expression and activity at the blood-brain and blood-spinal cord barriers. J Neurosci. 34 (25), 8585-8593 (2014).
- Hartz, A. M., et al. P-gp Protein Expression and Transport Activity in Rodent Seizure Models and Human Epilepsy. Mol Pharm. 14 (4), 999-1011 (2017).
- Pardridge, W. M., Eisenberg, J., Yamada, T. Rapid sequestration and degradation of somatostatin analogues by isolated brain microvessels. J Neurochem. 44 (4), 1178-1184 (1985).
- Goldstein, G. W., Betz, A. L., Bowman, P. D. Use of isolated brain capillaries and cultured endothelial cells to study the blood-brain barrier. Fed Proc. 43 (2), 191-195 (1984).
- Pardridge, W. M., Triguero, D., Yang, J., Cancilla, P. A. Comparison of in vitro and in vivo models of drug transcytosis through the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 253 (2), 884-891 (1990).
- Audus, K. L., Bartel, R. L., Hidalgo, I. J., Borchardt, R. T. The use of cultured epithelial and endothelial cells for drug transport and metabolism studies. Pharm Res. 7 (5), 435-451 (1990).
- Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. J Cell Sci. 103 (Pt 1), 23-37 (1992).
- Miller, D. S., et al. Xenobiotic transport across isolated brain microvessels studied by confocal microscopy. Mol Pharmacol. 58 (6), 1357-1367 (2000).
- Dolgikh, E., et al. QSAR Model of Unbound Brain-to-Plasma Partition Coefficient, Kp,uu,brain: Incorporating P-glycoprotein Efflux as a Variable. J Chem Inf Model. 56 (11), 2225-2233 (2016).
- Narayanan, R., Gunturi, S. B. In silico ADME modelling: prediction models for blood-brain barrier permeation using a systematic variable selection method. Bioorg Med Chem. 13 (8), 3017-3028 (2005).
- Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Res. 192 (1), 17-28 (1980).
- Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neurosci. 12, 40 (2011).
- He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. Cell-culture models of the blood-brain barrier. Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).
- Urich, E., Lazic, S. E., Molnos, J., Wells, I., Freskgård, P. O. Transcriptional profiling of human brain endothelial cells reveals key properties crucial for predictive in vitro blood-brain barrier models. PLoS One. 7 (5), e38149 (2012).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).
- Stebbins, M. J., et al. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
- Brown, J. A., et al. Recreating blood-brain barrier physiology and structure on chip: A novel neurovascular microfluidic bioreactor. Biomicrofluidics. 9 (5), 054124 (2015).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Cucullo, L., Hossain, M., Tierney, W., Janigro, D. A new dynamic in vitro modular capillaries-venules modular system: cerebrovascular physiology in a box. BMC Neurosci. 14, 18 (2013).
- Neuhaus, W., et al. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. J Biotechnol. 125 (1), 127-141 (2006).
- Stanness, K. A., et al. A new model of the blood--brain barrier: co-culture of neuronal, endothelial and glial cells under dynamic conditions. Neuroreport. 10 (18), 3725-3731 (1999).
- Ghosh, C., et al. Pattern of P450 expression at the human blood-brain barrier: roles of epileptic condition and laminar flow. Epilepsia. 51 (8), 1408-1417 (2010).
- Jeynes, B., Provias, J. An investigation into the role of P-glycoprotein in Alzheimer's disease lesion pathogenesis. Neurosci Lett. 487 (3), 389-393 (2011).
- Wijesuriya, H. C., Bullock, J. Y., Faull, R. L., Hladky, S. B., Barrand, M. A. ABC efflux transporters in brain vasculature of Alzheimer's subjects. Brain Res. 1358, 228-238 (2010).
- Pekcec, A., et al. Targeting prostaglandin E2 EP1 receptors prevents seizure-associated P-glycoprotein up-regulation. J Pharmacol Exp Ther. 330 (3), 939-947 (2009).
- Zibell, G., et al. Prevention of seizure-induced up-regulation of endothelial P-glycoprotein by COX-2 inhibition. Neuropharmacology. 56 (5), 849-855 (2009).
- Nelson, P. T., et al. Clinicopathologic correlations in a large Alzheimer disease center autopsy cohort: neuritic plaques and neurofibrillary tangles "do count" when staging disease severity. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (12), 1136-1146 (2007).
- Vaught, J., et al. The ISBER Best Practices: Insight from the Editors of the Third Edition. Biopreserv Biobank. 10 (2), 76-78 (2012).
- Gjedde, A., Kuwabara, H., Hakim, A. M. Reduction of functional capillary density in human brain after stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 10 (3), 317-326 (1990).
- Karbowski, J. Scaling of brain metabolism and blood flow in relation to capillary and neural scaling. PLoS One. 6 (10), e26709 (2011).
- Lokkegaard, A., Nyengaard, J. R., West, M. J. Stereological estimates of number and length of capillaries in subdivisions of the human hippocampal region. Hippocampus. 11 (6), 726-740 (2001).
- Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).
- Tontsch, U., Bauer, H. C. ISOLATION, CHARACTERIZATION, AND LONG-TERM CULTIVATION OF PORCINE AND MURINE CEREBRAL CAPILLARY ENDOTHELIAL-CELLS. Microvascular Research. 37 (2), 148-161 (1989).
- Abbott, N. J. Dynamics of CNS barriers: Evolution, differentiation, and modulation. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 5-23 (2005).
- Herculano-Houzel, S., Kaas, J. H., de Oliveira-Souza, R. Corticalization of motor control in humans is a consequence of brain scaling in primate evolution. J Comp Neurol. 524 (3), 448-455 (2016).
- Pardridge, W. M. Molecular biology of the blood-brain barrier. Mol Biotechnol. 30 (1), 57-70 (2005).
- Cirrito, J. R., et al. P-glycoprotein deficiency at the blood-brain barrier increases amyloid-beta deposition in an Alzheimer disease mouse model. J Clin Invest. 115 (11), 3285-3290 (2005).
- Rosenberg, G. A., Estrada, E. Y., Dencoff, J. E. Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain. Stroke. 29 (10), 2189-2195 (1998).
- van Vliet, E. A., et al. Blood-brain barrier leakage may lead to progression of temporal lobe epilepsy. Brain. 130 (Pt 2), 521-534 (2007).
- Kermode, A. G., et al. Breakdown Of The Blood-Brain-Barrier Precedes Symptoms And Other Mri Signs Of New Lesions In Multiple-Sclerosis - Pathogenetic And Clinical Implications. Brain. 113, 1477-1489 (1990).
- Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. Blood-brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury. Nat Rev Neurol. 6 (7), 393-403 (2010).
- Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 6 (8), 650-661 (2007).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
- Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
- Rubin, L., et al. A cell culture model of the blood-brain barrier. The Journal of cell biology. 115 (6), 1725-1735 (1991).
- Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. European journal of pharmaceutical sciences. 12 (3), 215-222 (2001).
- Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry international. 54 (3), 253-263 (2009).
- Li, J. Y., Boado, R. J., Pardridge, W. M. Blood-brain barrier genomics. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21 (1), 61-68 (2001).
- Ott, M., Fricker, G., Bauer, B. Pregnane X receptor (PXR) regulates P-glycoprotein at the blood-brain barrier: functional similarities between pig and human PXR. J Pharmacol Exp Ther. 329 (1), 141-149 (2009).
- Méresse, S., Delbart, C., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Low-density lipoprotein receptor on endothelium of brain capillaries. Journal of neurochemistry. 53 (2), 340-345 (1989).
- Hartz, A. M., Bauer, B., Block, M. L., Hong, J. S., Miller, D. S. Diesel exhaust particles induce oxidative stress, proinflammatory signaling, and P-glycoprotein up-regulation at the blood-brain barrier. FASEB J. 22 (8), 2723-2733 (2008).
- Moser, K. V., Reindl, M., Blasig, I., Humpel, C. Brain capillary endothelial cells proliferate in response to NGF, express NGF receptors and secrete NGF after inflammation. Brain research. 1017 (1), 53-60 (2004).
- Carrano, A., et al. ATP-binding cassette transporters P-glycoprotein and breast cancer related protein are reduced in capillary cerebral amyloid angiopathy. Neurobiol Aging. 35 (3), 565-575 (2014).
- Deane, R., et al. RAGE mediates amyloid-beta peptide transport across the blood-brain barrier and accumulation in brain. Nat Med. 9 (7), 907-913 (2003).
- McCaffrey, G., et al. P-glycoprotein trafficking at the blood-brain barrier altered by peripheral inflammatory hyperalgesia. Journal of neurochemistry. 122 (5), 962-975 (2012).
- Sanchez del Pino, M. M., Hawkins, R. A., Peterson, D. R. Biochemical discrimination between luminal and abluminal enzyme and transport activities of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 270 (25), 14907-14912 (1995).
- Agarwal, S., et al. Quantitative proteomics of transporter expression in brain capillary endothelial cells isolated from P-glycoprotein (P-gp), breast cancer resistance protein (Bcrp), and P-gp/Bcrp knockout mice. Drug metabolism and disposition. 40 (6), 1164-1169 (2012).
- Kamiie, J., et al. Quantitative atlas of membrane transporter proteins: development and application of a highly sensitive simultaneous LC/MS/MS method combined with novel in-silico peptide selection criteria. Pharmaceutical research. 25 (6), 1469-1483 (2008).
- Uchida, Y., et al. Quantitative targeted absolute proteomics of human blood-brain barrier transporters and receptors. Journal of neurochemistry. 117 (2), 333-345 (2011).
- Lee, B. -C., Lee, T. -H., Avraham, S., Avraham, H. K. Involvement of the Chemokine Receptor CXCR4 and Its Ligand Stromal Cell-Derived Factor 1α in Breast Cancer Cell Migration Through Human Brain Microvascular Endothelial Cells. Molecular Cancer Research. 2 (6), 327-338 (2004).
- Zagzag, D., et al. Hypoxia-inducible factor 1 and VEGF upregulate CXCR4 in glioblastoma: implications for angiogenesis and glioma cell invasion. Lab Invest. 86 (12), 1221-1232 (2006).
- Preston, J. E., Hipkiss, A. R., Himsworth, D. T. J., Romero, I. A., Abbott, J. N. Toxic effects of beta-amyloid(25-35) on immortalised rat brain endothelial cell: protection by carnosine, homocarnosine and beta-alanine. Neuroscience Letters. 242 (2), 105-108 (1998).
