Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Hipokampal teta salınımlarını fareler davranışlar içinde Optogenetic sürüklenme

Published: June 29, 2018 doi: 10.3791/57349
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1,2
1Systems Neurophysiology Research Group, Institute of Clinical Neuroscience and Medical Psychology, Medical Faculty, Heinrich Heine University Düsseldorf, 2Behavioural Neurodynamics Group, Leibniz Institute for Molecular Pharmacology (FMP)/ NeuroCure Cluster of Excellence, 3Neuronal Circuits and Behavior Research Group, Max Planck Institute for Metabolism Research

Summary

Biz optogenetics ve elektrofizyolojik kayıtlar hipokampal teta salınımları (5-10 Hz) farelerde davranıyor seçici işlemler için nasıl kullanılacağını açıklar. Yerel alan potansiyeli kullanarak ritim sürüklenme etkinliği izlenir. Opto - ve pharmacogenetic inhibisyon hipokampal eşitleme efferent okuma giderir.

Abstract

Kapsamlı veri neural ağ salınımlarını davranış için ilişkiler ve beyin bölgeleri arasında nöronal deşarj organizasyonu için yeni araçları seçerek beyin ritimleri işlemek ara. Burada hücre dışı Elektrofizyoloji hipokampal teta salınımları (5-10 Hz) davranışlar farelerde yüksek sadakat kontrolü için projeksiyon özgü optogenetics birleştiren bir yaklaşımı açıklamak. Optogenetic sürüklenme özgüllüğü channelrhodopsin-2 (ChR2) hedef alarak medial septal hücreleri, en önemlisi hipokampal teta titreşimler, üretimi dahil GABAergic nüfusa elde edilir ve bir yerel etkinleştirme senkronize hipokampüs inhibitör septal afferents bir alt kümesi. Optogenetic ritim denetimin etkinliğinin bir eş zamanlı yerel alanında potansiyel (LFP) lamina CA1 çevrenin ve/veya nöronal deşarj arasında izleme tarafından doğrulanır. Bu kolayca implementable hazırlık kullanarak çeşitli optogenetic stimülasyon protokolleri teta salınımlarını indüksiyon için ve onların frekans ve düzenlilik manipülasyon etkinliğini gösterir. Son olarak, projeksiyon özgü inhibisyon teta ritim denetimle bir arada okuma hipokampal eşitleme efferent bölgeler tarafından belirli yönlerini giderir.

Introduction

Memelilerde nöronal aktivite içinde ve beyin bölgeleri1,2,3,4arasında bilgi aktarımı yardımcı ağ salınımları tarafından koordine edilmektedir. Beyin ritimleri salınımları çok yavaş (< 0.8 Hz) kadar ultrafast (> 200 Hz) Frekanslar arasında değişen içerir. Kanıt büyük gövdeli ağ salınımlarını katılımı biliş5,6,7,8,9,10 da dahil olmak üzere çeşitli beyin fonksiyonları destekler. , yanı sıra Parkinson hastalığı ve epilepsi13,14,15gibi Nöropsikiyatrik bozukluklar doğuştan gelen davranışları11,12 . Ağ salınımlarını deneysel manipülasyon için seçici ve geçici kesin yöntemleri bu nedenle eşitleme fizyolojik açıdan makul modellerinin geliştirilmesi için ve davranış ile nedensel bağlantılar kurmak için gereklidir.

Ağ eşitlemesi farklı biyolojik yüzeylerde ve iyon kanalları moleküler kimliğini ve onların kinetik için uyarılabilirlik ve ağ bağlantısı neuromodulation kadar geniş süreçleri tarafından aracılık ettiği. Biyolojik ritim ortaya16 jeneratörleri birçok beyin ritimleri, hangi (Örneğin, frekans, genlik) farklı yönleri için çoğu kez tasarımını farklı hücre tipleri ve ağlar dinamikleri hakkında getirdi. Örneğin, asıl hücreler somata hedefleme inhibitör interneurons en önemli oyuncular frekans bantlarında ve Teta19,20, gama20 beyin bölgeleri17,dahil18, vardır , 21ve dalgalanma (140-200 Hz)22 titreşimler. Buna karşılık, Aşama eşitlemesi uzak hücre sağlam besleme ileri piramit hücrelerinin interneurons ateş sıfırlayan sinyal tarafından sağlanmaktadır. Titreşimler, eşitlenmiş nöronal nüfus büyüklüğü önemli bir parametre için ölçülen LFP salınım'ın genlik yakından ilgilidir ve en az hızlı salınım için interneurons2eksitatör diske bağlıdır. Buna ek olarak, delta ve Teta ritimleri, gibi daha yavaş salınım kortiko-talamik23,24 ve medial hipokampal septal projeksiyonlar25, oluşturduğu uzun menzilli desteklemeyeceğini döngüler tarafından oluşturulan 26,27, anılan sıraya göre. Salınımlarını böyle devrelerde sinyal yayma gecikmeler, heyecanlı yanıt ve katılımcı hücreleri28,29,30, içinde onların frekans tercih etkileşimler tarafından getirilen 31 , 32. GABAergic parvalbumin (PV) inhibitör projeksiyonlar-pozitif hücreler interneurons hipokampus25,33, parahipokampal bölge ve entorhinal korteks26 için medial septum (MS) Teta salınımlarını medial temporal lob üretimi için gerekli. Böylece, ağ salınımlar ve nöronal eşitleme fizyolojik mekanizmaları optogenetics gerçek zamanlı bir hassasiyetle kullanarak manipüle edilebilir.

Hücre türüne özgü optogenetic manipülasyonlar hipokampal ve kortikal salınımlarını vitro34,35,36,37,38 ve çalışmaları için uygulanan içinde vivofonksiyonel dahil olmak üzere30,39,40,41,42,43,44,45, araştırmalar gama5,12,36,46,47,48,49,50, 51,52 ve dalgalanma salınımlarını40,53,54 ve uyku iğlik55,56. Son zamanlarda Cre-bağımlı ChR2 virüs PV-Cre fareler MS bir anahtar bölge hipokampal teta ritim, nesil için dile getirdi. Bu hazırlık kullanarak, hipokampal teta salınımları (frekans ve zamansal istikrar) özelliklerini hipokampus11MS inhibitör projeksiyonlar uyarılması optogenetic tarafından kontrol. Ayrıca, inhibitör septo-hipokampal projeksiyonlar teta-frekans optogenetic uyarılması sırasında uyanık hareketsizlik teta ritim uyarılmış. Optogenetically spontan teta salınımlarını LFP ve nöronal aktivite düzeyine Mouse teta ritim görüntülenen özelliklerini entrained.

Bu protokolün temel özellikleri şunlardır: (1) hipokampal uyarılabilirlik; belirsiz etkileri kaçınırken spontan teta salınım için fizyolojik açıdan kritik bir inhibitör yolu kullanımı (2) aksonlar, yani, projeksiyon özel uyarı hipokampal MS efferents üzerinde; doğrudan bir etkisi en aza indirmek için (3) teta-ritmik septo-hipokampal dinamikleri ve Teta salınımlarını bir küresel ikili sürüklenme ile en az bir doğrudan müdahale sağlamak yerel teta-ritmik ışık stimülasyon, (4) teta salınım frekansı ve düzenlilik parametrik kontrolü; ve hayvan davranış içinde nicel Nedensellik analizi sağlamak için LFP sürüklenme sadakat yüksek zamansal çözünürlük ile (5) miktar kullanarak. Bu hazırlık aslında teta üretimi25,30septo-hipokampal Disinhibisyonu olan tanınmış bir rolüne büyük yapar bu yana, teta salınımlarını davranıyor farelerde çeşitli parametreleri üzerinde sağlam kontrol sağlar. Diğer daha az incelenen yolları ve hücre tipleri septo-hipokampal devresi neredeydin çalışmalar38,39,47,49,50,51 manipüle , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 ortaya daha fazla teta ritim mekanizmaları.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

PV-Cre çakma erkek fareler59, 10-25 haftalık kullanılmıştır. Fareler hayvan tesiste standart koşullar altında yer alan ve bir 12 h açık/koyu döngüsü devam etti. Tüm yordamlar ulusal ve uluslararası kurallara uygun olarak gerçekleştirilen ve (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen) yerel sağlık otoriteleri tarafından kabul edildi.

1. viral enjeksiyon

  1. Tüm prosedürü sırasında biyolojik güvenlik yönergeleri60izleyin. Laboratuvar önlüğü, ameliyat maskesi, bir saç filesi ve iki çift eldiven giymek.
  2. Tüp bir steril neşter veya makas ile yaklaşık 1 m boy kesme, Pompa enjektör sahibi Blok Ekle ve düzeltebilirim.
    1. Tüp şırınga kullanarak tamamen silikon yağı ile doldurun.
    2. Hava kabarcıkları boru içinde görünüp görünmediğini kontrol edin. Hava kabarcıkları gözlenir, tüp yağı ile tekrar tekrar doldur.
    3. İtici blok fırlatıcıya düzeltmek.
    4. Pistonu tüp dokunduğundan kadar yavaş yavaş itici tenkıye tutucusu blok doğru ilerlemek.
    5. Pistonu ucu tüp içine yerleştirin ve otomatik olarak ileri itici blok tenkıye tutucusu blok ulaşıncaya kadar "Infuse" komut penceresi ve düşük infüzyon hızı (Örneğin, 500 nL/dk) seçerek yavaş bir hızda hareket.
  3. Enjeksiyon iğne (34 G) hazırlayın.
    1. Hassas matkap/değirmeni bir kesim diske bağlı kullanarak açık bir kesim ile iğne hub kaldırın. Gerekirse, metal artıkları taze kesilmiş yüzeyden kaldırmak için bir iğne kullanın.
    2. Kılcal boru (3-4 cm uzunluk) iğne iplik.
    3. Tüp için iğne ile süper yapıştırıcı tutkal.
    4. Microsyringe pompa bağlanır hortumunun sonuna enjeksiyon iğne bağlayın.
  4. İğne stereotaksik sahibine iliştirin.
  5. İğne üstünde saydam tüp içinde bir hava kabarcığı görünene kadar hava geri alıyorum.
  6. Fare ile 1.5-%3 isoflurane oksijen anestezi. Yaklaşık 2-3 dakika bekleyin, sonra onun yanıt-e doğru ayak parmağı çimdik değerlendirmek tarafından fare tam anestezi onaylayın. Ameliyat boyunca hayvanın nefes izlemek ve gerekirse isoflurane konsantrasyon ayarlayın.
  7. Fareyi kullanarak travmatik olmayan kulak sahipleri stereotaksik çerçevesine yerleştirin.
  8. Fare bir lipid jel ile gözleri koruyun.
  9. 0.1 mL lidokain intradermally küçük bir 0,01-1 kullanarak baş cilt enjekte mL şırınga ve 26G Enjeksiyon kanül.
  10. Tıraş ve etanol çözüm kullanarak fare kafa dezenfekte. O zaman üç kez %2 KLORHEKSİDİN cerrahi sitesi dezenfekte için etanol ile alternatif.
  11. Bregma ve lambda görünecek şekilde kulak arkası arasından göz seviyesine mi ince ve keskin makas kullanarak bir ensizyon gerçekleştirin.
  12. Bir Ģırınga kullanarak NaCl yaklaşık 50 µL uygulayarak kafatası temiz ve kuru kağıt mendil ve bir hava üfle.
  13. Fare kafa bregma ve lambda aynı dorso-ventral düzeyde böylece burun kıskacı dorso-ventral düzeyini ayarlayarak konumlandırın (± 0,3 mm).
  14. MS (AP 0,98 ve L bregma referans olarak 0,5 mm) yukarıda bir delik.
  15. Bu noktada, bir aliquot ( AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato.WPRESV40en az 2 µL içermelidir) virüs (RT) Oda sıcaklığında yaklaşık 5 min için çözdürün.
  16. 1 dk. için RT de yaklaşık 4.000 x g, aliquot santrifüj kapasitesi.
  17. Pipet virüs Parafilm bir parça üzerine 2 µL; daha önce korumalı yan kullanın.
  18. Sıvı enjeksiyon iğne ucu daldırın ve dikkatli bir şekilde kesilmediğini gözleyerek sıvı düzeyini yaklaşık 500 nL/dk az tutar. Hava emme önlemek için virüs tamamen alınır önce para çekme durdurun. Çözüm viskozite göre geri hızını ayarlama; hızlı bir virüs geri çekilmesi ile daha yüksek viskozite kolaylaştırabilir.
  19. Kağıt mendil iğneyle temiz.
  20. Virüs tüp yer alıyor ve virüs ve petrol bir hava kabarcığı tarafından ayrılır emin olun. Virüs enjeksiyon sırasında başarıyla infüzyon olup olmadığını denetlemek için virüs tüp düzeyini işaretlemek.
  21. Kranyotomi yukarıda iğne yerleştirin ve yavaş yavaş beyin ilk enjeksiyon noktada (AP 0,98, L 0.5, V-5.2, 5.5 ° lateral) takın.
  22. 450 enjekte nL 100-150 nL/dak 10 dk bekle oranında şunun dikkatle iğne 0,1 mm yukarı taşımak ve başka bir 5 dakika bekleyin.
    1. İğne ikinci enjeksiyon noktaya (AP 0,98, L 0.5, V -4,6) taşıyın ve başka bir 450 enjekte nL 100-150 nL/dk.
    2. İğneyi 0,1 mm. kadar geçmeden önce 10 dakika için tekrar bekle başka bir 5 dk iğne çıkarmadan önce.
  23. Belgili tanımlık kesme kare knot kullanarak dikiş ipek siyah örgülü dikiş. Hayvan kurtarma hızlandırmak için kırmızı bir lamba ile sıcak. Antibiyotikler (0.3 mL Erycinum (1:4 steril NaCl)) ve carprofen IP günlük 2-3 gün ameliyat sonrası yönetmek.
  24. Virüs düzeyini belirtilen işareti yukarıda tüp kesti. Tüp daha fazla enjeksiyon için kullanılabilir. Daha önce her iğne taze enjeksiyon iğne hazırlayın.
    Not: Bu ameliyatı yaklaşık 1-1.5 saat sürer. Hayvan ameliyattan sonra genellikle 5 dk içinde uyanır. En az beklemek yeterli aksonal ifade için 6 haftalık zaman ama değil ifade düzeyleri yaklaşık 6 ay sonra virüs enjeksiyon azaltmak başladığınızda stereotaksik takılan, gerçekleştirmeden önce 5 ay daha uzun.

2. optik fiberler (Şekil 1A) hazırlanması

  1. Multimod optik fiber (105 µm çekirdek, silis çekirdek, 0,22 NA ile kaplı cam) kullanın. Şerit 125 µm kaplama lif lif biriktirme hâlâ bağlı mikro striptizci kullanarak fiber çekirdekli.
  2. Fiber bir elmas bıçak kullanarak yaklaşık 2-3 cm uzunluğunda için kesti.
  3. Fiber bir zirkon seramik sopa yüksük Ekle (ID: 126 µm). Yaklaşık 0,5-1 mm optik fiber yüksük dışbükey taraftan çıkıntı.
  4. Bir iğne kullanarak, epoksi tutkal bir damla her iki uçtan yüksük ama değil üzerine yüksük kenarlarına uygulanır. Alternatif olarak, süper yapıştırıcı kullanın.
  5. Tutkal için en az 30 dakika kurumasını sağlar.
  6. Film (3 µm Mısır ezmesi) parlatma fiber alıştırma elmas kullanarak yüksük dışbükey tarafında Lehçe.
  7. Bir optik güç metre kullanılarak ışık aktarımını sadakat testi.
    1. Dalga boyu güç metre olarak kullanılan lazer aynı dalga boyu için ayarlayın.
    2. Yama kablosu ucunu sensör ortasına bakacak şekilde yerleştirin. Lazer ve okuma güç metre hafif çıktısı gücüyle. Değeri kaydedin.
    3. Optik fiber üzerinden bir çiftleşme kol yama kablosu bağlayın ve sensör ortasına bakacak şekilde fiber ucu ile konumlandırın. Lazer ve okuma güç metre hafif çıktısı gücüyle. Değeri kaydedin.
    4. Aktarım hızını hesaplamak: ikinci değeri ilk değerle bölün. İletim hızı 0.5 ise, fiber atmak, aksi halde implantasyon için kullanın.
    5. İmplantasyondan önce her lif için aktarım hızını test.
    6. Daha sonraki deneyler için optik fiber iletim hızı için lazer ışık şiddeti çıkışını ayarlayın: 5-15 5-15 mW fiber ucundan son ışık verimi elde etmek için iletim hızına göre bölünmüş için yama kablosu uç--dan ışık çıkışını ayarlayın.
      Not: Ayrıca ref. 61 optik lifler hazırlanması için bkz.

3. hazırlık Tungsten Tel diziler LFP için kayıtları (Şekil 1B)

  1. Birkaç (örneğin 6) tutkal 100 µm silis tüp kılavuzları paralel yapışkan bant parçası tarafına. Bir parça, bir kablo dizi derleme için yaklaşık 4-6 mm kesme.
  2. Formvar izolasyonlu 45 µm tungsten teller forseps kullanarak Kılavuzu tüpler aracılığıyla iş parçacığı.
  3. Teller (yaklaşık 5 mm uzun) ve topraklama tel (yaklaşık 2-3 cm uzunluğunda) uzakta her iki ucunda yalıtım kazımak için neşterden kullanarak Yapıştırma şeridi altı emaye izolasyonlu ince bakır. Onları nanoconnector pins lehim.
  4. Her bağ tel Gümüş iletken boya, bir damla sırasıyla kullanarak bir tungsten tel bağlayın. En az 30 dk kurumaya bırakın.
  5. Çimento kabloları kapsayacak şekilde en az miktarda uygulayın. Çimento beyin dokusunda veya nanoconnector üst kısmında eklenecek tungsten teller üzerinde geçerli değil. İzin için en az 30 dakika Kuru çimento.
  6. Künt paslanmaz çelik makas kullanarak güvenilir implantasyon teller aşağıda veya bölge stratum pyramidale için ventrally bitişik teta genlik nerede tahmini için çok düşük üstünde etkinleştirme tungsten tellerin bir açısal kesme (5-20 °) gerçekleştirmek sürüklenme sadakat.
  7. İpucu (yaklaşık 2 mm) zemin tel uzakta yalıtım kazımak için neşterden kullanarak deinsulate. Akı ve presolder ile tedavi.
  8. Onay potansiyel çapraz-elektrotlar arasında kullanarak bir dijital multimetre görüşmeler. Bunu yapmak için direnç ölçme moduna ayarlamanız gerekir multimetre konektörü pin bağlayın. İkili kanal birleşimlerini denetleyin; 5 MΩ aşağıda multimetre üzerinde okuma önemli çapraz-talk gösterir.
  9. Serum fizyolojik bir empedans metre kullanarak her tel elektrot empedans denetleyin. 100 kΩ tipik empedans değerlerdir.
  10. İmplantasyon kolaylaştırmak için böylece lif ucu kısa tel düzeyinde ve lif yolgösterendir yakın ama tungsten teller değil müessir bir optik fiber kablo diziye tutkal. Fiber açı implantasyonu-doku hasarı önlemek için mümkün olduğu kadar küçük tutun.
    Not: Ayrıca ref. 62 tungsten tel dizileri imalatı için bkz.

4. stereotaksik takılan

  1. Hazırlıklar 1.6-1,13 adımlarda açıklandığı gibi gerçekleştirin.
  2. Bağ dokusu kafatası en baştan çıkarmak ve kayıt sırasında kas yapıları önlemek için iyice yaklaşık 2 mm tarafından boyun kasları itin.
  3. Temiz bir pamuk-ipucu aplikatör ve serum kullanarak kafatası ve 4 (2 ön) ve beyincik, 0.8 mm çap yukarıdaki 2 için zemin ve stabilization (Şekil 1 d) implantın kemik paslanmaz çelik vidalar (00-96 x 1/16) yerleştirmek için delik. Bir bakır tel (yaklaşık 2-3 cm uzunluk) beyincik yukarıda bağlı zemin vidayı yerleştirin.
  4. Zemin-vida ile tamamen çimento elektrofizyolojik kayıtları sırasında kas yapıları önlemek için kapak. Tüm vidaları (Şekil 1E) bağlanan bir çimento halka oluşturun.
  5. Bir kranyotomi implantasyon yan (hipokampus, AP-1.94, L 1.4, referans olarak bregma V 1.4) yukarıda gerçekleştirmek. Yaklaşık 5 µL steril NaCl beyin doku yüzeyine uygulamak.
  6. Yavaşça stereotaxis kranyotomi kullanarak Tel dizi indirin. Üniter kayıtları için bir silikon sonda bir tel dizi63yerine implant; Optoelectric hafif yapıları önlemek için doğrudan soruşturma karşı karşıya fiber ucu ile ayrı ayrı hipokampüs optik lif implant (Şekil 1 c -ı). Sürüklenme hemisferlerin arasında koordinasyonu soruşturma için ek bir optik fiber kontralateral hipokampal CA1 alanında implant.
  7. Yaklaşık 5 µL beyin dokusunu korumak için implantasyon site yukarıda bir şırınga ile 70 ° C'de ısıtılmış sıcak sıvı balmumu/parafin yağı uygulayın.
  8. Çimento tel dizi çevresinde uygulamak ve çimento ile kafatası kapağı.
  9. Presoldered zemin/başvuru tel ve örneğin bir iğne kullanarak zemin vida bağlı presoldered tel akı bir damla uygulamak ve teller lehim makinasıyla sigorta.
  10. Tüm zemin tel çimento ile kapak.
  11. 0.3 mL Erycinum (1:4 içinde steril NaCl) yönetmek ve carprofen (5mg/mL) IP ve ameliyattan sonra en az iki gün. Fare genellikle ameliyatı takiben 15 dk içinde uyanır. Hayvan kurtarma hızlandırmak için kırmızı bir lamba ile sıcak.
  12. Farenin ağırlığını her gün ameliyatı takiben ilk hafta için ya da ağırlığı dengeli olana kadar izlemek. Kilo kaybı ameliyattan önce kaydedilen fare ağırlığı yüzde 10'u geçmemelidir. Sabitleme ağırlığının hızlandırmak için ameliyatı takiben ilk gün boyunca fare ile ıslak yiyecek ve yoğunlaştırılmış süt tedarik.
  13. Hipokampal hücresel hareketlilik sürüklenme sırasında kaydetmek için hipokampus (AP-1.94, L 1.4, V 1, sonraki düşürülmesi ile) bir silikon sonda ref. 62 ' açıklandığı gibi implant (Şekil 1 c -ı). AP -3, L 1.4, V 1.6, 39 ° rostral kaudal, hipokampus optik lif implant. Hücre somata uyarılması isterseniz MS (AP +0.98, L 1, V 3.9, 15 ° lateral) ek bir optik lif implant.

5. Optogenetic stimülasyon ve elektrofizyolojik veri toplama

  1. (Örneğin, 15dk oturumları, 3 gün boyunca günde 1-2 seans) kayıt kurulum için fareyi alıştırmak. Hayvanın davranış ile ilk deneyler başlamadan önce inceleyin. Fare odasında, koklama, performans rearings, vb, çevre keşfetmek hareket ediyorsa ilk deneysel oturumu başlatmak.
  2. Diğer hayvanlar aynı odada yokluğunda tanıdık bir odasında fareyi getirin.
  3. Bir LED kafa-hayvanın konumunu izlemek için yapıştırıcı bant kullanarak sahne alanı'na ekleyin. Hayvan deneyleri başlamadan önce kayıt odası araştırmaktadır LED ışık süresi boyunca kamera tarafından yakalanır emin olun. Karanlıkta LED ışık izlemek için kaydedin. Bir kamera kayıt odası üzerinde konumlandırın.
  4. Yama kablosu ışık çıktısını denetleyin. Sonra bağlantı bağlı olarak iletim hızı implante lif lif ucundan ıșık çıkıșı tahmin. Fiber ucundan ıșık çıkıșı güvenilir sürüklenme etkinleştirmek için 5-15 mW arasında olduğundan emin olun.
  5. Headstage pre amplifikatör kronik implante konektörüne bağlayın. Kronik implante hipokampal fiber optogenetic stimülasyon deneyler için fiberoptik yama kablosu takın. Denetim ışık stimülasyon deneylerde, optik fiber için kulaklıklı mikrofon seti bağlı bir kukla yüksük bağlayın.
  6. Kayıt odasında fareyi getirin.
  7. Stimülasyon Protokolü oluşturmak için uyarıcı jeneratör kontrol yazılımını açın.
  8. 473 nm DPSS laser kontrol kanalı seçin. 3000 ilk satırına girdiğiniz mV (1 sütun), 30 ms zaman (2 sütun), 0 değeri mV (3 sütun), 112 ms zaman (4 sütun), tekrar 840 kürek ve Grup 7 Hz stimülasyon ile 30 ms uzun bakliyat 2 min için bir protokol oluşturmak için tekrar 1. Uyarımı başka bir frekans veya farklı bir süre de gerekirse süre 4 sütun ve satır Tekrarlamaların sayısını ayarlayın. İkinci satır Seç 0 mW olarak (1 sütun), 500 h zaman (2 sütun), satır yineleyin 1 ve Grup 1 stimülasyon Protokolü sonlandırıldı sonra lazer kapalı olduğundan emin olmak için tekrar ediyorum.
  9. Tıklayın "Dosya > Farklı Kaydet" ve istenen bir adla kaydedin.
  10. Uyarıcı TTL lazer tetikleme elektrofizyolojik edinimi eşitlemek için dijital Lynx analog giriş kuruluna bağlı çıkış temin ederim ve optogenetic veri.
  11. Alternatif olarak, parametrik teta salınım frekansı değişkenliği düzenleyen tren adlı arası darbe aralıkları, Gauss dağılımı aşağıdaki noktalarla değişen ışık darbeleri uygulanır. Örneğin, adım 3.2-15,1 ms2arası darbe aralıkları için farklı iletişim kuralları, dispersiyon değiştirin. Teta dönemini teta frekans (Şekil 6) farklı değişkenlik ile oluşturmak için bu iletişim kurallarını uygulayın.
  12. Kayıt sistemi yazılımını açın. Tıkırtı üstünde "satın alma" ve "REC" kaydetmek için. Temel davranış (Örneğin, temel hız almak için 2 dk veya temel yer alanları ayıklamak için 30 dk) kaydetmek için ışık stimülasyon başlanmasından önce bekleyin.
  13. Uyarıcı jeneratör kontrol yazılımını açın. "Dosya > Aç" tıklayın ve tercih Protokolü dosyası seçin. "Download ve ışık stimülasyon başlatmak için" Başlat.
    Not: Deneme araştırılmıştır ve stimülasyon uzaktan kumanda ile başladı; Bu hayvanın davranış deneyci varlığı etkisi içermez. Çalışmanın amacı bağlı olarak, stimülasyon başlatılan ve özel davranış sırasında sonlandırıldı.

6. bir kombine yaklaşım Optogenetic sürüklenme ve hipokampal çıkış projeksiyon özgü inhibisyonu için

  1. ChR2 MS GABAergic hücrelere PV-Cre farelerin 1 bölümünde açıklandığı gibi hızlı.
  2. Buna ek olarak, her iki dorsal hipokampal hemisferlerin (AP-1.7; CamKIIα bağlı halorhodopsin (eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH) 2.4 µL toplam enjekte L ± 1,05; V-2.05 ve - 1,4 mm; AP-1.7; L ± 1.7; V-2.05 ve - 1.55 mm; AP-2.3; L ± 1.5; V-2.2 ve - 1.3 mm; AP-2.3; L ± 2.2; V-1.65 ve - 2.45 mm).
  3. 6 hafta ifade zaman tanıyın.
  4. Hipokampal CA1 bölgesindeki optik lif içeren bir tungsten tel dizi 4 bölümde açıklandığı gibi implant. Ayrıca, yanal septum bilateral optik lifler implant (LS, AP 0,1, L 0,25, V-2.25 mm ve AP 0.5, L-0.3, V-2.7 mm).
  5. 5.4 5.5 adımlarda açıklandığı gibi optogenetic teta sürüklenme deneyler yapmak.
    1. LS hipokampal çıktısına eşzamanlı inhibisyonu için bir iletişim kuralı uyarıcı nesil oluşturmak: Örneğin, tetikleyici çıktı kanalı başlangıcı bağlı 593 nm DPSS laser 15 s için toplam 45'kalıcı bir sürekli darbe ile tetikleme önce s, 473 nm DPSS lazer bakliyat çıktı.
    2. LS yama halatlar multimod fiber optik girişli 593 nm DPSS lazere kullanarak üzerinden her iki lifler bağlayın.
    3. Kayýt iþlemini baþlatmak ve download ve uyarıcı üretimi denetlemek için iletişim kuralı tetikler.

7. veri işleme

  1. Elektrofizyolojik sinyalleri dönüştürmek ve nörofizyolojik veri (ND) Yöneticisi .dat ve .pos formatları, sırasıyla64ile izleme verilerini getirin.
  2. LFP alçak geçiren filtre uygulama ve aşağı örnekleme geniş bantlı sinyal 1,250 Hz ND Yöneticisi66kullanarak elde.
  3. Her kayıt, teta salınımları (Neuroscope kullanarak)19maksimal genliği ile kanalı seçin.
  4. Zaman damgaları lazer bakliyat ve stimülasyon dönemini algoritması algılama eşik ile tespit (MATLAB işlevi findpeaks.m kullanarak veya benzer)11.
  5. Bir çok kanallı veri analiz yazılımı .dat dosyasını almak için "Dosya > Al"'ı tıklatın, "ikili dosyaları" veri türü olarak seçin ve .dat dosyasını seçin. Yapılandırma iletişim kutusunda, doğru kanal sayısı ve 1,250 Hz örnekleme oranı girin, "Tamam" ve .smr dosyası olarak kaydedin. Güç spectra "Analiz > yeni sonuç görünümü > PowerSpectrum" seçerek arsa. Ayarları'nda, en yüksek teta genlik ve 16.384 FFT boyutu ile kanalı seçin, "Yeni"'ı tıklatın, "Başlangıç saati olarak" başında stimülasyon dönem ve "End time" olarak tanımlamak belgili tanımlık stimülasyon dönem ve tıkırtı "Süreci" sonuna.
  6. Sürüklenme sadakat toplu güç spektral yoğunluğu (PSD) oranı olarak optogenetic stimülasyon frekans aralığı içinde hesaplamak (stimülasyon frekans ± 0.5 Hz), multitaper yöntemi ile teta (5-12 Hz) bandında toplu PSD için (NW = 3, pencere boyutu 8,192) 10 s dönemini için (Örneğin, araç < http://chronux.org/>).
  7. Baskın PSD tepe ≤ nerede kayıt dönemini hariç analiz (non-theta dönemini, MATLAB işlevi find.m kullanarak) 5 Hz.
  8. LFP güç spectra raster (MATLAB işlevleri sortrows.m ve pcolor.m kullanarak) hesaplanan sürüklenme sadakat göre tüm kaydedilmiş dönemini için arsa. Yük güç spectra ve sürüklenme "Dosya > Aç" tıklayarak sadakat saklanan değişken inç türü güç = sortrows(In,1); pcolor(Power(:,2:End)).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ChR2 MS 1 bölümünde açıklandığı gibi GABAergic hücrelere hedefleme Şekil 2Agösterilmektedir. Dorsal hipokampus CA1 alanının üzerinde implante bir optik fiber üzerinden MS GABAergic hücrelerinin akson uyarılması Optogenetic teta salınımlarını uyarıcı Ipsilateral (Şekil 2B) frekansta kontralateral yanı sıra entrains Yarımküre (Şekil 2C). Teta titreşimler tarafından hangi etkinliği olarak göreli teta LFP güç stimülasyon frekans, yaniçevresinde her kayıt dönemi için hesaplanan optogenetic stimülasyon (Şekil 3A), daha fazla veya daha az verimli entrained, sürüklenme sadakat (Şekil 3B). Sürüklenme sadakat 0.3, yani, kendiliğinden ışık kapalı kayıtları, daha yüksek yukarıda kayıt dönemini yaklaşık % 80 gözlendi. Optostimulation sigara-theta frekanslarda daha az olduğunu etkili (Şekil 3 c).

Açık yani, parametrik manipülasyon teta salınım frekansı teta düzenli acil değişikliklerden eşlik etti: genlik zamansal düzenlilik ve Teta salınım frekansı yüksek dönemini sırasında artış oldu sürüklenme sadakat. Salınımlarını kararlılığını da parametrik tren ışık darbeleri, hangi dönemlerinde farklı dispersiyonu (Şekil 4) ile Gauss dağıtımları takip uygulayarak düzenlenmiş.

Salınım frekansı üzerinde Optogenetic kontrol teta frekans ve afferents (5A rakam) hareketi sırasında artan tarafından MS ile frekans kontrolü ile anlaşma içinde çalışan hızlı arasında ilişki ortadan kaldırılmıştır. Optostimulation da hareketsizlik (Şekil 5B) sırasında teta salınımlarını indüklenen. Sözde piramidal hücrelerde CA1 alanında Tercihli ateş aşama kaydedildi ve interneurons spontan teta (Şekil 6) karşılaştırıldığında entrained optogenetically teta salınım göre değişmez.

Hippocampus teta-aracılı, düzenleme, hareket, yanal septum yolu için katkısını çalışmaya biz optogenetically inhibe bu yolu. Halorhodopsin (eNpHR3.0) bilateral hipokampal piramidal hücrelerde (Şekil 7A), oysa ChR2 MS GABAergic hücrelerdeki ifade edildi ve Teta salınımlarını entrained optogenetically (Şekil 7B) olduğunu ifade edildi. Teta sürüklenme azaltılmış değişkenlik hız ama değil ne zaman hipokampus LS yolu için inhibe çalışan (Şekil 7C).

Figure 1
Şekil 1: resimde optik lifler, elektrotlar ve ameliyat. (A)bir optik fiber Illustration. (B) bir optik fiber hipokampal LFP kayıt hipokampal teta salınımlarını sürüklenme sırasında için yapıştırılmış bir tel dizi Illustration. (C) hipokampal hücresel aktivite kayıt için bir silikon sonda üzerinde microdrive monte edilir. (D) minyatür vida kafatasında konumlandırılmış. Bakır teller için zemin ve başvuru vida beyincik üzerinde konumlandırma daha önce presoldered. (E) Çimento kapak ve vidaları bağlanmak için uygulanır. Üst mavi daire kranyotomi silikon inceleyebilirsek implantasyon için yapılacağı yeri gösterir. Daha düşük mavi daire nerede kranyotomi hipokampüs optik lif implantasyonu kez yapıldı gösterir. (F) bir optik fiber hipokampal CA1 bölge hedeflemesini rostral kaudal bir açıda yerleştirilir. Hücre somata uyarılması (isteğe bağlı) isterseniz ikinci bir lif medial septum implante olması. (G) Silikon sonda hipokampal CA1 alanının üzerinde sadece indirilir. (H) microdrive ve bağlayıcı implant ve zemin çimentolu ve başvuru telleri lehimli. (ben) bakır mesh implant çevreleyen ve Faraday kafesi hizmet için inşa edilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: optogenetic hipokampal teta sürüklenme için hazırlık. (A)ChR2 PV-Cre fareler (üst düzeni) PV+ medial septal hücrelerinde dile getirdi. MS (1, 2) parlak floresan somata başarılı yapı ifade onaylar. Proje MS lifleri yolu ile fornix (f) ve Pilus (fi) için hippocampus (3-6); ACA: anterior komissür; ön bölümü. HDB: çapraz grup yatay kol çekirdeği; Veya: tabaka oriens. Mavi ışık ile optogenetic uyarılması için optik fiber piramit katmanın Hipokampal alanın CA1 üzerinde (alt düzeni) yerleştirilir. Ölçek çubukları: 500 µm (resim 1, 3, 4) ve 50 µm (resim 2, 5, 6). (B) hipokampal LFP spontan teta salınımlar (sol) ve 7 Hz (orta) veya 10 Hz (sağda) optogenetic sürüklenme sırasında. Mavi çizgili ışık uygulama zaman pencereleri gösterir. Not bir okla gösterilen hafif darbe tarafından araştırma aşamasında. Not gama zarflar sırasında kendiliğinden ve sürüklenmiş teta, fizyolojik teta ritim bir göstergesidir. Faz ters tabaka oriens arasında (str. veya.) ve stratum radiatum (str. rad.) Ayrıca sürüklenme sırasında yapılmaktadır. (C) sürüklenme sırasında Ipsilateral (üst araziler), aynı zamanda kontralateral (alt araziler) güvenilir optogenetic uyarım. Düzenleri liflerinin pozisyonlarda elektrot pozisyonları için saygı göstermek. Örnek LFP izlemeler teta ve ışık darbeleri uygulanması sırasında ortada gösterilir. Doğru güç spectra hipokampal LFP ipsi ve stimülasyon Frekansa göre renk kodlu kontralateral stimülasyon sırasında. Bu rakam ref. 11' den değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: optogenetic hipokampal teta sürüklenme vefa. (A) örnek hipokampal LFP izlemeler sırasında düşük ve yüksek sürüklenme sadakat. (B) güç spektral yoğunlukları 10 s dönemini teta frekans (solda), önde gelen göre sipariş satırları ile spontan teta ve 7 Hz (orta) ve sürüklenme sadakat göre sipariş satırları ile 10 Hz (sağda) optogenetic stimülasyon sırasında. İlgili örnek güç spectra (bir okla gösterilen) yukarıda çizilir. Güvenilir sürüklenme sadakat dönemini unutmayın. Sağ tarafta, kümülatif olasılığını sürüklenme sadakat teta frekanslar için gösterilir. (C) sürüklenme teta ritmik uyarılması gerekir. Hipokampal ağ etkinliğini başarıyla arasında 6-12 Hz frekansları kullanılarak entrained. Daha düşük frekanslarda (Örneğin, 2 veya 4 Hz) veya daha yüksek frekanslar (Örneğin, 20 Hz) sürüklenme güvenilir değil. Bu rakam ref. 11' den değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: theta salınımlarını düzenlilik parametrik manipülasyon. (A)stimülasyon kötü frekans ile 7,8 Gauss dağılımı aşağıdaki Hz teta aralığında değişen frekanslarda uygulandığı. Arası pulse aralıklarında standart sapma σ iletişim kurallarından genelinde yükseltilmiştir 3,19 için σ = 15,09 =. Toplamda 11 protokolleri oluşturulan ve uygulanan, her stimülasyon dönemi: 1 min Toplam süre. O, olasılık dağılımı 5 iletişim kurallarının gösterilir rakam sol tarafta. Hipokampal LFP ilgili iletişim kurallarının uygulaması sırasında 1-14 Hz aralığındaki güç spektral yoğunluğu ortasında şekil çizilir. Uygulama ilgili iletişim kurallarının teta dönemlerde olasılıklardan sağda gösterilmiştir. (B) uygulanan varyansını arası darbe aralıkları tespit eşzamanlı teta dönemi varyansını (Pearson r 0,94, p = 0.0002 =). (C) teta genlik değişkenliği ve arası darbe arasındaki ilişkiyi aralığı (Pearson r 0.61, p = 0,08 =). Bu rakam ref. 70değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: Optogenetic teta ritmik sürüklenme sırasındaki davranış biçimi hipokampal LFP belirler. (A)Optogenetic stimülasyon frekansı tespit teta frekans hareket sırasında. Bu nedenle, hız ile ilgili afferents hipokampal teta frekans etkisi değil ve spontan teta (siyah) sırasında olduğu gibi sonuç olarak hız teta frekans (mavi) ile ilişkili değil. Veri ± s.e.m. (B) sessiz uyanıklık sırasında demek olarak sunulan, hipokampal teta hareketi yokluğunda elde edildi. Yukarıda gösterilen hipokampal LFP izlerini öncesi ve sırasında başarılı sürüklenme ve sürüklenme sırasında kaydedilen örnek hızı izlemeler aşağıda gösterilmiştir (yukarıda tasvir hipokampal LFP izleme kırmızı izleme karşılık gelir). Mavi çizgili ışık stimülasyon bakliyat zaman pencereleri işaretleyin. Bu rakam ref. 11' den değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: hipokampal hücresel aktivite sırasında teta sürüklenme. (A)hücresel hareketlilik silikon sondalar (düzeni) kullanarak kaydedildi. Tek interneurons ve piramidal hücreleri izole ve onların anılan sıraya göre dalga göre tespit. Burada gösterilen ortalama dalga formu (orta) ve auto-correlogram örnek izole piramit hücre olduğunu. (B) tercih edilen deşarj piramit hücreleri (Pyr) aşamasıydı değil farklı sırasında spontan (siyah, n = 29 nöronlar) ve entrained optogenetically (mavi, n = 30) teta (p 0,79 =). (C) gösterildi burada olduğunu otomatik correlogram (solda) ve Tercihli ateş aşaması sırasında spontan bir hızlı pişirme interneuron ve optogenetically entrained teta. Karşılık gelen hipokampal LFP ritim spontan (sol) ve sürüklenmiş (sağda) teta sırasında. (D) tercih edilen akıntı hızlı pişirme interneurons aşaması sırasında farklı değildi (siyah içinde) spontan ve entrained optogenetically (mavi, n = 28 nöronlar) teta (p 0,97 =). Ortalama auto-correlogram sol tarafta gösterilir. (E) ortalama auto-correlogram str. oriens hücreleri. (F) spontan (siyah) ve entrained optogenetically sırasında str. oriens interneurons tercih edilen deşarj aşaması farklı değildi (mavi, n = 10 nöronlar) teta (p = 0.56). Histogramlar tercih edilen deşarj aşamalarının sağ tarafta gösterilir. (G) ortalama ateş oranları teta sürüklenme piramidal hücrelerde tarafından etkilenmemektedir (p = 0,98), hızlı pişirme interneurons (p = 0,96) veya str. oriens interneurons (p 0,85 =). Bu rakam ref. 11' den değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: kombinasyonu ile LS çıkış hipokampal teta sürüklenme ve optogenetic inhibisyonu hipokampal subcortical. (A)eNpHR3.0 (halorhodopsin) hipokampal piramidal hücrelerde (üst düzeni) dile getirdi. Yapı başarılı ifade hippocampus (üst Images) somata ve akson LS (alt resim) içinde parlak floresans tarafından doğrulandı. Optik lifler bilateral LS (alt düzeni) implante edildi. Ölçek çubukları: 500 µm (soldaki resim), 50 µm (Sağdaki fotoğraf). (B) hipokampal teta başarıyla LS yolu için hipokampus inhibisyonu sırasında entrained. Burada 9 Hz mavi ışık uyarılması sırasında çıkış inhibisyonu için güç spektral yoğunluğu gösterilmiştir. (C) önemli hipokampal subcortical çıkış yolu inhibisyonu hipokampal teta sürüklenme hızı üzerinde etkilerini engeller. Burada gösterilen hızı değişkenliği optogenetic (mavi kenarlıklarla beyaz bar), sürüklenme ile üzerine düşmesiyle yoktur olduğunu hipokampus LS yolu (sarı çubuk mavi kenarlıklı) için eşzamanlı inhibisyonu üzerine. İlgili ortalama temel hız sol tarafta gösterilir. Bu rakam ref. 11' den değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada biz trene binmek ve hipokampal teta salınımlarını behaving hayvan temin için yaygın olarak erişilebilir bir metodoloji sundu. Bu yaklaşım bilgi işleme ve davranış teta ritim'ın fonksiyonların çalışmaları için yararlı olabilir. Bu yöntemin önemli yönleri şunlardır: seçimi (1) opsin ve ChR2 MS aksonlar için hedefleme hipokampüs, sürekli stimülasyon ve LFP sağlamak için implante optik fiber-tel dizi derlemeler (2) sağlam optik ve elektriksel özellikleri hücreleri fareler, (3) en uygun miktarda ışık teta frekanslarda uygulanması, (4) özel mesaj miktar sürüklenme sadakat ve optoelectrical eserler (5) denetim davranıyor kayıt.

İlk ana bilmeniz gereken hemen bulunduğu venöz pleksus tutumlu bir güvenli virüs enjeksiyon olduğunu. Bu adımın suboptimal cerrahi yürütme enjeksiyonları başarı oranını azaltmak ve potansiyel sonuçları edinimi gecikme. Bir opsin kinetik kabul edilmelidir, ChR2 (etkinleştirme süresi: 2 ms, inactivation zaman: 9 ms65). İkinci nokta ışık geçirgenliği sadakat kontrolünü ve empedans İmplantasyondan önce elektrotlar kayıt gerektirir ve genellikle ek implantlar zamanında imalatı yararlanır.

Üçüncü göz geniş ölçekli devre manipülasyonlar amaçlayan optogenetics için yaygın ve ışık kaynakları ve 5-15 mW beyindeki bir 100 µm fiber hafif güç yoluyla teslim optik bağlantıları içerir. Her fare ve her kayıt önce bir test kaydı ıșık çıkıșı deneme için en uygun yoğunluk ayarlamak için gerçekleştirilebilir. Işık verimi projeksiyonlar güvenilir sürüklenme teta titreşimler, ama çok yüksek değil, termal olarak uyarılmış yanıtlar ve doku hasarı önlemek için izin vermek için yeterli sayıda etkinleştirmek için yüksek olmalıdır.

İleri ışık darbeleri ve her iki veri türleri aynı reklam dönüştürücü üzerinden örnekleyerek olan en yüksek hassasiyetle elde LFP veri eşitleme yönü saygılar. Eşitlenmiş zaman damgaları özellikle nöronal deşarj ve LFP eğitimine yönelik diğer potansiyel uygulamalar için gereklidir. Sürüklenme etkinliği arasında ve stimülasyon dönemini içinde değişebilir; Bu büyük olasılıkla optogenetic stimülasyon teta ritim16,66,67, birden çok jeneratörler nedeniyle içsel - ve/veya duyu tahrik sinyalleri ile belirlediği rhythmicity girişim nedeniyle oluşur 68. miktar bu son derece dinamik optogenetic manipülasyon69 anlık sadakat bu nedenle son derece yararlı bir etkisi büyüklüğü arasındaki ilişkiyi ifşa için yani, nedensel çıkarsama için (Örneğin , davranış değişikliği) ve seçilen eşitleme yönleri optogenetic kontrolünü anlık etkinliği. Önemlisi, birden çok salınım parametre optogenetic stimülasyon tarafından Örneğinetkilenebilir, sürüklenme frekans kilitleme sadece da teta salınımlarını11daha düzenli bir genliği aracılık eder.

Beşinci olarak, optogenetic stimülasyon sık sık optoelectrical eserler, metal elektrotlar fotoelektrokimyasal etkisiyle uyarılmış ile ilişkilidir. Onların derecesi elektrot malzeme, optik fiber ve ışık güç elektrot uç yakınlık bağlıdır. Burada açıklanan deneylerde eserler lif ve kayıt elektrot arasındaki mesafeyi artırarak önlenebilir optoelectrical yakın konumlandırma teta salınım kontrolü için gerekli olan değil. Zamanında ve kanallar arasında tutarlı şekli Optoelectrical eserler görüntüleyebilir ve bu nedenle, spike sıralama sırasında onlar genellikle farklı bir kümede gruplandırılır ve kaydedilen nöronlar70ile çakışmaz. Aynı zamanda, Aksiyon potansiyelleri, dalga biçimleri hangi eserler tarafından değiştirilmiş, küçük bir kısmını değil gruplandırılır diğer dikenli bir nöron tarafından ateş algoritmaları sıralama tarafından. Laminer LFP profilleri elde edilen tel dizileri (2B rakam) dahil olmak üzere çeşitli elektrot yapılandırmaları kullanarak ve doğrusal silikon sondalar, eserler ve eski sabit aşamasına göre doğru LFP desenler net bir farklılaşma etkinleştirmek ve fizyolojik laminer faz ikincisi kaydırır. Temel kayıtları stimülasyon önce keşif tipik laminer faz profilleri gibi karakteristik teta özellikleri etkinleştirin.

Teta salınımlarını kontrolünü Optogenetic teta sürüklenme hipokampal CA1 tabakasının tüm katmanlarında ve kontralateral sürüklenme bile yol açar. (Sınırlı bir bölgede veya bir subpopulation uyarılması etkileri incelenecektir için hedefleniyor eğer) bir deney yerel bir stimülasyon hedefleniyor eğer bu hesap için alınması gereken. Öte yandan, somatik optogenetic uyarılması daha az belirli bir manipülasyon teta titreşimler, yani, sürüklenme, hipokampal projeksiyonlar burada sunulan MS PV+ hücrelerinin dağınık şekilde sınırlı stimülasyon sağlar Son zamanlarda anaesthetized fareler71yılında uygulanan MS PV+ hücreler. İkinci somatik stimülasyon sürekli hipokampal salınım frekansları sonuç ilâ 40 Hz ve böylece son derece güvenilir bir ritmik pacing örneği gösterir. Buna ek olarak, burada sunulan aksonal stimülasyon tercihen teta frekans bandında (Şekil 3 c) etkili olduğunu ve bu nedenle daha Kuramoto geçiş72, yani, üzerinden muhtemelen sürüklenme benzer çalışma Frekanslar stimülasyon başlangıçlı spontan teta titreşimler mevcut olanlar yakın.

Burada açıklanan optogenetic hazırlık teta salınım özellikleri manipülasyon sağlarken, MS inhibitör nöronlar inhibisyonu somatik optogenetic uygulanan teta salınımlarını verimli inhibisyonu sırasında REM uykusu73için. Optogenetic aktüatörler nöronal uyarılabilirlik (Örneğin, 12) karşı denetim için kullanma iki teknik entegrasyonu potansiyel olarak çift yönlü denetim için daha fazla nedensel çalışmaların aynı hayvan teta ritim etkinleştirebilirsiniz Ağ salınımlar ve davranış çeşitli yönleri arasındaki bağlantıları.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

El yazması üzerinde uzman yardımı ile veri analizi için Maria Gorbati ve Jennifer Kupferman Yorumlar için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; tarafından desteklenen EXC 257 NeuroCure, TK ve AP; Öncelik Program 1665, 1799/1-1(2), Heisenberg programı, 1799/2-1, AP), Alman-İsrail Vakfı bilimsel araştırma ve geliştirme (GIF; Ben-1326-421.13/2015, TK) ve insan sınır bilim programı (HFSP; RGY0076/2012, TK).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PV-Cre mice The Jackson Laboratory B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J
Name Company Catalog Number Comments
Surgery
Stereotaxis David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA Model 963 Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument
Drill bits, 0.8 mm Bijoutil, Allschwil, Switzerland 49080HM
0.01-1 ml syringe Braun, Melsungen, Germany 9161406V
Sterican cannulas Braun 26 G, 0.45x25 mm BL/LB
Fine and sharp scissors Fine Science Tools Inc., Vancouver, Canada 14060-09
Forceps Fine Science Tools Inc. 11210-10 Dumont AA - Epoxy Coated Forceps
Blunt stainless steel scissors Fine Science Tools Inc. 14018-14
Soldering station Weller Tools GmbH, Besigheim, Germany WSD 81
Erythromycin Rotexmedica GmbH, Trittau, Germany PZN: 10823932 1g Powder for Solution for Infusion
Name Company Catalog Number Comments
Optogenetics
Hamilton pump PHD Ultra, Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA model 703008 PHD Ultra Syringe Pump with push/pull mechanism
Hamilton 5 µL Syringe, 26 gauge PHD Ultra, Harvard Apparatus Model 75 RN SYR
Hamilton 5 µL Plunger PHD Ultra, Harvard Apparatus Model 75 RN SYR
Tubing Fisher Scientific, Pittsburgh, USA PE 20 Inner diameter 0.38 mm (.015"), Outer diameter 1.09 mm (.043")
Sterican cannulas Braun, Melsungen, Germany 27 G, 25x0.40 mm, blunt
Precision drill/grinder Proxxon, Wecker, Luxemburg fbs 240/e
Cutting disks Proxxon NO 28812
Cre dependent channelrhodopsin Penn Vector Core, Philadelphia, PA, USA AV-1-18917P Contruct name: AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato, titer: 1.42x1013 vg/ml
Cam kinase dependent halorhodopsin Penn Vector Core AV-1-26971P Construct name: eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH, titer: 2.08_1012 vg/ml
Multimode optic fiber ThorLabs, Dachau, Germany FG105LCA 0.22 NA, Low-OH, Ø105 µm Core, 400 - 2400 nm
Ceramic stick ferrule Precision Fiber Products, Milpitas, CA, USA CFLC126 Ceramic LC MM Ferrule, ID 126um
Polishing paper Thorlabs LF3D 6" x 6" Diamond Lapping (Polishing) Sheet
Power meter Thorlabs PM100D Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD
Multimode fiber optic coupler Thorlabs FCMM50-50A-FC 1x2 MM Coupler, 50:50 Split Ratio, 50 µm GI Fibers, FC/PC
Fiberoptic patch cord Thorlabs FG105LCA CUSTOM-MUC custom made, 3 m long, with protective tubing, Tubing: FT030, Connector 1: FC/PC, Connector 2: 1.25mm (LC) Ceramic Ferrule
Sleeve Precision Fiber Products, Milpitas, CA, USA ADAL1 Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25 mm (LC/PC) Ferrules
473 nm DPSS laser Laserglow Technologies, Toronto, ON, Canada R471005FX LRS-0473 Series
593 nm DPSS laser Laserglow Technologies R591005FX LRS-0594 Series
MC_Stimulus II Multichannel Systems, Reutlingen, Germany STG 4004
Impedance conditioning module Neural microTargeting worldwide, Bowdoin, USA ICM
Name Company Catalog Number Comments
Electrophysiology
Tungsten wires California Fine Wire Company, Grover Beach, CA, USA CFW0010954 40 µm, 99.95%
Capillary tubing Optronics 1068150020 ID: 100.4 µm
Omnetics nanoconnector Omnetics Connector Corporation, Minneapolis, USA A79038-001
Screws Bilaney, Düsseldorf, Germany 00-96x1/16 stainless-steel
Silicone probe NeuroNexus Technologies, Ann Arbor, MI, USA B32
Headstage Neuralynx, Bozeman, Montana USA HS-8 miniature headstage unity gain preamplifiers
Silver conductive paint Conrad electronics, Germany 530042
Liquid flux Felder GMBH Löttechnik, Oberhausen, Germany Lötöl ST DIN EN 29454.1, 3.2.2.A (F-SW 11)
LED Neuralynx HS-LED-Red-omni-10V
Name Company Catalog Number Comments
Software
MATLAB Mathworks, Natick, MA, USA
MC_Stimulus software Multichannel, Systems
Neurophysiological Data Manager NDManager, http://neurosuite.sourceforge.net
Klusters http://neurosuite.sourceforge.net, Hazan et al., 2006
Software of the recording system Neuralynx Cheetah https://neuralynx.com/software/cheetah
Multi-channel data analysis software Cambridge Electronic Design Limited, Cambridge, GB Spike2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Salinas, E., Sejnowski, T. J. Correlated neuronal activity and the flow of neural information. Nat Rev Neurosci. 2 (8), 539-550 (2001).
  2. Buzsaki, G., Wang, X. J. Mechanisms of gamma oscillations. Annu Rev Neurosci. 35, 203-225 (2012).
  3. Cannon, J., et al. Neurosystems: brain rhythms and cognitive processing. Eur J Neurosci. 39 (5), 705-719 (2014).
  4. Fries, P. Neuronal gamma-band synchronization as a fundamental process in cortical computation. Annu Rev Neurosci. 32, 209-224 (2009).
  5. Cardin, J. A., et al. Driving fast-spiking cells induces gamma rhythm and controls sensory responses. Nature. 459 (7247), 663-667 (2009).
  6. Colgin, L. L., et al. Frequency of gamma oscillations routes flow of information in the hippocampus. Nature. 462 (7271), 353-357 (2009).
  7. Csicsvari, J., Jamieson, B., Wise, K. D., Buzsaki, G. Mechanisms of gamma oscillations in the hippocampus of the behaving rat. Neuron. 37 (2), 311-322 (2003).
  8. Gray, C. M., Singer, W. Stimulus-specific neuronal oscillations in orientation columns of cat visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (5), 1698-1702 (1989).
  9. Lisman, J. E., Jensen, O. The theta-gamma neural code. Neuron. 77 (6), 1002-1016 (2013).
  10. Sirota, A., et al. Entrainment of neocortical neurons and gamma oscillations by the hippocampal theta rhythm. Neuron. 60 (4), 683-697 (2008).
  11. Bender, F., et al. Theta oscillations regulate the speed of locomotion via a hippocampus to lateral septum pathway. Nat Commun. 6, 8521 (2015).
  12. Carus-Cadavieco, M., et al. Gamma oscillations organize top-down signalling to hypothalamus and enable food seeking. Nature. 542 (7640), 232-236 (2017).
  13. Bragin, A., Engel, J., Wilson, C. L., Fried, I., Buzsaki, G. High-frequency oscillations in human brain. Hippocampus. 9 (2), 137-142 (1999).
  14. Wang, J., et al. High-frequency oscillations in Parkinson's disease: spatial distribution and clinical relevance. Mov Disord. 29 (10), 1265-1272 (2014).
  15. Hammond, C., Bergman, H., Brown, P. Pathological synchronization in Parkinson's disease: networks, models and treatments. Trends Neurosci. 30 (7), 357-364 (2007).
  16. Buzsaki, G. Theta oscillations in the hippocampus. Neuron. 33 (3), 325-340 (2002).
  17. Gulyas, A. I., et al. Hippocampal pyramidal cells excite inhibitory neurons through a single release site. Nature. 366 (6456), 683-687 (1993).
  18. Buhl, E. H., et al. Physiological properties of anatomically identified axo-axonic cells in the rat hippocampus. J Neurophysiol. 71 (4), 1289-1307 (1994).
  19. Wulff, P., et al. Hippocampal theta rhythm and its coupling with gamma oscillations require fast inhibition onto parvalbumin-positive interneurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3561-3566 (2009).
  20. Korotkova, T., Fuchs, E. C., Ponomarenko, A., von Engelhardt, J., Monyer, H. NMDA receptor ablation on parvalbumin-positive interneurons impairs hippocampal synchrony, spatial representations, and working memory. Neuron. 68 (3), 557-569 (2010).
  21. Buhl, D. L., Harris, K. D., Hormuzdi, S. G., Monyer, H., Buzsaki, G. Selective impairment of hippocampal gamma oscillations in connexin-36 knock-out mouse in vivo. J Neurosci. 23 (3), 1013-1018 (2003).
  22. Racz, A., Ponomarenko, A. A., Fuchs, E. C., Monyer, H. Augmented hippocampal ripple oscillations in mice with reduced fast excitation onto parvalbumin-positive cells. J Neurosci. 29 (8), 2563-2568 (2009).
  23. Contreras, D., Steriade, M. Cellular basis of EEG slow rhythms: a study of dynamic corticothalamic relationships. J Neurosci. 15 (1 Pt 2), 604-622 (1995).
  24. Herrera, C. G., et al. Hypothalamic feedforward inhibition of thalamocortical network controls arousal and consciousness. Nat Neurosci. 19 (2), 290-298 (2016).
  25. Freund, T. F., Antal, M. GABA-containing neurons in the septum control inhibitory interneurons in the hippocampus. Nature. 336 (6195), 170-173 (1988).
  26. Unal, G., Joshi, A., Viney, T. J., Kis, V., Somogyi, P. Synaptic Targets of Medial Septal Projections in the Hippocampus and Extrahippocampal Cortices of the Mouse. J Neurosci. 35 (48), 15812-15826 (2015).
  27. Hangya, B., Borhegyi, Z., Szilagyi, N., Freund, T. F., Varga, V. GABAergic neurons of the medial septum lead the hippocampal network during theta activity. J Neurosci. 29 (25), 8094-8102 (2009).
  28. Bartho, P., et al. Ongoing network state controls the length of sleep spindles via inhibitory activity. Neuron. 82 (6), 1367-1379 (2014).
  29. Giocomo, L. M., et al. Grid cells use HCN1 channels for spatial scaling. Cell. 147 (5), 1159-1170 (2011).
  30. Stark, E., et al. Inhibition-induced theta resonance in cortical circuits. Neuron. 80 (5), 1263-1276 (2013).
  31. Crandall, S. R., Cruikshank, S. J., Connors, B. W. A corticothalamic switch: controlling the thalamus with dynamic synapses. Neuron. 86 (3), 768-782 (2015).
  32. Steriade, M., McCormick, D. A., Sejnowski, T. J. Thalamocortical oscillations in the sleeping and aroused brain. Science. 262 (5134), 679-685 (1993).
  33. Joshi, A., Salib, M., Viney, T. J., Dupret, D., Somogyi, P. Behavior-Dependent Activity and Synaptic Organization of Septo-hippocampal GABAergic Neurons Selectively Targeting the Hippocampal CA3 Area. Neuron. , (2017).
  34. Schlingloff, D., Kali, S., Freund, T. F., Hajos, N., Gulyas, A. I. Mechanisms of sharp wave initiation and ripple generation. J Neurosci. 34 (34), 11385-11398 (2014).
  35. Craig, M. T., McBain, C. J. Fast gamma oscillations are generated intrinsically in CA1 without the involvement of fast-spiking basket cells. J Neurosci. 35 (8), 3616-3624 (2015).
  36. Pastoll, H., Solanka, L., van Rossum, M. C., Nolan, M. F. Feedback inhibition enables theta-nested gamma oscillations and grid firing fields. Neuron. 77 (1), 141-154 (2013).
  37. Akam, T., Oren, I., Mantoan, L., Ferenczi, E., Kullmann, D. M. Oscillatory dynamics in the hippocampus support dentate gyrus-CA3 coupling. Nat Neurosci. 15 (5), 763-768 (2012).
  38. Mattis, J., et al. Frequency-dependent, cell type-divergent signaling in the hippocamposeptal projection. J Neurosci. 34 (35), 11769-11780 (2014).
  39. Vandecasteele, M., et al. Optogenetic activation of septal cholinergic neurons suppresses sharp wave ripples and enhances theta oscillations in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (37), 13535-13540 (2014).
  40. Stark, E., et al. Pyramidal cell-interneuron interactions underlie hippocampal ripple oscillations. Neuron. 83 (2), 467-480 (2014).
  41. Blumberg, B. J., et al. Efficacy of nonselective optogenetic control of the medial septum over hippocampal oscillations: the influence of speed and implications for cognitive enhancement. Physiol Rep. 4 (23), (2016).
  42. Courtin, J., et al. Prefrontal parvalbumin interneurons shape neuronal activity to drive fear expression. Nature. 505 (7481), 92-96 (2014).
  43. Nagode, D. A., Tang, A. H., Yang, K., Alger, B. E. Optogenetic identification of an intrinsic cholinergically driven inhibitory oscillator sensitive to cannabinoids and opioids in hippocampal CA1. J Physiol. 592 (1), 103-123 (2014).
  44. Bitzenhofer, S. H., et al. Layer-specific optogenetic activation of pyramidal neurons causes beta-gamma entrainment of neonatal networks. Nat Commun. 8, 14563 (2017).
  45. Kondabolu, K., et al. Striatal cholinergic interneurons generate beta and gamma oscillations in the corticostriatal circuit and produce motor deficits. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (22), E3159-E3168 (2016).
  46. Sohal, V. S., Zhang, F., Yizhar, O., Deisseroth, K. Parvalbumin neurons and gamma rhythms enhance cortical circuit performance. Nature. 459 (7247), 698-702 (2009).
  47. Pina-Crespo, J. C., et al. High-frequency hippocampal oscillations activated by optogenetic stimulation of transplanted human ESC-derived neurons. J Neurosci. 32 (45), 15837-15842 (2012).
  48. Iaccarino, H. F., et al. Gamma frequency entrainment attenuates amyloid load and modifies microglia. Nature. 540 (7632), 230-235 (2016).
  49. Kim, H., Ahrlund-Richter, S., Wang, X., Deisseroth, K., Carlen, M. Prefrontal Parvalbumin Neurons in Control of Attention. Cell. 164 (1-2), 208-218 (2016).
  50. Lu, Y., et al. Optogenetically induced spatiotemporal gamma oscillations and neuronal spiking activity in primate motor cortex. J Neurophysiol. 113 (10), 3574-3587 (2015).
  51. Kim, T., et al. Cortically projecting basal forebrain parvalbumin neurons regulate cortical gamma band oscillations. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (11), 3535-3540 (2015).
  52. Siegle, J. H., Pritchett, D. L., Moore, C. I. Gamma-range synchronization of fast-spiking interneurons can enhance detection of tactile stimuli. Nat Neurosci. 17 (10), 1371-1379 (2014).
  53. Gan, J., Weng, S. M., Pernia-Andrade, A. J., Csicsvari, J., Jonas, P. Phase-Locked Inhibition, but Not Excitation, Underlies Hippocampal Ripple Oscillations in Awake Mice In. Neuron. 93 (2), 308-314 (2017).
  54. van de Ven, G. M., Trouche, S., McNamara, C. G., Allen, K., Dupret, D. Hippocampal Offline Reactivation Consolidates Recently Formed Cell Assembly Patterns during Sharp Wave-Ripples. Neuron. 92 (5), 968-974 (2016).
  55. Kim, A., et al. Optogenetically induced sleep spindle rhythms alter sleep architectures in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), 20673-20678 (2012).
  56. Latchoumane, C. V., Ngo, H. V., Born, J., Shin, H. S. Thalamic Spindles Promote Memory Formation during Sleep through Triple Phase-Locking of Cortical, Thalamic, and Hippocampal Rhythms. Neuron. 95 (2), 424-435 (2017).
  57. Robinson, J., et al. Optogenetic Activation of Septal Glutamatergic Neurons Drive Hippocampal Theta Rhythms. J Neurosci. 36 (10), 3016-3023 (2016).
  58. Fuhrmann, F., et al. Locomotion, Theta Oscillations, and the Speed-Correlated Firing of Hippocampal Neurons Are Controlled by a Medial Septal Glutamatergic Circuit. Neuron. 86 (5), 1253-1264 (2015).
  59. Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biol. 3 (5), e159 (2005).
  60. Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).
  61. Armstrong, C., Krook-Magnuson, E., Oijala, M., Soltesz, I. Closed-loop optogenetic intervention in mice. Nat Protoc. 8 (8), 1475-1493 (2013).
  62. Buzsaki, G., et al. Multisite recording of brain field potentials and unit activity in freely moving rats. J Neurosci Methods. 28 (3), 209-217 (1989).
  63. Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. J Vis Exp. (61), e3568 (2012).
  64. Hazan, L., Zugaro, M., Buzsaki, G. Klusters, NeuroScope, NDManager: a free software suite for neurophysiological data processing and visualization. J Neurosci Methods. 155 (2), 207-216 (2006).
  65. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  66. Korotkova, T., et al. Reconciling the different faces of hippocampal theta: The role of theta oscillations in cognitive, emotional and innate behaviors. Neurosci Biobehav Rev. , (2017).
  67. Vertes, R. P., Hoover, W. B., Viana Di Prisco, G. Theta rhythm of the hippocampus: subcortical control and functional significance. Behav Cogn Neurosci Rev. 3 (3), 173-200 (2004).
  68. Hasselmo, M. E., Hay, J., Ilyn, M., Gorchetchnikov, A. Neuromodulation, theta rhythm and rat spatial navigation. Neural Netw. 15 (4-6), 689-707 (2002).
  69. Witt, A., et al. Controlling the oscillation phase through precisely timed closed-loop optogenetic stimulation: a computational study. Front Neural Circuits. 7, 49 (2013).
  70. Korotkova, T., Ponomarenko, A. In Vivo Neuropharmacology and Neurophysiology. , Springer Science. Series Neuromethods (2017).
  71. Dannenberg, H., et al. Synergy of direct and indirect cholinergic septo-hippocampal pathways coordinates firing in hippocampal networks. J Neurosci. 35 (22), 8394-8410 (2015).
  72. Pikovsky, A., Rosenblum, M., Kurths, J. Synchronization: A universal concept in nonlinear sciences. 70, American Journal of Physics. (2002).
  73. Boyce, R., Glasgow, S. D., Williams, S., Adamantidis, A. Causal evidence for the role of REM sleep theta rhythm in contextual memory consolidation. Science. 352 (6287), 812-816 (2016).

Tags

Neuroscience sayı 136 Optogenetics elektrofizyolojik kayıtlar in vivo davranış teta salınım hipokampus piramit hücreleri interneurons septum hareket pharmacogenetics
Hipokampal teta salınımlarını fareler davranışlar içinde Optogenetic sürüklenme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bender, F., Korotkova, T.,… More

Bender, F., Korotkova, T., Ponomarenko, A. Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice. J. Vis. Exp. (136), e57349, doi:10.3791/57349 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter