Summary
Qui descriviamo la procedura canalostomy che permette la consegna di droga locale nelle orecchie interno dei topi adulti e neonati attraverso il canale semicircolare con minimo danno alla funzione uditiva e vestibolare. Questo metodo può essere utilizzato per inoculare vettori virali, prodotti farmaceutici e le piccole molecole nell'orecchio interno del mouse.
Abstract
Recapito locale di farmaci terapeutici nell'orecchio interno è una promettente terapia per patologie dell'orecchio interno. Iniezione tramite canali semicircolari (canalostomy) ha dimostrato di essere un utile approccio alla consegna di droga locale nell'orecchio interno. L'obiettivo di questo articolo è di descrivere, in dettaglio, le tecniche chirurgiche coinvolte nella canalostomy in topi sia in adulti e neonatali. Come indicato dal colorante fast-verde e virus adeno-associato sierotipo 8 con il gene della proteina fluorescente verde, il canalostomy facilitato ampia distribuzione di reagenti iniettati nella coclea e fine-organi vestibolari con minimi danni all'udito e funzione vestibolare. L'ambulatorio è stato implementato con successo nei topi sia in adulti e neonatali; Infatti, gli ambulatori multipli possono essere eseguiti se necessario. In conclusione, canalostomy è un approccio efficace e sicuro alla consegna della droga nelle orecchie interno dei topi adulti e neonati e può essere usato per trattare patologie dell'orecchio interno umano in futuro.
Introduction
Neurosensoriale dell'udito perdita e la disfunzione vestibolare influiscono un numero considerevole di pazienti e sono strettamente associata a disturbi dell'orecchio interno. Consegna di farmaci terapeutici nell'orecchio interno Mostra la promessa per il trattamento di patologie dell'orecchio interno. Un approccio sistemico o locale può essere utilizzato per consegnare i farmaci nell'orecchio interno. Alcune malattie dell'orecchio interno sono trattati con successo con farmaci sistemici, come la perdita dell'udito improvvisa idiopatica, che è comunemente trattato con steroidi sistemici1. Inoltre, Lentz et al hanno dimostrato che la somministrazione sistemica di oligonucleotide antisenso è stato in grado di migliorare l'udito e l'equilibrio di funzioni in Ush1c topo mutante modello2. Tuttavia, gran parte delle patologie dell'orecchio interno in modo efficace non sono trattati da somministrazione sistemica a causa della barriera sangue-labirinto, che limita l'accesso di droga per l'orecchio interno3,4. Al contrario, strategie di consegna della droga locale possono trattare patologie dell'orecchio interno in modo più efficiente. Infatti, l'orecchio interno è potenzialmente un bersaglio ideale per la consegna di droga locale; è pieno di liquido, che facilita la diffusione della droga dopo uno-sito diffusione o iniezione, ed è relativamente isolato da organi vicini, che limita gli effetti collaterali5,6.
Strategie di consegna di droga locali includono metodi intratimpanici e intralabyrinthine. L'efficacia del percorso intratimpanico si basa in gran parte sulla permeabilità del farmaco attraverso la membrana della finestra rotonda (RWM) e il tempo di permanenza del farmaco sul RWM3,4,7,8. Così, non è adatto per la consegna di farmaci o reagenti che non possono penetrare il RWM. Intralabyrinthine metodi implicano l'inoculazione di farmaci direttamente nell'orecchio interno, con conseguente una dose elevata e distribuzione capillare. Tuttavia, intralabyrinthine metodi richiedono interventi chirurgici delicati e sono invasivi, conseguenti danni alla funzione dell'orecchio interno. Attualmente, la intralabyrinthine iniezione delle droghe viene utilizzata solo negli studi sugli animali come non è stato dimostrato di essere sufficientemente sicuro per uso in esseri umani9. Di conseguenza, le procedure chirurgiche devono essere semplificate e ridurre il rischio di lesioni per tradurre intralabyrinthine approcci in clinica.
Intralabyrinthine diversi approcci sono stati valutati negli animali tramite l'iniezione attraverso il RWM5,10,11 e nella scala media12,13,14, tympani di scala 15 , 16, il vestibolo di scala17, i canali semicircolari16,18,19,20e il sacco endolinfatico21. Ciascuno di questi approcci ha vantaggi e svantaggi6. Consegna attraverso il RWM è atraumatica in topi neonatali5,22. Tuttavia, una perdita della capacità uditiva delicata viene osservata in topi adulti dopo iniezione RWM23, probabilmente a causa di effusione dell'orecchio centrale dopo la chirurgia24. Iniezione del mezzo di scala, che comprende l'iniezione di reagente direttamente nello spazio endolinfatico contenente l'epitelio sensoriale, raggiunge una concentrazione di reagente alta nella destinazione finale-organi12,14, 25 , 26. Tuttavia, questo approccio richiede una procedura complessa e risultati in significativa elevazione della soglia dell'udito se eseguita più tardi postnatale giorno 5 (P5)25,27, che limita la sua applicazione.
Rispetto ai suddetti approcci intralabyrinthine, canalostomy provoca il minimo danno all'orecchio interno, soprattutto in topi adulti16,18,28,29,30, che è importante per la valutazione degli effetti protettivi e aspetti traslazionali. Inoltre, nei roditori, i canali semicircolari si trovano oltre la bulla, che facilita le procedure chirurgiche ed evita la dispersione dell'orecchio medio durante la chirurgia. Nella clinica, canale semicircolare ambulatori sono utilizzati per vertigine posizionale parossistica benigna intrattabile31,32,33, suggerendo la fattibilità clinica di canalostomy. Poiché in primo luogo è stato descritto da Kawamoto et al. 16 nel 2001, canalostomy è stato utilizzato per trasportare vari reagenti, quali vettori virali, siRNA, cellule staminali e aminoglicoside, nel murino dell'orecchio interno18,19,28,29 ,34,35,36,37. Inoculazione di vettori di virus adeno-associato (AAV) di canalostomy attivare la sovraespressione di geni esogeni in epitelio sensoriale e neuroni primari della coclea e del fine-organi vestibolari18,28, 29,30. Whirlin terapia genica di canalostomy ristabilisce la funzione di equilibrio e migliora l'ascolto in un modello murino di umano Usher sindrome19, suggerendo che canalostomy è utile per gli studi di terapia genica per le malattie genetiche cochleovestibular. Trapianto di cellule staminali mesenchimali da canalostomy risultati nella riorganizzazione dei fibrociti cocleari e recupero dell'udito in un modello del ratto di di perdita dell'udito neurosensoriale acuta35. Inoltre, canalostomy può essere usato per introdurre gli aminoglicosidi nell'orecchio interno per stabilire lesioni vestibolari18,34,38, e iniezioni multiple possono essere eseguite se necessario18 , 34.
Nel presente articolo, descriveremo nel dettaglio, tecniche di canalostomy in topi adulti e neonati. Abbiamo inoculato reagenti vari, tra cui fast-verde colorante e sierotipo AAV 8 (AAV8), insieme con il gene della proteina fluorescente verde (GFP) (AAV8-GFP) e streptomicina, nell'orecchio interno del mouse per valutare i risultati immediati e a lungo termine dopo canalostomy.
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Protocol
Tutte le procedure e gli ambulatori animali sono state condotte secondo le linee guida del Comitato di uso dell'Università medica capitale della Cina e cura degli animali.
1. dispositivo preparazioni
- Per rendere la cannula di iniezione (Figura 1A), collegare la tubazione di polyimide (diametro interno 114.3 µm, diametro esterno 139,7 µm, lunghezza ~ 3 cm) per tubi in polietilene (diametro interno 280 µm, diametro esterno 640 µm, lunghezza 40cm ~). Utilizzando colla a presa rapida, sigillare il collegamento con almeno tre applicazioni. Sterilizzare la cannula di iniezione con ossido di etilene.
Nota: Quando il tubo di tenuta, è possibile impedire la supercolla entrino la tubazione di polyimide, che può provocare un'ostruzione della cannula. Sigillare il tubo a almeno tre volte, perché la sterilizzazione a gas può causare perdite al collegamento. - Utilizzando un ago 30g, collegare l'estremità del tubo in polietilene per una siringa da 1 cc contenente soluzione fisiologica normale. Riempire la cannula con soluzione salina per iniezione con la siringa da 1 cc per verificare eventuali perdite o blocco alla connessione tra la tubazione di polyimide e tubi in polietilene.
Nota: Se c'è una perdita o un blocco della connessione, la cannula non può essere utilizzata nelle procedure seguenti. - Evacuare una micro-siringa 10 µ l con soluzione salina e collegarlo all'ago 30g suddetto con la cannula di iniezione. Installare la micro-siringa su una pompa di Microiniezione (Figura 1B). Impostare la velocità di iniezione a 0,5 µ l/min e il volume a 1 µ l di colorante fast-verde e AAV8-GFP o 2 µ l per streptomicina.
Nota: L'intervallo raccomandato di velocità dell'iniezione è 0.1−0.5 µ l/min, e l'intervallo raccomandato di volume di iniezione è µ l 0.5−2. - Tirare indietro la micro-siringa a 1 µ l ed estrarre il reagente di iniezione. Un'intercapedine d'aria si forma tra la normale soluzione salina e il reagente iniettato (Figura 1).
- Facoltativamente, etichettare la posizione del bordo della gas-liquido del tubo di polietilene utilizzando un pennarello. Questo può essere utilizzato per monitorare il flusso di reagente durante l'iniezione.
2. Canalostomy in topi adulti
- Anestetizzare un topo adulto (femmina, FVB/N, vecchio di 5 a 6 settimane) tramite l'iniezione intraperitoneale di chetamina (120 mg/kg) e xilazina HCl (7 mg/kg). Attendere 5−10 min fino a quando l'animale non presenta nessuna risposta agli stimoli dolorosi (il riflesso di punta-pizzico). Metti l'animale su un tappetino elettrico preriscaldato dopo l'anestesia. Un analgesico, Meloxicam (1 mg/kg), è stato applicato per via sottocutanea prima dell'intervento chirurgico.
- Coprire gli occhi dell'animale con unguento oculare. Radere la regione di alberino-auricolare sinistra con un elettrico tosatrice per animali e disinfettare la pelle tre volte con etanolo al 75%.
- Metti l'animale su un tappetino elettrico preriscaldato. Impostare la temperatura del pad elettrica a ~ 37° C. Metti l'animale nella posizione laterale di destra per facilitare la chirurgia sull'orecchio sinistro.
- Fare un'incisione di alberino-auricolare di 1-1.5 cm ~ 3 mm dalla scanalatura retroauricular sinistro (Figura 2A).
- Posizionamento del canale semicircolare posteriore (PSC) e il canale semicircolare laterale (LSC): quando la radice del pinna (grassetto puntino in Figura 2B) è definita come l'origine e il piano parallelo al calvarium come 3 a 9, il PSC e il LSC sono in genere Situato a circa 3 mm dalla radice della pinna tra 2 e 3 (Figura 2B).
- Senza mezzi termini sezionare il muscolo che copre l'osso temporale con micro-pinze per esporre il PSC e LSC, cui i margini sono chiaramente visibili come strisce scure nell'osso temporale (Figura 2). Il CSL è a un angolo di circa 30° dal piano parallelo al calvarium e il PSC è verticale per la LSC (Figura 2). Raccogliere un piccolo pezzo di muscolo con micro-forcipe e lasciarla asciugare. Nel passaggio seguente, questo muscolo servirà per sigillare il foro.
Nota: Evitare eccessiva lacerazione dei tessuti per minimizzare il danno ai muscoli. Evitare di danneggiare il vaso adiacente quando si espone il PSC (Figura 2D). - Fare un piccolo foro nella parte centrale del PSC utilizzando un ago da 26 G (Figura 2D). Perdita di liquido attraverso il foro indica la penetrazione di successo della parete ossuta del PSC. Allargare il foro a una dimensione appropriata, leggermente più grande rispetto al diametro della tubazione di polyimide.
Nota: Forare ed allargare il foro dolcemente e gradualmente per evitare la frattura del PSC. - Pulire l'effusione che circonda il buco del PSC usando un batuffolo di cotone.
- Inserire delicatamente la punta della tubazione di polyimide il PSC verso il comune di Cru ad una profondità di 1 − 2 mm (Figura 2E). Avviare l'iniezione premendo il pulsante 'Esegui' sulla pompa.
- Dopo l'iniezione, attendere ~ 2 min per consentire il reagente a diffondersi. Tagliare il piccolo pezzo di muscolo raccolto nel passaggio 2.6 con micro-forbici. Successivamente, rimuovere la cannula di iniezione e mettere immediatamente il muscolo nel foro del PSC.
Nota: Controllare per qualsiasi liquido che fuoriesce dal foro dopo aver collegato per assicurarsi che il foro è chiuso ermeticamente. - Restituire il separato muscoli e dei tessuti sottocutanei. Sutura l'incisione utilizzando una sutura 5 / 0. Disinfettare la regione di incisione con povidone iodio.
Nota: Tutte le procedure chirurgiche sopra prendere circa 25 min. - Posizionare l'animale su un pad elettrico preriscaldato a ~ 37 ° C. Mettere l'animale in posizione laterale di destra per il recupero.
- Eseguire uditive del tronco cerebrale (ABR) risposta misure e test una settimana dopo la chirurgia18di nuoto.
- Se necessario, è possibile eseguire iniezioni ripetute in una zona diversa del PSC o LSC.
3. Canalostomy in topi neonatali
- Utilizzare l'ipotermia per indurre e mantenere la sedazione in topi neonatali (FVB/N) a giorni postnatali 1 a 2 (P1-2). Posto il cucciolo su un letto di ghiaccio tritato per ~ 4 min coperti in involucro di plastica. Avanti, laici il pup su una piattaforma piena di ghiaccio. Disinfettare il campo chirurgico tre volte con etanolo al 75%.
Nota: Assicurarsi che la testa del cucciolo è fuori dal ghiaccio. Eseguire l'intero intervento con il pup su una piattaforma piena di ghiaccio. - I passaggi seguenti differiscono nel neonato rispetto ai topi adulti.
- Fare un'incisione postauricular ~ 3 mm da ~ 2 mm posteriore alla piega auricolare (Figura 3A -B).
- Delicatamente e realizzare un'apertura morbida PSC utilizzando un ago da 26 G. Inserire la cannula nel PSC senza allargare l'apertura (Figura 3 -E).
- Dopo l'iniezione, è possibile utilizzare un pezzo di muscolo per coprire, anziché collegare, l'apertura come quest'ultimo può portare ad una frattura del CPS molli (Figura 3F).
- Chiudere la pelle utilizzando una sutura in 6-0.
- Eseguire ABR misurazioni e prove di nuoto P3030.
- Cannibalismo parentale è un problema comune dopo la chirurgia neonatale. I passaggi seguenti riducono la probabilità di cannibalismo parentale.
- Pulire il sangue che circonda l'incisione con salviettine imbevute di alcool dopo la chirurgia.
- Assicurarsi che il neonato possa muoversi liberamente prima di restituirlo alla diga.
- Striscio di neonati con biancheria sporca dalla gabbia della madre e posto che i neonati indietro nel bel mezzo della cucciolata.
- Qualsiasi che non sottoporsi ad intervento chirurgico dovrebbero ricevere un simile incisione postauricular e sutura.
- Separare il maschio dalla gabbia di allevamento.
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Representative Results
Fast-verde colorante è stato iniettato nel PSC di topi adulti e neonati per valutare la distribuzione immediata nell'orecchio interno. Il colorante è stato rilevato in tutta la coclea, vestibolo e canali semicircolari immediatamente dopo l'intervento chirurgico (Figura 4).
Per valutare la sicurezza e l'efficienza di canalostomy per la consegna del gene dell'orecchio interno, AAV8-GFP è stato iniettato nell'orecchio interno dei topi adulti e neonati. Tutti gli animali hanno esibito normali soglie ABR e punteggi dei test di nuoto dopo AAV8-GFP iniezione18,30. Immunohistology ha rivelato che, nell'epitelio sensoriale uditiva, cellule ciliate interne (IHCs) e poche cellule ciliate esterne (OHCs) della girata basale ha mostrato robusto GFP espressione30. Nell'epitelio sensoriale vestibolare, espressione della GFP è stato rilevato nell'utricolo, sacculo e ampolle30. Sia le cellule cigliate vestibolari (Figura 5) e cellule di supporto sono state trasdotte con alta efficienza18,30.
Infusione di streptomicina da canalostomy induce perdita severa della cellula ciliata in utricolo18,34,38. Per verificare la fattibilità di iniezioni multiple tramite canalostomy, i topi sono stati dati la streptomicina attraverso la LSC seguita dopo 7 giorni da sospensioni AAV8-GFP attraverso il PSC. Questo esperimento è stato progettato anche per valutare le caratteristiche di trasduzione del AAV8-GFP nel utricle leso, che era utile per gli studi di terapia genica nell'orecchio interno danneggiato dopo HC perdita18. GFP è stato distribuito in tutto il utricle leso (Figura 6). Numerose cellule GFP-positive erano negative per miosina VIIA, che indica che essi erano trasdotte SCs. Alcuni HCs (cellule di miosina VIIa-positive) con pacchi dei capelli immaturo anche espresso GFP.
Figura 1: preparazione del dispositivo. (A) la tubazione di polyimide (i) e i tubi di polietilene (ii) sono sigillati per rendere una cannula di iniezione (iii). (B) la cannula è collegata a una 10-µ l micro-siringa con un ago 30g e quindi installata una pompa. Freccia indica la punta della cannula. (C) iniezione reagente e salino normale sono separati da un'intercapedine d'aria. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Canalostomy a un topo adulto. (A) un'incisione alberino-auricolare (freccia). (B) sono esposti i muscoli che copre l'osso temporale. Se definiamo la radice del pinna (grassetto dot) come l'origine e il piano parallelo al calvarium come 3/9 in punto, il canale semicircolare posteriore (PSC) e canale semicircolare laterale (CSL) si trovano generalmente nella regione tra 2 e 3 (pentagramma) , ~ 3 mm dall'origine. Inserto: basso-ingrandimento immagine dell'orientamento. La linea tratteggiata indica il piano di calvarium. (C) il PSC e LSC sono esposte (linee tratteggiate). Inserto: La LSC è a un angolo di circa 30° dal piano parallelo al calvarium e il PSC è verticale per la LSC. (D) un piccolo foro è fatto in CPS. (E) la punta della cannula è inserita nel PSC, e il reagente viene iniettato. (F) il foro è sigillato con un piccolo pezzo di muscolo. Barra della scala nel A è 5 mm, che in B è di 1 mm (B per B-F), che nella rientranza a B è di 1 cm, e cioè nella rientranza a C 5 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Canalostomy un mouse neonatale. (A) un'incisione alberino-auricolare (freccia). (B) sono esposti i muscoli che copre l'osso temporale, e il canale semicircolare posteriore (PSC) è ~ 2 mm dalla radice della pinna (grassetto dot) a 2-3 (pentagramma). L'orientamento è identico a quello in topi adulti (Figura 2B). (C) il PSC e canale semicircolare laterale (CSL) sono esposte (linee tratteggiate). (D) una piccola apertura fatta nel PSC. (E) la cannula viene inserita nel PSC. (F) un piccolo pezzo di muscolo viene utilizzato per coprire l'apertura dopo l'iniezione. Scala bar nella A e B inserto sono di 5 mm, che in B è di 1 mm, e che in C è 1 mm (C per C-F). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: immagini al microscopio Stereo delle orecchie interno di adulto (A-A') e topi neonatali (B-B') amministrato colorante fast-verde via canalostomy. I campioni sono stati raccolti immediatamente dopo la chirurgia. (A e B) La superficie extracranial. (A' e B') La superficie intracranica. Fast-verde colorante distribuisce in tutta la coclea, vestibolo e canali semicircolari. Barre della scala sono di 1 mm (A' per A-A 'e B' per B-B'). PSC, canale semicircolare posteriore. LSC, canale semicircolare laterale. SSC, canale semicircolare superiore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: immagini confocal rappresentative di tutta supporti della coclea (A-A") e utricolo (B-B") di topi adulti, preparato 30 giorni dopo l'iniezione di AAV8-GFP via canalostomy. I campioni sono macchiati con gli anticorpi per GFP (verde) e miosina VIIa (rossi). (A-A ") GFP è espressa in cellule ciliate più interne (IHC). (B-B ") Presso il piano focale della piastra cuticolare del utricle, numerosi capelli cellule esprimono GFP (frecce). GFP, proteina fluorescente verde. OHC, le cellule ciliate esterne. Barre della scala sono 25 µm (A"per un", B "per B-B"). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: immagini confocal rappresentative di un traumatizzato utricolo ottenuto 30 giorni dopo l'iniezione di AAV8-GFP via canalostomy. Un topo adulto è stato iniettato con streptomicina tramite il canale semicircolare laterale e 7 giorni più successivamente iniettati con AAV8-GFP tramite il canale semicircolare posteriore. GFP (green), miosina VIIa (rosso) e l'actina (blu). Punte di freccia indicano rappresentante supporto cellule trasformate con AAV8-GFP (GFP + / miosina VIIa-cellule), e le frecce indicano rappresentante capelli cellule trasformate con AAV8-GFP (GFP + cellule di miosina VIIa +) con pacchi dei capelli immaturo. Barra della scala è di 20 µm (D per A-D). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo studio, abbiamo dimostrato che la consegna della droga di canalostomy provocato distribuzione capillare del reagente in tutta la coclea e fine-organi vestibolari. Come un metodo di consegna del gene dell'orecchio interno, canalostomy provocato l'espressione di GFP nelle orecchie interno dei topi adulti e neonati con danni minimi alla funzione uditiva e vestibolare. Inoltre, le iniezioni multiple possono essere facilmente eseguite nello stesso animale.
Uno dei maggiori punti di forza di canalostomy è che provoca danni minimi alla funzione dell'orecchio interno, soprattutto in topi adulti16,18,28,29,30, che è significativo per la valutazione degli effetti protettivi e per gli aspetti traslazionali. Diversi gruppi hanno utilizzato canalostomy per trasportare vari reagenti, quali vettori virali, siRNA, cellule staminali e aminoglicoside, in murino dell'orecchio interno18,19,28,29, 34,35,36,37. Nello studio corrente, abbiamo descritto passo-passo, dettagliate tecniche chirurgiche di canalostomy in topi adulti e neonati. Rispetto agli studi precedenti, il nostro studio fornisce ulteriori dettagli sul posizionamento dei canali semicircolari, che è una procedura fondamentale per il successo della chirurgia. Come mostrato in Figura 2B e C, il PSC e LSC erano generalmente trova ~ 3 mm dalla radice della pinna al 2-3. Il CSL è stata a un angolo di circa 30° dal piano parallelo al calvarium e il PSC è stato verticale per la LSC. Inoltre, abbiamo semplificato le procedure chirurgiche e accorciato il tempo chirurgico per circa 25 minuti con risultati comparabili29.
Durante canalostomy, è indispensabile per evitare perdite al sito di iniezione e blocco della cannula. Prima di accendere la pompa, è importante accertarsi che la punta della cannula è inserita nel canale semicircolare e che la cannula non è piegata o bloccata. Muscolare asciutta è consigliato per essere utilizzato quando il buco nel canale semicircolare di topi adulti di tenuta perché, in presenza di fluido canale semicircolare, si espande e tappi il foro (Vedi punti 2.6 e 2.10). Poiché la parete del canale semicircolare di topi neonatali è morbido e fragile, l'apertura deve essere sigillato coprendo di muscolo autogeno o colla medica30. Abbiamo anche rimosso la cannula senza coprire l'apertura con il muscolo; i risultati hanno rivelato comparabili AAV efficienza di trasduzione nell'orecchio interno (dati non mostrati), che indica che l'apertura nel PSC di topi neonatali è stato chiuso in modo soddisfacente.
Un altro vantaggio di canalostomy è la fattibilità delle procedure multiple, che consente alle applicazioni ripetitive dei reagenti stessi o diversi (Figura 6). Perché fibrotica e tessuti di granulazione si trovano frequentemente a siti chirurgici precedenti e il canale semicircolare può essere ostruito dopo chirurgia34, è consigliabile effettuare iniezioni durante interventi chirurgici ripetuti in una zona diversa della laterale e/o canali semicircolari posteriori18.
La limitazione principale di canalostomy è la difficoltà nella determinazione se la cannula di iniezione è inserita nello spazio perilymphatic o endolinfatico. Dopo la somministrazione di vettori adenovirali nel orecchio interno16 via canalostomy, più cellule trasdotte erano situate nello spazio perilymphatic, suggerendo che l'iniezione è stata probabilmente eseguita in quella zona. Composti a basso peso molecolare (ad es., AAV, streptomicina e siRNA) possono passare attraverso la barriera tra la perilinfa e l'endolinfa e raggiungere l'epitelio sensoriale dopo l'iniezione nella spazio endolinfatico o perilinfatica18,19 ,34. Tuttavia, dopo iniezione nel perilymph, reagenti possono rimanere nello spazio perilymphatic se essi non può penetrare la barriera tra la perilinfa ed endolinfa16,39,40. Di conseguenza, la permeabilità dei reagenti iniettati dovrebbe essere considerata prima di utilizzare canalostomy.
In conclusione, canalostomy si traduce in un'ampia distribuzione di reagenti a coclea e del vestibolo con il minimo disturbo della funzione uditiva e vestibolare. L'intervento chirurgico viene implementata facilmente in topi adulti e neonati, e più procedure possono essere eseguite se necessario. Canalostomy è dunque un approccio efficace e sicuro per il drug delivery nell'orecchio interno dei roditori e può, in futuro, essere usato clinicamente per trattare malattie umane cochleovestibular.
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Disclosures
Non vengono dichiarati conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal National Natural Science Foundation della Cina (sovvenzione numeri 81570912, 81771016, 81100717).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polymide Tubing | A-M Systems | 823400 | |
| Polyethylene Tubing | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/1 | |
| 10μl Microsyringe | Hamilton Company | 80001 | |
| Xylazine HCL | Sigma-Aldrich Co. Llc. | X-1251 | |
| Operating Miroscope | Carl Zeiss Optical LLC. | Pico | |
| Micro Forceps | Dumont Dumostar | 10576 | |
| Fast-green Dye | Sigma-Aldrich Co. Llc. | F7252 | |
| AAV8-GFP | BioMiao Biological Technology Co. Ltd (Beijing, China) | 20161101 | Titer: 2×10e12 vg/mL |
| Streptomycin Sulfate | Sigma-Aldrich Co. Llc. | S9137 | |
| Microinjection Pump | Stoelting Co. | 789100S | |
| Electric Pad | Pet Fun | 11072931136 | |
| 1 cc Syringe | Mishawa Medical Industries Ltd. (Shanghai, China) | 2011-3151258 | |
| Ketamine HCL | Gutian Pharmaceutical Co., Ltd. (Fujian, China) | H35020148 | |
| Electric Animal Clipper | Codos Electrical Appliances Co., Ltd. (Guangdong, China) | CP-8000 | |
| Cotton Pellet | Yatai Healthcare Ltd. (Henan, China) | Yu-2008-1640081 | |
| Suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. (Shanghai, China) | Hu-2013-2650207 | |
| Eye Ointment | Beijing Shuangji Pharmaceutical Ltd. (Beijng China) | H11021270 |
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